CN108575999B - Ahl分子作为化学农药杀菌增效剂在洋葱伯克霍尔德氏菌引起的植物病害防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细菌产生的小分子化合物作为化学农药杀菌剂的增效剂应用，该增效剂是由铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,PA产生的3‑氧十二烷酰高丝氨酸内酯（AHL），可以从铜绿假单胞菌发酵液中提取或可通过人工化学合成。微量该小分子化合物（AHL）与化学农药杀菌剂混合使用，对Burkholderia cenocepacia洋葱伯克霍尔德氏菌（Bc）杀菌有明显的协同增效作用。本发明能显著提高化学农药杀菌剂的杀菌效果，大幅减少化学农药的使用量和药剂残留，不仅能降低成本，还能保护环境，有效缓解病原菌抗药性日益严峻的问题，促进达成“减药”指标和农业绿色发展。

Description

AHL分子作为化学农药杀菌增效剂在洋葱伯克霍尔德氏菌引 起的植物病害防治中的应用
技术领域
本发明涉及铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,PA 产生的AHL小分子作为一种新型增效剂对于各种化学农药杀菌剂在洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cenocepacia（Bc）的杀菌增效作用，属于生物防治技术植物保护领域。
背景技术
伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia，BC)是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于自然界中，它不仅能引起植物病害而且能感染人体引起疾病，对人类生产和生活造成很大影响；美国著名植物病理学家Burkholder1949年首次在腐烂的洋葱茎中发现了它，并把它称为洋葱假单胞菌，1992年Yabuuchi等正式把它归为一个新属，即伯克霍尔德菌属。
在我国农药的使用量远远高于国际平均水平，少地区甚至滥用农药。农药的过度使用，引发了严重的环境问题，严重威胁人畜健康，同时也诱导病菌产生抗药性。因此如何提高农药的防效、减少农药的使用量是推动现代农业绿色安全健康发展、维护生态***稳定的亟待解决的问题。
农药增效剂的应用能明显减少化学农药的使用量。研发新型的生物杀菌增效剂，提高农药的防效，不但具有可观的经济效益更是降低农业使用量，保护环境，推动绿色农业，发展绿色食品的重要途径。本发明所述的小分子AHL是从铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，PA发酵培养液中提取或人工化学合成，为细菌的次生代谢物，没有环境污染的问题，同时对解决病菌抗药性问题有重要意义。其结构式如下：
Figure 124127DEST_PATH_IMAGE001
(Pearson, J P, Gray, K M and Passador, L, et al.,1994)
前期研究证明一定浓度的AHL与申嗪霉素混配后可对洋葱伯克霍尔德氏病菌Bc产生明显的杀菌增效作用，可显著减少农药的使用量。目前尚未见以小分子AHL研发成农药增效剂的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供小分子AHL作为农药增效剂的一个新用途，为解决农药滥用问题提供一种有效方法，显著减少农药的使用量。
本发明提供的技术方案是：小分子化合物AHL作为防治伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂的增效剂的应用。
所述的小分子AHL是从铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，PA发酵培养液中提取或人工化学合成。
所述小分子AHL的提取方法是：首先离心铜绿假单胞菌过夜培养液得到上清，上清中加入乙酸乙酯萃取，利用高效液相色谱（HPLC）进行分离纯化，收集活性物质，经结构分析鉴定确认为铜绿假单胞菌产生的小分子。
所述伯克霍尔德菌是洋葱伯克霍尔德氏病菌。
所述防治伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂是抗生素类杀菌剂；比较优选地，所述的防治柑橘溃疡病的化学药剂是农用硫酸链霉素、中生菌素或/和申嗪霉素。
所述的应用，其特征在于，是将小分子化合物AHL与伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂混配使用，以增加防治效果。
所述的混配方法是：将分离提取所得的小分子AHL配制成不同的浓度梯度溶液（相同体积5ul含不同浓度AHL信号分子甲醇溶液），分别与各种化学农药混合处理人工培养基上的病原菌Bc，记录菌落数量及生长情况。
试验结果表明，一定浓度的小分子AHL可以显著增强各种化学农药对病原菌Bc的杀菌能力，利用小分子AHL作为一种新型高效的杀菌农药增效剂在防治农业植物病害方面具有很高的利用价值和开发前景。
结合考虑之后的生产应用成本和杀菌效果，本发明选择40μM~500μM小分子AHL的浓度范围作为与化学农药混合配制来防治洋葱伯克霍尔德氏病菌的优选浓度范围。较为优地，所述小分子化合物AHL的浓度为40uM~500uM，更为优选地为160uM~500uM。混配时，进一步优选地，所述小分子化合物AHL的浓度为320uM，或500uM。
本发明具有以下有益效果：本发明从开发杀菌增效剂的一个新方向着手，利用细菌本身产生的信号分子AHL与化学农药混配，结果表明能明显提高各种化学农药杀菌剂的药效，大幅减少了杀菌剂的使用量和药剂残留，不仅能降低成本，并且自身是细菌的天然产物对环境更友好，还能保护环境，有效缓解病原菌抗药性日益严峻的问题，促进达成“减药”指标和农业绿色发展，对严峻的病原菌抗药性问题的解决具有重要意义。本发明确定了小分子AHL作为化学农药杀菌剂的增效剂防治洋葱伯克霍尔德氏病菌的适用浓度为40uM~500uM。
附图说明
图1 小分子AHL混配申嗪霉素对洋葱伯克霍尔德氏菌杀菌增效作用（处理菌液稀释10倍），其中， 1A：WT（不加任何物质处理）；1B：Phe（单独用农用申嗪霉素处理）；1C：农用申嗪霉素稀释200倍与40μM AHL混配；1D：农用申嗪霉素稀释200倍与80μM AHL混配；1E：农用申嗪霉素稀释200倍与160μM AHL混配；1F：农用申嗪霉素稀释200倍与320μM AHL混配；1G：农用申嗪霉素稀释200倍与500μM AHL混配；注：处理液稀释104倍涂板。
图2小分子AHL混配申嗪霉素对洋葱伯克霍尔德氏菌杀菌作用的菌落数（CFU）统计结果，Phe为单独用农用申嗪霉素处理，P-40~ P-500表示为选择40μM ~500μM AHL混配农用申嗪霉素处理菌液。
图3小分子AHL混配农用申嗪霉素对洋葱伯克霍尔德氏菌杀菌增效作用统计结果。其中： P-40~ P-500表示为选择40μM ~500μM AHL混配农用申嗪霉素处理菌液；不同浓度AHL作为增效剂混配农用申嗪霉素的增效比值=农用申嗪霉素单用CFU/（农用申嗪霉素+AHL增效剂）CFU。
图4 0.5%甲醇对洋葱伯克霍尔德氏菌影响作用，4A:WT(单独加5ul无菌水处理)；4B(单独加5ul甲醇处理）。
具体实施方式
以下通过实施例和试验例进一步详细说明本发明内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，适用于各种化学农药杀菌剂，包括铜制剂杀菌剂（如喹啉铜、络氨铜和氢氧化铜等）、噻唑类杀菌剂（如噻唑锌等）、抗生素类杀菌剂（如农用硫酸链霉素、中生菌素、申嗪霉素等）增效效果相同。
实施例1 AHL小分子的制备
将过夜培养的铜绿假单胞菌种子液接入YEB培养基，28oC、200rpm培养24个小时后，通过离心收集培养液上清。所得上清待提取小分子用。其中，YEB培养基配方为：0.5 g/LMgSO4•7H2O, 5 g/L Sucrose, 5 g/L Yeast Extract, 10g/L Trypton, 5 g/L NaCl，pH7.0。
本发明采用的是常规的化合物分离提取的方法对发酵液中活性物质的分离与提取。在离心收集培养液上清后，加入与上清液等体积的乙酸乙酯，放入4℃静置2h后于20℃摇床处理1h, 用分液漏斗萃取，收集上层分液。再利用旋转蒸发仪将收集的上层分液旋蒸，将有机溶剂蒸干后，使用2-3mL甲醇洗脱。将含有活性成分的甲醇溶液蒸干浓缩之后，再利用高效液相色谱（HPLC）进一步纯化、分析、收集活性物质。结构鉴定确认活性成分为AHL。
实施例2 小分子AHL与1%申嗪霉素混配对洋葱伯克霍尔德氏病菌Bc的杀菌增效作用
采用菌落计数统计法（CFU法）测定不同浓度小分子AHL提取物对申嗪霉素的杀菌增效作用：用甲醇作为溶剂将小分子AHL配置并稀释至成一定浓度的药剂，取过夜培养至OD600=1.0 的Bc菌液，加入稀释200倍100mg/ml的1%申嗪霉素，设置一个不加小分子AHL处理作为阳性对照，再设置一系列具浓度梯度（40μM 、80μM 、160μM、320μM、500μM）的小分子AHL与申嗪霉素混合的处理。所有处理在28oC、200rpm培养24个小时后，稀释104倍，从中取200μL菌液涂板（培养基为LB ），置于28℃恒温培养箱中培养。约3~4天后观察并统计结果。
统计平板菌落数可得：单独用申嗪霉素处理的CFU为1.98×104、用申嗪霉素稀释200倍与40μM AHL混配处理的CFU为1.93×104、用申嗪霉素稀释200倍与80μM AHL混配处理的CFU为1.95×104、用申嗪霉素稀释200倍与160μM AHL混配处理的CFU为1.3×104、用申嗪霉素稀释200倍与320μM AHL混配处理的CFU为7.6×103、用申嗪霉素稀释200倍与500μMAHL混配处理的CFU为7.0×103（请参见图1和图2）。用40μM的小分子AHL对申嗪霉素的杀菌增效比值为1.04倍、用80μM的小分子AHL对申嗪霉素的杀菌增效比值为0.79倍、用160μM的小分子AHL对申嗪霉素的杀菌增效比值为1.61倍、用320μM的小分子AHL对申嗪霉素的杀菌增效比值为为2.98倍、用500μM的小分子AHL对申嗪霉素的杀菌增效比值为为3.37倍（请参见图3）。0.5%甲醇对洋葱伯克霍尔德氏病菌无明显影响（请参见图4）。

Claims (7)

1.小分子化合物AHL作为防治伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂的增效剂的应用，其中，所述防治伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂是抗生素类杀菌剂；所述小分子化合物AHL具有下述结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述防治伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂是申嗪霉素。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述伯克霍尔德菌是洋葱伯克霍尔德氏病菌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述小分子化合物AHL是从铜绿假单胞菌发酵液中提取获得，或者人工化学合成。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，是将小分子化合物AHL与伯克霍尔德菌引起的植物病害的化学药剂混配使用，以增加防治效果。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，混配时，所述小分子化合物AHL的浓度为40uM~500uM。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，混配时，所述小分子化合物AHL的浓度为160uM~500uM。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，混配时，所述小分子化合物AHL的浓度为320uM，或500uM。
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