CN108579699B

CN108579699B - 吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料及制备方法

Info

Publication number: CN108579699B
Application number: CN201810345242.2A
Authority: CN
Inventors: 温永强; 黄垚; 袁志鹏
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN108579699A

Abstract

本发明主要属于生物医用材料技术领域，具体涉及用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料及其制备方法。所述三维纳米纤维海绵吸附材料由经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维均匀分布组成，所述三维纳米纤维海绵吸附材料均匀修饰有多粘菌素B。本发明提供的所述三维纳米纤维海绵吸附材料比表面积大、孔隙率高、吸附位点多，对细菌内毒素吸附选择性强，吸附率高。

Description

吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料及制备方法

技术领域

本发明主要属于生物医用材料技术领域，具体涉及用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料及其制备方法。

背景技术

细菌内毒素，又称脂多糖(LPS)，广泛存在于自然界中，与蛋白质和磷脂共同构成革兰氏阴性细菌的外膜。内毒素由类脂A，核心多糖和O-特异性多糖链3部分组成，显示出亲水性和疏水性。内毒素具有很强的热稳定性，其生物活性不会受到破坏，除非在160℃下至少2个小时。内毒素进入血液时，会出现发热，心动过速，白细胞减少，骨髓坏死，低血压，弥漫性血管内凝血(DIC)，甚至脓毒血症等不良反应。内毒素刺激单核巨噬细胞和多形核白细胞，通过与特异性受体CD14结合，产生并释放TNF，IL-1，IL-6，IL-8等细胞因子，导致全身炎症反应综合征，进而导致脓毒症，引发多器官功能衰竭，最终导致死亡。

内毒素血症常用方法为抗生素药物治疗和血液净化，与药物治疗相比，血液净化法不会引入新的物质，因而具有更大的发展潜力。血液灌流是血液净化最常用的方法之一，其基本原理为当血液通过血液灌流柱时，内毒素将被选择性去除，而后流回人体。自体血液循环净化备受人们的关注。

多粘菌素B是一种多肽类抗生素，与细菌内毒素能特异性结合，选择性良好，因而人们期望将其用于细菌内毒素的去除。但是多粘菌素B具有神经毒性和肾毒性，因此不能直接用于内服或静脉注射，这极大地限制的它在临床上的应用，因此人们期望将它固定到吸附剂上，进行体外吸附。

到目前为止，常用的多粘菌素B载体有聚苯乙烯纤维、聚苯乙烯微球、氯甲基的聚苯乙烯-二乙苯烯微球、交联纤维素微球、琼脂糖凝胶、多粘菌素B纤维柱(PMX-F)等，但是这些载体材料对多粘菌素B的固定量比较低。其中，多粘菌素B纤维柱(PMX-F)是临床上应用最广泛的一种，其中，PMX-F上固定的多粘菌素B的氨基末端与α-氯乙酰胺-甲基聚苯乙烯纤维共价结合，能选择性去除细菌内毒素。但是PMX-F价格昂贵，大多数患者不能承担高额的治疗费用；此外，PMX-F结构致密，在去除细菌内毒素的同时，也会导致血浆蛋白的大量损失。因此，研发廉价、高效、高通量、高选择性的内毒素吸附剂以满足临床应用的需求就显得尤为重要。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提出一种用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，所述三维纳米纤维海绵吸附材料比表面积大、孔隙率高、吸附位点多，能够特异性吸附细菌内毒素。

本发明是通过以下技术方案实现的：

用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，所述三维纳米纤维海绵吸附材料包括经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维，两种纳米纤维均匀分布，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维上均匀修饰有多粘菌素B；

经过修饰改性的所述功能性聚丙烯腈纳米纤维的表面覆盖有羧基，能够提高所述功能性聚丙烯腈纳米纤维对多粘菌素B的固定量。

进一步地，在所述三维纳米纤维海绵吸附材料中，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维和所述二氧化硅纳米纤维质量比为1～2:1。

进一步地，所述三维纳米纤维海绵吸附材料为多级孔结构，孔隙率为90～95％。

进一步地，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维是通过对聚丙烯腈纳米纤维依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化修饰改性制备获得。

一种所述用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：

制备聚丙烯腈纳米纤维膜和二氧化硅纳米纤维膜；

对所述聚丙烯腈纳米纤维膜依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化，获得经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维；

将所述二氧化硅纳米纤维膜和所述功能性聚丙烯腈纳米纤维混合、均质乳化，将乳化后混合液冷冻成型、冷冻干燥，然后置于马弗炉中进行原位交联，得到三维纳米纤维气凝胶；

将所述三维纳米纤维气凝胶置于EDC/NHS溶液中，于室温下振荡，洗涤，以活化所述三维纳米纤维气凝胶中的羧基；

将羧基活化后的三维纳米纤维气凝胶置于多粘菌素B溶液中，于室温下振荡反应，得到所述用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料。

进一步地，对所述聚丙烯腈纳米纤维膜依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化，具体方法为：

将制备获得的所述聚丙烯腈纳米纤维膜置于质量分数为18～24％的氢氧化钠溶液中，于60～70℃下反应2～3h，至纤维膜呈橘黄色后取出，用水充分洗涤后置于质量分数为4～6％盐酸中，反应10～12h，至纤维膜呈白色后，干燥处理，获得所述功能性聚丙烯腈纳米纤维。

进一步地，利用所述二氧化硅纳米纤维膜和所述功能性聚丙烯腈纳米纤维制备三维纳米纤维气凝胶的方法具体为：

将所述二氧化硅纳米纤维膜和所述功能性聚丙烯腈纳米纤维以质量比1～2:1混合，以叔丁醇和水的混合溶液为溶剂，按溶质(g)：溶剂(mL)＝1：100～200置于柱形容器中均质乳化；将乳液倒入模具中，将模具置于-20℃冰箱中冷冻成型；成型后将模具置于真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，而后置于马弗炉中于235～240℃下原位交联2～3h，升温速度为10～15℃/min，得到三维纳米纤维气凝胶。其中，所述叔丁醇和水的混合溶液中，叔丁醇：水＝1:4。

一种所述三维纳米纤维海绵吸附材料的应用方法，将所述三维纳米纤维海绵吸附材料应用于去除细菌内毒素。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料对生理盐水中细菌内毒素的去除率为99.1％～99.9％；对人血浆中细菌内毒素的去除率为 90.2～95.3％，对血浆蛋白回收率为76.3～82.4％；对牛血清蛋白溶液中细菌内毒素的去除率为93.3～97.8％，对牛血清蛋白回收率为 72.9～87.5％。

本发明的有益技术效果：

1)本发明所提供的用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料具有比表面积高、孔隙率大的优点，经功能修饰后，其吸附位点多，对细菌内毒素吸附选择性强，吸附率高。

2)本发明所使用的聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维能够通过静电纺丝法获得，成本低廉。

3)本发明所提供的修饰多粘菌素B过程工艺简单，条件可控；可用于人血浆及生物制品中细菌内毒素的吸附，并且对血浆蛋白回收率高，能够达到76.3～82.4％。

4)本发明所提供的三维纳米纤维海绵吸附材料孔隙率大，因而其流动通量大，流动循环时间少，能通过大量蛋白，因为其蛋白回收率高。

附图说明：

图1为本发明实施例中用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料的结构示意图；

图2为本发明实施例中用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料的扫描电子显微镜照片；

附图标记：1.功能性聚丙烯腈纳米纤维；2.二氧化硅纳米纤维； 3.多粘菌素B。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

实施例1

如图1所示，一种用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，所述三维纳米纤维海绵吸附材料包括经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维1和二氧化硅纳米纤维2，两种纳米纤维均匀分布，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维上均匀修饰有多粘菌素B3；

经过修饰改性的所述功能性聚丙烯腈纳米纤维的表面覆盖有大量的羧基，能够提高所述功能性聚丙烯腈纳米纤维对多粘菌素B的固定量。

所述功能性聚丙烯腈纳米纤维是通过对聚丙烯腈纳米纤维依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化修饰改性制备获得。聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维均能够通过静电纺丝法制备，通过静电纺丝法制备的纳米纤维，直径小，具备较大的比表面积。

在所述三维纳米纤维海绵吸附材料中，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维和所述二氧化硅纳米纤维质量比为2:1。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料的底面直径为1.12cm，高度为 0.88cm。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料为多级孔结构，孔隙率为93％。所述三维纳米纤维海绵吸附材料对生理盐水中细菌内毒素的去除率为99.2％。

实施例2

一种用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，所述三维纳米纤维海绵吸附材料包括经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维，两种纳米纤维均匀分布，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维上均匀修饰有多粘菌素B；

所述功能性聚丙烯腈纳米纤维是通过对聚丙烯腈纳米纤维依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化修饰改性制备获得。聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维均能够通过静电纺丝法制备。

在所述三维纳米纤维海绵吸附材料中，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维和所述二氧化硅纳米纤维质量比为1:1。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料的底面直径为1.32cm，高度为 0.98cm。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料为多级孔结构，孔隙率为95％。所述三维纳米纤维海绵吸附材料对生理盐水中细菌内毒素的去除率为98.7％。

实施例3

所述三维纳米纤维海绵吸附材料的底面直径为1.07cm，高度为 0.67cm。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料对人血浆中细菌内毒素的去除率为93.6％。

实施例4

所述三维纳米纤维海绵吸附材料的底面直径为1.08cm，高度为 0.76cm。

所述三维纳米纤维海绵吸附材料对牛血清蛋白溶液中细菌内毒素的去除率为96.6％，蛋白质回收率为73.4％。

实施例5

本实施例提供一种用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料的制备方法，所述方法具体为：

1)制备聚丙烯腈纳米纤维膜和二氧化硅纳米纤维膜；

聚丙烯腈纳米纤维膜的制备：以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂配制质量分数为10～12％的聚丙烯腈溶液，搅拌至完全溶解，静置脱泡；将溶液置于静电纺丝仪盛液器中，以无纺布为接收基底静电纺丝，静电纺丝条件为：纺丝电压为15～30kV，接收距离为15～20cm，纺丝温度为25～30℃，空气湿度为25～40％，制备成膜后剪碎，待用；

二氧化硅纳米纤维膜的制备：以去离子水为溶剂配制质量分数为 10％的聚乙烯醇溶液，80℃水浴加热，搅拌溶解，静置冷却脱泡；以去离子水为溶剂配制质量分数为50％的正硅烷四乙酯溶液，室温下搅拌水解过夜；将聚乙烯醇溶液和正硅烷四乙酯混合搅拌均匀，置于静电纺丝仪盛液器中，以无纺布为接收基底静电纺丝，纺丝条件为：纺丝电压为25～30kV，接收距离为15～20cm，纺丝温度为25～30℃，空气湿度为25～40％，制备成膜后置于马弗炉中于800℃下灼烧2h，升温速度为10℃/min，制备成二氧化硅纳米纤维膜后剪碎，待用；

2)对所述聚丙烯腈纳米纤维膜依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化，获得经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维；

将制备获得的所述聚丙烯腈纳米纤维膜置于质量分数为20～25％的氢氧化钠溶液中，于60～70℃下反应2～3h，至纤维膜呈橘黄色后取出，用水充分洗涤后置于质量分数为4～6％盐酸中，反应10～12h，至纤维膜呈白色后，干燥处理，获得所述功能性聚丙烯腈纳米纤维。

聚丙烯腈纳米纤维上含有大量氰基，氰基经氢氧化钠氧化后可氧化为羧酸钠，再经盐酸质子化，用氢离子置换出钠离子，从而使氰基氧化为羧基，因而使制备获得的功能性聚丙烯腈纳米纤维表面覆盖大量羧基。

3)将所述二氧化硅纳米纤维膜和所述功能性聚丙烯腈纳米纤维混合、均质乳化，将乳化后混合液冷冻成型、冷冻干燥，然后置于马弗炉中进行原位交联，得到三维纳米纤维气凝胶；

具体为：将所述二氧化硅纳米纤维膜和所述功能性聚丙烯腈纳米纤维以质量比1～2:1混合，以叔丁醇和水的混合溶液为溶剂，按溶质 (g)：溶剂(mL)＝1：100～200置于柱形容器中均质乳化；将乳液倒入模具中，将模具置于-20℃冰箱中冷冻成型；成型后将模具置于真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，而后置于马弗炉中于235～245℃下原位交联 2h，升温速度为10～15℃/min，得到三维纳米纤维气凝胶。其中，所述叔丁醇和水的混合溶液中，叔丁醇：水＝1:4。

其中，将乳液冷冻成型后置于真空冷冻干燥机中，凝固的溶剂以升华的方式成为气体被抽走，使得三维纳米纤维气凝胶内部成为多级孔结构，从而具有较大孔隙率。将三维纳米纤维气凝胶放进马弗炉中，加热使纤维结点原位熔融交联，从而使其物理状态稳定，具有较大弹性。

4)将所述三维纳米纤维气凝胶置于EDC/NHS溶液中，于室温下振荡，洗涤，以活化所述三维纳米纤维气凝胶中的羧基；

5)将羧基活化后的三维纳米纤维气凝胶置于多粘菌素B溶液中，于室温下振荡反应，得到所述用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料。

由于功能性聚丙烯腈纳米纤维表面覆盖有大量羧基，反应基团密度大，活性位点多；表面的羧基经EDC/NHS活化后能生成活泼酯，并与多粘菌素B发生取代反应，从而将多粘菌素B固定到聚丙烯腈纤维表面。一般载体材料如交联纤维素微球、琼脂糖凝胶等，对多粘菌素B的固定量为17～25mg/g，而本实施例提供的三维纳米纤维海绵吸附材料对多粘菌素B的固定量为98～110mg/g，因此，选用三位纳米纤维海绵吸附材料作为多粘菌素B的载体材料能极大地增大多粘菌素B的固定量，进一步提高所述材料对细菌内毒素的吸附率。

Claims

1.一种用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以N ,N-二甲基甲酰胺为溶剂配制质量分数为10~12%的聚丙烯腈溶液，搅拌至完全溶解，静置脱泡；将溶液置于静电纺丝仪盛液器中，以无纺布为接收基底静电纺丝，静电纺丝条件为：纺丝电压为15~30kV，接收距离为15~20cm，纺丝温度为25~30℃，空气湿度为25~40%，制备成聚丙烯腈纳米纤维膜后剪碎，待用；

以去离子水为溶剂配制质量分数为10%的聚乙烯醇溶液，80℃水浴加热，搅拌溶解，静置冷却脱泡；以去离子水为溶剂配制质量分数为50%的正硅烷四乙酯溶液，室温下搅拌水解过夜；将聚乙烯醇溶液和正硅烷四乙酯混合搅拌均匀，置于静电纺丝仪盛液器中，以无纺布为接收基底静电纺丝，纺丝条件为：纺丝电压为25~30kV，接收距离为15~20cm，纺丝温度为25~30℃，空气湿度为25~40%，制备成膜后置于马弗炉中于800℃下灼烧2h，升温速度为10℃/min，制备成二氧化硅纳米纤维膜后剪碎，待用；

将制备获得的所述聚丙烯腈纳米纤维膜置于质量分数为18~24%的氢氧化钠溶液中，于60~70℃下反应2~3h，至纤维膜呈橘黄色后取出，用水充分洗涤后置于质量分数为4~6%盐酸中，反应10~12h，至纤维膜呈白色后，干燥处理，获得功能性聚丙烯腈纳米纤维；

将所述二氧化硅纳米纤维膜和所述功能性聚丙烯腈纳米纤维以质量比1~2:1混合，以叔丁醇和水的混合溶液为溶剂，按溶质(g)：溶剂(mL)=1：100~200置于柱形容器中均质乳化；将乳液倒入模具中，将模具置于-20℃冰箱中冷冻成型；成型后将模具置于真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，而后置于马弗炉中于235~240℃下原位交联2~3h，升温速度为10~15℃/min，得到三维纳米纤维气凝胶；其中，所述叔丁醇和水的混合溶液中，叔丁醇：水=1:4；

2.用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，其特征在于，所述三维纳米纤维海绵吸附材料采用根据权利要求1所述的制备方法制备获得，

所述三维纳米纤维海绵吸附材料包括经修饰改性的功能性聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维，两种纳米纤维均匀分布，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维上均匀修饰有多粘菌素B；

经过修饰改性的所述功能性聚丙烯腈纳米纤维的表面覆盖有羧基，能够提高所述功能性聚丙烯腈纳米纤维对多粘菌素B的固定量，

其中，聚丙烯腈纳米纤维和二氧化硅纳米纤维能够通过静电纺丝法获得。

3.根据权利要求2所述用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，其特征在于，在所述三维纳米纤维海绵吸附材料中，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维和所述二氧化硅纳米纤维质量比为1~2:1。

4.根据权利要求3所述的用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，其特征在于，所述三维纳米纤维海绵吸附材料为多级孔结构，孔隙率为90~95%。

5.根据权利要求2所述的用于吸附细菌内毒素的三维纳米纤维海绵吸附材料，其特征在于，所述功能性聚丙烯腈纳米纤维是通过对聚丙烯腈纳米纤维依次进行氢氧化钠氧化和盐酸质子化修饰改性制备获得。

6.一种权利要求2-5任一项所述三维纳米纤维海绵吸附材料的应用方法，其特征在于，将所述三维纳米纤维海绵吸附材料应用于去除细菌内毒素；所述三维纳米纤维海绵吸附材料对生理盐水中细菌内毒素的去除率为99.1%~99.9%；对人血浆中细菌内毒素的去除率为90.2~95.3%，对血浆蛋白回收率为76.3~82.4%；对牛血清蛋白溶液中细菌内毒素的去除率为93.3~97.8%，对牛血清蛋白回收率为72.9~87.5%。