CN108855003B - 一种用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂及其制备方法，本发明依据炎性因子如IL‑6、TNF‑α、IL‑1β和IL‑8的抗原表位及与其相对应的受体之间的多种分子间作用力，通过计算机辅助药物设计方法，设计了具有选择性的5‑18个氨基酸的小分子多肽的亲和配基，具体以乙酸乙烯酯‑三烯丙基异氰脲酸酯为基本骨架，以乙酸乙酯和烷烃混合物为致孔剂，以过氧化苯甲酰为引发剂的合成树脂为载体，经过醇解活化后接枝小分子多肽，得到小分子配基免疫吸附剂，而不吸附大分子蛋白等。该免疫吸附剂制备简单，具有高的吸附量、高的选择性、良好的生物和血液相容性、且成本相对低廉，为清除患者体内过量的致病性炎症因子提供了一种新的治疗方法。

Description

一种用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域。具体涉及一种新颖的医用免疫吸附剂，特别是适用于血液灌流清除体内炎性因子的免疫吸附剂及其制备方法。
技术背景：
炎症是最基本的病理变化之一，在炎症发生发展过程中，可刺激机体炎性细胞(如中性白细胞、巨噬细胞、内皮细胞等)释放多种细胞因子，从而引起全身炎性反应，甚至引起脓毒血症和败血症性休克。全世界每年有超过1800万人患有脓毒血症，在我们国家由于抗生素滥用、空气质量变差、水污染等，每年脓毒血症患者也高达数百万，并且数据显示脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因症。
血浆灌流技术可以有效的去除血液中聚集的大量毒素及细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8等)是治疗炎症的新出路。血液灌流是血液借助体外循环，通过血液灌流器中具有特殊吸附功能的吸附剂除去病人血液中的内源性或外源性毒物或致病物质，从而达到血液净化的一种治疗技术。血液灌流技术由于过敏反应微弱，适应性广，治疗成本低，成为极具发展潜力的血液净化技术。血液灌流技术的核心就是吸附材料的使用，吸附材料不仅应对人体安全无毒、无过敏反应，不引起热源，而且具有稳定的化学性质、不破碎、不易脱落和良好的血液相容性等使用要求，因而，吸附材料的发展决定血液灌流器的应用和推广。因此，开发一种能有效清除血液中的致病毒素和炎症因子的免疫吸附剂，同时也具有相对低廉的成本，不仅可以提高患者的生活质量、减轻经济负担，而且可以带来巨大的经济效应和社会价值。
目前，在国外已被成功应用于临床的对炎症因子进行清除的吸附剂有日本的多粘菌素B吸附剂和美国的Cytosorb吸附剂，但多粘菌素B吸附剂，产品价格高昂，且存在配基脱落及毒性问题，Cytosorb吸附剂，对于中分子的细胞因子如(IL-6、IL-1β和IL-8等)具有较好的清除效果，但对分子量较大的TNF-α清除效果较低，并且两种吸附剂均未进入我国市场。在我国，相关的专利如201310593832.4是以纤维素、琼脂糖、或聚乙烯醇球为载体，以疏水性的烷基苯胺为配基制成吸附剂，专利201610880603.4是以纳米碳酸钙-苯乙烯-二乙烯苯为基本骨架，制成的纳米复合微球吸附剂。这两种吸附剂虽取得了不错的体外吸附效果，但主要还是靠疏水作用来清除毒素，存在着选择性不高的缺点，可能在清除毒素的同时也清除掉了对体内有益的物质。
综上，有必要开发出一种具有特异选择性的、高吸附性能的、价格低廉的免疫吸附剂来用于血液灌流。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种新型的具有良好的血液、生物相容性、较高的吸附性能，同时，由于配基的高选择性，可以有效地避免非特异性吸附，且成本相对低廉，可用于血液灌流清除患者体内过量的致病性炎性因子的免疫吸附剂及其制备方法，可用于血液灌流吸附剂。
本发明提供的用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂，是一种由亲水性载体和配基组成的免疫吸附剂，是以聚乙烯醇微球为载体，以小分子多肽为亲和配基，以环氧氯丙烷为交联剂，使配基与载体通过共价偶联，而制成的新型选择性的患者血液或血浆中的过量的致病性炎症因子的吸附剂。所述免疫吸附剂中，载体环氧量为80-120μmoL/mL，优选90-110μmoL/mL；小分子多肽固载量为50-90μmoL/mL，优选60-80μmoL/mL。
所述的亲水性聚乙烯醇载体为球形，粒度在100-500μm之间，优选200-400μm；比表面积在20-100m2/g之间，优选30-80m2/g；孔体积在1.05-6.8cm3/g之间，优选1.89-4.85cm3/g。
所述的小分子多肽的组成包括，提供疏水作用的苯丙氨酸(F)和异亮氨酸(I)中的至少一种；包括提供氢键作用的组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)中的至少一种；包括提供静电作用的天冬氨酸(N)和谷氨酸(E)中的至少一种，以及同时将不同作用位点之间用不同长度的丙氨酸(A)进行连接，所筛选的小分子多肽的亲和配基包括：FAHAN、IAHAN、FIAHYANN、FFAAHHAE、IIAAHHAE、FFAAYYAAEE、IIAAYYAAEE、FAIAHAYASATANAE或FIAAHHAAYYAANNAAEE等，优选FAHAN、FFAAYYAAEE或FIAAHHAAYYAANNAAEE。
本发明提供的一种用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂的制备方法，包括以下步骤：
第1步、聚乙烯醇载体微球的合成；
将单体乙酸乙烯酯与交联剂三烯丙基异氰脲酸酯按重量比1.5-5.5:1混合均匀，再按体积比加入占单体和交联剂1.2-5倍的致孔剂，致孔剂由质量比为0.2-1：1：0.6-1的乙酸乙酯、正庚烷和正己烷组成，按质量比加入占反应单体、交联剂和致孔剂总质量0.3％-1％的引发剂过氧化苯甲酰，搅拌使其混合均匀，得到油相；然后将该油相体系溶液加入到质量百分比为0.5％-3％的聚乙烯醇的水相中，水相中含质量分数为1％-10％的NaCl；其中油相和水相的质量比为1：1.5-3，调节搅拌速率，使体系分散成均匀的小油珠，升温至50-60℃后，反应3-6h后，然后继续升温至70-80℃反应3-6h，过滤，反应体系经过滤、热水洗涤的后处理后，然后用甲醇抽提12-36h后除去致孔剂，真空干燥24-48h得白色共聚物微球后加入到质量分数为1％-5％的NaOH/甲醇溶液中，在40-60℃下进行24-72h的酯交换，过滤后，用甲醇抽提12-36h后，自然晾干后得到聚乙烯醇载体微球；
第2步、载体微球的环氧化；
用已知的试剂和方法对上步得到的聚乙烯醇载体微球进行环氧化，环氧化后用乙醇及去离子水洗涤至中性，4℃保存备用，既得环氧化的聚乙烯醇载体微球，所述载体微球的环氧量为80-120μmoL/mL，优选90-110μmoL/mL；
第3步、环氧化载体微球偶联配基；
将小分子多肽溶于0.1M，pH＝9.8的Na2CO3-NaHCO3缓冲液中，再加入第2步得到的环氧化后的聚乙烯醇载体微球，其中小分子多肽的质量：缓冲液的体积：聚乙烯醇载体微球的质量＝0.1-0.8g：1.5mL：0.1g；在37-50℃下振荡反应12-24h，抽滤，用去离子水淋洗至中性。然后加入到60.6mg/mL的Tris溶液中，其中Tris溶液的体积：聚乙烯醇载体微球的质量＝2.2-3.5mL：1g，于37-50℃下振荡反应5-8h，抽滤，用去离子水淋洗至中性，4℃保存备用，既得血液灌流用清除炎性因子的免疫吸附剂，所述小分子多肽固载量为50-90μmoL/mL，优选60-80μmoL/mL。
本发明聚乙烯醇微球的环氧化是通过文献可知的方法和反应条件活化偶联，环氧活化后再固载配基。
本发明提供的免疫吸附剂可用于血浆或全血灌流清除患者体内过量的致病性炎性因子；所述炎性因子包括IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8。
本发明的优点和有益效果
本发明依据细胞因子如IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8的抗原表位及与其相对应的受体之间的多种分子间作用力，通过计算机辅助药物设计方法，设计了具有选择性的5-18个氨基酸的小分子多肽的亲和配基，制备了有效的特异性去除血液中炎性因子的小分子多肽配基免疫吸附剂。该免疫吸附剂具有良好的血液和生物相容性好，具有较高的吸附性能，同时，由于配基的高选择性，可以有效地避免非特异性吸附(如大分子蛋白)，且成本相对低廉，可用于血液灌流清除患者体内过量的致病性炎症因子。
附图说明
图1吸附剂对病人血清中静态IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8和总蛋白的吸附测定。
具体实施方式
实施例1
(1)聚苯乙烯微球的制备
将单体53g乙酸乙烯酯与交联剂10g三烯丙基异氰脲酸酯加入到250mL的烧杯中混合均匀后，再向其中加入35.2g乙酸乙酯、35.9g正庚烷、23.4g正己烷和0.6g的过氧化苯甲酰，搅拌使其溶解，待溶解完全后，充分混均，得到油相。然后将该体系溶液加入到252mL2.8％的聚乙烯醇溶液(其中含1.2％的NaCl)，调节搅拌速率，使体系分散成均匀的小油珠，升温至52℃后，反应5.5h后，然后继续升温至79℃反应3.5h，过滤，反应体系经过滤、热水洗涤后处理后，然后用甲醇抽提16h后除去致孔剂，真空干燥36h得白色共聚物微球后加入到1.2％的NaOH/甲醇溶液中，在40℃下进行72h的酯交换，过滤后，用甲醇抽提12h后，自然晾干后得到醇解后的聚乙烯醇载体微球。粒度在200-400μm之间，比表面积为58m2/g，孔体积为4.26cm3/g。
(2)载体微球的环氧化
取步骤(1)制备的聚乙烯醇载体微球20g(干重)，加入到装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，向反应器中加入200mL二甲基亚砜、160mL环氧氯丙烷和10mL 3moL/L的NaOH溶液，40℃下振荡反应5h，抽滤，用乙醇及去离子水洗涤至中性，4℃保存备用，载体微球的环氧量为106.8μmoL/mL。
(3)环氧化载体微球偶联配基
取步骤(2)环氧化后的聚乙烯醇载体微球10g加入到150mLFAHAN溶液中(10gFAHAN溶于150mL 0.1M，pH＝9.8的Na2CO3-NaHCO3缓冲液)中，37℃下振荡反应24h，抽滤，用去离子水淋洗至中性。然后加入到33mL 60.6mg/mL的Tris溶液中，50℃下振荡反应5h，抽滤，用去离子水淋洗至中性，4℃保存备用，既得血液灌流用清除炎性细胞因子的免疫吸附剂，多肽固载量为75.4μmoL/mL，编号为PVA-1。
实施例2
(1)聚苯乙烯微球的制备
将单体62.6g乙酸乙烯酯与交联剂17.4g三烯丙基异氰脲酸酯加入到500mL的烧杯中混合均匀后，再向其中加入84.5g乙酸乙酯、153.6g正庚烷、145.9g正己烷和4.64g的过氧化苯甲酰，搅拌使其溶解，待溶解完全后，充分混均，得到油相。然后将该体系溶液加入到1299.2mL 0.65％的聚乙烯醇溶液(其中含9.6％的NaCl)，调节搅拌速率，使体系分散成均匀的小油珠，升温至59℃后，反应3.5h后，然后继续升温至72℃反应5h，过滤，反应体系经过滤、热水洗涤后处理后，然后用甲醇抽提28h后除去致孔剂，真空干燥24h得白色共聚物微球后加入到4.9％的NaOH/甲醇溶液中，在60℃下进行24h的酯交换，过滤后，用甲醇抽提36h后，自然晾干后得到醇解后的聚乙烯醇载体微球。粒度在200-400μm之间，比表面积为72.3m2/g，孔体积为4.52cm3/g。
(2)载体微球的环氧化
取步骤(1)制备的聚乙烯醇载体微球20g(干重)，加入到装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，向反应器中加入200mL二甲基亚砜、160mL环氧氯丙烷和10mL 3moL/L的NaOH溶液，40℃下振荡反应5h，抽滤，用乙醇及去离子水洗涤至中性，4℃保存备用，既得环氧化的聚乙烯醇载体微球，环氧量为102.4μmoL/mL。
(3)环氧化微球偶联配基
取步骤(2)环氧化后的聚乙烯醇载体微球5g加入到75mLFFAAYYAAEE溶液中(26gFFAAYYAAEE溶于75mL 0.1M，pH＝9.8的Na2CO3-NaHCO3缓冲液)中，45℃下振荡反应16h，抽滤，用去离子水淋洗至中性。然后加入到12.5mL 60.6mg/mL的Tris溶液中，37℃下振荡反应8h，抽滤，用去离子水淋洗至中性，4℃保存备用，既得血液灌流用细胞因子的免疫吸附剂，多肽固载量为73.9μmoL/mL，编号为PVA-2。
实施例3
(1)聚苯乙烯微球的制备
将单体49.2g乙酸乙烯酯与交联剂30.8g三烯丙基异氰脲酸酯加入到500mL的烧杯中混合均匀后，再向其中加入29.6g乙酸乙酯、118.2g正庚烷、92.2g正己烷和2.08g的过氧化苯甲酰，搅拌使其溶解，待溶解完全后，充分混均，得到油相。然后将该体系溶液加入到740.8mL 1.7％的聚乙烯醇溶液(其中含5.2％的NaCl)，调节搅拌速率，使体系分散成均匀的小油珠，升温至55℃后，反应4.5h后，然后继续升温至76℃反应4.5h，过滤，反应体系经过滤、热水洗涤后处理后，然后用甲醇抽提36h后除去致孔剂，真空干燥12h得白色共聚物微球后加入到2.6％的NaOH/甲醇溶液中，在50℃下进行48h的酯交换，过滤后，用甲醇抽提24h后，自然晾干后得到醇解后的聚乙烯醇载体微球。粒度在200-400μm之间，比表面积为68.2m2/g，孔体积为4.15cm3/g。
(2)载体微球的环氧化
取步骤(1)制备的聚乙烯醇载体微球20g(干重)，加入到装有搅拌器和温度计的三口烧瓶中，向反应器中加入200mL二甲基亚砜、160mL环氧氯丙烷和10mL 3moL/L的NaOH溶液，40℃下振荡反应5h，抽滤，用乙醇及去离子水洗涤至中性，4℃保存备用，既得环氧化的聚乙烯醇载体微球，环氧量为95.2μmoL/mL。
(3)环氧化微球偶联配基
取步骤(2)环氧化后的聚乙烯醇载体微球8g加入到120mL FIAAHHAAYYAANNAAEE溶液中(60g FIAAHHAAYYAANNAAEE溶于120mL 0.1M，pH＝9.8的Na2CO3-NaHCO3缓冲液)中，50℃下振荡反应12h，抽滤，用去离子水淋洗至中性。然后加入到22.4mL 60.6mg/mL的Tris溶液中，45℃下振荡反应6.5h，抽滤，用去离子水淋洗至中性，4℃保存备用，既得血液灌流用细胞因子的免疫吸附剂，多肽固载量为68.4μmoL/mL，编号为PVA-3。
实施例4
吸附剂对脓毒症患者血清中吸附混合细胞因子的静态吸附试验
取实施例1、2、3中吸附剂PVA-1、PVA-2、PVA-3为实验组，以Cytosorb(美国Cytosorbents公司购买)树脂为阳性对照组，分别各取0.3mL于离心管中，加入3mL脓毒症患者的血清样品(样品中IL-6浓度约为1258.34pg/L，TNF-α浓度约为514.98pg/L，IL-1β浓度约为1092.41pg/L，IL-8浓度约为3149.59pg/L)，封口膜密封，于空气摇床中，37℃震荡吸附2h。吸附完成后，1000rpm/min离心1min，离心，取上层液测定其浓度。
吸附结果见附图1。
实施例5
吸附剂对脓毒症患者血清中总蛋白的测定
取实施例1、2、3中吸附剂PVA-1、PVA-2、PVA-3为实验组，以Cytosorb(美国Cytosorbents公司购买)树脂为阳性对照组，分别各取0.3mL于离心管中，加入3mL脓毒症患者的血清样品(样品中总蛋白浓度约为62.74mg/L)，封口膜密封，于空气摇床中，37℃震荡吸附2h。吸附完成后，1000rpm/min离心1min，离心，取上层液测定其浓度。
吸附结果见附图1。
实施例6
吸附剂对血小板粘附性能测试
称取实施例1、2、3中吸附剂吸附剂0.1g，用氯化钠注射液充分冲洗后加入1mL富含血小板兔血血浆，37℃水浴1h后，分别取20uL于血液细胞分析仪测定血小板指标变化，结果见下表1：
表1：吸附剂的血小板粘附性能测试
Figure BDA0001711140000000071
从表中结果可知：本发明所得吸附剂，均对血小板的吸附小于5％，有良好的血液相容性，符合国家生物医用材料标准，可用于血液灌流清除炎性因子。

Claims (6)

1.一种用于清除血液中炎性因子的免疫吸附剂，其特征在于该吸附剂是一种由亲水性载体和配基组成的免疫吸附剂，是以聚乙烯醇微球为载体，以小分子多肽为亲和配基，以环氧氯丙烷为交联剂，使配基与载体通过共价偶联，所述免疫吸附剂中载体环氧量为80-120μmoL/mL，小分子多肽固载量为50-90μmoL/mL；所述的小分子多肽的组成包括，提供疏水作用的苯丙氨酸F和异亮氨酸I中的至少一种；包括提供氢键作用的组氨酸H、酪氨酸Y、丝氨酸S和苏氨酸T中的至少一种；包括提供静电作用的天冬氨酸N和谷氨酸E中的至少一种，以及同时将不同作用位点之间用不同长度的丙氨酸A进行连接；
所述免疫吸附剂的制备方法包括以下步骤：
第1步、聚乙烯醇载体微球的合成；
将单体乙酸乙烯酯与交联剂三烯丙基异氰脲酸酯按重量比1.5-5.5:1混合均匀，再按体积比加入占单体和交联剂1.2-5倍的致孔剂，致孔剂由质量比为0.2-1：1：0.6-1的乙酸乙酯、正庚烷和正己烷组成，按质量比加入占反应单体、交联剂和致孔剂总质量0.3％-1％的引发剂过氧化苯甲酰，搅拌使其混合均匀，得到油相；然后将该油相体系溶液加入到质量百分比为0.5％-3％的聚乙烯醇的水相中，水相中含质量分数为1％-10％的NaCl；其中油相和水相的质量比为1：1.5-3，调节搅拌速率，使体系分散成均匀的小油珠，升温至50-60℃后，反应3-6h后，然后继续升温至70-80℃反应3-6h，过滤，反应体系经过滤、热水洗涤的后处理后，然后用甲醇抽提12-36h后除去致孔剂，真空干燥24-48h得白色共聚物微球后加入到质量分数为1％-5％的NaOH/甲醇溶液中，在40-60℃下进行24-72h的酯交换，过滤后，用甲醇抽提12-36h后，自然晾干后得到聚乙烯醇载体微球；
第2步、载体微球的环氧化；
用已知的试剂和方法对上步得到的聚乙烯醇载体微球进行环氧化，环氧化后用乙醇及去离子水洗涤至中性，4℃保存备用，既得环氧化的聚乙烯醇载体微球，所述载体微球的环氧量为80-120μmoL/mL；
第3步、环氧化微球偶联配基；
将小分子多肽溶于0.1M，pH＝9.8的Na2CO3-NaHCO3缓冲液中，再加入第2步得到的环氧化后的聚乙烯醇载体微球，其中小分子多肽的质量：缓冲液的体积：聚乙烯醇载体微球的质量＝0.1-0.8g：1.5mL：0.1g；在37-50℃下振荡反应12-24h，抽滤，用去离子水淋洗至中性；然后加入到60.6mg/mL的Tris溶液中，其中Tris溶液的体积：聚乙烯醇载体微球的质量＝2.2-3.5mL：1g，于37-50℃下振荡反应5-8h，抽滤，用去离子水淋洗至中性，4℃保存备用，既得血液灌流用清除炎性因子的免疫吸附剂，所述小分子多肽固载量为50-90μmoL/mL。
2.根据权利要求1所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述载体为聚乙烯醇微球，粒度在100-500μm之间；比表面积在20-100m2/g之间；孔体积在1.05-6.8cm3/g之间。
3.根据权利要求2所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述载体粒度为200-400μm；比表面积为30-80m2/g；孔体积为1.89-4.85cm3/g。
4.根据权利要求1所述的免疫吸附剂，其特征在于，所筛选的小分子多肽的亲和配基包括：FAHAN、IAHAN、FIAHYANN、FFAAHHAE、IIAAHHAE、FFAAYYAAEE、IIAAYYAAEE、FAIAHAYASATANAE或FIAAHHAAYYAANNAAEE。
5.根据权利要求4所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述的小分子多肽的亲和配基为：FAHAN、FFAAYYAAEE或FIAAHHAAYYAANNAAEE。
6.权利要求1-5任一项所述的免疫吸附剂的应用，其特征在于，用于清除血液中的炎性因子，所述炎性因子包括IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8，具有良好的清除效果。
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