CN108611295A - 一种缓解内毒素感染的脆弱拟杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种缓解内毒素感染的脆弱拟杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的脆弱拟杆菌CCFM1020具有低免疫原性，能够降低内毒素感染宿主血液中促炎因子的含量，增加抑炎因子的浓度，上调Foxp3+调节性T细胞的数量，及稳定肠道菌群组成。所述的脆弱拟杆菌CCFM1020用于缓解内毒素感染的药物组合物，具有广泛的应用前景。

Description

一种缓解内毒素感染的脆弱拟杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种缓解内毒素感染的脆弱拟杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
内毒素，又称脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组成组分。内毒素结构稳定，主要由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)三部分组成。类脂A是脂化的葡萄胺二糖，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。一般情况下，内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，而内毒素结构稳定，只有长时间的高温处理或以强碱、强酸或强氧化剂辅助高温处理才能破坏其的生物活性。
正常机体肠腔内含有大量的肠道细菌，肠粘膜能够选择性地吸收营养成分，并阻止微生物及其有害的代谢物进入。然而，当机体处在应激状态下或过量使用抗生素时，肠道菌群紊乱，释放出内毒素，过量的内毒素能够增加肠道通透性，导致一系列免疫失调引起的肠道疾病，通过屏障进入血液循环，作用于机体的巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血小板，以及补体***和凝血***等，引起微循环紊乱而导致内毒素休克；更有加重抑郁症的可能性。已有研究报道，每年至少有75万例患者发生内毒素感染休克，其中超过21万人因此丧命。
目前，针对内毒素感染的治疗原则多主张减少内毒素的产生和吸收及改善内毒素引起的微循环障碍。专利CN102406869A公开了一种采用大黄、芍丹等中药降低内毒素水平的应用方法；有研究发现，多粘菌素能特异性结合内毒素中活性部位类脂A，从而中和或者灭活其毒性(吕根法、卫国等。“多粘菌素B拮抗内毒素的体外作用研究”，《第三军医大学学报》，2004，26，14:1252-1254)；CN106334540A、CN1864755等专利发明了用于血液灌流的内毒素吸附剂及其应用，用于清除机体内内毒素。然而，传统的中医药治疗对清除内毒素具有一定的作用，但疗效并不显著；抗生素的应用并不能有效地清除内毒素，反而具有一定的负面影响；血液净化法对内毒素有着良好的清除作用，但费用较高，且临床数据不足。
因此，通过调节肠道菌群抑制肠源性内毒素引起的炎症，对治疗或预防内毒素感染有广阔的应用前景。目前，已有一些专利或专利申请文献涉及通过肠道菌治疗内毒素感染，如专利CN102470152A公开了6种乳酸菌、双歧杆菌或它们的任何混合物的细菌的以下用途：在哺乳动物中治疗代谢性内毒素血症、抑制细菌位移和调节脂质吸收。也有研究报道，双歧杆菌能够治疗内毒素引起的新生儿坏死性小肠结肠炎(Xiang Ling,et al.“Protective Effects of Bifidobacterium on Intestinal Barrier Function in LPS-Induced Enterocyte Barrier Injury of Caco-2 Monolayers and in a Rat NecModel”,《PLoS One》,2016,11(8):e0161635)。
拟杆菌是人体肠道共生菌中含量最高的一类革兰氏阴性菌，具有大量碳水化合物降解基因，环境适应力强，并且与宿主的免疫、代谢及神经***均存在紧密联系。目前已有观点认为拟杆菌具备潜在的生理调节功能，可能成为“新一代益生菌”。例如，已有专利CN105434476A公开了拟杆菌群中的脆弱拟杆菌ZY-312能够缓解DSS对肠道造成的化学性损伤而引起的溃疡性炎症；专利CN103120705A及CN103082294A分别公开了具有的预防便秘及腹泻功能的脆弱拟杆菌；专利103156888A公开了一株脆弱拟杆菌能够缓解半抗原物质TNBS在被乙醇破坏的肠组织中引起的炎症反应；也有研究发现脆弱拟杆菌ATCC25285能够缓解由致病菌肝螺杆菌定植而引起的结肠炎(Sarkis Mazmanian,et al.“A Microbialsymbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease”.《Nature》,2008,453)。但目前并没有任何专利文献报道脆弱拟杆菌对内毒素感染的缓解作用，尤其未关注该类菌株改变肠道通透性等的作用途径。
本发明总结现有技术的基础尝试，通过大量实验研究，筛选出了一种具有缓解内毒素感染的脆弱拟杆菌，并证明其在动物模型中可调节因内毒素激活肠道免疫通路，缓解炎症，进而缓解内毒素感染。进一步考察了其在药物组合物中的应用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，命名为脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)CCFM1020，依据其基因序列对该拟杆菌鉴定为脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)CCFM1020，已于2018年3月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:60342。
所述的脆弱拟杆菌CCFM1020具有下列性质：
1)具有低免疫原性，对小鼠血液及结肠组织中的免疫因子无显著性影响；
2)能够降低内毒素感染小鼠血液中促炎因子的含量，增加抑炎因子的浓度；
3)能够上调内毒素感染小鼠脾脏中Foxp3+调节性T细胞的数量；
4)能够稳定内毒素感染小鼠的肠道菌群组成。
菌体特征：革兰氏染色阴性杆状细菌，菌体约0.9-1.2μm宽，3-8μm长，无芽孢形成。
菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.3-2mm之间，正面形态圆形，侧面形态呈凸起状，边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑。
生长特性：该菌株为严格厌氧菌，对氧气敏感，在温度30-37℃生长最佳，最高和最低初始生长pH为8.0和5.0，最适初始生长pH为7.0。
本发明的第二个目的是提供所述脆弱拟杆菌CCFM1020在制备用于缓解内毒素感染的药物组合物方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述的药物组合物是由脆弱拟杆菌CCFM1020菌剂与在药学上可接受的载体组成。
在本发明的一种实施方式中，在药学上可接受的载体包括一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
在本发明的一种实施方式中，所述脆弱拟杆菌CCFM1020在药物组合物中重量是所述药物组合物重量的15-35％，或20-30％。
在本发明的一种实施方式中，所述的填充剂应该理解为用于增加片剂重量和体积而便于压片的辅料稀释剂，或以吸收原料中多余液体成分的辅料吸收剂。所述填充剂选自淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂应该理解为原料药物本身无粘性或粘性不足，需加入粘性物质以便于制粒。所述粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂应该理解为原料药物本身无粘性，但可润湿其药物原辅料并诱发其粘性而制成颗粒的液体。所述润湿剂选自水、乙醇、淀粉或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂应该理解为一种能够加入片剂中而促进其片剂在胃肠液中快速崩解成细小粒子的辅料。所述崩解剂选自羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂应该理解为一种有利于提高片剂在制粒过程中的流动性，有利于片剂脱模的化学物质。所述润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂应该理解为在药品中用以改善或屏蔽药物不良气味和味道的药用辅料。所述的矫味剂选自如单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆或樱桃糖浆的甜味剂；柠檬、茴香或薄荷油的芳香剂；海藻酸钠、***胶、明胶、甲基纤维素或羧甲基纤维素钠的胶浆剂；柠檬酸、酒石酸或碳酸氢钠混合物的泡腾剂。
在本发明的一种实施方式中，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型，单个剂型含有为达到所需药量的预定活性物质，例如本发明的脆弱拟杆菌CCFM1020菌剂。
本发明第三个目的是提供所述脆弱拟杆菌CCFM1020菌剂，所述菌剂是将含有所述脆弱拟杆菌CCFM1020的菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其他工艺制备所得到的粉剂，它含有106CFU/g以上的活性脆弱拟杆菌CCFM1020细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的脆弱拟杆菌CCFM1020菌剂含有至少106CFU/g的活性脆弱拟杆菌CCFM1020。
本发明的第四个目的是提供所述脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)CCFM1020的培养方法，是将所述脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)CCFM1020接种至培养基中，于35～37℃厌氧培养。
在本发明的一种实施方式中，培养12-18h菌株达稳定期。
在本发明的一种实施方式中，应用BHI培养基进行培养。
在本发明的一种实施方式中，所述BHI培养基中还加入半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K1 0.002g/L。
本发明的第五个目的是提供一种脆弱拟杆菌冻存剂，含有≥1010CFU/ml的脆弱拟杆菌CCFM1020。
在本发明的一种实施方式中，所述冻存剂是将脆弱拟杆菌CCFM1020处于稳定期的菌液用pH7.0～7.2的磷酸盐缓冲液清洗1-2次后，加入保护剂，于-80℃保存备用。
在本发明的一种实施方式中，所述保护剂含有1g/L半胱氨酸盐酸盐，200g/L甘油。
本发明的第六个目的是提供含有所述脆弱拟杆菌CCFM1020的非药物用途的组合物。
本发明还要求保护所述脆弱拟杆菌CCFM1020在食品、生物领域作为发酵微生物在生产产品方面的应用。
有益效果：本发明的脆弱拟杆菌CCFM1020具有低免疫原性，可显著将因内毒素感染而造成的小鼠血液中炎症因子的含量与脾脏中Foxp3+调节性T细胞的数量恢复至正常小鼠水平，并能够稳定内毒素感染小鼠的肠道菌群组成。所述的脆弱拟杆菌CCFM1020可用于制备能够缓解内毒素感染的药物组合物，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为小鼠灌胃脆弱拟杆菌CCFM1020后血液及结肠组织中免疫因子的浓度；
图2为脆弱拟杆菌CCFM1020对内毒素感染小鼠血液内免疫因子水平的调节作用，*表示脆弱拟杆菌CCFM1020组与内毒素造模组存在显著性差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图3为脆弱拟杆菌CCFM1020对内毒素感染小鼠脾脏内调节性T细胞含量的调节作用，*表示脆弱拟杆菌CCFM1020组与内毒素造模组存在显著性差异，**表示p<0.01；#表示内毒素感染组与对照组存在显著性差异，##表示p<0.01；
图4为脆弱拟杆菌CCFM1020对内毒素感染小鼠肠道菌群组成的调节作用。D1LPSCTRL:实验第一天内毒素感染组小鼠肠道菌群；D3LPSCTRL:实验第三天内毒素感染组小鼠肠道菌群；D5LPSCTRL:实验第五天内毒素感染组小鼠肠道菌群；D1LPSBF:实验第一天脆弱拟杆菌CCFM1020干预内毒素感染组小鼠肠道菌群；D3LPSBF:实验第三天脆弱拟杆菌CCFM1020干预内毒素感染组小鼠肠道菌群；D5LPSBF:实验第五天脆弱拟杆菌CCFM1020干预内毒素感染组小鼠肠道菌群。
生物材料保藏
一种Bacteroides fragilis，已于2018年3月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:60342。
具体实施方式
实施例1：脆弱拟杆菌CCFM1020的培养和保存
1、培养基的制备：配制脑心浸液BHI培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)，溶解于蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，混合均匀，然后调整其pH为7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述培养基。
2、培养方法：脆弱拟杆菌CCFM1020菌种按照以上述培养基的重量计2-4％接种量接种，在37℃下厌氧培养12-18h，可达稳定期。
3、保护剂的制备：称取半胱氨酸盐酸盐1g/L，甘油200g/L，均匀溶解于蒸馏水中，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述保护剂。
4、保存方法：将脆弱拟杆菌CCFM1020稳定期菌液用无菌的磷酸盐缓冲液(pH7.2)清洗1-2次后，用所述的保护剂重悬达到浓度1010CFU/ml，即得脆弱拟杆菌CCFM1020冻存剂，于-80℃保存备用。
实施例2：脆弱拟杆菌CCFM1020灌胃小鼠的耐受剂量实验
取6-8周龄健康雌性C57小鼠10只，每24小时灌胃一次0.1ml的实施例1制备的脆弱拟杆菌CCFM1020冻存剂(1010CFU/ml)，观察5日，记录小鼠体重及死亡状况。
结果如表1所示，喂食浓度为109CFU的脆弱拟杆菌CCFM1020未对小鼠造成明显影响，体重上升，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
表1：喂食109CFU的脆弱拟杆菌CCFM1020对小鼠体重的影响
实施例3：脆弱拟杆菌CCFM1020灌胃小鼠的免疫耐受实验
取6-8周龄健康雌性C57小鼠20只，随机分为两组：阴性对照组及脆弱拟杆菌CCFM1020干预组，每组含小鼠10只。脆弱拟杆菌CCFM1020干预组小鼠每24小时灌胃一次0.1ml的上述脆弱拟杆菌CCFM1020冻存剂(1010CFU/ml)，对照组小鼠则每24小时灌胃一次0.1ml上述冻存剂的保护剂，连续灌胃5天后处死所有小鼠，分别取血液及结肠组织经RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司产品)裂解匀浆后，采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定免疫因子的浓度。
实验结果如附图1所示，脆弱拟杆菌CCFM1020干预组小鼠血液中的免疫因子TNF-α、IL-6、IL-10及CXCL-2及结肠组织中的免疫因子sIgA及IgE的含量与对照组小鼠无明显差别。因此，实施例3结果表明本发明脆弱拟杆菌CCFM1020不会刺激小鼠的免疫***，具有低免疫原性。
实施例4：脆弱拟杆菌CCFM1020对内毒素感染小鼠血液中免疫因子水平的调节作用
取6-8周龄健康雌性C57小鼠30只，随机分为三组：阴性对照组，内毒素感染模型组及脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组，每组含小鼠10只。内毒素感染组及脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组小鼠每24小时腹腔注射一次0.1ml由生理盐水稀释的内毒素溶液(0.1mg/kg)，对照组及内毒素感染组小鼠则每24小时灌胃一次0.1ml实施例1制备的冻存剂的保护剂，脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组小鼠每24小时灌胃一次0.1ml的实施例1制备的含有脆弱拟杆菌CCFM1020冻存剂(1010CFU/ml)，连续5天后处死所有小鼠，取血液采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司产品)测定免疫因子的浓度。
实验结果如附图2所示，内毒素感染将小鼠血液中促炎因子TNF-α含量从522.93ng/L上升至566ng/L，而抑炎因子IL-10从686.83ng/L下降为567.68ng/L，而经过脆弱拟杆菌CCFM1020的治疗，显著性地降低了小鼠血液中TNF-α的含量，调整为450ng/L(p<0.05)，增加了IL-10的含量为692ng/L(p<0.01)，使得上述免疫因子达到正常小鼠水平。以上结果表明，本发明脆弱拟杆菌CCFM1020能够缓解内毒素感染造成的炎症反应。
实施例5：脆弱拟杆菌CCFM1020对内毒素感染小鼠脾脏中调节性T细胞含量的调节作用
取6-8周龄健康雌性C57小鼠30只，随机分为三组：阴性对照组，内毒素感染模型组及脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组，每组含小鼠10只。内毒素感染组及脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组小鼠每24小时腹腔注射一次0.1ml由生理盐水稀释的内毒素溶液(0.1mg/kg)，对照组及内毒素感染组小鼠则每24小时灌胃一次0.1ml上述冻存剂的保护剂，脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组小鼠每24小时灌胃一次0.1ml的上述脆弱拟杆菌CCFM1020冻存剂(1010CFU/ml)，连续5天后处死所有小鼠，取脾脏组织经红细胞裂解液裂解匀浆后，采用小鼠调节性T细胞染色试剂盒(eBioscience公司产品)标记CD4、CD25及表面分子Foxp3后，通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD公司)检测调节性T细胞的含量变化。
实验结果如附图3所示，内毒素感染显著减少了小鼠脾脏中Foxp3+调节性T细胞，从7.69％降至5.69％(p<0.01)，而经脆弱拟杆菌CCFM1020治疗后，小鼠脾脏中调节性T细胞含量显著性地提高至7.73％(p<0.01)，接近对照组小鼠水平。实施例5结果表明，本发明脆弱拟杆菌CCFM1020缓解内毒素感染造成的炎症反应。
实施例6：脆弱拟杆菌CCFM1020对内毒素感染小鼠肠道菌群组成的调节作用
取6-8周龄健康雌性C57小鼠30只，随机分为三组：阴性对照组，内毒素感染模型组及脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组，每组含小鼠10只。内毒素感染组及脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组小鼠每24小时腹腔注射一次0.1ml由生理盐水稀释的内毒素溶液(0.1mg/kg)，对照组及内毒素感染组小鼠则每24小时灌胃一次0.1ml上述冻存剂的保护剂，脆弱拟杆菌CCFM1020治疗组小鼠每24小时灌胃一次0.1ml的上述脆弱拟杆菌CCFM1020冻存剂(1010CFU/ml)，连续5天后处死所有小鼠。实验过程中，分别于第一天灌胃前、第三天及第五天灌胃后，取小鼠粪便，采用Fast DNA Spin Kit for Feces试剂盒(MP Biomedicals公司产品)提取粪便细菌宏基因组后，对16s V3-V4区序列进行PCR扩增后，通过二代测序仪粪便样品中肠道菌群的组成差异。
实验结果如附图4所示，内毒素感染小鼠肠道中拟杆菌门与厚壁菌门的含量分别为50％及40％，其中拟杆菌S24-7占42.7，乳杆菌12％，梭状杆菌8.2％，与结肠炎相关的Allobaculum的含量显著增加至10％，导致肠道菌群多样性的降低。而经过脆弱拟杆菌CCFM1020治疗后发现，小鼠粪便菌群中拟杆菌门与厚壁菌门的含量调整为60％及30％，其中拟杆菌、梭状杆菌与Allobaculum等变化幅度大大减小，分别占38.3％、8.7％及0.5％，并且乳杆菌含量有升高，约为15％。因此实施例6结果表明，本发明脆弱拟杆菌CCFM1020拟杆菌能够削弱了LPS对肠道菌群的改变，提高肠道菌群的多样性，稳定肠道菌群的平衡，从而预防因内毒素引起肠道菌群失调而可能导致的一系列疾病。
以上实例表明，本发明脆弱拟杆菌CCFM1020能够辅助缓解内毒素感染对小鼠造成的肠道菌群组成及免疫应答失调。
实施例7：制备含有本发明脆弱拟杆菌CCFM1020的胶囊制品
将本发明的脆弱拟杆菌CCFM1020在BHI培养基中于37℃厌氧培养24小时，在4℃于5000rpm条件下离心15min，用无菌的磷酸盐缓冲液(pH 7.2)冲洗1-2次，使用上述保护剂重悬菌体使菌体终浓度达到1010CFU/ml。将菌悬液加入海藻酸钠溶液中，充分搅拌使得细胞均匀分散于海藻酸钠溶液中，然后将此混合液挤压到氯化钙溶液中形成胶粒，静止固化30min，过滤收集胶粒，将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48小时，得到含本发明脆弱拟杆菌CCFM1020粉剂，将该粉剂装入市售的药用胶囊，即得所述的胶囊制品。
实施例8：利用本发明脆弱拟杆菌CCFM1020制备片剂
分别称取采用冷冻干燥方法制备的本发明脆弱拟杆菌CCFM1020菌粉制剂25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，混合，采用常规方法制成湿颗粒，然后使用中南制药机械厂生产的压片机进行压片，使用青州市益康中药机械有限公司生产的小型药物干燥机进行干燥，再包装得到本发明的片剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，已于2018年3月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:60342。
2.权利要求1所述的脆弱拟杆菌在制备用于缓解内毒素感染的药物组合物方面的应用。
3.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的脆弱拟杆菌CCFM1020和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述在药学上可接受的载体包括一种或多种选自药学上通常使用的填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂的载体。
5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物是颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
6.根据权利要求3～5任一所述的药物组合物，其特征在于，含有≥106CFU/ml或≥106CFU/g脆弱拟杆菌CCFM1020。
7.含有权利要求1所述脆弱拟杆菌的菌剂，其特征在于，是将所述脆弱拟杆菌通过常规冷冻干燥工艺制备或其他工艺制备所得到的粉剂，含有106CFU/g以上的活性脆弱拟杆菌CCFM1020细胞。
8.一种脆弱拟杆菌冻存剂，其特征在于，含有≥1010CFU/ml的脆弱拟杆菌CCFM1020。
9.根据权利要求8所述的冻存剂，其特征在于，将权利要求1所述的脆弱拟杆菌处于稳定期的菌液用pH7.0～7.2的磷酸盐缓冲液清洗1-2次后，加入保护剂；所述保护剂含有1g/L半胱氨酸盐酸盐及200g/L甘油。
10.权利要求1所述的脆弱拟杆菌在非医药用途方面的应用。
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