CN108570474A

CN108570474A - 水稻花发育基因eh1及其应用

Info

Publication number: CN108570474A
Application number: CN201810344126.9A
Authority: CN
Inventors: 饶玉春; 任德勇; 余海萍; 徐江民; 徐娜
Original assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Current assignee: Zhejiang Normal University CJNU
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN108570474B

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制水稻花发育基因EH1的分离克隆、功能验证，及其在水稻花粉败育中的应用。即，本发明公开了一种水稻花发育基因EH1，水稻的花发育基因EH1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还同时提供了上述水稻花发育基因EH1在水稻育种中的应用，用于提高水稻产量。

Description

水稻花发育基因EH1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种控制水稻花发育基因EH1的分离克隆、功能验证，及其在水稻花粉败育中的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)世界上最重要的粮食作物之一和单子叶模式植物，对其花/穗发育的研究具有重要意义。通过深入了解水稻花/穗在整个生殖发育过程中的分子遗传机制，一方面，可以为改善水稻等禾本科作物的产量和品质提供理论依据；另一方面，也将丰富人们对整个开花植物花/穗发育分子调控机理的认识。

水稻花的发育经过枝梗分化小穗分化和花器官分化3个阶段：首先是在花序分生组织特异基因激活下诱导形成花序分生组织，分化形成一次分枝二次分枝和三次分枝，继而在分枝的顶端形成花分生组织花芽，最后再分化形成花器官原基，进行花器官的分化，逐渐分化形成外稃内稃浆片雄蕊雌蕊花序分枝的方式和花着生位置决定稻穗的基本结构。花的发育按一定的步骤进行植物先对来自外界和体内自身的信号产生反应，从营养生长向生殖生长转换形成花序分生组织，这一过程受开花基因的控制即花序分生组织特异基因的控制。如水稻稀穗LAX(Laxpanicle)突变体^[1]表现为花序分生组织仅分化形成一次枝梗或也可分化形成二次枝梗但不形成小穗。控制水稻从营养生长向生殖生长转变的关键基因PLAI基因，其突变表现为抑制枝梗(穗轴)的分化形成，从而延缓生殖生长的开始。在花分生组织特性基因的作用下，花分生组织从花序分生组织的周围形成控制水稻花序和花分生组织形成主要基因之一的FZP基因(Frizzy panicle)^[2]，其穗轴卷曲突变体表现为花序分生组织无限生长，花分生组织的形成受到抑制，枝梗上不能分化形成小穗。在花器官特性基因调控下，花分生组织分化形成花器官。目前植物花器官的发育模型已从最初的ABC模型发展到ABCDE，并且还在不断补充和完善。ABCDE模型中各类基因的功能主要为^[3]：A类基因具有单独决定萼片发育又能影响花瓣形成的功能；B类基因的功能主要是能够与A类基因共同决定花瓣的发育，又能与C类基因共同决定雄蕊的发育；C类基因具有与B类共同决定雄蕊发育却又能单独决定心皮发育的功能；D类基因能够控制胚珠的发育；E类功能基因分布于整个花器官，不能独立决定某个花器官的发育，但是在整个花器官的发育过程中都有表达。水稻的ABCDE 5类功能基因主要是：具有决定花器官分生组织功能的类SOUA基因，相对于A类功能基因的有OsMADS14、OsMADS15、OsMADS18和OsMADS20；有B功能基因的OsMADS2、OsMADS4和OsMADS16(SUPERWOMAN1)，尽管OsMADS2、OsMADS4这两个B类基因具有不同的功能，但总的说来B类基因在拟南芥和水稻这两个物种中的作用还是保守的；C类基因包含OsMADS3、OsMADS58、OsMADS13、和OsMADS21，这4个基因具有类似于类AG的C基因的功能，但是前两个基因在表达时间上有差异，而后两个基因在不同的花轮中具有不同的功能；D类基因包含OsMADS13和OsMADS21，这两个基因具有非专化性，可在胚珠种子中表达；E类基因有OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，其中OsMADS1具有在早期发育阶段专化花器官发育及决定花形成的功能，当缺失该功能基因时会引起花分生组织和花器官发育的不完整，OsMADS5对花发育的作用不是很大，OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34突变将影响花的发育，水稻中的这5类SEP基因都是花器官发育过程中ABC类基因实现正常功能所必不可少的。

目前已克隆的与水稻花发育相关基因包括LAX、FZP、OsCKX2、FON1等。LAX编码了一个植物特有的bHLH转录因子，在地上部顶端分生组织与新形成的分生组织之间的边界区域表达，是控制水稻腋芽原基形成的主要调节因子^[4]。FZP编码包含一个EREBP/AP2结构域的转录因子，具有阻止腋芽分生组织形成并建立花分生组织的作用，并通过调控OsMADS盒基因表达，决定花器官特性^[5]。OsCKX2编码一种降解细胞***素的酶，该基因表达的减弱使细胞***素在花序分生组织中累积，增加繁殖器官的数目，穗粒数就越多，最终提高水稻的产量^[6]。FON1编码一个与拟南芥CLAVATA1直系同源的富亮氨酸重复受体激酶，FON1突变导致花分生组织增大，引起所有花器官数目增加，每轮器官以及额外形成的一轮器官都异位发育出新的花器官，内轮花器官受到的影响比外轮器官严重。许多心皮原基持续发育，同时基本发育成熟的花的中央仍有未分化分生组织，但营养生长分生组织和花序分生组织绝大部分正常^[7]。

水稻(Oryza sativa)是全球近一半人口赖以生存的基本食粮，在我国有很大的种植面积，本发明克隆的控制水稻花发育基因EH1及其编码的蛋白在改善花粉败育中具有重要的生产应用价值。

所涉及的参考文献如下：

1.王贇,肖晗,钱前,等.水稻稀穗突变体的遗传分析及基因的精细定位.科学通报,2003,48:1666-1670；

2.***,吴为人,段远霖,等.水稻小穗特征基因FZP的图位克隆.遗传学报,2003,30:811-816；

3.Theissen G.Development of floral organ indentity:stories from theMADS house.Curr Opin Plant Biol,2001,4:75-85(Theissen G.花器官的发展：MADS家族的故事.植物生物学当代进展,2001,4:75-85)；

4.Komatsu K,Maekawa M,Ujiie S,et al.LAX and SPA:major regulators ofshoot branching in rice.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100:11765-11770(KomatsuK,Maekawa M,Ujiie S,等.LAX和SPA：水稻中主要调控分枝的基因.美国国家科学院院刊,2003,100:11765-11770)；

5.Komatsu M,Chujo A,Nagato Y,et al.FRIZZY PANICLE is required toprevent the formation of axillary meristems and to establish floral meristemidentity in rice spikelets.Development,2003,130:3841-3850(Komatsu M,Chujo A,Nagato Y,等.FRIZZY PANICLE在水稻小穗发育中具有阻止腋芽分生组织形成并建立花分生组织的作用.发育生物学,2003,130:3841-3850)；

6.Ashikari M,Sakakibara H,Lin S,Yamamoto T,et al.Cytokinin oxidaseregulates rice grain production.Science,2005,309:741-745(Ashikari M,Sakakibara H,Lin S,Yamamoto T,等.细胞***素氧化酶调节水稻产量.科学,2005,309:741-745)；

7.Suzaki T,Sato M,Ashikari M,et al.The gene FLORAL ORGANNUMBER1regulates floral meristem size in rice and encodes a leucine-richrepeat receptor kinase orthologous to Arabidopsis CLAVATA1.Development,2004,131:5649-5657(Suzaki T,Sato M,Ashikari M,等.基因FLORAL ORGAN NUMBER1调控水稻花分生组织大小，编码富含亮氨酸的重复受体激酶与拟南芥CLAVATA1直向同源.发育生物学,2004,131:5649-5657)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻花发育基因EH1及其在水稻育种中的应用。

为了解决上述问题，本发明提供一种水稻花发育基因EH1(即，水稻额外的颖壳突变体eh1基因)，水稻的花发育基因EH1(即，水稻额外的颖壳突变体eh1基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还同时提供了上述水稻花发育基因EH1在水稻育种中的应用。

作为本发明的应用的改进：用于提高水稻产量。

水稻花发育基因EH1(即，水稻额外的颖壳突变体eh1基因)的核苷酸序列为SEQ IDNO：1，该水稻额外颖壳突变体对应野生型的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供了含有上述基因的质粒，以及含有所述基因或所述载体的工程菌或宿主细胞。

所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的工程菌或宿主细胞。但随着科技发展，所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化，或在非转基因目的的应用领域，也同样涉及载体和工程菌的利用，但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体，均在本发明的保护范围之内。

进一步地，本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有基因序列，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明的另一个目的在于提供上述基因用于转基因改良作物的用途。

转基因水稻的制备为本领域常规技术手段，本发明不另作限定，利用本发明所述基因进行水稻转基因的技术方案均在本发明的保护范围之内。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻额外颖壳突变体基因EH1的鉴定和定位

本发明的额外颖壳突变体eh1是从粳稻品种日本晴NIP的EMS诱变体库中筛选得到的。在成熟期，观察eh1的花药结果发现eh1具有额外的颖壳，比正常的多出一倍的颖壳。为了分离EH1基因，本发明首先构建了一个定位群体，由eh1与籼稻品种TN1杂交组配成F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用多种分子标记对EH1位点进行初步定位，将其初步定位在第11染色体上，并介于P1与P8标记之间。通过对这两个标记之间的序列进行分析，发展新的多态性标记将EH1基因精确定位到ID标记P4与P5之间约400kb的区域内，通过对区间的预测基因测序比对分析发现与NIP相比，eh1的LOC_Os11g38270基因的编码区发生了单碱基替换。Blast分析发现EH1基因(LOC_Os11g38270)与前人报道的FON4是等位基因。eh1突变位点与前人报道的的FON4等位基因的突变位点不一致，eh1中的突变位点位于编码区的第三个外显子上的第317位核苷酸A替换为G，导致编码的第106位氨基酸由His变为Arg。

本发明的水稻额外颖壳突变体eh1表型与其他FON4等位突变体(fon4和fon2)有所差别。其特征是：而fon4突变体的主要特征是花器官数目和一次枝梗数目增加，fon2的特征主要为花分生组织增大和雌蕊数目增加，然而eh1突变体主要表现为花器官数目增加，比如外轮颖壳及内轮花器官。

二、EH1基因的鉴定与功能分析

利用pCAMBIA1300质粒构建EH1互补载体。构建步骤：PCR扩增NIP中EH1基因的5’-UTR 2005bp至3’-UTR1206bp的共4.7-kb基因组DNA片段，将该片段连接到pCAMBIA1300载体上获得pCAMBIA1300-EH1互补载体。

通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使eh1恢复正常颖壳的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了EH1基因，明确了EH1基因的功能。

综上所述，本发明分离并克隆鉴定了控制花发育相关基因EH1，并通过互补实验进行基因功能验证。本发明为改良、增强水稻育性，加速分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是野生型和eh1突变体抽穗期小花的表型，A：野生型的小花；B：野生型小花内部花器官；C：eh1突变体小花；D：eh1突变体小花内部花器官。

图2是野生型和eh1突变体早期小花的扫描电镜，A：野生型早期小花；B：eh1突变体早期小花。

图3是是EH1基因的定位图，A：EH1基因的精细定位，利用eh1/TN₁的F₂群体的701株突变单株，将EH1基因定位在第11号染色体的定位于P4和P5标记之间；B：EH1界定在400kb区域；C：EH1基因的结构示意图，通过对该区域的NIP和eh1亲本基因组DNA序列测序比对分析，结果发现在基因EH1(LOC_Os11g38270)的第三个外显子上的第317位核苷酸A替换为G。

图4是pCAMBIA1300-EH1载体图谱。

图5是功能互补实验转基因水稻cp的表型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、突变体eh1材料的获得

通过EMS化学诱变粳稻品种日本晴，筛选到一份额外颖壳突变体eh1。该突变体的性状经过多代自交已稳定遗传，在大田条件下观察和比较突变体与野生型在开花期表现出额外的颖壳的表型。所有水稻材料种植于浙江省金华市浙江师范大学生化学院试验田，常规管理。

上述EMS化学诱变方法具体为：将日本晴种子浸没于浓度在0.05-0.5mol/L的甲基磺酸乙酯30min，之后将种子发芽种植到大田，经过多代自交，满足植株额外颖壳筛选条件(即，满足后代各个株系表型稳定，不再发生表型分离的条件)的作为额外颖壳突变体eh1。

实施例2、突变体eh1的表型分析

在开花期，与野生型日本晴相比，突变体eh1的小花发育出一个额外稃状器官，内部花器官雄蕊和雌蕊都明显增加(图1)，对早期小花的扫描电镜结果发现在早期突变体eh1就出现了雄蕊和雌蕊数目增加(图2)。

实施例3、群体构建和遗传分析

将突变体eh1和常规籼稻TN₁进行杂交配组，F₁植株均表现出正常野生型表型，说明eh1受隐性核基因控制。统计F₂分离群体分离比(表1)，结果表明，正常表型的植株和突变体表型的植株的分离比经过卡方检验接近3:1分离，这表明eh1的额外颖壳表型是由一对单隐性核基因控制。

表1突变体eh1的遗传分析

实施例4、EH1基因的基因定位

利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体的262对SSR引物对突变体与TN₁进行多态性筛选，筛选到134对SSR引物具有多态性。然后用21个eh1/TN₁中F₂(即eh1和TN₁两个品种杂交以后产生F₁植株，然后再用F1植株的种子进行自交产生F₂植株)具有额外颖壳单株进行连锁分析，初步确认目标基因所在的染色***置。基因组DNA采用CTAB法提取。

具体步骤如下：

①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入600μl的CTAB溶液(2％(m/V)CTAB，100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；pH8.0)配制的DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。再加600μl的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。

②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷(至4℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。

③、再用70％(体积浓度)的已醇200μl洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。

④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μl TE缓冲液或纯水中。

⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完整的DNA。

PCR反应体系采用10μL体系：DNA模板1μL，10×PCR缓冲液1μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，dNTPs 1μL，rTaq酶0.2μL，加ddH₂O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃下预变性4min；94℃下变性30s，55℃～60℃下退火30s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30s，40个循环；最后72℃下延伸10min。PCR产物用4％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶。利用上述筛选的134对SSR引物进行EH1基因连锁分析发现在第11号染色体的SSR标记P1处表现出连锁现象。在连锁标记上下游设计新的Indel标记，用这21个单株将目的基因区间锁定在分子标记P1与P8之间。在此区间再次设计新的分子标记，用701个F₂单株最终将该基因定位在P4和P5之间大约400kb的区间内。引物序列见表2。

表2、基因定位所用分子标记

根据水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据信息，对区域内预测基因分析，发现区间内有一个已经报道的花器官数目控制基因FON4，其登陆号为LOC_Os11g38270，利用覆盖候选基因FON4区域的引物分别扩增野生型和突变体的cDNA，测序结果表明，eh1的FON4基因位于编码区的第三个外显子上的第317位核苷酸A替换为G，导致编码的第106位氨基酸由His变为Arg，预示该基因为候选基因(图3)，其他被报道的fon4等位突变体都是大片段缺失。

水稻额外颖壳突变体基因EH1的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，水稻额外颖壳突变体对应野生型日本晴的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

水稻额外颖壳突变体基因EH1所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所述。野生型日本晴所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所述。

实施例5、植物转化与功能验证

扩增日本晴中EH1基因的5’-UTR 2005bp至3’-UTR 1206bp的共4.7-kb基因组DNA片段。然后连入pEASY-Blunt Cloning Vector(TransGen Biotech公司)中，之后在连入到pCAMBIA1300载体中(图4)。

这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用eh1成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体(pCAMBIA1300-COLD2)的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右(光照强度为13200LX，温度为32℃)。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下(光照强度为13200LX，温度为32℃)培养一个月左右得到抗性转基因植株。对互补苗植株cp在成熟期进行花器官的观察与分析，发现互补苗的颖壳恢复到野生型一样(图5)。

备注说明：上文中提及的各项培养基(诱导培养基、筛选培养基、分化培养基)均为常规培养基。

实施例6、水稻花发育基因EH1在水稻育种中的应用

在生产实践中，将上述EH1基因跟常规品种(例如浙辐802)杂交，在后代中选育具有EH1基因型的个体，这样选育出来的个体，颖花数目增加，从而提高单株产量(产量能至少提高5％)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江师范大学

<120> 水稻花发育基因EH1及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgggccggc tcttcttgtg tttggtggtt gcatggtgtt gggttgctct gctgcttgtt 60

gctccggtgc atggacgtgt tggcttgccc ggtgagttta gtggtgacca gaggccagtc 120

ccggcgacat cttttgatct cgtgacagag ccgaagacga agcagccgcg cggcgtgaag 180

ggcacccgca ggccgtcgtg gtcttcttgg tcgtcgacgg cgtcgagatc gtcgccgccg 240

ccggggagag gggcgccctc ggccgccgcg gcggcggagc tccggtcagt gccggccggc 300

ccggacccga tgcaccgcca cggcagcccg aggcggccgg agcacgcgcg cagcaccggc 360

cggccatga 369

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atgggccggc tcttcttgtg tttggtggtt gcatggtgtt gggttgctct gctgcttgtt 60

gctccggtgc atggacgtgt tggcttgccc ggtgagttta gtggtgacca gaggccagtc 120

ccggcgacat cttttgatct cgtgacagag ccgaagacga agcagccgcg cggcgtgaag 180

ggcacccgca ggccgtcgtg gtcttcttgg tcgtcgacgg cgtcgagatc gtcgccgccg 240

ccggggagag gggcgccctc ggccgccgcg gcggcggagc tccggtcagt gccggccggc 300

ccggacccga tgcaccacca cggcagcccg aggcggccgg agcacgcgcg cagcaccggc 360

cggccatga 369

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Gly Arg Leu Phe Leu Cys Leu Val Val Ala Trp Cys Trp Val Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Ala Pro Val His Gly Arg Val Gly Leu Pro Gly Glu

20 25 30

Phe Ser Gly Asp Gln Arg Pro Val Pro Ala Thr Ser Phe Asp Leu Val

35 40 45

Thr Glu Pro Lys Thr Lys Gln Pro Arg Gly Val Lys Gly Thr Arg Arg

50 55 60

Pro Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Thr Ala Ser Arg Ser Ser Pro Pro

65 70 75 80

Pro Gly Arg Gly Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser

85 90 95

Val Pro Ala Gly Pro Asp Pro Met His Arg His Gly Ser Pro Arg Arg

100 105 110

Pro Glu His Ala Arg Ser Thr Gly Arg Pro

115 120

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

Met Gly Arg Leu Phe Leu Cys Leu Val Val Ala Trp Cys Trp Val Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Ala Pro Val His Gly Arg Val Gly Leu Pro Gly Glu

20 25 30

Phe Ser Gly Asp Gln Arg Pro Val Pro Ala Thr Ser Phe Asp Leu Val

35 40 45

Thr Glu Pro Lys Thr Lys Gln Pro Arg Gly Val Lys Gly Thr Arg Arg

50 55 60

Pro Ser Trp Ser Ser Trp Ser Ser Thr Ala Ser Arg Ser Ser Pro Pro

65 70 75 80

Pro Gly Arg Gly Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Glu Leu Arg Ser

85 90 95

Val Pro Ala Gly Pro Asp Pro Met His His His Gly Ser Pro Arg Arg

100 105 110

Pro Glu His Ala Arg Ser Thr Gly Arg Pro

115 120

Claims

1.水稻花发育基因EH1，其特征在于：水稻的花发育基因EH1的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

2.如权利要求1所述的水稻花发育基因EH1在水稻育种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：用于提高水稻产量。