CN108485669A - 海藻活性提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了海藻活性提取物,其制备方法包括:预处理、脱脂、发酵、提取、纯化,首先将新鲜海藻经清洗、晾晒、干燥、粉碎得海藻干粉,在海藻干粉中加入分析纯丙酮进行脱脂,在脱脂残渣与蒸馏水的混合液中接种入海滨芽孢杆菌进行发酵,将发酵液脱水后先后进行醇提与水提,在提取浓缩液中加入氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯的混合溶液进行纯化,经洗涤干燥后即得海藻活性提取物。本发明还公开了海藻活性提取物在土壤土质改良剂中的用途。有益效果为:海藻活性提取物中海藻糖的含量可达93‑95%,大大提高了海藻糖的利用价值,海藻提取物应用于土壤土质改良剂中可改善土壤微环境,改善土壤土质。
Description
技术领域
本发明涉及海藻深加工领域,尤其是涉及海藻活性提取物及其用途。
技术背景
“海藻”是海带、紫菜、裙带菜、石花菜等海洋藻类的总称,是生长在海中的藻类,是植物界的隐花植物,藻类包括数种不同类以光合作用产生能量的生物。它们一般被认为是简单的植物,主要特征为:无维管束组织,没有真正根、茎、叶的分化现象;不开花,无果实和种子;生殖器官无特化的保护组织,常直接由单一细胞产生孢子或配子;以及无胚胎的形成。由于与陆地植物有不同的代谢途径和代谢产物,海藻的化学成分复杂,种类多,据报道有60 多种,包括大量钙、铁、镁、锌等矿质营养元素,褐藻淀粉、岩藻多糖、褐藻糖胶、木聚糖、葡聚糖等海藻多糖,还有糖醇、氨基酸、维生素、细胞色素、甜菜碱以及酚类化合物等,此外,还含有生长素、细胞激动素、赤霉素、脱落酸等天然激素类物质。
发明内容
本发明的目的在于提供海藻活性提取物及其用途,海藻活性提取物的提取方法简单易行,提取过程强化了海滨芽孢杆菌的发酵能力,强化糖与结合蛋白的分离,提高了分离效率,还可以大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率,提高海藻糖的得率与含量,海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂。
本发明所用的微生物及其购买企业为:海滨芽孢杆菌,上海酶研生物科技有限公司。
本发明针对背景技术中提到的问题,采取的技术方案为:海藻活性提取物,其制备方法包括:预处理、脱脂、发酵、提取、纯化、洗涤,具体包括以下步骤:
预处理:将采获的新鲜海藻用自来水清洗4-5次,在26-30℃温度下晾晒3-5天,于55-60℃烘箱中烘48-60小时得到干燥海藻,粉碎后过80-120目筛得海藻干粉;预处理可将附着在海藻表层的盐分、贝类、沙土等污物清洗干净,然后将海藻制成粉状有助于后续操作;
脱脂:在海藻干粉中加入8-10倍分析纯丙酮,搅拌脱脂3-4小时,以4000-5000r/min离心5-8分钟,弃去上清液,沉淀中再加入海藻干粉4-5倍的分析纯丙酮,重复以上操作,最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收;以分析纯级丙酮脱脂简单易控,不会破坏海藻中活性物质的结构与性质,同时丙酮可以回收再利用,降低了成本;
发酵:将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18-20mL的固液比混合,调节混合液pH至6.5-6.8,121-122℃灭菌15-18分钟,待混合液温度降至室温后,接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵,种子液接种量为5-8%,在38-42℃、80-150r/min条件下发酵10-16小时,发酵结束后,离心取上清液即为海藻发酵液;通过海滨芽孢杆菌发酵处理,海藻脱脂残渣中的糖与结合蛋白会分离,蛋白质进一步降解为多肽及氨基酸等小分子,其中的活性糖分得以保留,方便后续对糖分的提取;
提取:将海藻发酵液低温脱水至密度为1.1-1.2g/mL得发酵液浸膏,按质量体积比为1g:5-10mL将体积分数90-95%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中,于65-70℃水浴中提取15-30分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次,收集滤渣;在滤渣中加入12-15倍重量份的蒸馏水,于55-60℃水浴中提取45-60分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次,合并滤液并低温浓缩得浓缩液;醇提与水提结合可以大大提高海藻多糖的得率,不会破坏多糖的结构,同时提取溶剂容易除去,不会增加除杂工序;
纯化:将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比80-85:12-15:1:0.2-0.25的比例混合均匀得混合溶液,酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.5-15.8:1;在不断搅拌下,按照体积比2-4:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中,密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌20-30分钟,倒入分液漏斗中,静止分层后收集上层溶液,并离心分离出变性蛋白,按上述步骤重复操作2-3次,使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液;氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白转变为不溶性物质,经离心去除,可以达到去除海藻糖中蛋白质的目的;特定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用,可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用,因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量,大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率,提高海藻糖的得率与含量,降低提取成本;
洗涤:向海藻糖粗提液加入5-8倍体积分数为95-98%的乙醇溶液,静置过夜后离心,分离出固形物,分别以98-99%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物,冷冻干燥,即得海藻活性提取物;海藻活性提取物中海藻糖的含量可达93-95%,大大提高了海藻糖的利用价值;海藻糖类分子链上含有大量的羟基与羧基,均带负电荷,与金属离子络合成高分子量的复合物,这些复合物的吸水能力强劲,可以有效增强土壤的保水能力,同时,海藻提取物本身又具有一定粘性,能改善土壤团粒结构,提高土壤通气性,土壤水分含量及通气状况发生改变,其氧化还原状态随之发生改变,因此,海藻提取物能间接影响土壤微生物数量、活性及群落结构。
作为优选,发酵步骤的蒸馏水中含有0.5-0.8‰的4-羟基苯甲醇与0.1-0.16‰的间氯苯丙酮;特殊配比的4-羟基苯甲醇与间氯苯丙酮具有协同增效作用,该作用可以作用于体系中的海滨芽孢杆菌,并促使海滨芽孢杆菌增强糖酵解反应,提供更多的活化乙酸,进而提高体系中乙酰辅酶A的含量,增多乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸的量,进一步强化海滨芽孢杆菌的柠檬酸循环,促进海滨芽孢杆菌的生长繁殖,提高对海藻脱脂残渣的发酵,强化糖与结合蛋白的分离,提高分离效率。
海藻活性提取物的用途,海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂,海藻活性提取物及其复合物具有较高的吸水、保水能力,同时其粘性特征使其有助于改善土壤团粒结构,提高土壤通气性,能够间接影响土壤微生物数量、活性及其群落结构,可改善土壤微环境,改善土壤土质。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
1)本发明在发酵的同时会强化海滨芽孢杆菌的柠檬酸循环,促进海滨芽孢杆菌的生长繁殖,提高对海藻脱脂残渣的发酵,强化糖与结合蛋白的分离,提高分离效率;
2)定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用,可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用,因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量,大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率,提高海藻糖的得率与含量,降低提取成本;
3)海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂,海藻活性提取物及其复合物具有较高的吸水、保水能力,同时其粘性特征使其有助于改善土壤团粒结构,提高土壤通气性,能够间接影响土壤微生物数量、活性及其群落结构,可改善土壤微环境,改善土壤土质。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明:
实施例1:
海藻活性提取物,其制备方法包括以下步骤:
1)将采获的新鲜海藻用自来水清洗4次,在26℃温度下晾晒3天,于55℃烘箱中烘48小时得到干燥海藻,粉碎后过80目筛得海藻干粉;2)在海藻干粉中加入8倍分析纯丙酮,搅拌脱脂3小时,以4000r/min离心5分钟,弃去上清液,沉淀中再加入海藻干粉4倍的分析纯丙酮,重复以上操作,最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收;3)将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18mL的固液比混合,调节混合液pH至6.5,121℃灭菌15分钟,待混合液温度降至室温后,接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵,种子液接种量为5%,在38℃、80r/min条件下发酵10小时,发酵结束后,离心取上清液即为海藻发酵液;4)将海藻发酵液低温脱水至密度为1.1g/mL得发酵液浸膏,按质量体积比为1g:5mL将体积分数90%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中,于65℃水浴中提取15分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次,收集滤渣;在滤渣中加入12倍重量份的蒸馏水,于55℃水浴中提取45分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次,合并滤液并低温浓缩得浓缩液;5)将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比80:12:1:0.2的比例混合均匀得混合溶液,酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.5:1;在不断搅拌下,按照体积比2:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中,密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌20分钟,倒入分液漏斗中,静止分层后收集上层溶液,并离心分离出变性蛋白,按上述步骤重复操作2次,使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液;6)向海藻糖粗提液加入5倍体积分数为95%的乙醇溶液,静置过夜后离心,分离出固形物,分别以98%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物,冷冻干燥,即得海藻活性提取物。
实施例2:
海藻活性提取物,其制备方法包括以下步骤:
1)预处理:将采获的新鲜海藻用自来水清洗5次,在30℃温度下晾晒5天,于60℃烘箱中烘60小时得到干燥海藻,粉碎后过120目筛得海藻干粉;预处理可将附着在海藻表层的盐分、贝类、沙土等污物清洗干净,然后将海藻制成粉状有助于后续操作;
2)脱脂:在海藻干粉中加入10倍分析纯丙酮,搅拌脱脂4小时,以5000r/min离心8分钟,弃去上清液,沉淀中再加入海藻干粉5倍的分析纯丙酮,重复以上操作,最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收;以分析纯级丙酮脱脂简单易控,不会破坏海藻中活性物质的结构与性质,同时丙酮可以回收再利用,降低了成本;
3)发酵:将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g: 20mL的固液比混合,调节混合液pH至6.8,122℃灭菌18分钟,待混合液温度降至室温后,接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵,种子液接种量为8%,在42℃、150r/min条件下发酵16小时,发酵结束后,离心取上清液即为海藻发酵液;通过海滨芽孢杆菌发酵处理,海藻脱脂残渣中的糖与结合蛋白会分离,蛋白质进一步降解为多肽及氨基酸等小分子,其中的活性糖分得以保留,方便后续对糖分的提取;
4)提取:将海藻发酵液低温脱水至密度为1.2g/mL得发酵液浸膏,按质量体积比为1g:10mL将体积分数95%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中,于70℃水浴中提取30分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取3次,收集滤渣;在滤渣中加入15倍重量份的蒸馏水,于60℃水浴中提取60分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取3次,合并滤液并低温浓缩得浓缩液;醇提与水提结合可以大大提高海藻多糖的得率,不会破坏多糖的结构,同时提取溶剂容易除去,不会增加除杂工序;
5)纯化:将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比85:15:1: 0.25的比例混合均匀得混合溶液,酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.8:1;在不断搅拌下,按照体积比4:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中,密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌30分钟,倒入分液漏斗中,静止分层后收集上层溶液,并离心分离出变性蛋白,按上述步骤重复操作3次,使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液;氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白转变为不溶性物质,经离心去除,可以达到去除海藻糖中蛋白质的目的;特定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用,可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用,因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量,大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率,提高海藻糖的得率与含量,降低提取成本;
6)洗涤:向海藻糖粗提液加入8倍体积分数为98%的乙醇溶液,静置过夜后离心,分离出固形物,分别以99%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物,冷冻干燥,即得海藻活性提取物;海藻活性提取物中海藻糖的含量可达95%,大大提高了海藻糖的利用价值;海藻糖类分子链上含有大量的羟基与羧基,均带负电荷,与金属离子络合成高分子量的复合物,这些复合物的吸水能力强劲,可以有效增强土壤的保水能力,同时,海藻提取物本身又具有一定粘性,能改善土壤团粒结构,提高土壤通气性,土壤水分含量及通气状况发生改变,其氧化还原状态随之发生改变,因此,海藻提取物能间接影响土壤微生物数量、活性及群落结构。
实施例3:
海藻活性提取物,其制备方法包括:预处理、脱脂、发酵、提取、纯化、洗涤,具体包括以下步骤:
预处理:将采获的新鲜海藻用自来水清洗4次,在28℃温度下晾晒4天,于55℃烘箱中烘48小时得到干燥海藻,粉碎后过100目筛得海藻干粉;预处理可将附着在海藻表层的盐分、贝类、沙土等污物清洗干净,然后将海藻制成粉状有助于后续操作;
脱脂:在海藻干粉中加入8倍分析纯丙酮,搅拌脱脂4小时,以4500r/min离心6分钟,弃去上清液,沉淀中再加入海藻干粉5倍的分析纯丙酮,重复以上操作,最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收;以分析纯级丙酮脱脂简单易控,不会破坏海藻中活性物质的结构与性质,同时丙酮可以回收再利用,降低了成本;
发酵:将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18mL的固液比混合,调节混合液pH至6.7,121℃灭菌15分钟,待混合液温度降至室温后,接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵,种子液接种量为6%,在40℃、120r/min条件下发酵15小时,发酵结束后,离心取上清液即为海藻发酵液;通过海滨芽孢杆菌发酵处理,海藻脱脂残渣中的糖与结合蛋白会分离,蛋白质进一步降解为多肽及氨基酸等小分子,其中的活性糖分得以保留,方便后续对糖分的提取;
提取:将海藻发酵液低温脱水至密度为1.1g/mL得发酵液浸膏,按质量体积比为1g:8mL将体积分数94%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中,于68℃水浴中提取25分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次,收集滤渣;在滤渣中加入14倍重量份的蒸馏水,于55℃水浴中提取45分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2次,合并滤液并低温浓缩得浓缩液;醇提与水提结合可以大大提高海藻多糖的得率,不会破坏多糖的结构,同时提取溶剂容易除去,不会增加除杂工序;
纯化:将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯按照体积比84:14:1:0.2的比例混合均匀得混合溶液,酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.6:1;在不断搅拌下,按照体积比3:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中,密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌25分钟,倒入分液漏斗中,静止分层后收集上层溶液,并离心分离出变性蛋白,按上述步骤重复操作3次,使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液;氯仿、正丁醇的混合溶液可以将游离蛋白转变为不溶性物质,经离心去除,可以达到去除海藻糖中蛋白质的目的;特定比例的L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯在乙酸的存在下可以对蛋白质变性胶状物起作用,可以起到隔离糖与蛋白质变性胶状物的作用,因此可以大大降低蛋白质变性胶状物包裹的海藻糖的量,大大降低海藻糖以蛋白质渠道被分离出去的概率,提高海藻糖的得率与含量,降低提取成本;
洗涤:向海藻糖粗提液加入7倍体积分数为96%的乙醇溶液,静置过夜后离心,分离出固形物,分别以98%的乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤固形物,冷冻干燥,即得海藻活性提取物;海藻活性提取物中海藻糖的含量可达93-95%,大大提高了海藻糖的利用价值;海藻糖类分子链上含有大量的羟基与羧基,均带负电荷,与金属离子络合成高分子量的复合物,这些复合物的吸水能力强劲,可以有效增强土壤的保水能力,同时,海藻提取物本身又具有一定粘性,能改善土壤团粒结构,提高土壤通气性,土壤水分含量及通气状况发生改变,其氧化还原状态随之发生改变,因此,海藻提取物能间接影响土壤微生物数量、活性及群落结构。
发酵步骤的蒸馏水中含有0.6‰的4-羟基苯甲醇与0.12‰的间氯苯丙酮;特殊配比的4-羟基苯甲醇与间氯苯丙酮具有协同增效作用,该作用可以作用于体系中的海滨芽孢杆菌,并促使海滨芽孢杆菌增强糖酵解反应,提供更多的活化乙酸,进而提高体系中乙酰辅酶A的含量,增多乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成柠檬酸的量,进一步强化海滨芽孢杆菌的柠檬酸循环,促进海滨芽孢杆菌的生长繁殖,提高对海藻脱脂残渣的发酵,强化糖与结合蛋白的分离,提高分离效率。
海藻活性提取物的用途,海藻活性提取物及其复合物可应用于土壤土质改良剂,海藻活性提取物及其复合物具有较高的吸水、保水能力,同时其粘性特征使其有助于改善土壤团粒结构,提高土壤通气性,能够间接影响土壤微生物数量、活性及其群落结构,可改善土壤微环境,改善土壤土质。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知,在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明,应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例,并不用于限制本发明,凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.海藻活性提取物,其制备方法包括:预处理、脱脂、发酵、提取、纯化、洗涤,其特征在于:所述发酵步骤为:将海藻脱脂残渣与蒸馏水按照1g:18-20mL的固液比混合,调节混合液pH至6.5-6.8并灭菌,待混合液温度降至室温后,接入海滨芽孢杆菌种子液进行发酵,种子液接种量为5-8%,发酵结束后,离心取上清液即为海藻发酵液。
2.根据权利要求1所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述发酵步骤的蒸馏水中含有0.5-0.8‰的4-羟基苯甲醇与0.1-0.16‰的间氯苯丙酮。
3.根据权利要求1所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述发酵步骤中的发酵温度为38-42℃,摇床转速为80-150r/min,发酵时间为10-16小时。
4.根据权利要求1所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述预处理步骤为:将采获的新鲜海藻用自来水清洗,晾晒后于55-60℃烘箱中烘48-60小时得到干燥海藻,粉碎后过80-120目筛得海藻干粉。
5.根据权利要求1所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述脱脂步骤为:在海藻干粉中加入8-10倍分析纯丙酮,搅拌脱脂3-4小时,离心弃去上清液,沉淀中再加入海藻干粉4-5倍的分析纯丙酮,重复以上操作,最后所得残渣在常温下挥干丙酮并回收。
6.根据权利要求1所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述提取步骤为:将海藻发酵液低温脱水得发酵液浸膏,按质量体积比为1g:5-10mL将体积分数90-95%的乙醇溶液加入到发酵液浸膏中,于65-70℃水浴中提取15-30分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次,收集滤渣;在滤渣中加入12-15倍重量份的蒸馏水,于55-60℃水浴中提取45-60分钟,过滤后取滤渣按同样条件水浴加热提取2-3次,合并滤液并低温浓缩得浓缩液。
7.根据权利要求6所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述提取步骤中,发酵液浸膏的密度为1.1-1.2g/mL。
8.根据权利要求1所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述纯化步骤为:将氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯混合均匀得混合溶液,在不断搅拌下,按照体积比2-4:1的比例将混合溶液缓慢倒入浓缩液中,密封后用磁力搅拌器缓慢搅拌20-30分钟,倒入分液漏斗中,静止分层后收集上层溶液,并离心分离出变性蛋白,按上述步骤重复操作2-3次,使提取液中的蛋白质脱除完全即得海藻糖粗提液。
9.根据权利要求8所述的海藻活性提取物,其特征在于:所述纯化步骤中,氯仿、正丁醇、乙酸、酒石酸二甲酯的体积比为80-85:12-15:1:0.2-0.25,酒石酸二甲酯中L-酒石酸二甲酯与D-酒石酸二甲酯的比例为15.5-15.8:1。
10.海藻活性提取物的用途,其特征在于:所述海藻活性提取物及其复合物在土壤土质改良剂中的用途。
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