CN108495929A - 由人多能干细胞向下丘脑神经元的分化诱导 - Google Patents
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Abstract
本发明提供由人多能干细胞高效地分化诱导为下丘脑神经元的方法。另外，本发明提供由人多能干细胞构建下丘脑组织和垂体组织一体化的细胞结构体的方法。本发明通过包括如下步骤的方法得到含有下丘脑组织的细胞结构体，所述步骤为：将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，以及将在该步骤中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。另外，通过包括如下步骤的方法得到含有下丘脑组织和垂体组织的细胞结构体，所述步骤为：将人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，将该步骤中形成的细胞凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤，以及将该步骤中得到的细胞凝集块在适于垂体和下丘脑的同时诱导的培养基中进行悬浮培养的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及将人多能干细胞分化为下丘脑神经元的技术及其应用。本申请主张基于2016年1月22日提出申请的日本专利申请第2016－10940号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照援引入本说明书中。
背景技术
下丘脑是用于维持成长·***·代谢·应激反应·生殖·哺乳保育·免疫等人体内稳态的中枢。特别是最近，对伴随糖尿病等生活习惯病的增加的食欲控制的关注提高，而食欲中枢也存在于下丘脑。此外，作为下丘脑激素之一的催产素除了一直以来所说到的排乳·子宫收缩效果以外，还与信任关系、爱情有关的报告增加，表明其是与人的生活密切相关的激素。
如果下丘脑产生异常，则不进行正常的激素分泌，引起中枢性尿崩症等疾病、摄食障碍、睡眠障碍等。对因下丘脑的异常所致的激素分泌不足进行激素补充疗法。但是，激素补充疗法存在限制，大多得不到充分的效果。本来，激素的分泌量对应于环境的变化而进行调节。通过来自外部的补充再现这样的生物体所具备的调节机构事实上可以说是不可能的。
由于下丘脑位于大脑的深部，并且是较小的区域，因此，难以将实际的组织取出而用于研究。另一方面，尝试由ES细胞等多能干细胞制作下丘脑神经元。例如，2008年Wataya等开发了SFEBq法，确立了由小鼠ES细胞分化诱导下丘脑AVP产生细胞的方法(非专利文献1)。在SFEBq法中使用不含血清、生长因子的gfCDM培养基，在非粘附的板内使细胞凝集而进行三维悬浮培养，分化为神经组织。2015年，Merkle等使用三维悬浮培养和二维平面培养这2种方法，成功由人ES细胞和iPS细胞分化诱导为下丘脑神经元(非专利文献2)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Wataya T.et al.,Minimization of exogenous signals in EScell culture induces rostral hypothalamic differentiation.Procnatl Acad SciUSA 105(33):11796-11801(2008).
非专利文献2：Merkle FT et al.,Generation ofneuropeptidergichypothalamicneurons from human pluripotent stem cells.Development.2015 Feb15；142(4):633-43.
非专利文献3：Ozone C et al.,Functional anterior pituitary generated inself-organizing culture of human embryonic stem cells.nat Commun.2016 Jan 14；7:10351.。
发明内容
如上所述，尝试了将多能干细胞分化诱导为下丘脑神经元。但是，在Wataya等的方法中，人ES细胞时未顺利地分化。另外，在Merkle等的方法中，三维培养时AVP分化效率非常差(分化效率为0.2％左右)，二维培养中未成功地进行AVP神经元的分化。
如果能够确立将人多能干细胞(ES细胞、iPS细胞)分化诱导为下丘脑神经元的方法，换言之构建下丘脑组织的方法，则针对下丘脑障碍的治疗法的开发大幅前进。例如，能够开发使用由中枢性尿崩症患者建立的疾病特异性iPS细胞的病理解析、治疗法。另外，也可期待应用于移植医疗。
另一方面，由于下丘脑和垂体原本功能上是不可分开的，因此，下丘脑和垂体功能上一体化的结构体是对将下丘脑和/或垂体作为靶的新药筛选等极其有效的工具。另外，该结构体作为对下丘脑和/或垂体的功能障碍的移植材料，有用性也高。
在以上的背景下，本发明的第1课题在于提供将人多能干细胞高效地分化诱导为下丘脑神经元的方法。另外，第2课题在于提供由人多能干细胞构建下丘脑组织和垂体组织一体化的细胞结构体的方法。
本发明人等为了解决上述课题反复进行了研究。首先，Merkle等的方法未必是按照发生的顺序的分化法，由它们的结果进行推测，认为分化为下丘脑中的腹侧。通常在下丘脑内背侧确认到AVP神经元。因此，本发明人等对依次再现发生的各阶段的分化条件进行检索并优化，由此进一步精密地控制下丘脑内的诱导位置，作为结果认为可得到背侧下丘脑的AVP神经元。作为各分化步骤的标记物，设定作为下丘脑初始标记物的Rx(retina andanteriorneural fold homeobox)，接着设定作为背侧标记物的Pax6(paired box 6)，然后设定作为AVP的真正的(Bona fide)标记物的Otp(orthopedia homeobox)和Brn2(也作为POU3F2、POU class 3 homeobox 2等已知)，最后设定AVP。
首先，遵循Wataya等的方法(非专利文献1)，仅使用不含生长因子的化学合成培养基(growth-factor-free Chemica11y Defined Medium；gfCDM)尝试分化，结果细胞未顺利地形成凝集块。认为营养不足是原因，将血清代替物KSR少量添加到培养基中，结果虽然形成了凝集块，但位置信息向端脑偏离。因此，加入BMP4信号，结果虽然作为下丘脑标记物的Rx和作为背侧标记物的Pax6均成为阳性，但视网膜标记物Chx10也成为阳性，判明成为神经视网膜。因此，加入腹侧化因子的Shh(Sonic hedgehog)信号(作为Shh激动剂的SAG)，结果能够分化为下丘脑祖细胞。
进一步进行研究，结果调整KSR浓度、BMP4信号和Shh信号(SAG)的浓度，并且通过有无添加少量的其它作为腹侧化信号的Akt抑制剂，成功地分别制作背侧下丘脑和腹侧下丘脑。即，发现背侧下丘脑诱导条件和腹侧下丘脑诱导条件。在背侧下丘脑诱导条件下继续悬浮培养，结果确认到Otp和Brn2的表达，在培养第100天确认到AVP的表达，但其数量微少。因此，并入对神经产生有利的分散培养，结果在培养第150天确认到AVP神经元的出现。另外，确认到该AVP神经元实际上分泌AVP激素。进而，AVP神经元在刺激试验中显示良好的反应性。
确认到如果在背侧下丘脑诱导条件或腹侧下丘脑诱导条件下进行培养，则也能够分化诱导AVP神经元以外的下丘脑神经元。在腹侧下丘脑条件下继续培养时，比背侧下丘脑诱导条件高效地确认到MCH神经元等腹侧下丘脑神经元。
另一方面，通过组合下丘脑神经元成熟条件(分散培养用培养基的使用)，并调整各阶段的条件，成功地由一个细胞块分化·成熟下丘脑和垂体这两者。
如上所述，本次研究的结果，与Merkle等的方法相比，能够更高效地分化诱导为下丘脑神经元(例如AVP神经元)。另外，能够准确地分别制作下丘脑的背侧和腹侧，结果能够更精密地控制分化诱导本身。不仅能够分化诱导AVP神经元，而且也能够分化诱导产生也被称为爱情激素的催产素的神经元、与食欲相关的多个下丘脑激素产生神经元。进而，也成功地构建了下丘脑和垂体功能上一体化的结构体。
以下的发明主要基于上述成果。
[1]一种含有下丘脑组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：
(1)将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，
(2)将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(2)。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，进一步包括以下的步骤(3)：
(3)回收步骤(2)中得到的细胞凝集块，将构成细胞凝集块的细胞进行分散培养的步骤。
[4]根据[3]所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(3)。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，
步骤(1)中的所述骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4，培养基中的其浓度为0.1nM～5.0nM，
步骤(1)和(2)中的所述作用于Shh信号通路的物质为SAG，培养基中的其浓度为0.1μM～2.0μM，
通过所述步骤(1)和(2)来诱导向背侧下丘脑组织的分化。
[6]根据[5]所述的制造方法，其中，所述背侧下丘脑组织包含选自血管加压素神经元、催产素神经元、促甲状腺激素释放激素神经元、促肾上腺皮质激素释放激素神经元和神经肽Y神经元中的一种以上的神经元。
[7]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，
步骤(1)中的所述骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4，培养基中的其浓度为0.1nM～3.0nM，
步骤(1)和(2)中的所述作用于Shh信号通路的物质为SAG，培养基中的其浓度为0.1μM～2.0μM，
所述培养基进一步含有Akt抑制剂，
通过所述步骤(1)和(2)来诱导向腹侧下丘脑组织的分化。
[8]根据[7]所述的制造方法，其中，所述腹侧下丘脑组织包含选自刺鼠相关蛋白神经元、前阿黑皮素原神经元、黑色素凝集激素神经元和食欲素神经元中的一种以上的神经元。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制造方法，其中，在饲养细胞的非存在下进行所述悬浮培养。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制造方法，其中，步骤(1)中的所述凝集块通过分散的人多能干细胞的悬浮培养而形成。
[11]根据[10]所述的制造方法，其中，通过无血清凝集悬浮培养法进行所述悬浮培养。
[12]一种含有下丘脑组织和垂体组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(i)～(iii)：
(i)将人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，
(ii)将步骤(i)中形成的细胞凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤，
(iii)将步骤(ii)中得到的细胞凝集块在适于垂体和下丘脑的同时诱导的培养基中进行悬浮培养的步骤。
[13]根据[12]所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(ii)和(iii)。
[14]根据[12]或[13]所述的制造方法，其中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间进行以下的步骤(a)，在步骤(iii)中，将步骤(a)中得到的细胞凝集块进行悬浮培养，
(a)将步骤(ii)中得到的细胞凝集块在含有作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。
[15]根据[12]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(a)。
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的制造方法，其中，在饲养细胞的非存在下进行所述悬浮培养。
[17]根据[12]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，步骤(i)中的所述凝集块通过分散的人多能干细胞的悬浮培养而形成。
[18]根据[12]～[17]中任一项所述的制造方法，其中，骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4。
[19]根据[12]～[18]中任一项所述的制造方法，其中，作用于Shh信号通路的物质为SAG。
[20]一种细胞结构体，是通过[1]1～[19]中任一项所述的制造方法而得到的。
附图说明
图1是小鼠ES细胞向AVP神经元的分化(左)和人ES细胞的培养结果(右)。即使将小鼠ES细胞中有效的分化法应用于人ES细胞，也未形成细胞块。AVP：绿色。
图2是使用以低浓度含有血清代替物KSR的培养基的分化。形成凝集块(左)，但分化为端脑(右)。Rx::Venus：绿色、Bf1：红色、DAPI：蓝色。
图3是使用以低浓度含有血清代替物KSR且含有BMP4信号的培养基的分化。下丘脑标记物Rx和背侧标记物Pax6均成为共阳性，但视网膜标记物Chx10也成为阳性。Rx::Venus：绿色、Pax6：红色、Nkx2.1(NKX2-1nK2 homeobox 1)：白色、DAPI：蓝色、Chx10：红色。
图4是使用以低浓度含有血清代替物KSR、含有BMP4信号且含有Shh信号(作为Shh激动剂的SAG)的培养基的分化。能够分化为下丘脑祖细胞(左)。Rx::Venus：绿色、Pax6：红色、Nkx2.1：白色、DAPI：蓝色。下丘脑祖细胞的分化效率超过80％(右)。
图5是在背侧下丘脑诱导条件下的培养第30天的细胞结构体(左)和在腹侧下丘脑诱导条件下的培养第30天的细胞结构体(右)。Rx::Venus：绿色、Pax6：红色、Nkx2.1：白色、DAPI：蓝色。
图6是在背侧下丘脑诱导条件下的培养第60天的细胞结构体。Opt：红色、DAPI：蓝色、Brn2：白色。
图7是在背侧下丘脑诱导条件(没有分散培养)下的培养第103天的细胞结构体。AVP：红色、DAPI：蓝色。
图8是在背侧下丘脑诱导条件(有分散培养)的培养第150天的细胞结构体。AVP：红色、DAPI：蓝色。
图9是在背侧下丘脑诱导条件(有分散培养)下构建的细胞结构体所产生的AVP激素的测定结果(左)和KCl刺激试验的结果(右)。
图10是在背侧下丘脑诱导条件(有分散培养)下的培养第130～150天的细胞结构体中所确认到的下丘脑神经元(下)和各下丘脑神经元在生物体中的定位(上)。OXT：绿色、TRH：红色、CRH：红色、NPY：红色、AgRP：红色、POMC：红色、MCH：红色、食欲素：绿色。
图11是各下丘脑神经元的分化效率的比较。以每1000个神经细胞的免疫染色阳性神经元的数量进行比较。
图12是在腹侧下丘脑诱导条件下的培养第150天的细胞结构体。MCH：红色、DAPI：蓝色。
图13是在下丘脑和垂体的同时成熟条件下的培养第150天的细胞结构体。DAPI：蓝色、CRH：绿色、ACTH：红色。
图14是背侧下丘脑诱导法的概略图。
图15是腹侧下丘脑诱导法的概略图。
图16是下丘脑和垂体的同时成熟法的概略图(前半)。
图17是下丘脑和垂体的同时成熟法的概略图(后半)。
图18是使人iPS细胞(201B7株)分化而得到的下丘脑AVP神经元的免疫染色图像。AVP：绿色、DAPI：蓝色。
图19是在下丘脑和垂体的同时成熟条件下培养人iPS细胞而得到的结构体的ACTH分泌能力。＊p<0.05、＊＊p<0.01
图20是将垂体(前叶)和下丘脑分离，仅培养垂体(前叶)的情况(A)与使垂体(前叶)和下丘脑再次邻接而培养的情况(B)的ACTH分泌能力的比较。测定培养第150天的培养液中的ACTH浓度(右)。＊p<0.05
图21是表示利用CRH的ACTH刺激试验的概要的示意图(右)和试验结果(左)。＊p<0.05。中央为免疫染色图像。DAPI：蓝色、ACTH：绿色、CRH-R1：红色。
图22是表示利用***的ACTH抑制试验的概要的示意图(右)和试验结果(左)。＊p<0.05
图23为表示利用CRH-R1抑制剂的ACTH抑制试验的概要的示意图(右)和试验结果(左和中央)。＊p<0.05
图24是表示利用低葡萄糖的ACTH分泌试验和低葡萄糖+CRH-R1抑制剂负荷试验的概要的示意图(右)和试验结果(左和中央)。＊p<0.05、＊＊p<0.01
图25为利用已有报道的方法进行分化诱导而得到的结构体的免疫染色图像(左、中央)和对应的示意图(右)。ACTH：红色、Lim3：绿色、Rx：绿色、AVP：红色。
具体实施方式
1.含有下丘脑组织的细胞结构体的制造方法
本发明的第1方面涉及制造含有下丘脑组织的细胞结构体的方法。下丘脑由弓状核、室旁核、室周核、视上核、视前核、背内侧下丘脑核、腹内侧下丘脑核、后核等构成。下丘脑中存在兼具神经细胞和内分泌细胞这两者的功能的细胞群。可以将下丘脑根据其位置关系大致分为背侧下丘脑和腹侧下丘脑。背侧下丘脑和腹侧下丘脑各自存在特征性神经细胞(下丘脑神经元)。下丘脑中主要在靠近背侧确认到定位的神经细胞有血管加压素(AVP)神经元、催产素(OXT)神经元、促甲状腺激素释放激素(TRH)神经元、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元、神经肽Y(NPY)神经元等，主要靠近腹侧确认到定位的神经细胞有刺鼠相关蛋白(AgRP)神经元、前阿黑皮素原(POMC)神经元、黑色素凝集激素(MCH)神经元、食欲素神经元等。
本发明中，作为统称背侧下丘脑和腹侧下丘脑的术语，使用丘脑组织。因此，只要没有特别提及，术语“下丘脑组织”是指背侧下丘脑或腹侧下丘脑、或者包括这两者的组织。
本发明的制造方法中，进行以下的步骤(1)和(2)。
(1)将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤
(2)将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤
步骤(1)
步骤(1)中，首先，准备人多能干细胞的凝集块。“人多能干细胞”是指兼具可分化为构成生物体的全部细胞的能力(分化多能性)和经过细胞***而生出具有与自身相同的分化能力的子细胞的能力(自我复制能力)的人细胞。分化多能性可通过将评价对象的细胞移植到裸鼠中，测验有无形成包含三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的各自的细胞的畸胎瘤而进行评价。
作为多能干细胞，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)等，只要是兼具分化多能性和自我复制能力的细胞，就不限定于此。本发明中，优选使用ES细胞或iPS细胞。
ES细胞例如可以通过培养着床以前的早期胚胎、构成该早期胚胎的内部细胞块、单卵裂球等而建立(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)；Thomson，J.A.et al.，Science，282，1145-1147(1998))。作为早期胚胎，可以使用通过将体细胞的核进行核移植而制作的早期胚胎(Wilmut et al.(Nature，385，810(1997))、Cibelli et al.(Science，280，1256(1998))、入谷明等(蛋白质核酸酶，44，892(1999))、Baguisi et al.(NatureBiotechnology，17，456(1999))、Wakayama et al.(Nature，394，369(1998)；natureGenetics，22，127(1999)；Proc.natl.Acad.Sci.USA，96，14984(1999))、Rideout III etal.(Nature Genetics，24，109(2000)、Tachibana et al.(Human Embryonic Stem CellsDerived by Somatic Cellnuclear Transfer,Cell(2013)in press)。作为早期胚胎，可以使用孤雌胚胎Kim et al.(Science，315，482-486(2007))、Nakajima et al.(Stem Cells，25，983-985(2007))、Kim et al.(Cell Stem Cell，1，346-352(2007))、Revazova et al.(Cloning Stem Cells，9，432-449(2007))、Revazova et al.(Cloning Stem Cells，10，11-24(2008))。除上述的论文之外，关于ES细胞的制作，参考Strelchenkon.,et al.ReprodBiomed Online.9:623-629,2004；Klimanskaya I.,et al.nature 444:481-485,2006；Chung Y.,et al.Cell Stem Cell 2:113-117,2008；Zhang X.,et al Stem Cells 24:2669-2676,2006；Wassarman,P.M.et al.Methods in Enzymology,Vol.365,2003等。此外，通过ES细胞和体细胞的细胞融合而得到的融合ES细胞也包含于本发明的方法所使用的胚胎干细胞。
ES细胞也有能够从保藏机构获得的细胞或者市售的细胞。例如，对于人ES细胞，能够从京都大学再生医科学研究所(例如KhES-1、KhES-2和KhES-3)、WiCell ResearchInstitute、ESI BIO等获得。
EG细胞可以通过将原始生殖细胞在LIF、bFGF、SCF的存在下进行培养等而建立(Matsui et al.，Cell，70，841-847(1992)、Shamblott et al.，Proc.natl.Acad.Sci.USA，95(23),13726-13731(1998)、Turnpenny et al.，Stem Cells，21(5)，598-609，(2003))。
“诱导多能干细胞(iPS细胞)”是通过初期化因子的导入等将体细胞(例如成纤维细胞、皮肤细胞、淋巴细胞等)进行重编程，由此制作的具有分化多能性和自我复制能力的细胞。iPS细胞显示与ES细胞接近的性质。iPS细胞的制作中使用的体细胞没有特别限定，可以为分化的体细胞，也可以为未分化的干细胞。iPS细胞可以通过迄今为止报告的各种方法而制作。另外，认为也可想到应用今后开发的iPS细胞制作法。
iPS细胞制作法的最基本的方法为利用病毒将作为转录因子的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc这4种因子导入细胞的方法(Takahashi K,Yamanaka S:Cell 126(4),663-676,2006；Takahashi,K,et al:Cell 131(5),861-72,2007)。关于人iPS细胞，有通过Oct4、Sox2、Lin28和Nonog这4种因子的导入而建立的报告(Yu J,et al:Science 318(5858),1917-1920,2007)。也报告了通过除c-Myc以外的3种因子(Nakagawa M,et al:nat.Biotechnol.26(1),101-106,2008)、Oct3/4和Klf4这2种因子(Kim J B,et al:nature454(7204),646-650,2008)或者仅Oct3/4(Kim J B,et al:Cell136(3),411-419,2009)的导入而建立iPS细胞。另外，也报告了将作为基因的表达产物的蛋白质导入细胞的方法(Zhou H,Wu S,Joo JY,et al:Cell Stem Cell 4,381-384,2009；Kim D,Kim CH,Moon JI,et al:Cell Stem Cell 4,472-476,2009)。另一方面，也有通过使用针对组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294、组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)或BayK8644等，能够提高制作效率、减少导入的因子等(Huangfu D,et al:nat.Biotechnol.26(7),795-797,2008；Huangfu D,et al:nat.Biotechnol.26(11),1269-1275,2008；Silva J,et al:PLoS.Biol.6(10),e 253,2008)。对基因导入法也进行了研究，开发了除逆转录病毒以外，还将慢病毒(Yu J,et al:Science 318(5858),1917-1920,2007)、腺病毒(Stadtfeld M,etal:Science 322(5903),945-949,2008)、质粒(Okita K,et al:Science 322(5903),949-953,2008)、转座子载体(Woltjen K,Michael IP,Mohseni P,et al:nature 458,766-770,2009；Kaji K,norrby K,Pac a A,et al:nature 458,771-775,2009；Yusa K,Rad R,Takeda J,et al:nat Methods 6,363-369,2009)或游离型载体(Yu J,Hu K,Smuga-OttoK,Tian S,et al:Science 324,797-801,2009)利用于基因导入的技术。
产生向iPS细胞的转化，即初期化(重编程)的细胞可以将Fbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1和Cript等多能干细胞标记物(未分化标记物)的表达等作为指标而进行选择。
iPS细胞例如也可接受由国立大学法人京都大学或独立行政法人理化学研究所生物资源中心的提供。
人多能干细胞可以通过公知的方法，在生物体外(in vitro)维持。将临床应用纳入视野的情况等、期望提供安全性高的细胞的情况下，优选通过使用血清代替物(Knockoutserum replacement(KSR)等)的无血清培养、无饲养细胞培养来维持多能干细胞。如果使用(或并用)血清，则使用自体血清(即接受者的血清)即可。
步骤(1)中使用的“人多能干细胞的凝集块”可以通过将分散的人多能干细胞在相对于培养器为非粘附性的条件下进行培养(即，悬浮培养)，使多个人多能干细胞集合而形成凝集块，从而得到。
用于该凝集块形成的培养器没有特别限定。例如可以使用烧瓶、组织培养用瓶、皿、陪替培养皿、组织培养用皿、多联皿(multi-dish)、微平板、微孔板、微孔、多联盘、多孔板、室载玻片、培养皿(schale)、管、托盘、培养袋、滚瓶等。为了能够进行非粘附性的条件下的培养，优选使用具有细胞非粘附性的培养面的培养器。作为符合的培养器，可举出以成为培养器的细胞非粘附性的方式进行表面(培养面)处理的培养器，对表面(培养面)没有实施用于提高细胞的粘附性的处理(例如，利用细胞外基质等的包被处理)的培养器。
用于凝集块的形成的培养基可以将哺乳动物细胞的培养中使用的培养基作为基础培养基来进行制备。作为基础培养基，例如只要是BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s培养基、Ham’s F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基以及它们的混合培养基等能够用于哺乳动物细胞的培养的培养基就没有特别限定。在一个方式中，可以使用IMDM培养基和Ham’s F-12培养基的混合培养基。混合比以容量比计例如为IMDM：Ham’s F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8。
也可以使用含血清培养基、无血清培养基中的任一者。无血清培养基是不含血清的培养基。含有精制的来自血液的成分、来自动物组织的成分(例如，增殖因子)的培养基只要不含血清自身，则属于无血清培养基。从为了避免未知的或者无意的成分的混入等观点出发，优选使用无血清培养基。
用于凝集块的形成的培养基可以含有血清代替物。血清代替物例如可含有白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’巯基甘油或它们的等价物等。可以通过公知的方法(例如参照WO98/30679)制备血清代替物。也可以使用市售的血清代替物。作为市售的血清代替物例子，可举出KSR(Invitrogen公司制)、化学成分确定的浓缩脂质(Gibco公司制)、Glutamax(Gibco公司制)。
用于凝集块的形成的培养基可以以不对由人多能干细胞分化诱导为目标组织造成不良影响作为条件而含有其它添加物。作为此处的添加物，例如可举出胰岛素、铁源(例如转铁蛋白等)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)。
例如，在形成人多能干细胞的凝集块时，首先，从传代培养回收人多能干细胞。将其分散至单个细胞或与其接近的状态。人多能干细胞的分散可以使用适当的细胞解离液进行。作为细胞解离液，例如可以单独或适当组合使用EDTA-胰蛋白酶、胶原酶IV、金属蛋白酶等蛋白分解酶等。优选细胞毒性少的细胞解离液。作为这样的细胞解离液，例如能够获得Dispase(EIDIA)、TrypLE(Invitrogen)或Accutase(MILLIPORE)等市售品。分散的人多能干细胞悬浮在上述培养基中。
将分散的人多能干细胞的悬浮液接种在培养器中，将分散的人多能干细胞在相对于培养器为非粘附性的条件下进行培养，由此多个人多能干细胞集合而形成凝集块。此时，将分散的人多能干细胞接种于较大的培养器(例如10cm皿)，在1个培养隔室中可以同时形成多个人多能干细胞的凝集块，但如果如此进行，则每个凝集块的大小、凝集块中所含的人多能干细胞的数量有可能产生较大的不均。而且，由于该不均，在凝集块间，分化的程度产生差异，作为结果导致分化诱导效率降低。因此，优选使分散的人多能干细胞迅速地凝集，在1个培养隔室中形成1个凝集块。作为使分散的人多能干细胞迅速地凝集的方法，例如可举出以下的方法(1)和(2)。
(1)在较小的体积(例如，1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下)的培养隔室中封入分散的人多能干细胞，在隔室中形成1个凝集块。优选封入分散的人多能干细胞后，将培养隔室静置。作为培养隔室，可举出多孔板(384孔、192孔、96孔、48孔、24孔等)、微孔、室载玻片等中的孔、管、悬滴法中的培养基的液滴等，但并不限定于此。封入隔室的分散的人多能干细胞由于重力而沉淀于1个部位，或者细胞彼此粘附，由此每1个隔室中形成1个凝集块。多孔板、微孔、室载玻片、管等的底部的形状优选为U型底或V型底以便使分散的人多能干细胞容易沉淀于1个部位。
(2)将分散的人多能干细胞放入离心管进行离心，使人多能干细胞沉淀于1个部位。在管中形成1个凝集块。
接种在1个培养隔室中的人多能干细胞的数量只要是每1个培养隔室中形成1个凝集块，且可以通过本发明的方法在该凝集块中由人多能干细胞分化诱导为目标组织(下丘脑组织、下丘脑和垂体组织)就没有特别限定，每1个培养隔室中通常接种约1×103～约5×104个，优选约1×103～约2×104个，更优选约2×103～约1.2×104个人多能干细胞。然后，通过使人多能干细胞迅速地凝集，每1个培养隔室中形成1个通常由约1×103～约5×104个，优选约1×103～约2×104个，更优选约2×103～约1.2×104个人多能干细胞构成的细胞凝集块。
至凝集块形成为止的时间可以在每1个培养隔室中形成1个凝集块，且可以通过本发明的方法在该凝集块中由人多能干细胞分化诱导为目标组织的范围内适当确定，但为了高效地分化诱导为目标组织，优选该时间短。优选在24小时以内、更优选在12小时以内、进一步优选在6小时以内、最优选在2～3小时内形成人多能干细胞的凝集块。对于该至凝集块形成为止的时间，本领域技术人员可以通过用于使细胞凝集的装置、条件(例如离心处理的条件)等的设定或调整而适当地调节。
凝集块形成时的培养温度、CO2浓度等其它培养条件可适当设定。培养温度没有特别限定，例如为约30～40℃，优选为约37℃。另外，CO2浓度例如为约1～10％，优选为约5％。
准备多个相同培养条件的培养隔室，在各培养隔室中形成1个人多能干细胞的凝集块，由此能够质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团。人多能干细胞的凝集块为质量均匀可以基于凝集块的尺寸和细胞数量、宏观形式、通过组织染色解析得到的微观形态及其均匀性、分化和未分化标记物的表达及其均匀性、分化标记物的表达控制及其同步性、分化效率的凝集块间的再现性等进行评价。在一个方式中，对于本发明的方法中使用的人多能干细胞的凝集块的集团，凝集块中所含的人多能干细胞的数量是均匀的。对于特定的参数，人多能干细胞的凝集块的集团“均匀”是指凝集块的集团整体中的90％以上的凝集块在该凝集块的集团中的该参数的平均值±10％的范围内，优选为平均值±5％的范围内。
在步骤(1)中，将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。
将凝集块进行“悬浮培养”是指将凝集块在培养基中，在相对于培养器为非粘附性的条件下进行培养。悬浮培养中所使用的培养基含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质。通过骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的作用，诱导人多能干细胞向下丘脑的分化。
用于悬浮培养的培养器没有特别限定。例如可以使用烧瓶、组织培养用瓶、皿、陪替培养皿、组织培养用皿、多联皿(multi-dish)、微平板、微孔板、微孔、多联盘、多孔板、室载玻片、培养皿(schale)、管、托盘、培养袋、滚瓶等。为了能够进行非粘附性的条件下的培养，优选使用具有细胞非粘附性的培养面的培养器。作为符合的培养器，可举出以成为培养器的细胞非粘附性的方式进行表面(培养面)处理的培养器，对表面(培养面)没有实施用于提高细胞的粘附性的处理(例如，利用细胞外基质等的包被处理)的培养器。
作为用于悬浮培养的培养器，可以使用氧透过性的培养器。通过使用氧透过性的培养器，向细胞凝集块的氧的供给提高，能够有助于细胞凝集块的长时间的维持培养。
在细胞凝集块的悬浮培养时，只要能够维持细胞凝集块相对于培养器的非粘附状态，则可以将细胞凝集块进行静置培养，也可以通过旋转培养、振荡培养有意地移动凝集块。但是，在本发明中，不需要通过旋转培养、振荡培养来有意地移动凝集块。即，在一个方式中，本发明的制造方法中的悬浮培养通过静置培养来进行。静置培养是指在不使凝集块有意地移动的状态下进行培养的培养法。例如，有伴随局部的培养基温度的变化而培养基对流，由于该流动而凝集块移动的情况，但由于未有意地使凝集块移动，因此，这样的情况也属于静置培养。可以经过悬浮培养的整个期间实施静置培养，也可以仅部分时间实施静置培养。在优选的方式中，经过悬浮培养的整个期间进行静置培养。静置培养具有不需要特别的装置、可期待细胞块的损伤也少、也能够减少培养液的量等许多优点。
可以在饲养细胞的存在下/非存在下的任一条件下进行细胞凝集块的悬浮培养，但从避免未确定因子的混入的观点出发，优选在饲养细胞的非存在下进行细胞凝集块的悬浮培养。
细胞凝集块的悬浮培养中的培养温度、CO2浓度、O2浓度等其它培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度例如为约1～10％，优选为约5％。O2浓度例如为约20％。
在本发明中，骨形态发生因子信号转导通路激活物质是指通过骨形态发生因子与受体的结合而激活传导信号的通路的物质。作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质的例子，可举出BMP2、BMP4、BMP7、GDF5等。优选使用BMP4作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质。以下，主要对BMP4进行记载，但本发明中所使用的骨形态发生因子信号转导通路激活物质并不限定于BMP4。BMP4是公知的细胞因子，其氨基酸序列也是公知的。本发明中使用的BMP4为哺乳动物的BMP4。作为哺乳动物，例如可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔子等实验动物、猪、牛、山羊、马、绵羊等家畜、狗、猫等宠物、人、猴子、猩猩、黑猩猩等灵长类。BMP4优选为啮齿类(小鼠、大鼠等)或灵长类(人等)的BMP4，最优选为人BMP4。人BMP4是指具有在人体内天然表达的BMP4的氨基酸序列的BMP4。作为人BMP4的代表性的氨基酸序列，可举出NCBI的登记号NP_001193.2(2013年6月15日更新)、NP_570911.2(2013年6月15日更新)、NP_570912.2(2013年6月15日更新)、分别从这些氨基酸序列中除去N末端信号序列(1-24)而得到的氨基酸序列(成熟型人BMP4氨基酸序列)。
本发明的作用于Shh信号通路的物质只要是能够增强由Shh介导的信号传导的物质就没有特别限定。作为作用于Shh信号通路的物质，例如可举出属于Hedgehog家族的蛋白(例如Shh)、Shh受体、Shh受体激动剂、Purmorphamine，Smoothened Agonist(SAG)(3-氯-N-[反式-4-(甲基氨基)环己基]-N-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]-苯并[b]噻吩-2-甲酰胺)和Hh-Ag1.5(3-氯-4,7-二氟-N-(4-(甲基氨基)环己基)-N-(3(吡啶-4-基)苄基)苯并[b]噻吩-2-甲酰胺)。特别优选SAG。
骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的优选的组合BMP4和SAG的组合。
在本发明中，为了诱导向下丘脑组织的分化，使用含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基。在一个方式(以下，称为“第1方式”)中，诱导向背侧丘脑组织的分化。在该方式中，使用BMP4作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质时的“低浓度”例如为0.1nM～5.0nM，优选为0.5nM～4.0nM，进一步优选为1.0nM～3.0nM。骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度在遍及步骤(1)的所有时期可以不是恒定的。例如，从悬浮培养开始起3天～8天(具体例为6天)可以不在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质，然后，在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质。另外，可以在培养中途降低骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度。例如，从悬浮培养开始起3天～8天(具体例为6天)不在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质，之后的6天～12天(具体例为9天)设为培养基中的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度较高的条件(例如使用含有1.0nM～3.0nM的BMP4的培养基)，接下来的1天～5天(具体例为3天)，在培养基中的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度降低的条件(例如使用含有0.5nM～1.5nM的BMP4的培养基)下进行培养。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
另一方面，在第1方式中，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时的“低浓度”例如为0.1μM～2.0μM，优选为0.2μM～1.5μM，进一步优选为0.3μM～1.0μM。作用于Shh信号通路的物质的浓度在遍及步骤(1)的所有期间可以不是恒定的。例如，从悬浮培养开始起3天～8天(具体例为6天)可以不在培养基中添加作用于Shh信号通路的物质，然后，在培养基中添加作用于Shh信号通路的物质。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
在另一个方式(以下，称为“第2方式”)中，诱导向腹侧下丘脑的分化。在该方式中，使用BMP4作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质时的“低浓度”例如为0.1nM～3.0nM，优选为0.3nM～2.0nM，进一步优选为0.5nM～1.5nM。骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度在遍及步骤(1)的所有期间可以不是恒定的。例如，从悬浮培养的开始至3日～8日(具体例为6日)可以不在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质，然后，在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质。另外，可以在培养中途降低骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度。例如，从悬浮培养开始起3天～8天(具体例为6天)不在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质，之后的6天～12天(具体例为9天)设为培养基中的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度为较高的条件(例如使用含有0.5nM～1.5nM的BMP4的培养基)，接下来的1天～5日(具体例为3天)在培养基中的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度降低的条件(例如使用含有0.25nM～0.75nM的BMP4的培养基)下进行培养。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
另一方面，在第2方式中，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时的“低浓度”例如为0.1μM～2.0μM，优选为0.2μM～1.5μM，进一步优选为0.3μM～1.0μM。作用于Shh信号通路的物质的浓度在遍及步骤(1)的所有期间可以不是恒定的。例如，从悬浮培养开始起3天～8天(具体例为6天)可以不在培养基中添加作用于Shh信号通路的物质，然后，在培养基中添加作用于Shh信号通路的物质。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
对于使用BMP4以外的骨形态发生因子信号转导通路激活物质时应采用的浓度，即“低浓度”的范围，考虑到使用的物质的特性和BMP4的特性的不同(特别是活性的不同)，本领域技术人员可依照上述浓度范围进行设定。另外，设定的浓度范围是否适当可通过依照后述的实施例的预备实验来确认。使用SAG以外的作用于Shh信号通路的物质的情况也是同样的。如此，对关于骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的“低浓度”而言，本领域技术人员可以在不伴有特别困难的情况下认识且理解。
第2方式中使用的培养基优选除低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质以外还含有Akt抑制剂。Akt抑制剂作为腹侧化信号发挥作用，促进向腹侧下丘脑的有效的分化。作为Akt抑制剂，可以使用Akt抑制剂VIII(1,3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑并[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮，例如Calbiochem公司提供)。Akt抑制剂的浓度可根据使用的Akt抑制剂的不同而变动，例如在使用Akt抑制剂VIII的情况下，例如为0.1μM～2.0μM，优选为0.2μM～1.5μM，进一步优选为0.3μM～1.0μM。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
为了抑制通过分散而诱导的人多能干细胞的细胞死亡，步骤(1)中使用的培养基优选从培养开始时添加Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂(参照日本特开2008－99662号公报)。从培养开始起例如15天以内、优选10天以内、更优选6天以内添加ROCK抑制剂。作为ROCK抑制剂，可举出Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)等。ROCK抑制剂可以以能够抑制通过分散而诱导的人多能干细胞的细胞死亡的浓度使用。例如，在使用Y-27632的情况下，例如为约0.1～200μM，优选为约2～50μM的浓度。可以在添加期间内变动ROCK抑制剂的浓度，例如可以在添加期间的后半使浓度减半。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
用于悬浮培养的培养基可以将哺乳动物细胞的培养中所使用的培养基作为基础培养基来进行制备。作为基础培养基，例如只要是BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、G1asgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s培养基、Ham’s F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基以及它们的混合培养基等能够用于哺乳动物细胞的培养的培养基就没有特别限定。在一个方式中，可以使用IMDM培养基和Ham’s F-12培养基的混合培养基。混合比以容量比计例如为IMDM：Ham’s F-12＝0.8～1.2：1.2～0.8。
也可以使用含血清培养基、无血清培养基中的任一者。从为了避免未知的或者无意的成分的混入等观点出发，优选使用无血清培养基。
用于悬浮培养的培养基可以含有血清代替物。血清代替物，例如可含有白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇或3’巯基甘油、或者它们的等价物等。可通过公知的方法(例如参照WO98/30679)制备血清代替物。也可使用市售的血清代替物。作为市售的血清代替物的例子，可举出KSR(Invitrogen公司制)、化学成分确定的浓缩脂质(Gibco公司制)、Glutamax(Gibco公司制)。
细胞凝集块的悬浮培养中所使用的培养基可以以不对由人多能干细胞分化诱导为目标组造成不良影响作为条件而含有其它添加物。作为此处的添加物，例如可举出胰岛素、铁源(例如转铁蛋白等)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。
在一个方式中，从不对向目标组织的分化诱导造成不良影响的观点出发，悬浮培养中所使用的培养基为在本说明书中明确记载包含于培养基的培养基以外的不含生长因子的化学合成培养基(growth-factor-free Chemically Defined Medium；gfCDM)中添加血清代替物(KSR等)的培养基。此处的“生长因子”包含Fgf；BMP；Wnt、Noda1、Notch、Shh等模式形成因子(pattern formation factor)、胰岛素和富脂白蛋白。作为不含生长因子的化学合成培养基，例如可举出Wataya et al，Procnatl Acad Sci USA，105(33):11796-11801，2008中公开的gfCDM。
步骤(1)中，进行由未分化细胞向下丘脑的分化的初始定向。作为步骤(1)的初始定向的结果，在经过接下来的步骤(2)的过程中，可靠地向背侧或腹侧下丘脑分化。例如，步骤(2)中向背侧下丘脑分化诱导时，典型而言在培养开始30天后左右显示背侧下丘脑特有的性质(Pax6表达等)(参照图5)
通过进行步骤(1)的培养，能够得到将来能够成为下丘脑的细胞的凝集块，即，下丘脑祖细胞的凝集块。步骤(1)例如实施至培养中的细胞凝集块中10％以上、优选30％以上、更优选50％以上的细胞凝集块含有下丘脑祖细胞即可。下丘脑祖细胞例如可通过RT-PCR、使用下丘脑祖细胞的标记物特异性抗体的免疫组织化学来检测。作为下丘脑祖细胞的标记物，优选使用Rx。培养期间可根据使用的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的种类而变动，例如为10～26天(具体例为18天)。
在优选的一个方式中，将质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。通过使用质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团，将凝集块间的分化程度的差控制在最小限度，能够提高分化诱导效率。作为质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团的悬浮培养的例子，可举出以下的方式(A)和(B)。
(A)准备多个培养隔室，以1个培养隔室中含有1个人多能干细胞的凝集块的方式接种质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团。(例如向96孔板的各孔逐个放入人多能干细胞的凝集块)然后，在各培养隔室中，将1个人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。
(B)以1个培养隔室中含有多个人多能干细胞的凝集块的方式，在1个培养隔室中接种质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团。(例如向10cm皿放入多个人多能干细胞的凝集块。)然后，在该隔室中，将多个人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。
本发明的方法中也可以采用(A)和(B)中的任一方式。另外，可以在本发明的方法的培养的中途变更方式(从(A)的方式变更为(B)的方式。或者从(B)的方式变更为(A)的方式)。在一个方式中，在步骤(1)的培养中采用(A)的方式，在步骤(2)的培养中采用(B)的方式。
步骤(2)
在接着步骤(1)的步骤(2)中，将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养。通过该步骤，诱导向下丘脑组织的进一步的分化。对于没有特别提及的培养条件(培养方法(优选采用静置培养)、饲养细胞的使用的可能性(优选在饲养细胞非存在下进行培养)、可使用的培养器、使用的基础培养基、作用于Shh信号通路的物质以外的添加物等)与步骤(1)同样。以下，对步骤(2)中特征性的培养条件进行说明。
步骤(2)优选在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下进行悬浮培养，实现了向细胞凝集块内部的氧的到达以及细胞凝集块的长时间的维持培养，能够进行向下丘脑组织的有效的分化诱导。
高氧分压条件是指超过空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。步骤(2)的氧分压例如为30～60％，优选为35～60％，更优选为38～60％(具体例为40％)。
步骤(2)的悬浮培养的培养温度、CO2浓度等其它培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度例如为约1～10％，优选为约5％。
步骤(2)中使用的培养基以低浓度含有作用于Shh信号通路的物质。在第1方式(诱导向背侧下丘脑组织分化的方式)中，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时的“低浓度”例如为0.1μM～2.0μM，优选为0.2μM～1.5μM，进一步优选为0.3μM～1.0μM。在第2方式(诱导向腹侧下丘脑组织分化的方式)中也可采用同样的浓度。只要能够得到本发明所需要的作用效果(即，向背侧下丘脑组织或腹侧下丘脑组织的分化诱导)，则作用于Shh信号通路的物质的浓度遍及步骤(2)的所有期间可以不是恒定的。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
对于使用SAG以外的作用于Shh信号通路的物质时应采用的浓度，即“低浓度”的范围，考虑到使用的物质的特性和SAG的特性的不同(特别是活性的不同)，本领域技术人员可以依照上述浓度范围进行设定。另外，设定的浓度范围是否适当可以通过依照后述的实施例的预备实验来确认。如此，在步骤(2)中，对关于作用于Shh信号通路的物质的“低浓度”而言，本领域技术人员也可以在不伴有特别的困难的情况下认识且理解。
步骤(2)中使用的培养基优选不含骨形态发生因子信号转导通路激活物质。换言之，在步骤(2)中，优选使用以低浓度含有作用于Shh信号通路的物质而不含骨形态发生因子信号转导通路激活物质的培养基。根据该条件，能够得到避免因骨形态发生因子信号转导通路激活物质的长期暴露所致所致的细胞凝集块的囊泡化、分化方向的变化(从下丘脑向神经视网膜的分化方向的变化等)的效果。
第2方式中的步骤(2)中使用的培养基优选除了低浓度的作用于Shh信号通路的物质以外还含有Akt抑制剂。Akt抑制剂作为腹侧化信号发挥作用，促进向腹侧下丘脑的有效的分化。关于优选的Akt抑制剂及其使用浓度，可举出与上述步骤(1)的第2方式的例子同样的浓度。
实施充分期间的步骤(2)的培养用以进一步诱导向下丘脑组织(背侧下丘脑或腹侧下丘脑)的分化。产生向下丘脑组织的进一步的诱导的情况可通过下丘脑组织特异性标记物的检测来确认。作为下丘脑组织的标记物，优选使用Pax6和/或Nkx2.1。也可以并用Rx。典型而言，背侧下丘脑组织为Rx阳性、Pax6阳性且Nkx2.1阴性的组织，腹侧下丘脑组织为Rx阳性、Pax6阴性且Nkx2.1阳性的组织。
分化向背侧下丘脑组织(第1方式的情况)进行的情况可通过出现背侧下丘脑组织特征性的神经祖细胞(例如血管加压素(AVP)神经元祖细胞、催产素(OXT)神经元祖细胞、促甲状腺激素释放激素(TRH)神经元祖细胞、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)神经元祖细胞、神经肽Y(NPY)神经元祖细胞)来确认。在确认到背侧下丘脑组织特征性的神经祖细胞的情况下，可判断为更进一步进行了向背侧下丘脑组织的分化诱导。神经祖细胞出现的确认只要分别利用特征性的标记物即可。例如，如果确认到Otp和Brn2的表达，则可判断为出现AVP神经元祖细胞。
另一方面，产生向腹侧下丘脑组织的进一步的诱导(第2方式的情况)的情况可通过出现腹侧下丘脑组织特征性的神经祖细胞(例如刺鼠相关蛋白(AgRP)神经元祖细胞、前阿黑皮素原(POMC)神经元祖细胞、黑色素凝集激素(MCH)神经元祖细胞、食欲素神经元祖细胞)来确认。在确认到背侧下丘脑组织特征性的神经祖细胞的情况下，可判断为更进一步进行了向背侧下丘脑组织的分化诱导。神经细胞出现的确认只要分别利用特征性的标记物即可。
步骤(2)的培养期间可根据使用的作用于Shh信号通路的物质的种类而变动，例如为20～100天，优选为30天～80天(具体例为30天、40天、50天、60天、70天、80天)。
步骤(3)
本发明的制造方法中，优选除了步骤(1)和(2)以外还进行以下的步骤(3)。
(3)回收步骤(2)中得到的细胞凝集块，将构成细胞凝集块的细胞进行分散培养的步骤
通过步骤(3)进一步促进向下丘脑组织的分化诱导，并且发生成熟化。换言之，步骤(3)带来分化效率的进一步的提高。步骤(3)的培养相当于有利于神经细胞的培养的分散培养。通过步骤(3)，从悬浮培养这样的三维培养切换为二维培养。
进行分散培养时，首先，回收细胞凝集块，使细胞解离(单个细胞化)。细胞的解离可单独或适当组合使用EDTA-胰蛋白酶、胶原酶IV、金属蛋白酶等蛋白分解酶等。优选细胞毒性少的酶。作为这样的细胞解离液，例如可获得Dispase(EIDIA)、TrypLE(Invitrogen)或Accutase(MILLIPORE)等市售品。
将单个细胞化的细胞接种于适于分散培养的培养器。用于分散培养的培养器没有特别限定。例如可以使用皿、陪替培养皿、组织培养用皿、多联皿(multi-dish)、微平板、微孔板、微孔、多联盘、多孔板、室载玻片、培养皿(schale)等。为了提高对培养面的细胞的粘附性，可以使用通过基质膜(BD)、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、胶原蛋白、明胶、层粘蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白或者它们中的两种以上的组合进行了包被处理的培养器。
步骤(3)优选在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下进行平面培养，容易分化为神经细胞。
高氧分压条件是指超过空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。步骤(3)的氧分压例如为30～60％，优选为35～60％，更优选为38～60％(具体例为40％)。
分散培养的培养温度、CO2浓度、O2浓度等其它培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度例如为约1～10％，优选为约5％。O2浓度例如为约20％。
分散培养中使用的培养基可以将哺乳动物细胞的培养中所使用的培养基作为基础培养基来进行制备。作为基础培养基，例如，只要是BME培养基、BGJb培养基、CMRL 1066培养基、G1asgow MEM培养基、Improved MEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle MEM培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、Ham’s培养基、Ham’s F-12培养基、RPMI1640培养基、Fischer’s培养基、Neurobasal培养基和它们的混合培养基等、可用于哺乳动物细胞的培养的培养基就没有特别限定。在一个方式中，可以使用DMEM培养基和Ham’sF-12培养基的混合培养基(例如Sigma Aldrich公司的DMEM/F-12Catalogno.D6421)。
也可以使用含血清培养基、无血清培养基中的任一者。为了避免未知的或未知的成分的混入的等观点出发，优选使用无血清培养基。
为了促进神经细胞的增殖和分化，优选使用添加有睫状体神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3(NT-3)、胎牛血清、N2补充剂、B27补充剂等的培养基。在优选的一个方式中，使用添加有N2补充剂和B27补充剂的培养基。培养基中的N2补充剂的含量例如以容量比计为整体量的1％。同样地，培养基中的B27补充剂的含量例如以容量比计为整体量的2％。应予说明，N2补充剂可以从Gibco(产品名N2 supplment(x100))等获得，B27补充剂可以从Gibco(产品名B27 supplement(x100))等获得。另外，BDNF可以由LM22A-4(作为BDNF激动剂的N1,N3,N5-三(2-羟乙基)-1,3,5-苯三甲酰胺(可以从SIGMA-ALDRICH获得))替代。
分散培养中所使用的培养基可以含有血清代替物和/或其它添加物。作为此处的其它添加物，例如可举出胰岛素、铁源(例如转铁蛋白等)、矿物质(例如硒酸钠等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如丙酮酸、乳酸等)、血清蛋白(例如白蛋白等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、维生素类(例如抗坏血酸、d-生物素等)、抗生素(例如链霉素、青霉素、庆大霉素等)、缓冲剂(例如HEPES等)等。
关于神经细胞的分散培养，有各种报告(例如Wataya T.et al.,Procnatl AcadSci USA 105(33):11796-11801(2008).)，可以参考它们来设定或调整本发明的分散培养的条件。
实施充分期间的步骤(3)的培养至下丘脑神经细胞的分化·成熟。对于产生下丘脑神经细胞的充分的分化·成熟的情况，如果为第1方式(诱导向背侧下丘脑组织的分化的方式)的情况，可通过在背侧下丘脑组织确认到定位的神经细胞(例如，AVP神经元、OXT神经元、TRH神经元、CRH神经元、NPY神经元)的有无、存在率、该神经细胞产生的激素的有无、量来确认。例如，如果确认到AVP的产生，则可判断为出现了功能性的AVP神经元，产生了神经细胞的充分的分化·成熟。对于在背侧下丘脑组织确认到定位的其它神经细胞，也可以将各神经细胞产生的激素作为指标，判断其分化·成熟的有无或程度。
同样地，在第2方式(诱导向腹侧下丘脑组织的分化的方式)的情况下，可以通过在腹侧下丘脑组织确认到定位的神经细胞(例如AgRP神经元、POMC神经元、MCH神经元、食欲素神经元)的有无、存在率、该神经细胞产生的激素的有无、量来确认产生神经细胞的充分的分化·成熟的情况。
步骤(3)的培养期间可根据培养条件而变动，例如为30～150天，优选为40天～110天(具体例为40天、50天、60天、70天、80天、90天、10天、110天)。
2.含有下丘脑组织和垂体组织的细胞结构体的制造方法
本发明的第2方面涉及含有下丘脑组织和垂体组织的细胞结构体(以下，也称为“杂交型细胞结构体”)的制造方法。在本发明的制造方法中，进行以下的步骤(i)～(iii)。另外，关于没有特别提及的事项，与上述第1方面同样，援引对应的说明。
(i)将人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤
(ii)将步骤(i)中形成的细胞凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤
(iii)将步骤(ii)中得到的细胞凝集块在适于垂体和下丘脑的同时诱导的培养基中进行悬浮培养的步骤
步骤(i)
在步骤(i)中，首先，通过与本发明的第1方面的情况同样的手段准备人多能干细胞的凝集块，在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。
可以在饲养细胞的存在下/非存在下的任一条件下进行细胞凝集块的悬浮培养，但从避免未确定因子的混入的观点出发，优选在饲养细胞的非存在下进行细胞凝集块的悬浮培养。
细胞凝集块的悬浮培养的培养温度、CO2浓度、O2浓度等其它培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度例如为约1～10％、优选为约5％。O2浓度例如为约20％。
作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质，可以使用BMP2、BMP4、BMP7、GDF5等。优选使用BMP4作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质。另一方面，作为作用于Shh信号通路的物质，可以使用属于Hedgehog家族的蛋白(例如Shh)、Shh受体、Shh受体激动剂、Purmorphamine、Smoothened Agonist(SAG)(3-氯-N-[反式-4-(甲基氨基)环己基]-N-[[3-(4-吡啶基)苯基]甲基]-苯并[b]噻吩-2-甲酰胺)。优选使用SAG。骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的优选的组合为BMP4和SAG的组合。
培养基中的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度可以在能够分化诱导为下丘脑和垂体的范围内适当设定，使用BMP4作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质时，其浓度例如为0.01～1000nM，优选为0.1～100nM，更优选为1～10nM(具体例为5nM)。骨形态发生因子信号转导通路激活物质在遍及步骤(i)的所有期间可以不是恒定的。例如，从悬浮培养开始起3天～8天(具体例为6天)可以不在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质，然后，在培养基中添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
培养基中的作用于Shh信号通路的物质的浓度可以在能够分化诱导为下丘脑和垂体的范围内适当设定，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时，其浓度例如为1nM～1000μM，优选为10nM～100μM，更优选为100nM～10μM(具体例为2μM)。作用于Shh信号通路的物质的浓度在遍及步骤(i)的所有期间可以不是恒定的。例如，从悬浮培养开始起3天～8日(具体例为6天)可以不在培养基中添加作用于Shh信号通路的物质，然后，在培养基中添加作用于Shh信号通路的物质。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
步骤(i)中使用的培养基为了抑制通过分散而诱导的人多能干细胞的细胞死亡，优选从培养开始时添加Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂(参照日本特开2008－99662号公报)。从培养开始起例如15天以内，优选10天以内，更优选6天以内添加ROCK抑制剂。作为ROCK抑制剂，可举出Y-27632((+)-(R)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐)等。ROCK抑制剂可以以能够抑制通过分散而诱导的人多能干细胞的细胞死亡的浓度使用。例如，在使用Y-27632的情况下，例如为约0.1～200μM，优选为约2～50μM的浓度。可以在添加期间内变动ROCK抑制剂的浓度，例如可在添加期间的后半段使浓度减半。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
可使用的基础培养基、可含有于培养基的物质等、没有特别提及的事项依照上述第1方面的步骤(1)。
实施充分期间的步骤(i)的培养用以诱导从人多能干细胞向下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的分化。向下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层的分化例如可以通过RT-PCR、使用下丘脑神经上皮组织、表皮外胚层的标记物特异性抗体的免疫组织化学来检测。例如，实施至培养中的细胞凝集块中10％以上、优选30％以上、更优选50％以上的细胞凝集块含有下丘脑神经上皮组织和表皮外胚层。培养期间可根据使用的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的种类而变动，例如为15～20天(具体例为18天)。
下丘脑神经上皮组织是指表达下丘脑标记物的神经上皮组织。作为下丘脑标记物，可举出NKx2.1(腹侧下丘脑标记物)、Pax6(背侧下丘脑标记物)等。在一个方式中，腹侧下丘脑神经上皮组织为Rx阳性、Chx10阴性且Nkx2.1阳性的神经上皮组织。在一个方式中，背侧下丘脑神经上皮组织为Rx阳性、Chx10阴性且Pax6阳性的神经上皮组织。
表皮外胚层是在胚发生中在胚的表层上形成的外胚层细胞层。作为表皮外胚层标记物，可举出广谱细胞角蛋白(pan-cytokeratin)。表皮外胚层通常可分化为垂体前叶、皮肤、口腔上皮、牙釉质、皮腺等。在一个方式中，表皮外胚层为E-钙粘蛋白阳性且广谱细胞角蛋白阳性的细胞层。
优选地，在步骤(i)中得到的细胞凝集块中，下丘脑神经上皮组织占据该细胞凝集块的内部，单层的表皮外胚层的细胞构成该细胞凝集块的表面。表皮外胚层可以在其一部分中含有加厚的表皮基板。
在优选的一个方式中，将质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。通过使用质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团，能够将凝集块间的分化的程度的差控制在最小限度，提高分化诱导效率。作为质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团的悬浮培养的例子，可举出以下の方式(A)和(B)。
(A)准备多个培养隔室，以1个培养隔室中含有1个人多能干细胞的凝集块的方式接种质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团。(例如向96孔板的各孔逐个放入人多能干细胞的凝集块)然后，在各培养隔室中，将1个人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。
(B)以1个培养隔室中含有多个人多能干细胞的凝集块的方式将质量均匀的人多能干细胞的凝集块的集团接种于1个培养隔室。(例如向10cm皿放入多个人多能干细胞的凝集块)然后，在该隔室中，将多个人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养。
本发明的方法也可以采用(A)和(B)中的任一方式。另外，可以在本发明的方法的培养的中途变更方式(从(A)的方式变更为(B)的方式。或者从(B)的方式变更为(A)的方式)。在一个方式中，步骤(i)的培养采用(A)的方式，步骤(ii)的培养采用(B)的方式。
步骤(ii)
在接着步骤(i)的步骤(ii)中，将步骤(i)中得到的细胞凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养。通过该步骤，可诱导向下丘脑和垂体的进一步的分化。对于没有特别提及的培养条件(培养方法(优选采用静置培养)、饲养细胞的使用的可能性(优选在饲养细胞非存在下进行培养)、可使用的培养器、使用的基础培养基、骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质以外的添加物等)，与步骤(i)同样。以下，对步骤(ii)中特征性的培养条件进行说明。
步骤(ii)优选在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下进行悬浮培养，实现了向细胞凝集块内部的氧的到达以及细胞凝集块的长时间的维持培养，能够进行向下丘脑组织和垂体组织的有效的分化诱导。
高氧分压条件是指超过空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。步骤(ii)的氧分压例如为30～60％、优选为35～60％、更优选为38～60％(具体例为40％)。
步骤(ii)的悬浮培养的培养温度、CO2浓度等其它培养条件可以适当设定。培养温度例如为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度例如为约1～10％，优选为约5％。
步骤(ii)中使用的培养基含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质。培养基中的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度可以在能够分化诱导为下丘脑和垂体的范围内适当设定，使用BMP4作为作为骨形态发生因子信号转导通路激活物质时，其浓度例如为0.01～1000nM，优选为0.1～100nM，更优选为1～10nM(具体例为5nM)。可以在培养中途降低骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度。例如，可以在步骤(ii)开始时设为上述浓度，以每2～4天变为一半的浓度的方式逐步降低浓度。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
培养基中的作用于Shh信号通路的物质的浓度可以在能够分化诱导为下丘脑和垂体的范围内适当设定，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时，其浓度例如为1nM～1000μM，优选为10nM～100μM，更优选为100nM～10μM(具体例为2μM)。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
在一个方式中，步骤(ii)中使用的培养基含有FGF2。FGF2促进从表皮外胚层向垂体基板的分化。培养基中的FGF2的浓度通常为1～1000ng/ml，优选为10～100ng/ml。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
FGF2是也被称为碱性成纤维细胞增殖因子(bFGF)的公知的细胞因子，其氨基酸序列也是公知的。本发明中使用的FGF2通常为哺乳动物的FGF2。作为哺乳动物，例如可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类、兔子等实验动物、猪、牛、山羊、马、绵羊等家畜、狗、猫等宠物、人、猴、猩猩、黑猩猩等灵长类。FGF2由于在许多哺乳动物的种间具有交差反应性，因此，只有能够实现本发明的目的，则可以使用任意的哺乳动物的FGF2，但FGF优选为啮齿类(小鼠、大鼠等)或灵长类(人等)的FGF2，优选为人FGF2。人FGF2是指具有在人体内天然表达的FGF2的氨基酸序列。作为人FGF2的代表性的氨基酸序列，可例示NCBI的登记号NP_001997.5(2014年2月18日更新)等。
步骤(ii)的培养期间可根据使用的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的种类而变动，例如为6～20天，优选为10天～14天(具体例为12天)。
步骤(iii)
将步骤(ii)中得到的细胞凝集块供于进一步的悬浮培养。在该步骤的培养中，使用适于垂体和下丘脑的同时诱导的培养基。换言之，变更培养基组成，促进垂体和下丘脑的同时诱导。
在步骤(iii)的培养中，优选使用含有作用于Shh信号通路的物质的培养基。培养基中的作用于Shh信号通路的物质的浓度可以在能够分化诱导为下丘脑和垂体的范围内适当设定，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时，其浓度例如为1nM～1000μM，优选为10nM～100μM，更优选为100nM～10μM(具体例为2μM)。另一方面，优选使用含有上述步骤(3)的分散培养中使用的培养基的成分的培养基(优选含有促进神经细胞的增殖和分化的成分)。例如，使用将上述步骤(3)的分散培养中使用的培养基和上述步骤(ii)的培养中使用的培养基以容量比1：1混合而得到的培养基。另外，可以在该混合培养基中添加以容量计为20％左右的血清代替物(例如KSR)。此外，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
实施充分期间的步骤(iii)的培养至下丘脑的成熟(下丘脑神经细胞的分化·成熟)和垂体的成熟。产生下丘脑的充分的成熟的情况可通过在下丘脑组织确认到定位的神经细胞(例如AVP神经元、OXT神经元、TRH神经元、CRH神经元、NPY神经元、AgRP神经元、POMC神经元、MCH神经元、食欲素神经元)的有无、存在率、该神经细胞产生的激素的有无、量来确认。另一发明，产生垂体的充分的成熟的情况可通过垂体激素产生细胞(生长激素(GH)产生细胞、催乳素(PRL)产生细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)产生细胞、促甲状腺激素(TSH)产生细胞、***(FSH)产生细胞、促黄体激素产生细胞、黑素细胞刺激激素(MSH)产生细胞等)的有无、存在率、该细胞产生的激素的有无、量来确认。
步骤(iii)的培养期间可根据培养条件而变动，例如为50天～200天，优选为70天～150天(具体例为70天、80天、90天、100天、110天、120天)。
在一个方式中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间进行以下的步骤(a)。
(a)将步骤(ii)中得到的细胞凝集块在含有作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤
在该方式中，将步骤(a)中得到的细胞凝集块供于步骤(iii)的培养。通过步骤(a)，可诱导向下丘脑和垂体的有效的分化。对于没有特别提及的培养条件(培养方法(优选采用静置培养)、饲养细胞的使用的可能性(优选在饲养细胞非存在下培养)、可使用的培养器、使用的基础培养基和作用于Shh信号通路的物质以外的添加物等)，与步骤(ii)同样。以下，对步骤(a)中特征性的培养条件进行说明。
在步骤(a)中，使用含有作用于Shh信号通路的物质的培养基。培养基中的作用于Shh信号通路的物质的浓度可以在能够分化诱导为丘脑和垂体的范围内适当设定，使用SAG作为作用于Shh信号通路的物质时，其浓度例如为1nM～1000μM，优选为10nM～100μM，更优选为100nM～10μM(具体例为2μM)。应予说明，最佳浓度可通过预备实验进行设定。
步骤(a)中使用的培养基优选不含骨形态发生因子信号转导通路激活物质。换言之，在步骤(a)中，优选使用含有作用于Shh信号通路的物质而不含骨形态发生因子信号转导通路激活物质的培养基。根据该条件，能够得到避免因骨形态发生因子信号的长期暴露所致的细胞块的囊泡化、分化方向的变化这样的效果。
步骤(a)中使用的培养基优选含有血清代替物。培养基中的血清代替物的浓度可以在能够分化诱导为丘脑和垂体的范围内适当设定，使用KSR作为血清代替物时，其浓度例如为1％(v/v)～30％(v/v)，优选为5％(v/v)～～20％(v/v)(具体例为10％(v/v))。
步骤(a)优选在高氧分压条件下进行。通过在高氧分压条件下进行悬浮培养，实现了向细胞凝集块内部的氧的到达以及细胞凝集块的长时间的维持培养，能够进行向丘脑组织和垂体组织的有效的分化诱导。
高氧分压条件是指超过空气中的氧分压(20％)的氧分压条件。步骤(a)的氧分压例如为30～60％，优选为35～60％，更优选为38～60％(具体例为40％)。
步骤(a)的培养期间可根据培养条件而变动，例如为10天～40天，优选为15天～30天(具体例为20天、25天)。
3.细胞结构体、构成细胞结构体的细胞的用途
通过本发明的制造方法而得到的细胞结构体，即，含有背侧或腹侧的下丘脑组织的细胞结构体或杂交型细胞结构体、或者其一部分(构成细胞结构体的组织或细胞)例如被利用于移植医疗。“细胞结构体的一部分”可以通过利用手术刀等的裁切、利用蛋白质分解酶、EDTA等的处理等来制备。在应用于移植医疗等之前，可以将细胞表面标记物、形态、分泌物质等作为指标对制备的细胞进行精制或纯化。
在使用含有下丘脑组织的细胞结构体或其一部分的移植医疗中，将由下丘脑的障碍引起的疾病、伴有下丘脑的障碍的疾病(本说明书中将以上两种疾病汇总称为“下丘脑疾病”)成为治疗对象。另一方面，在使用杂交型细胞结构体或其一部分的移植医疗中，由下丘脑和/或垂体的障碍引起的疾病、伴有下丘脑和/或垂体的障碍的疾病(本说明书中将以上两种疾病汇总称为“下丘脑垂体疾病”)成为治疗对象。杂交型细胞结构体由于功能上不可分开的下丘脑组织和垂体组织形成复合体，因此，特别适合于在下丘脑和垂体两者确认到障碍的病症的治疗。
如果例示可应用本发明的细胞结构体或其一部分的疾病，则为中枢性尿崩症、下丘脑性垂体功能减退症、普拉德综合症、劳-蒙-毕氏综合征(Laurence-Moon-BiedlSyndrome)、下丘脑性肥胖、进食障碍、认知功能障碍、睡眠障碍、全垂体功能减退症、垂体性侏儒症、肾上腺皮质功能减退症、部分垂体功能减退症、单一性垂体前叶功能不全、因外伤、放射线治疗、切除术等引起的下丘脑和/或垂体的损伤。
将本发明的细胞结构体或其一部分用于移植医疗时的移植部位只要在移植后发挥作为下丘脑和/或垂体的功能就没有特别限定，例如可举出肾皮膜下、皮下、腹膜、大脑、下丘脑、垂体。由以上的说明表明，本申请也提供一种下丘脑疾病或下丘脑垂体疾病的治疗方法，其特征在于，将本发明的细胞结构体或构成其的细胞移植于患者。
在移植医疗中，因组织適合性抗原的不同引起的排斥屡屡成为问题，但通过使用由接受者的体细胞建立的人多能干细胞制造本发明的细胞结构体，能够克服该问题。因此，在本发明的优选的方式中，作为本发明的方法的人多能干细胞，使用由接受者的体细胞建立得到的人多能干细胞(例如iPS细胞)。根据该方式，由自身的细胞构建的细胞结构体或其一部分被移植于接受者。
本发明的细胞结构体或其一部分可以用于药物的筛选、评价。详细而言，能够应用于下丘脑疾病或下丘脑垂体疾病的治疗药的筛选、治疗药候选的有效性评价、毒性试验等。例如，由患有下丘脑疾病或下丘脑垂体疾病的患者制作iPS细胞，利用本发明的制造方法由该iPS细胞制造细胞结构体。将得到的细胞结构体或其一部分在受试物质的存在下进行培养(试验组)。作为对照组，在非存在下进行培养。然后，在试验组和对照组之间比较障碍的程度。选择确认到减轻了障碍的程度的效果的受试物质作为治疗药的候选物质。作为受试物质，可以使用各种分子尺寸的有机化合物或无机化合物。作为有机化合物的例子，可例示核酸、肽、蛋白质、脂质(单纯脂质、复合脂质(磷酸甘油酯、鞘脂、糖基甘油酯、脑苷脂等)、***素、类异戊二烯化合物、萜烯、类固醇、多酚、儿茶素、维生素(B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等)。受试物质可以为天然物来源，或者也可以为通过合成而得到的物质。在后者的情况下，例如可利用组合合成的方法构建有效的筛选***。可以使用植物提取液、细胞提取液、培养上清液等作为受试物质。另外，可以使用现有的药剂作为受试物质。通过同时添加2种以上的受试物质，可以调查受试物质间的相互作用、协同作用等。
实施例
A.由人ES细胞的分化诱导
1.由人ES细胞向下丘脑的分化诱导法的研究
(1)已报道的方法的应用
Wataya等确立了由小鼠ES细胞分化诱导为下丘脑神经元的方法(Wataya T.etal.,Procnatl Acad Sci USA 105(33):11796-11801(2008).)。在使用小鼠ES细胞的情况下，确认了通过该方法分化为AVP神经元(图1左)。
接着，对该方法是否也能够应用于人ES细胞进行了研究。使用将人ES细胞(KhES-1)通过常规方法在MEF上进行维持培养而得到的细胞。为了监测向丘脑组织的分化诱导，利用向作为下丘脑神经的标记物的Rx的基因敲入Venus cDNA而得到的KhES-1。为了通过无血清悬浮凝集块培养法(SFEBq法)使人ES细胞分化，通过Nakano等(Cell Stem Cell.2012Jun14；10(6):771-85.)的方法，用酶使人ES细胞分散为单个细胞，并且使用低细胞粘附性的V型底96孔板(SUMITOMO BAKELITE)使其再凝集。对每个孔接种10000个细胞，在gfCDM分化培养基中在5％CO2下在37℃进行培养。将接种日作为分化培养第0天，从第0天至第3天添加20μM Y-27632(ROCK抑制剂：分散时的细胞死亡抑制剂：Watanabe等(Nat Biotechnol.2007Jun；25(6):681-6.Epub 2007 May 27.))，在培养第3天以后，在不含Y-27632的分化培养基中以3天1次的频率更换一半培养基。
将结果示于图1右。在培养第3天，确认了未形成细胞块。即，虽然使用gfCDM培养基并实施了SFEBq法，但未确认到细胞块的形成。
(2)培养基中的成分的研究1(血清代替物的使用)
认为未形成凝集块的原因在于营养不足，在gfCDM中添加少量的血清代替物KSR，检验其效果。具体而言，在gfCDM培养基中混合2％、5％、10％、20％的KSR并实施SFEBq法。第18天以后，使培养时的氧分压为40％。通过荧光抗体法对组织的分化进行解析。
在培养第3天形成了凝集块(图2左)，但培养第30天的细胞块的内部，Rx没有表达，确认到Bf1的广泛的表达(图2右)。认为分化为端脑的祖细胞。
(3)培养基中的成分的研究2(骨形态发生因子信号转导通路激活物质的使用)
认为位置信息向端脑偏离的原因在于KSR含有的各种生长因子，添加骨形态发生因子信号转导通路激活物质。具体而言，在以下的条件下尝试了分化诱导。从实施SFEBq法后第6天在含有3.0nM左右的骨形态发生因子信号转导通路激活物质的培养基中进行悬浮培养。培养第15天的培养基更换后，使用不含骨形态发生因子信号传导活化物质的培养基更换一半的培养基(因此，培养第15天以后每次培养基更换后骨形态发生因子信号传导活化物质的浓度变为培养基更换前的1/2)。培养基更换的频率为3天1次。
通过加入BMP4信号，在培养第30天，作为下丘脑标记物的Rx和作为背侧标记物的Pax6成为共阳性(图3左)。但是，视网膜标记物Chx10也成为阳性(图3右)，判明成为神经视网膜。
(4)培养基中的成分的研究3(作用于Shh信号通路的物质的使用)
认为诱导向神经视网膜的分化的原因在于腹侧化因子不足，追加腹侧化因子的Shh信号(作为Shh激动剂的SAG)。具体而言，在以下条件下尝试了分化诱导。从实施SFEBq法后第6天在含有少量的骨形态发生因子信号转导通路激活物质(具体例中为1.5～2.0nM)和少量的SAG(具体例中为0.5μM)的培养基中进行悬浮培养。从第12天仅逐渐减少骨形态发生因子信号转导通路激活物质的浓度，维持SAG的浓度。通过加入Shh信号，在培养第30天确认到Rx和Pax6均为阳性且Chx10为阴性的细胞凝集块，能够分化为下丘脑祖细胞(图4左)。下丘脑祖细胞的分化效率超过80％(图4右)。
(5)向背侧下丘脑或腹侧下丘脑的选择性分化
为了分开制作背侧下丘脑和腹侧下丘脑，进一步进行了研究。对骨形态发生因子信号转导通路激活物质和SAG的添加浓度以及添加时机、Akt抑制剂的添加有无和浓度和时机进行了研究。作为背侧下丘脑条件，采用(4)的培养条件。另一方面，为了促进向腹侧下丘脑的分化，将BMP4的最终浓度变更为1.0nM。此外，从培养开始第6天以最终浓度0.5μM添加Akt抑制剂。
在背侧下丘脑条件下，Rx::Venus阳性细胞的大部分显示Pax6阳性(图5左)。认为分化为背侧下丘脑的祖细胞。另一方面，在腹侧下丘脑条件下，Rx::Venus阳性细胞的大部分显示Nkx2.1阳性(图5右)。认为分化为腹侧下丘脑的祖细胞。
如上所示，通过KSR浓度、BMP4信号和Shh信号(SAG)的浓度的调整和作为其它腹侧化信号的Akt抑制剂的少量的添加的有无，成功地分开制作背侧下丘脑和腹侧下丘脑，即，选择性地分化为背侧下丘脑或腹侧下丘脑。
(6)背侧下丘脑诱导条件的优化
在背侧下丘脑诱导条件下继续悬浮培养，结果在培养第60天确认了Otp和Brn2的表达(通常认为Otp和Brn2阳性的下丘脑处于AVP神经元的前体状态)(图6)，在培养第103天确认到少量的AVP阳性细胞(图7)。为了提高诱导效率，并入有利于神经产生的分散培养。具体而言，在以下的条件下尝试了分化诱导。将细胞凝集块分散，在利用层粘连蛋白(laminin)、聚-D-赖氨酸、基质膜(matrigel)包被的玻璃板上以2×104～40×104cells/cm2接种细胞，利用在DFNB培养基中添加有NT3、BDNF、CNTF、FBS的培养基进行平面培养。另外，以3天1次的频率进行培养基更换。
在上述条件下进行分化诱导，结果确认了在培养第150天出现AVP神经元(图8)。为了验证该AVP神经元的成熟度和功能，将培养第180天的细胞作为样品，通过以下的步骤进行AVP激素的测定和刺激试验。首先，回收用于3天细胞培养后的培养基，通过RIA法进行培养基中的AVP激素测定。测定的结果确认了所诱导的AVP神经元实际上分泌AVP激素(图9左)。另外，在氯化钾(在含有0.1％氯化钾的等渗溶液中培养30分钟)刺激中也良好地反应(图9右)。
(7)其它下丘脑神经元的出现
在上述条件((6)的栏)下进行分化诱导，在培养第150天通过以下的方法检测OXT神经元、TRH神经元、CRH神经元、NPY神经元、AgRP神经元、POMC神经元、MCH神经元和食欲素神经元。
在培养第150天进行免疫染色，确认了出现AVP神经元以外的下丘脑神经元(OXT神经元、TRH神经元、CRH神经元、NPY神经元、AgRP神经元、POMC神经元、MCH神经元、食欲素神经元)(图10)。根据检测结果，比较各下丘脑神经元的分化效率(图11)。能够有效地诱导AVP神经元。
另一方面，在腹侧下丘脑诱导条件(图15)下培养时，比背侧下丘脑诱导条件高效地确认到MCH神经元等腹侧下丘脑神经元(图12)。
2.下丘脑和垂体的同时成熟
下丘脑和垂体原本是功能上不可分开的，因此，下丘脑和垂体功能上一体化的结构体作为新药筛选等的工具或者作为移植材料是极其有用的。因此，为了构建下丘脑和垂体功能上一体化的结构体，进行了以下的研究。Ozone C等报告了从人ES细胞向垂体的分化诱导方法(Functional anterior pituitary generated in self-organizing cultureof human embryonic stem cells.Ozone C,Suga H,Eiraku M,Kadoshima T,Yonemura S,Takatan,Oiso Y,Tsuji T,Sasai Y.nat Commun.2016 Jan 14；7:10351.doi:10.1038/ncomms10351.)。再现了该方法，结果如报告所示，同时诱导了初始的下丘脑祖细胞和垂体原基。然而，下丘脑组织在培养中途分化停止，没有到达至表达下丘脑激素的神经元。因此，培养前半设为依照背侧下丘脑诱导条件的条件(但是，将骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的浓度设定得较高。另外，从培养第18天的培养基更换后，使用不含骨形态发生因子信号传导活化物质的培养基更换一半的培养基)，对于培养后半，改良使用的培养基的组成，使其不仅适于垂体，也适于向丘脑的分化。具体而言，采用将上述步骤(ii)中使用的培养基和分散培养中使用的培养基以容量比1：1混合并加入20％的血清代替物(例如KSR)(参照图17)的培养基，继续悬浮培养。
在培养开始第150天通过荧光抗体法进行解析，结果判明在下丘脑组织中存在CRH神经元，在垂体组织中存在ACTH神经元(图13)。即，成功地由一个细胞块使下丘脑和垂体两者分化·成熟。
3.结论
通过以上的研究，发现了向背侧下丘脑的分化诱导条件和向腹侧下丘脑的分化诱导条件。另外，也判明了通过使下丘脑和垂体同时成熟，能够构建下丘脑和垂体功能上一体化的结构体的分化诱导条件。将优选的分化诱导条件的具体例(概要)示于图14(背侧下丘脑)、图15(腹侧下丘脑)、图16、17(下丘脑和垂体的同时成熟)。
有成功地使人ES细胞分化为垂体前叶的报告(Ozone C et al.,Functionalanterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonicstem cells.nat Commun.2016 Jan 14；7:10351.)，但通过荧光抗体法对在其所示的条件下分化诱导而得到的细胞块的特性进行评价，结果未检测出下丘脑神经元(AVP神经元等)(图25)，没有达到最终分化的功能性神经元的出现。因此，通过上述研究发现的新的分化诱导条件在能够构建含有功能性下丘脑神经元的结构体方面与该报告明显不同。
B.由人iPS细胞的分化诱导
为了确认通过上述研究而发现的分化诱导条件对于由人iPS细胞诱导下丘脑以及下丘脑和垂体的同时成熟有效，进行了以下的验证实验。
1.下丘脑AVP神经元的出现
在通过使用人ES细胞的研究而发现的背侧下丘脑诱导条件(参照A.1.(6)的栏)下培养人iPS细胞(201B7株)。其结果，确认到AVP神经元的出现(图18)。
2.下丘脑和垂体的同时成熟
(1)垂体的成熟化
在对下丘脑和垂体的同时成熟有效的条件(参照A.2.的栏)下培养人iPS细胞(201B7株)。在培养第60天确认到垂体组织和下丘脑组织，在垂体组织中检测出ACTH神经元。另外，通过长期培养，来自垂体组织的ACTH的分泌量增加(图19)，确认到垂体组织的成熟化随着培养时间的经过而进行。
(2)由下丘脑和垂体的相邻而产生的效果
在培养第70天将垂体组织和下丘脑组织分离，利用仅垂体组织继续培养的情况(图20A)和使垂体组织和下丘脑组织再次邻接而培养的情况(图20B)比较评价组织的成熟化。在培养第150天测定培养液中的ACTH浓度，结果使垂体组织和下丘脑组织再次邻接而培养的情况的ACTH浓度显著高(图20右)。其结果表示在将两个组织邻接的状态下培养对于其成熟化是极其重要的。
(3)垂体组织的功能评价1
为了评价在(1)的条件下培养而得到的垂体组织的功能，进行使用CRH的ACTH刺激试验(图21右)。试验方法依照已报道(Ozone C et al.,Functional anterior pituitarygenerated in self-organizing culture of human embryonic stem cells.natCommun.2016 Jan 14；7:10351.)的方法(以5μg/ml添加CRH)。试验的结果显示与CRH反应而分泌ACTH，即，得到功能性的ACTH神经元(图21左)。此外，通过荧光抗体法进行解析，也确认了ACTH阳性细胞为CRH-R1阳性(图21中央)。
(4)垂体组织的功能评价2
为了进一步评价在(1)的条件下培养而得到的垂体组织的功能，进行使用***的ACTH抑制试验(图22右)。进行基于CRH添加的刺激时以500ng/ml添加***(试验组)，与不添加***的情况(对照组)比较ACTH分泌量。试验的结果，ACTH的分泌被***抑制(图22左)。即，确认了形成有产生基于类固醇的负反馈的功能性垂体组织。
(5)垂体组织的功能评价3
为了进一步评价在(1)的条件下培养而得到的垂体组织的功能，进行使用CRH-R1抑制剂(安他纳明(Antalarmin)，NBI2719)的ACTH抑制试验(图23右)。在进行基于CRH添加的刺激时以10-5M添加CRH-R1抑制剂(试验组)，与不添加CRH-R1抑制剂的情况(对照组)比较ACTH分泌量。试验结果，ACTH的分泌被CRH-R1抑制剂抑制(图23左和中央)。该结果表示ACTH神经元(ACTH阳性细胞)受到CRH神经元(CRH阳性细胞)的控制而发挥功能。
(6)下丘脑和垂体一体化的结构体的功能评价
评价通过同时成熟而得到的结构体对低血糖应激的反应性(图24右)。对由低葡萄糖刺激引起的ACTH分泌量的变化进行调查，结果对低葡萄糖刺激反应而ACTH分泌量增大(图24左)，该反应性通过CHRH-R1抑制剂而减弱(图24中央)。这些结果表示通过同时成熟而得到的结构体中所含的ACTH神经元(ACTH阳性细胞)受到下丘脑的控制而发挥功能，并且证明了形成有下丘脑和垂体功能上一体化的结构体。
产业上的可利用性
根据本发明，能够有效地由人多能干细胞诱导下丘脑组织。通过本发明的方法构建的细胞结构体例如作为以下丘脑的障碍为靶的新药筛选用工具是有用的。另外，也可期待作为针对下丘脑的障碍的治疗手段(移植材料)的利用。另一方面，本发明也能够在体外构建下丘脑组织和垂体组织功能上一体化的细胞结构体。该细胞结构体是对以下丘脑和/或垂体为靶的新药筛选等极其有效的工具，另外，也可期待作为移植材料的应用。
本发明并不受上述发明的实施方式和实施例的说明任何限定。在不脱离权利要求书的记载的情况下本领域技术人员能够容易想到的范围内的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等内容通过援引而引用其全部内容。
Claims (20)
1.一种含有下丘脑组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(1)和(2)：
(1)将人多能干细胞的凝集块在含有低浓度的骨形态发生因子信号转导通路激活物质和低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，
(2)将步骤(1)中得到的细胞凝集块在含有低浓度的作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(2)。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，进一步包括以下的步骤(3)：
(3)回收步骤(2)中得到的细胞凝集块，将构成细胞凝集块的细胞进行分散培养的步骤。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(3)。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，
步骤(1)中的所述骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4，培养基中的其浓度为0.1nM～5.0nM，
步骤(1)和(2)中的所述作用于Shh信号通路的物质为SAG，培养基中的其浓度为0.1μM～2.0μM，
通过所述步骤(1)和(2)来诱导向背侧下丘脑组织的分化。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述背侧下丘脑组织包含选自血管加压素神经元、催产素神经元、促甲状腺激素释放激素神经元、促肾上腺皮质激素释放激素神经元和神经肽Y神经元中的一种以上的神经元。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，
步骤(1)中的所述骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4，培养基中的其浓度为0.1nM～3.0nM，
步骤(1)和(2)中的所述作用于Shh信号通路的物质为SAG，培养基中的其浓度为0.1μM～2.0μM，
所述培养基进一步含有Akt抑制剂，
通过所述步骤(1)和(2)来诱导向腹侧下丘脑组织的分化。
8.根据权利要求7所述的制造方法，其中，所述腹侧下丘脑组织包含选自刺鼠相关蛋白神经元、前阿黑皮素原神经元、黑色素凝集激素神经元和食欲素神经元中的一种以上的神经元。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制造方法，其中，在饲养细胞的非存在下进行所述悬浮培养。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制造方法，其中，步骤(1)中的所述凝集块通过分散的人多能干细胞的悬浮培养而形成。
11.根据权利要求10所述的制造方法，其中，通过无血清凝集悬浮培养法进行所述悬浮培养。
12.一种含有下丘脑组织和垂体组织的细胞结构体的制造方法，包括以下的步骤(i)～(iii)：
(i)将人多能干细胞的凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进行悬浮培养的步骤，
(ii)将步骤(i)中形成的细胞凝集块在含有骨形态发生因子信号转导通路激活物质和作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤，
(iii)将步骤(ii)中得到的细胞凝集块在适于垂体和下丘脑的同时诱导的培养基中进行悬浮培养的步骤。
13.根据权利要求12所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(ii)和(iii)。
14.根据权利要求12或13所述的制造方法，其中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间进行以下的步骤(a)，在步骤(iii)中，将步骤(a)中得到的细胞凝集块进行悬浮培养，
(a)将步骤(ii)中得到的细胞凝集块在含有作用于Shh信号通路的物质的培养基中进一步进行悬浮培养的步骤。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的制造方法，其中，在高氧分压条件下进行步骤(a)。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的制造方法，其中，在饲养细胞的非存在下进行所述悬浮培养。
17.根据权利要求12～16中任一项所述的制造方法，其中，步骤(i)中的所述凝集块通过分散的人多能干细胞的悬浮培养而形成。
18.根据权利要求12～17中任一项所述的制造方法，其中，骨形态发生因子信号转导通路激活物质为BMP4。
19.根据权利要求12～18中任一项所述的制造方法，其中，作用于Shh信号通路的物质为SAG。
20.一种细胞结构体，是通过权利要求1～19中任一项所述的制造方法而得到的。
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