CN108384771A - 一种提高比活力的碱性蛋白酶突变体及其编码基因 - Google Patents
一种提高比活力的碱性蛋白酶突变体及其编码基因 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因。本发明碱性蛋白酶BmP突变体的突变位点为氨基酸SEQ ID NO.7所示的碱性蛋白酶BmP的第178位由S突变成D或M或G或Q或T。本发明获得的突变体比原始酶具有更高的比活。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质分子改造领域，具体涉及一种提高比活力的碱性蛋白酶 BmP突变体及其编码基因和应用。
背景技术
蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，根据其最适反应pH环境可将蛋白酶分 为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是一类在碱性条件下水解 蛋白质的酶类，碱性蛋白酶因具有较强的水解能力，广泛的应用于食品、洗涤、 饲料等工业领域。目前碱性蛋白酶主要来源于地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及 环状芽孢杆菌，其他芽孢杆菌碱性蛋白酶报道相对较少。
在前期的实验中，本实验室克隆、表达以及分析了来自莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)的碱性蛋白酶BmP，BmP对蛋白原料分解能力强，适用 于食品、洗涤、饲料等工业领域。但是BmP比活力相对较低，生产成本高，限 制了其产业化应用。因此提高BmP的比活力，是BmP产业化应用急需解决的问 题。
发明内容
本发明对来源于莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP进 行蛋白质分子改造，从而提高BmP的比活力，降低其生产成本，为BmP的工业 化应用奠定基础。
莫海威芽孢杆菌的碱性蛋白酶BmP的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.7所示。
本发明的目的是提供一种提高比活力碱性蛋白酶BmP的突变体。所述突变 体为氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的蛋白酶BmP的突变体，其中突变位点为 第178位。
本发明首先通过同源建模得到碱性蛋白酶BmP的三维结构图，申请人通过 实验发现，第178对碱性蛋白酶BmP的水解活性潜在贡献较大，因此选定第178 位作为定点饱和突变目标位点。采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.7所示 的碱性蛋白酶BmP的第178位进行突变，经过筛选得到5个突变体可以有效提 高碱性蛋白酶BmP的比活力。这5个突变体分别命名为B1、B2、B3、B4和B5。 相对于原始碱性蛋白酶BmP，B1、B2、B3、B4和B5的比活力分别提高了35％，21％，28％，19％和25％。突变体B1、B2、B3、B4和B5的核苷酸序列如SEQ IDNO.2到SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8到SEQ ID NO.12所 示。其中B1包含的突变位点为S178D；B2包含的突变位点为S178M；B3包含 的突变位点为S178G；B4包含的突变位点为S178Q；B5包含的突变位点为S178T。
根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列(Genebank:AY665611.1) 直接合成目的基因，扩增莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶BmP基因。将扩增的PCR 产物纯化回收，连接到表达载体phyP43L，得到表达载体phyP43L-BmP；通过饱 和突变碱性蛋白酶BmP第178位获得所述的提高比活力碱性蛋白酶BmP的突变 体。
其中定点饱和突变具体包括如下步骤：以构建好的phyP43L-BmP为模板， 以相应的突变引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化 回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物才用热 激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转 化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，通过电转 化转入枯枯草芽孢杆菌WB600。
本发明的再一目的是提供提高比活力碱性蛋白酶BmP突变体的编码基因。 所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明还请求保护一种包含所述提高比活力碱性蛋白酶BmP突变体编码基 因的重组载体。
本发明还请求保护一种包含提高比活力碱性蛋白酶BmP突变体编码基因的 宿主细胞。
本发明还请求保护一种所述提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体的应用。
本发明通过蛋白理性设计提高了莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP的比活力，降低其生产成本，为其工业化应用奠定基础。
附图说明
图1原始碱性蛋白酶BmP和突变体B1至B5的最适反应pH。
图2原始碱性蛋白酶BmP和突变体B1至B5的pH稳定性。
图3原始碱性蛋白酶BmP和突变体B1至B5的最适反应温度。
图4原始碱性蛋白酶BmP和突变体B1至B5的热稳定性。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和 产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、枯草芽孢杆菌WB600、表达载体phyP43L均由本实验 室保藏。
2、酶与试剂盒
Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、 试剂盒购自上海生工公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。 枯草芽孢培养基为LBK为LB培养基加卡那霉素。
实施例1、莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP基因的克隆
根据已报道莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列(Genebank:AY665611.1) 直接合成目的基因。根据合成的目的基因设计两条引物(R：5'-ATCGGGATCCGCTCAACCGGCGAAAAATGTT-3'和F：5'-TCTAGCGGCCGC TTATTGAGCG GCAGCTTCGAC-3')用于扩增莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶BmP基因。将扩增 的PCR产物纯化回收，连接到表达载体phyP43L，得到表达载体phyP43L-BmP。
实施例2、理性设计定点饱和突变
通过同源建模软件对碱性蛋白酶BmP进行建模，得到BmP的三维空间构象 图。通过生物信息学软件对构建后的BmP模型进行对接分析，找到关键氨基酸 位点第178位。通过饱和突变研究第178位对碱性蛋白酶BmP比活力的影响。
定点饱和突变的过程如下：以构建好的phyP43L-BmP为模板，以相应的突 变引物进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR 产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物才用热激法转入 大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质 粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，通过电转化转入枯 枯草芽孢杆菌WB600。
重组转化子的筛选如下：首先将在卡那霉素抗性板上生长的重组菌接入LBK培养基中，37℃，200rpm培养24小时；将培养后的菌液离心取上清，进 行酶活测定，酶活测定方法参照GBT/28715-2012进行。
实施例3、原始碱性蛋白酶BmP及突变体比活力分析
采用镍柱纯化对碱性蛋白酶BmP和突变体进行纯化。将纯化后的碱性蛋白 酶BmP和突变体进行比活力测定，实验结果如表1所示，由表1可知第178位 是影响碱性蛋白酶BmP水解活性的关键氨基酸位点，当其突变为D、M、G、Q 和T时，相对比活力分别提高了35％，21％，28％，19％和25％。
表1原始碱性蛋白酶BmP和突变体比活力分析
| 编号 | 相对比活力(％) |
| 原始碱性蛋白酶BmP | 100 |
| S178D | 135 |
| S178M | 121 |
| S178G | 128 |
| S178Q | 119 |
| S178T | 125 |
实施例4、原始碱性蛋白酶BmP及突变体的最适反应pH及pH稳定性
参照国标方法测定原始碱性蛋白酶BmP及突变体B1至B5的最适反应pH， 原始碱性蛋白酶BmP及突变体B1至B5的最适反应pH如图2所示。由图2可 知，突变体B1至B5的最适pH值几乎和原始碱性蛋白酶BmP一样，均为10.0。
将原始碱性蛋白酶BmP及突变体B1至B5分别在pH6-11条件下室温处理2 小时，然后参照国标的方法测定酶活，结果如图3所示。由图3可知突变体B1 至B5的pH稳定性与原始碱性蛋白酶BmP一致。
实施例6、碱性蛋白酶BmP及突变体的最适反应温度及热稳定性
参照国标方法测定原始碱性蛋白酶BmP及突变体B1至B5的最适反应温度， 结果如图4所示。由图4可知，碱性蛋白酶BmP的最适反应温度为65℃，而突 变体B1至B5的最适反应温度为60℃。
将原始碱性蛋白酶BmP及突变体B1至B5分别在70℃，水浴处理5分钟后， 参照国标测定剩余酶活。由图4可知，相对于碱性蛋白酶BmP(保留率40％)， 突变体B1至B5的热稳定性有所下降，剩余酶活保留率分别为31％，32％，36％， 33％和39％。
序列表
<110> 珠海市双指环投资有限公司
<120> 一种提高比活力的碱性蛋白酶突变体及其编码基因
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> Bacillus mojavensis
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Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln
340 345 350
Claims (6)
1.一种提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的蛋白酶BmP的突变体，其中突变位点为第178位。
2.根据权利要求1所述的提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的碱性蛋白酶BmP突变体的突变位点为第178位由S突变成D或M或G或Q或T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.12所示。
3.一种编码权利要求2所述提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体的基因，其中所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
4.一种包含权利要求3所述基因的重组载体。
5.一种包含权利要求3所述基因的宿主细胞。
6.一种权利要求2所述提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体的应用。
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