CN108570477A - 一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法 - Google Patents

一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，属于基因工程领域，本发明按照枯草芽孢杆菌密码子偏好性优化碱性蛋白酶BmP的基因序列得到Bmp‑opt，同时通过基因敲除技术敲除了枯草芽孢杆菌168的碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及中温淀粉酶得到了突变菌株Bs1。将优化后的碱性蛋白酶基因Bmp‑opt在突变菌Bs1进行表达，最终得到了高效表达碱性蛋白酶BmP的重组枯草芽孢菌株。

Description

一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法
技术领域
本发明涉及一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法，属 于基因工程领域。
背景技术
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶。根据蛋白酶的来源可分为动物性蛋白酶、 植物性蛋白酶以及微生物蛋白酶。相对于动物蛋白酶和植物蛋白酶，微生物来源 的蛋白酶作用范围广，水解底物种类多。微生物来源的蛋白酶根据其最适反应 pH环境可将蛋白酶分为酸性、中性和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是一类在碱性条 件下水解蛋白质的酶类，碱性蛋白酶因具有较强的水解能力，广泛的应用于食品、 洗涤、饲料等工业领域。
目前制备碱性蛋白酶主要有两种方式，一种是通过发酵培养产碱性蛋白酶的 野生菌从而获得碱性蛋白酶；另一种是将碱性蛋白酶基因进行异源表达获得碱性 蛋白酶。相对于模式菌，野生菌培养过程及培养基组成复杂，因此培养野生菌生 产碱性蛋白酶生产成本较高。相对于第一种方式，将碱性蛋白酶基因进行异源表 达能够有效降低其生产成本。
中国专利申请201210563540.1公开了一种碱性蛋白酶及其重组表达工程菌， 其通过将克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的碱性蛋白酶基因转入枯草芽孢杆 菌(Bacillus subtilis)中，构建得到枯草芽孢杆菌工程菌株。该工程菌株能高效 表达碱性蛋白酶，20L罐发酵其酶活高达9120U/ml。本发明的重组表达碱性蛋 白酶可广泛用作洗涤用品添加剂。该工程菌株由于碱性蛋白酶内基因的影响以及 基因序列适配性的影响表达活力较低。
发明内容
本发明首先对来源于莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP 进行密码子优化，同时通过基因敲除技术敲除了枯草芽孢杆菌168的碱性蛋白酶、 中性蛋白酶以及中温淀粉酶得到了突变菌Bs1。将优化后的碱性蛋白酶基因 Bmp-opt在突变菌Bs1进行高效表达，最终得到了高效表达碱性蛋白酶BmP的 枯草芽孢菌株。
本发明根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性，对碱性蛋白酶基因Bmp(基因登录 号：AY665611.1，序列如SEQ ID NO.1所示)进行优化得到碱性蛋白酶基因Bmp-opt，因此，本发明的目的之一是提供一种酶活高的碱性蛋白酶Bmp-opt基 因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
为了减少枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及中温淀粉酶对重组碱性 蛋白酶BmP的影响，本发明敲除了枯草芽孢杆菌168的碱性蛋白酶基因、中性 蛋白酶基因和中温淀粉酶基因，得到了突变菌株Bs1。故本发明目的之二是提供 一种用于表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，所述的重 组枯草芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因和中温淀粉酶基因被敲 除。
所述目标基因的敲除方法包括下述步骤：将枯草芽孢杆菌168接入LB培养 基，37℃培养24h后，提取基因组DNA，分别使用引物扩增目标基因的上游同 源臂和下游同源臂，将上下游同源臂用重叠PCR方法进行融合，将融合完成的 产物进行PCR扩增，扩增产物用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切后，连入载 体Pub-At，转至大肠杆菌top10，提取质粒得到碱性蛋白酶敲除载体；使用电转 化法将敲除载体转入枯草芽孢杆菌168，转化子用四环素抗性平板筛选，将在抗 性平板上生长的转化子进行高温诱导使得敲除载体和枯草芽孢杆菌168同源重 组，用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂PCR扩增，确定同源臂单交 换所发生的位置；将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子进行无抗传代培养， 连续传代10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初 步确定为目标基因缺失的枯草芽孢杆菌菌株。所述的目标基因是碱性蛋白酶基因、 中性蛋白酶基因和中温淀粉酶基因中的一种。其中所述的重叠PCR反应体系组 成为：
实验材料 体积
High-Fidelity DNA 10
Polymerase
上游同源臂+下游同源臂 10
重叠PCR反应条件为：98℃，预变性20s；98℃，预变性10s；58℃，退火 30s；72℃，延伸1min；30个循环，最后72℃，延伸5min。
本发明目的之三是提供一种使用重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1表达碱性蛋白 酶Bmp-opt基因的方法。本发明以枯草突变菌株Bs1为宿主菌，将优化后的 Bmp-opt在不同的启动子和信号肽的调控下进行表达。其中启动子包括：启动子P1(地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，序列如SEQ ID NO.3所示)，启动子P2 (解淀粉芽孢杆菌中性蛋白酶启动子，序列如SEQ ID NO.4所示)和启动子P3 (枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，序列如SEQ ID NO.5所示)。其中信号肽包 括：S1(枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)， S2(枯草芽孢杆菌中温淀粉酶信号肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)和S3 (枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)。由表1 可知，在启动子P2和信号肽S3的组合下，重组菌种摇瓶培养条件下表达酶活为 1100U/mL，其次为启动子P2和信号肽S1的组合表达酶活为950U/mL。在20升 发酵罐培养条件下，启动子P2和信号肽S3的组合同样最高，表达酶活为
12000U/mL，其次为启动子P2和信号肽S1的组合表达酶活为8800U/mL。
本发明还请求保护按照基因序列SEQ ID NO.2所表达得到的碱性蛋白酶。
本发明通过密码子优化技术、基因敲除技术以及优化启动子和信号肽的组合 技术实现了碱性蛋白酶BmP在枯草芽孢杆菌的高效表达，最终得到了高效表达 碱性蛋白酶BmP的重组芽孢工程菌种，为碱性蛋白酶BmP的工业化应用奠定基 础。
附图说明
图1敲除载体Pub-At的基因序列示意图。
图2表达载体Puc-1的基因序列示意图。
图3启动子信号肽组合P2+S3和P2+S1下重组枯草芽孢杆菌20升发酵罐产 酶曲线。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和 产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 实验材料和试剂：
1.菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、枯草芽孢杆菌168、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌 均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心、敲除载体Pub-At和表达载体Puc1实 验室自己构建。
2.酶与试剂盒
高保真Q5酶，购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂 盒购自上海生工公司。
3.培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。 LB-Tc为LB培养基加30μg/mL四环素。产酶培养基：3％牛肉浸膏，0.5％蛋白 胨，0.5％氯化钠，pH7.4-7.6。
实施例1碱性蛋白酶基因Bmp密码子优化
针对枯草芽孢杆菌表达***，通过在线软件Graphical Codon Usage Analyser(http://gcua.schoedl.de/)对不含信号肽的碱性蛋白酶基因Bmp的密码 子进行分析，找出低频密码子，进行优化。优化后的基因Bmp-opt由基因合成公 司进行合成。经过优化，基因Bmp的密码子适应指数由0.48提升到0.95，GC 含量由原来的49.6％调整到45.1％。碱基A，T，C和G均匀分布于优化后的基 因Bmp-opt，减少了AT和GC富集区，利于Bmp在枯草芽孢杆菌的表达。优 化后的基因Bmp-opt与原始基因的相似性为76％。
实施例2枯草芽孢杆菌168碱性蛋白酶缺失菌种的构建
将枯草芽孢杆菌168接入LB培养基，37℃培养24h后，提取基因组DNA。 用引物apre1-fw(ATCGGGATCCAGAGCGATTGCGGCTGTGTAC)和引物apre1- rev(AACGTGAGTTCCGTGAGAGTTGTTGTCTTGGAAAGGAT)扩增碱性蛋白 酶的上游同源臂，用引物apre2-fw(ATCCTTTCCAAGACAACAACTC TCACGGAACTCACGTT)和引物apre2-rev(ATCGTCTAGAGGAATTCTTCA GAGGGAGCCA)扩增碱性蛋白酶的下游同源臂。将扩增好的上下游同源臂用 重叠PCR方法进行融合，重叠PCR反应体系及条件如下：
重叠PCR反应条件为：98℃，预变性20s；98℃，预变性10s；58℃，退火 30s；72℃，延伸1min；30个循环，最后72℃，延伸5min。以融合好的PCR产 物为模板用引物apre1-fw和apre2-rev进行扩增，将扩增产物用限制性内切酶 BamHI和XbaI酶切后，连入载体Pub-At，转至大肠杆菌top10，提取质粒得到 碱性蛋白酶敲除载体Pub-At-apre。
采用电转化的方法将敲除载体Pub-At-apre转入枯草芽孢杆菌168，转化子 用四环素抗性平板筛选。将在抗性平板上长出的转化子，在45℃下进行高温诱 导，使载体Pub-At-apre的复制子失活，从而促使载体Pub-At-apre和枯草芽孢杆 菌168进行同源重组。用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂PCR扩增， 确定同源臂单交换所发生的位置。
将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子，进行无抗传代培养，连续传代 10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为 碱性蛋白酶缺失。提取初步确定碱性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌的基因组，用引 物Apre-fw(CGGGGAAAAGAAATATATTGT)和引物Apre-rev(TTACCGGCTG CCGCAACGACT)进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，最终确定碱性蛋白酶 缺失的枯草芽孢杆菌，命名为Bs168-1。
实施例3枯草芽孢杆菌中性蛋白酶缺失菌种的构建
中性蛋白酶缺失菌种的构建方法与实施例2相同。以枯草芽孢杆菌168基因 组为模板，用引物npre1-fw(ATCGGGATCCGCTGAAGGTCATCAGCTTAAA) 和引物npre1-rev(AGGTTTAGAAAGATCACGCATTTTACTGCCTTTGTTATC) 扩增中性蛋白酶的上游同源臂，用引物npre2-fw (GATAACAAAGGCAGTAAAATGCGTGATCTTTCTAAACCT)和引物apre2-rev(ATCGTCTAGATTACAAGCCGACCGCATTCCA)扩增中性蛋白酶的下游同源 臂。将扩增好的上下游同源臂用重叠PCR方法进行融合，重叠PCR反应体系及 条件如下：
重叠PCR反应条件为：98℃，预变性20s；98℃，预变性10s；58℃，退火 30s；72℃，延伸1min；30个循环，最后72℃，延伸5min。以融合好的PCR产 物为模板用引物npre1-fw和npre2-rev进行扩增，将扩增产物用限制性内切酶 BamHI和XbaI酶切后，连入载体Pub-At，转至大肠杆菌top10，提取质粒得到 碱性蛋白酶敲除载体Pub-At-npre。
采用电转化的方法将敲除载体Pub-At-npre转入枯草芽孢杆菌Bs168-1，转 化子用四环素抗性平板筛选。将在抗性平板上长出的转化子，在45℃下进行高 温诱导，使载体Pub-At-npre的复制子失活，从而促使载体Pub-At-npre和枯草芽 孢杆菌Bs168-1进行同源重组。用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂 PCR扩增，确定同源臂单交换所发生的位置。
将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子，进行无抗传代培养，连续传代 10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为 中性蛋白酶缺失。提取初步确定中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌的基因组，用引 物Npre-fw(CAATCAATCTGCTGCAAAAAC)和引物Npre-rev (GGCAGGTTATATTGTCGGTTT)进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，最终 确定中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌，命名为Bs168-2。
实施例4枯草芽孢杆菌中温淀粉酶缺失菌种的构建
中温淀粉酶缺失菌种的构建方法与实施例2相同。以枯草芽孢杆菌168基因 组为模板，用引物amy1-fw(ATCGGGATCCAAAGAAGAACTGCAAAAACGG) 和引物amy1-rev(TGTATCAGCCGACATCGTATCGCTTATATCTATAAACATG) 扩增中温淀粉酶的上游同源臂，用引物amy2-fw (CATGTTTATAGATATAAGCGATACGATGTCGGCTGATACA)和引物amy2-rev(ATCGTCTAGAGTAAGTCAGGATATCAACCGG)扩增中温淀粉酶的下游同源 臂。将扩增好的上下游同源臂用重叠PCR方法进行融合，重叠PCR反应体系及 条件如下：
重叠PCR反应条件为：98℃，预变性20s；98℃，预变性10s；58℃，退火 30s；72℃，延伸1min；30个循环，最后72℃，延伸5min。以融合好的PCR产 物为模板用引物amy1-fw和引物amy2-rev进行扩增，将扩增产物用限制性内切 酶BamHI和XbaI酶切后，连入载体Pub-At，转至大肠杆菌top10，提取质粒得 到碱性蛋白酶敲除载体Pub-At-amy。
采用电转化的方法将敲除载体Pub-At-amy转入枯草芽孢杆菌Bs168-2，转化 子用四环素抗性平板筛选。将在抗性平板上长出的转化子，在45℃下进行高温 诱导，使载体Pub-At-amy的复制子失活，从而促使载体Pub-At-amy和枯草芽孢 杆菌Bs168-2进行同源重组。用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂PCR 扩增，确定同源臂单交换所发生的位置。
将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子，进行无抗传代培养，连续传代 10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为 中温淀粉酶缺失。提取初步确定中温淀粉酶缺失的枯草芽孢杆菌的基因组，用引 物Amy-fw(CCTCTTTACTGCCGTTATTCG)和引物Amy-rev (CATCATTAATCATCCTTCCAG)进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，最终 确定中性蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌，命名为Bs1。
实施例5、启动子和信号肽组合优化表达碱性蛋白酶基因Bmp-opt
采用重叠PCR的方法将不同的启动子、不同的信号肽和优化后的碱性蛋白 酶基因Bmp-opt融合至一起后连接到表达载体Puc-1得到相应的蛋白酶表达载体。 将构建好的表达载体，通过电转化的方法转入宿主菌Bs1。将转化子接入产酶培 养基，摇瓶培养条件下，培养48h后进行蛋白酶活性测定。蛋白酶活性测定参 照国标GB 28715-2012中的碱性蛋白酶方法进行。根据酶活测定结果，得到有效 的启动子和信号肽组合。不同启动子和信号肽组合表达碱性蛋白酶BmP的酶活 如表1所示。在启动子P2和信号肽S3的组合下，重组菌种表达酶活为1100U/mL， 其次为启动子P2和信号肽S1的组合表达酶活为950U/mL。
表1碱性蛋白酶Bmp-opt在不同启动子及信号肽下的表达酶活
启动子+信号肽 蛋白酶表达活性(U/mL)
P2+S3 1100
P2+S1 950
P1+S3 750
P1+S2 630
P2+S2 760
P3+S1 800
P1+S1 540
P3+S3 680
P3+S2 720
实施例6、重组枯草芽孢工程菌在20升发酵罐高密度发酵
根据摇瓶筛选的结果选择组合P2+S3以及组合P2+S1的重组枯草芽孢菌种作 为高密度发酵实验的实验菌种，高密度发酵实验在20升发酵罐进行，高密度发 酵的培养基为：3.3％的豆柏粉，2.6％的玉米粉，3.8％的麸皮，0.4％磷酸氢二钠， 培养温度为37℃，培养pH为6.0。培养过程中每隔12小时取样进行酶活测定。 由图3可知，组合P2+S3的重组枯草芽孢菌种在20升发酵罐培养48小时后发酵 活力达到最高为12000U/mL，组合P2+S1的重组枯草芽孢菌种在20升发酵罐培 养60小时后发酵活力达到最高为10500U/mL。
序列表
<110> 珠海爱姆迪酶制剂有限公司
<120> 一种碱性蛋白酶基因及其重组枯草芽孢杆菌菌株的构建方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
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gctcaacctg ctaaaaacgt tgaaaaagat tacatcgttg gcttcaaatc tggcgttaaa 60
acagcttctg ttaaaaaaga tatcatcaaa gaatctggcg gcaaagttga taaacaattc 120
cgtatcatca acgctgctaa agctaaactt gataaagaag ctcttaaaga agttaaaaac 180
gatcctgatg ttgcttacgt tgaagaagat catgttgctc atgctcttgc tcaaacagtt 240
ccttacggca tccctcttat caaagctgat aaagttcaag ctcaaggctt caaaggcgct 300
aacgttaaag ttgctgttct tgatacaggc atccaagctt ctcatcctga tcttaacgtt 360
gttggcggcg cttctttcgt tgctggcgaa gcttacaaca cagatggcaa cggccatggc 420
acacatgttg ctggcacagt tgctgctctt gataacacaa caggcgttct tggcgttgct 480
ccttctgttt ctctttacgc tgttaaagtt cttaactctt ctggctctgg ctcttactct 540
ggcatcgttt ctggcatcga atgggctaca acaaacggca tggatgttat caacatgtct 600
cttggcggcg cttctggctc tacagctatg aaacaagctg ttgataacgc ttacgctcgt 660
ggcgttgttg ttgttgctgc tgctggcaac tctggctctt ctggcaacac aaacacaatc 720
ggctaccctg ctaaatacga ttctgttatc gctgttggcg ctgttgattc taactctaac 780
cgtgcttctt tctcttctgt tggcgctgaa cttgaagtta tggctcctgg cgctggcgtt 840
tactctacat accctacaaa cacatacgct acacttaacg gcacatctat ggcttctcct 900
catgttgctg gcgctgctgc tcttatcctt tctaaacatc ctaacctttc tgcttctcaa 960
gttcgtaacc gtctttcttc tacagctaca taccttggct cttctttcta ctacggcaaa 1020
ggccttatca acgttgaagc tgctgctcaa taa 1053
<210> 3
<211> 694
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 3
tgatcatttc ttgcgtgtcg ttaatctcct gatacgcttt ttcgtttgac agccttgtca 60
ataacggatg gtcccaggaa tggttgccga cttcgtttcc ttccttcagc atccgtttta 120
cgtttcggga taatattggg ctctgcttcc aagcacaaag aaggtcgatg cccttcatgc 180
tctgtaaagc gtttaatatt ttattcgttg tagcgggatt cggaccgtca tcaaatgtga 240
gggcaatcac gtttttcatc gggattaatt ttcgcttgct tcggaagcgg aacaggctcc 300
tgatcagtga ttccgtccgc tcgctttcca atctgaaggt ttcattgtgg gatgttgatc 360
cggaagattg gaagtacaaa aataagcaaa agattgtcaa tcatgtcatg agccatgcgg 420
gagacggaaa aatcgtctta atgcacgata tttatgcaac gtccgcagat gctgctgaag 480
agattattaa aaagctgaaa gcaaaaggct atcaattggt aactgtatct cagcttgaag 540
aagtgaagaa gcagagaggc tattgaataa atgagtagaa agcgccatat cggcgctttt 600
cttttggaag aaaatatagg gaaaatggta cttgttaaaa attcagaata tttatacaat 660
atcatatgtt tcacattgaa aggggaggag aatc 694
<210> 4
<211> 515
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 4
cactaaacag caagtcatat ctgtccgtcc ttcctttttt ccgccaagtg ctgtttcagc 60
tgcattctcg ccctgtacag ggtgctcttc accttcgaaa gactccagtc caaaacatct 120
gcaatctctt cgtaagacag ctcttgaaat atctgtcgaa atgctgaata aaatgactga 180
aaatctctga catctgaaac aatccttttc gtttattaag gcctcacccg tttagacaaa 240
cggctataaa aaaagtttta caaatcggaa catttttccc ctatcatttt tcccgacttc 300
atttgtcatt tttttcagaa taaatcgcat cattcgactc atgtctgatt caacacgtgc 360
ctctcggctt atcccccgat gctggcctcc ggaagccttt ccgggacgat tctatcaatt 420
catcagcgga gtctagtttt atattgcaga atgagagaat gctggtttat tataacaata 480
taagttttca ttattttcaa aaagggggat ttatt 515
<210> 5
<211> 191
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 5
gttcttttct gtatgaaaat agttatttcg agtctctacg gaaatagcga gagatgatat 60
acctaaatag agataaaatc atctcaaaaa aatgggtcta ctaaaatatt attccatcta 120
ttacaataaa ttcacagaat agtcttttaa gtaagtctac tctgaactta agcaaaagga 180
gagggacgcg t 191
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 6
gtgagaggca aaaaggtatg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60
gcgttcggca gcacgtctcc tgcccaggcg 90
<210> 7
<211> 99
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 7
atgtttgcaa aacgattcaa aacctcttta ctgccgttat tcgctggatt tttattgctg 60
tttcatttgg ttctggcagg accggcggct gcgagtgct 99
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
<400> 8
gtgggtttag gtaagaaatt gtctgttgct gtcgctgctt cgtttatgag tttatcaatc 60
agcctgccag gtgttcaggc t 81

Claims (10)

1.一种酶活高的碱性蛋白酶Bmp-opt基因，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于表达权利要求1所述的碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶基因、中性蛋白酶基因和中温淀粉酶基因被敲除。
3.根据权利要求2所述的用于表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，其特征在于，目标基因的敲除方法包括下述步骤：将枯草芽孢杆菌168接入LB培养基，37℃培养24h后，提取基因组DNA，分别使用引物扩增目标基因的上游同源臂和下游同源臂，将上下游同源臂用重叠PCR方法进行融合，将融合完成的产物进行PCR扩增，扩增产物用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切后，连入载体Pub-At，转至大肠杆菌top10，提取质粒得到碱性蛋白酶敲除载体；使用电转化法将敲除载体转入枯草芽孢杆菌168，转化子用四环素抗性平板筛选，将在抗性平板上生长的转化子进行高温诱导使得敲除载体和枯草芽孢杆菌168同源重组，用相应引物分别进行5端同源臂和3端同源臂PCR扩增，确定同源臂单交换所发生的位置；将确定好同源臂单交换所发生位置的转化子进行无抗传代培养，连续传代10次进行点板实验，将在抗性板上不长，在无抗性板上长的转化子初步确定为目标基因缺失的枯草芽孢杆菌菌株。
4.根据权利要求3所述的用于表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1，其特征在于，重叠PCR反应体系组成为：
重叠PCR反应条件为：98℃，预变性20s；98℃，预变性10s；58℃，退火30s；72℃，延伸1min；30个循环，最后72℃，延伸5min。
5.一种使用重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的方法，其特征在于，所述的碱性蛋白酶Bmp-opt基因在启动子和信号肽的调控下进行表达。
6.根据权利要求5所述的使用重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的方法，其特征在于，所述的启动子为启动子P1，启动子P2或启动子P3中的一种，所述的启动子P1的序列如SEQ ID NO.3所示，所述的启动子P2的序列如SEQ ID NO.4所示，所述的启动子P3的序列如SEQ ID NO.5所示；所述的信号肽为信号肽S1，信号肽S2或信号肽S3中的一种，所述的信号肽S1的序列如SEQ ID NO.6所示，所述的信号肽S2的序列如SEQ ID NO.7所示，所述的信号肽S3的序列如SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求5所述的使用重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1表达碱性蛋白酶Bmp-opt基因的方法，其特征在于，所述的启动子为启动子P2，所述的信号肽为信号肽S3。
8.一种权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1的高密度发酵方法，其特征在于，高密度发酵的培养基为：3.3％的豆柏粉，2.6％的玉米粉，3.8％的麸皮，0.4％磷酸氢二钠，培养温度为37℃，培养pH为6.0。
9.根据权利要求6所述的重组枯草芽孢杆菌菌株Bs1的高密度发酵方法，其特征在于，所述的发酵时长为48小时。
10.一种权利要求1所述的基因序列所表达得到的碱性蛋白酶。
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