JP2007537737A - 中国冬虫夏草無性型菌（ＨｉｒｓｕｔｅｌｌａｈｅｐｉａｌｉＣｈｅｎ＆Ｓｈｅｎ）の工業発酵生産方法 - Google Patents

Abstract

本発明は中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子工業発酵生産方法に及ぶ。本発明の利点や効果は以下のようである。先ず、毎年産地へ新菌類を収集し、操業を始めた菌類を若返らせる方法や、培養期で生長発育周期を完成させ、発育特徴が子実体を産出できるかを観察する方法で、菌類の真偽を測定し、それに、無性胞子特徴を通し、固有の遺伝特性が喪失かを検定したので、冬虫夏草無性型中国被毛胞子の品種の真偽や菌類の特性を絶え間なく修正でき、製品の質や薬用効果を安定させる。次に、本発明の培地調合法や物理条件を応用したので、様々な虚弱症の治療や、人体器官移植後排異を抵抗する（とりわけ腎臓移植手術）後、この製品はあり変わらず天然冬虫夏草と同じような排異を抵抗する役割や排異を抵抗する薬の服用で起こした毒害を解消する役割を持っているが、値段が天然冬虫夏草より遥かに低く、市場の見込みが広い。

Description

発明の詳細な説明

本出願は、同時継続中である2005年４月25日に出願された「中国冬虫夏草無性型菌（Ｈirsutella hepiali Chen & Shen）の工業発酵生産方法」と題された特許協力条約出願PCT/CN2005/000565の一部継続出願であり当該出願の優先権を主張するものである。なお、特許協力条約出願PCT/CN2005/000565は、本出願において、そっくりそのまま参考文献として組み込まれる2004年３月３１日に出願された中国出願番号200410037116.9の優先権を主張するものである。

〔技術分野〕
本発明は中国冬虫夏草（Cordyceps sinensis (Berk) Sacc）の無性型菌の生産方法にかかわる；この無性型菌の学名はHirsutella sinensis Liu ,Guo ,Yu & Zengである。また、その同種異名はHirsutella hepiali Chen et Shenである。特に中国冬虫夏草無性型(Hirsutella sinensis Liu ,Guo ,Yu & Zeng）の工業発酵生産方法にかかわる。

〔背景技術〕
中国冬虫夏草は青海チベット高原に分布しており、主な産地は４５００〜５２００メートルの高海抜地域である。その上、温度と湿度とが非常に低く、光の質と空気組成が非常に厳密で、一年の内八ヶ月の間氷に閉ざされているような非常に特殊な生態条件を必要とする。しかしながら、その薬用価値は高い。特に人体の免疫機能と内分泌との両方を調節する作用がある。また、器官移植の際の拒絶反応を抑える作用もある。近年、腎臓移植の研究の間に、冬虫夏草を有効成分として含む薬剤に、拒絶反応抑制剤であるサイクロスポリン（Ｃｓ）Ａおよび、それに添加される薬剤の長期間の投与によって引き起こされる有毒な副作用に対して非常に良質の解毒作用があることが発見された。

真菌は下等植物であり、長期に渡って適合ではない環境で成長すれば、もとの品種特性が変わって、優れた薬効が徐々に失われる。もとの菌類特性の変化を引き起こす原因は二つある：第一は、品種の変化である。無性時期すなわち菌糸時期の期間中に、同一あるいは類似の生態条件の下で成長する様々な品種の真菌の特性は、非常に似ている。冬虫夏草が生育する組織の体表には、数十種の異なる真菌がある。したがって、初代培養するときに、共生する雑菌が消毒と殺菌のため抑制状態になる。しかし時間が経つと雑菌が蘇って、速く成長して、知らないうちに冬虫夏草に取って代わる。第二は、以下の通りである。つまり、たとえ「品種」が変わらなくても、もともとの成長する環境は高海抜地域で、温度が非常に低くて、一年に結氷期が八ヶ月もある。しかし、人工培養の場合、成長を速くして、産量を上げるため、１６〜１８度の条件の下で培養する。しかも、培地としては菌糸の成長が速い原料を使う。光線の質量と空気の成分も大いに異なる。このように、長期に適合ではない条件の下で繁殖して、しかも成長の速い個体ばかりを取り出すと、固有の特性が徐々に変化して、もとの薬効成分も次第に減少する。

菌糸が発酵缶の中で育ちあがった後、生産品（菌糸）を取り出す時、一般的には遠心機絹紗袋濾過法を使う。ところが、絹紗袋の孔径が均一ではないため、遠心機が高速に回転することで一部の菌糸が無くなる；そして、濾過される菌糸は遠心の圧力の作用で濾過袋に密着して、硬くて丈夫な菌糸層を形成する。その菌糸層を手で薄片に引き裂く必要がある。手工作業で引き裂かれる菌糸の薄片はそれぞれの厚さが不均質なため、それを加熱して乾燥させる時に、それぞれの薄片の加熱される程度と酸化する程度が不均質で、生産品の光沢と成分に影響を与える；更に、手工作業は生産品の細菌に接触する機会を増加させる。前記問題を解決するために、工場の優秀な技術員は長い年月の実践と実験を積み重ねて、回転真空濾過機で濾過してからトンネル乾燥で菌糸を取り出す技術を採用する。それによって、菌糸の生産量と質量をともに上げることができる。

冬虫夏草の薬用価値が高いため、二十世紀八十年代から、全国で二十から三十の研究所がこの菌についての研究をしている。この菌の種を得るために、その産地に実験室を建てる必要がある。産地に建てられた実験室の中に、海抜が３７００メートルの実験室もある。その実験室の夏の最高温度は１６度である。実験基地は海抜が４６００メートルの冬虫夏草の生産区域に位置する。そこで成熟した冬虫夏草の有性胞子（子嚢胞子）を獲得できる。滅菌の条件の下でそれを三角瓶の中で完全に発育させる。野生の子嚢胞子（或いは生きた組織）→菌コロニー→分生胞子→子実体（子座ともいう、高等植物の穂出しに当たる）→子嚢胞子（高等植物の種に当たる）。この過程は野生の子嚢胞子の発育周期と全く同じである。

培地。中国冬虫夏草菌は専一的な昆虫寄生真菌で、宿主に対する要求が非常に厳しくて、コウモリ蛾幼虫にしか寄生できない。つまり、冬虫夏草は栄養に対する要求が高くて、特殊である。人工の培地でその要求を満たすことが難しい。コウモリ蛾幼虫は高海抜山地の地下虫である。その分布規律についての研究を通して、菌類を分離するとき、直接に宿主虫を培地として使う。菌類を分離したあと、逆に各種の真菌培地を使って実験を行って、好まれる成分を引き出して、それらを組み合わせる。それによって、無菌条件の下で、三角フラスコの中で発育周期が完成できる培地を作る。

また、分離するときに使う組織の材料も重要である。もし冬虫夏草の子実体が地面を出てから採集すれば、虫草の虫体組織の中にすでにたくさんの雑菌が入っているため、虫草菌を分離するのが難しい。高海抜産地で培地にするための宿主虫をたくさん掘り出す。山に登って宿主虫を採集するときに、一度に十の寄生されたばかりの虫を掘り出すことがよくある。その虫の頭に粟ぐらいの大きさの子実体が“芽”とも呼ばれる。これらの寄生された虫は氷の中で冬を過ごして、翌年の五月のはじめの頃に氷が溶けて、子実体が地面を出る。冬の前に、これらの虫の組織体を使って虫草菌を分離すれば成功率が一番高い。それは、そのときの虫の組織体が丈夫で清潔で、しかも虫草菌も生命力が一番強い時期だからである。

虫草菌を得たあと、それが本当の虫草菌であるかどうかを証明するのも重要である。産地での研究は、虫草採集地域に虫草有性胞子（子本胞子）を育てる実験基地を建てることができる。その採集地域は一般的に住民から離れて、海抜の高いところにある。牛や羊が夏の牧場に入る前に、自然に成長する冬虫夏草を土といっしょに掘り出して集める。そして、針金でそれを囲んで、見張りをつける。そうしないと、真夏に牛や羊が産地に入って、土を踏んだり噛んだりしてからは、冬虫夏草を見つけることができなくなる。有性胞子（子嚢胞子）が成熟して噴出す前に消毒紙袋をかぶれば、大量の成熟子嚢胞子を収集できる。当地で成熟する子本胞子だけが芽生えられるからである。冬虫夏草子嚢胞子の個体が大きいため、その表面が細菌と微小な真菌胞子に感染されることは避けられない。個体を守るために一般の殺菌方法は使えない。ところが、大量の成熟子嚢胞子を収集すれば、実験室で沸かした産地の土壌溶液（土壌と水の比例は１：１）で子嚢胞子を消毒紙袋の中から土壌溶液に流して、２０％、４０％、６０％、８０％の濃度の違う蔗糖溶液を形成させる。遠心機でそれぞれの濃度の溶液を３０分高速遠心させる。その目的は子嚢胞子の体表の異なる比重の雑菌とほかの真菌胞子を振り落として、冬虫夏草子嚢胞子を浄化して消毒することである。それから、殺菌土壌溶液の中で比較的薄い胞子溶液を調合して、それを小さな蒸発皿の底部の薄い培地に敷いて、１５〜２０度の室温の下で３〜６日置くと、子嚢胞子が芽生える。顕微鏡で回りに雑菌がない子嚢胞子を探して、接種針でそれを取り出して、清潔な小さな蒸発皿に移植する。その子嚢胞子の菌糸を生やす→菌コロニを形成する→分生胞子を生やすの過程を顕微鏡で観察する。もしそれが生きている虫草組織体から分離する菌の分生胞子と同じであれば、冬虫夏草だと判断できる。それを５００ミリリットル以上の三角フラスコに移して、１０度以下の温度で培養する。その中に子実体を形成する個体もある。ブラックライト灯と紫外線灯を当ててから、その中に子嚢胞子をはじき出す個体もある。その状況は自然に成長する胞子と同じである。それによって、有性胞子も同じであることを証明できる。ところが、このプロセスはたくさんの時間を必要として、難度も高い。それを簡単にするため、子嚢胞子の個体が瓶あるいは試験管の斜面で生やす分生胞子と生きている組織から分離する個体が生やした分生胞子の大きさ、形態、色、胞子茎などの特徴を比較することによって、冬虫夏草であるかどうかを判断できる。発育周期が完成する。これは生物界の公認する最も科学的な証拠である。

特許を申請した：中国冬虫夏草およびその人工培養方法（中国特許：８５１０１９７１．４）。

十分の数量の産品を獲得し、医療市場に供給するために、生物科学の発酵の方法を採用する必要がある。この種の菌類の要求が非常特殊なので、工業的な発酵を実現させるのも非常に難しいことである。普通の菌類の場合、２５℃以上の状況で１０日間ぐらいで完成できるが、虫草菌の場合、２０℃以下の状況でなければならないし、４０日間にわたって４級の発酵が絶対必要である。こんな長い期間で汚染を防止することが非常に難しことである。『中国の冬虫夏草真菌の発酵生産方法』（中国特許：９７１１０４４８．４）に記載されている特許の特徴としては、菌類を一級の菌類缶に移入し、２０℃以下の温度状況で、６〜８日間発酵させ、培地の十倍の量に拡大させ、クラスごとに発酵させ、必要な量になると、缶から取り出して濾過することである。液体培地は、炭源０．５〜５％、窒源０．５〜５％、微量元素、少しのビタミンと水からなっている。この方法で、冬虫夏草真菌の大量的な生産ができるようになり、しかもコストも低く、速度も速い。しかし、生産の継続につれて、真菌の代々の繁殖により、産品も段々変異していく。この特許は冬虫夏草真菌の本来の種類と菌類の特性を保持するという面においてはたりないである。

〔発明の公開〕
本発明の目的は、上述の足りないところを補い、絶え間なしに冬虫夏草真菌の本来の種類を検定し修正すると同時に菌類の特性を保持することができ、そして産品の品質を守り、産品の薬用効果を長く保持できる生産方法を提供することである。

本発明の二番目の目的は、一種の改良された、生産量を高め、品質を改善できる菌糸を摂取し乾燥する方法を提供することにある。

本発明は、上述の技術問題を以下の技術案で解決する。
中国の冬虫夏草無性型菌中国被毛胞子の工業発酵方法であり、以下のステップを含む。

１．新菌類の分離：産地で新しい菌類を分離し、１０〜２０℃で培養するために三角フラスコへ移す；
２．検定：獲得した上記新菌類を０〜１０℃の状況で培養し、新菌類が子実体を生み出すかどうを検定し、子実体を生み出す菌類を生産に使う。

３．若返らせて培養すること：生産に使った菌類、純化され１０代以上繁殖した菌類を若返らせて培養し、０〜１０℃の低温状況で、５代以上繁殖させる。培養で生み出された分生胞子と胞子茎とは、産地から分離された菌類の分生胞子と胞子茎と同一であり、子実体を生み出すことができる。このことは、比較することで検証される。上述のステップに用いられる培地は固形培地であって、その調合法は、１０００ｇ当たり、牛肉スープ（１：２）３００〜５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５〜１０ｇ、酵母１０ｇ、ブドウ糖２０〜４０ｇ、ミルク１００〜２００ｇ、核酸０．５〜１ｇ、硫酸マグネシウム０．１〜０．４ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６〜１ｇ、ビタミン複合物０．５〜２ｇ、寒天１５〜２０ｇ、水３００〜６００ｇである。上記培地のｐＨ値は７〜８である。

４．二次培養：上述の要求に合う菌類を液体培地に移入し、１２〜２０℃の状況で培養し、そして振とう装置に置いて、６〜１２日間培養する。

５．発酵：上述の培養された菌類をステップ１の開始容器に移入し、１２〜２０℃の状況で８〜１２日間を発酵させ、そして培地を８〜１２倍に拡大させ、徐々に発酵させ、上記容器から取り出し乾燥する。上記液体培地は、重量のパーセンテージで炭源０．５〜５％、窒源０．５〜２％、微量元素０．１〜０．２％、およびビタミン０．１〜０．２％の中からいずれかを一種以上含み、それ以外は水である。

培地は菌類の成長、繁殖、異化代謝および同化作用を支える栄養原料で、当該培地の組成と配合とが適切かどうかに、菌類の生長と、発達と、発酵単位と、抽出技術と、最終製品の品質と生産量とが相当の影響受ける。培地の配合が適切であれば、生産用の菌類の生物的合成能力を十分発揮でき、最高の生産効果があり、発酵の効率を高めることもできる。それ故、培地の組成を重要視しなければならない。よい培地を確定するためには、長期間の生産実践が必要で、絶えずに改善することも必要である。培地の成分の一つである、炭源は培地の中でエネルギーでありながら、菌類を構成する細胞材料でもある。微生物の成長の中で、炭源は主に菌類が成長するのに必須であり、菌類の生存を維持するために消費されることが必要で、蓄積した代謝産物の消費に必要である。公式で示すと、１／Ｙ_Ｘ／Ｓ＝ｍ／μ＋１／Ｙ_Ｇになるが、その中のｍは炭源で、Ｙ_Ｘ／Ｓは菌類の成長、または発酵の過程の中で物質が消費されると同時に生成した菌体量の比である。公式からも分かるように、炭源が菌類の成長と代謝に必須、または、もっとも重要な物質であり、菌類の成長過程の中で炭源のバランスを維持する必要がある。本発明者は長期にわたった研究に基づいて、固形培地の調合法を発明した。以下の通りである。１０００ｇで計算する場合：牛肉スープ（１：２）３００〜５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５〜１０ｇ、酵母１０ｇ、ブドウ糖２０〜４０ｇ、ミルク１００〜２００ｇ、核酸０．５〜１ｇ、硫酸マグネシウム０．１〜０．４ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６〜１ｇ、ビタミン複合物０．５〜２ｇ、寒天１５〜２０ｇ、水３００〜６００ｇ。液体培地は、下記の物質を少なくとも１種以上含み、その他は水である。０．５〜５％の炭源、０．５〜２％の窒源、０．１〜０．２％の微量元素、０．１〜０．２％のビタミン。それ故、中国冬虫夏草の炭源のバランスを維持することができるだけでなく、菌体の発酵するときの効率を最も高くすることができる。結果として、発酵生産物の収量を劇的に増やすことができる。菌類の成長過程の中で、エネルギー源としてのＡＴＰだけでは不十分である。常に、細胞にもともとの原子価状態で存在している窒源、微量元素、およびビタミン等のような細胞を合成するのに必要なその他の物質が必要である。菌類の成長過程では、二種類の状況が起こっている。一つは、炭源から分解されることで生じるＡＴＰが限定要因となっていることを除けば、菌細胞を合成するための物質が豊富にあるという状況で、もう一つは、菌細胞を合成するための物質が限定要因となっていることを除けば、ＡＴＰは過剰に存在するという状況である。本発明者は長期間の研究を通して、ＡＴＰと菌体細胞材料との相互制限を解決し、最大の利用効果を実現し、中国被毛胞の発酵の獲得率を高めることができる、固形培地の調合法と液体培地の調合方法とを発明した。つまり、固形培地の調合は、以下の通りである（１０００ｇで計算する場合）：牛肉スープ（１；２）３００〜５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５〜１０ｇ、酵母粉１０ｇ、ブドウ糖２０〜４０ｇ、ミルク１００〜２００ｇ、核酸０．５〜１ｇ、硫酸マグネシウム０．１〜０．４ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６〜１ｇ、ビタミン複合物０．５〜２ｇ、寒天１５〜２０ｇ、および水３００〜６００ｇ。液体培地は少なくとも下記の物質のいずれかを１種以上含み、その他は水である。０．５〜５％の炭源、０．５〜２％の窒源、０．１〜０．２％の微量元素、０．１〜０．２％のビタミン。菌体の成長に影響を与えている物理的な要因の中で、温度が重要な役割を果たしている。熱は菌体の表面に影響を与えているだけでなく、菌体の中に伝達し、菌体の中のすべての構造物質にも影響を与える。そして、中国の冬虫夏草無性型菌中国被毛胞子は温度への要求が非常に高く、発酵の間に菌類自身も熱量を発しているので、温度のコントロールがよくなければ、菌類の大部分が死んでしまう。本発明は温度を、菌類に最適な温度条件である、１２〜２０℃の範囲に制御する。菌体の成長には一定のｐＨで表される酸度またはアルカリ度が必要である。ｐＨ値は微生物の成長と代謝産物の形成に重要な役割を担っている。違った種類の菌体は、異なるｐＨ値をそれぞれ要求する。さらに同じ種類の菌類でもｐＨ値の違いによって、違った発酵産物が生成される。そして、菌類の成長に最も適切なｐＨ値と発酵に最も適切なｐＨ値が違う場合もよくある。主な原因としては、下記の理由を挙げることができる。１、発酵液の中のｐＨ値が変化することにより、菌類細胞の形質膜の電荷が変化する。２．発酵液のｐＨ値が直接に酵素の活性に影響を与えるので、違った酵素が違ったｐＨ値の状況でしか最大の活性が発揮できない。３．発酵液のｐＨ値は培地のある重要な栄養物質と中間代謝産物の分解に影響し、菌類がこれらの物質を利用することに影響を与える。しかし、本発明は固形培地のｐＨ値を７〜８に調整し、液体培地のｐＨ値を７．０〜７．５に調整したので、この種の菌類は成長に最も適切なｐＨ値で、最高の成長ができる。

最適の選択として、上記固形培地の調合法（１０００ｇで計算する場合）は、牛肉スープ（１：２）３００〜５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５〜１０ｇ、酵母１ｇ、ブドウ糖２０〜４０ｇ、ミルク１００〜２００ｇ、核酸０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、燐酸二水素化カリウム１ｇ、ビタミン複合物１ｇ、寒天１５ｇ、および水４００〜６００ｇである。当該培地のｐＨ値は７．２〜７．６である。

最適の選択として、上記液体培地において、窒減は下記のいずれかの物質を少なくとも１種以上含み、含有量は重量パーセンテージで０．５〜２％である；カーコのさなぎ、蛋白ペプトン、ミルク粉、酵母、およびラクトアルブミン加水分解産物。炭源は下記のいずれかの物質を少なくとも１種以上含み、含有量は重量パーセンテージで０．５〜５％である；ローヤルゼリー、オートムギ粉、ムギかす、蔗糖、ブドウ糖、およびトウモロコシ粉。微量元素は下記のいずれかの物質を少なくとも１種以上含み、含有量は重量パーセンテージで０．１〜０．２％である；硫酸マグネシウム、燐酸二水素化カリウム、および希土類元素。これらの培地原料を使うならば、コストが低いだけでなく、簡単に手に入り、それに培養効果も非常によい。

最適の選択として、上記液体培地には、水１０００ｇ当たり、カイコのさなぎ粉１５ｇ、蛋白ペプトン２ｇ、トウモロコシ粉１０ｇ、ムギかす１５ｇ、ブドウ糖２０ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、および燐酸二水素化カリウム０．６ｇが入っている。そして当該液体培地のｐＨ値は７．０〜７．５である。

最適の選択として、上記液体培地には、水１０００ｇ当たり、ローヤルゼリー２ｇ、オートムギ粉２０ｇ、ミルク粉１５ｇ、蔗糖２０ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６ｇ、およびビタミン１ｇが入っている。そして当該液体培地のｐＨ値は７．０〜７．５である。

最適の選択としては、上述のビタミン複合物は、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、チアミン、およびリボフラビンと水とを混合することで調製される。

本発明のもう一つの特徴は上述の発酵が完了した後、上記液体培地を高位保存缶に移入し、ゆっくりとドラム真空乾燥機に入れることである。その結果、菌糸を満遍なくに底に吸着し、徐々に１５〜２０メートルの長い乾燥トンネルに送ることができる。上記菌糸を含む培地が出口に到達すると、７０〜８０％の水分を失っている。それから、カッターで０．８〜１．２ｃｍの断片にする。最終的にこれら断片を、沸騰乾燥機によって素早く乾燥した後、粉粋してから篩にかけて最終製品を得る。

または、人工的に発酵した培地をホモジナイズし、膜を通して濾過してから、霧吹き乾燥し、菌粉を獲得する。この霧吹き乾燥方法によって、培地中の菌類の誘導物の量が増加するため、自然の冬虫夏草により近い成分を含み効果がより高くなる。

本発明の利点と効果は以下の通りである。まず、毎年産地で採集した新菌を使い、そして使われた菌を若返らせて培養し、培養期の中で成長が終わり、子実体を生み出すかどうかを観察することで菌類の真偽を検定し、また無胞子で固有の遺伝特性を鑑定する。以上の方法を使うので、絶えずに冬虫夏草無性型菌中国被毛胞子の真偽を検定し、その特性を修正することもできる。次に、本発明の培地調合法と物理条件を利用した。本発明の方法により製造された製品は、各種の不全症候群を治療することおよび、臓器移植後（特に腎臓移植後）に用いられる抗拒絶効果並びに、自然の冬虫夏草が有する効果と同一であるＣｓおよびその他の抗拒絶薬剤に対する解毒効果に関して、基本的に自然の冬虫夏草が有している効果と同一であることを、実践を通して検証し証明した。しかも価格が自然の冬虫夏草よりかなり低く、市場の見込みがかなりある。最後に、本発明では真空乾燥法で産品を摂取、乾燥するので、菌糸の獲得率が５〜２０％ほど高まった。色は元々の灰色と濃褐色とから現在の自然の冬虫夏草の表面と同じ色である濃褐色または茶褐色に変わり酸化が均一であるということを示している。その結果、産品の品質が自然の冬虫夏草のものに非常に近くなっている。

〔図面の簡単な説明〕
図１は本発明で発酵する時の菌体成長の曲線タイヤグラフである。

図２は本発明の菌類の子実体の写真である。

〔本発明を実現するベスト方法〕
実施例１：毎年産地に新菌類を分離し、それの有性繁殖型と無性繁殖型との培養をした（子実体を生み出すことと胞子を生むこと）。つまり１０℃で培養し、獲得した新菌を５００ｍｌの三角フラスコに移入して、０〜１０℃の状況で培養し、子実体を生み出す菌類は冬虫夏草で、生み出さないのを捨てる。生産に用いられ、純化され１０代以上繁殖した菌類は、高栄養固形培地で、０〜１０℃で５代以上若返えらさなければならない。比較の結果、仮に若返った菌類の分生胞子と胞子茎とが、新しく産地から分離された菌類のものと同一であり、三角フラスコ内に子実態を発達することができコロニーを形成することができれば、変異は無いか、もしくはほとんど変異は無く、そのため、上記菌類は依然として、生産に用いることができる。

上述の培養に使う培地の調合法は総量が１０００ｇである場合、牛肉スープ３００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物１０ｇ、酵母１ｇ、ブドウ糖４０ｇ、ミルク４０ｇ、核酸０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．１ｇ、燐酸二水素化カリウム１ｇ、ビタミン複合物２ｇ、寒天２ｇ、および水３００ｇであり、その培地のｐＨ値は７である。

上述のように処理された菌類を液体培地に移入し、そしてテーブルに置く。温度は１２℃である。そしてステップ１の開始容器に移入し、１２℃の状況で１２日間発酵させる。それから、培地を１２倍に拡大させ、徐々に発酵させる。ステップ４において２０〜３０トンの生産容器に移すまで、発酵は液体培地の中で行う。上記培地（重量のパーセンテージで示す）：１０００ｇの水の中には、カイコのさなぎ粉１５ｇ、蛋白ペプトン２ｇ、トウモロコシ粉１０ｇ、ムギかす１５ｇ、ブドウ糖２０ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、および燐酸二水素化カリウム０．６ｇが入っている。その液体培地のｐＨ値は７．０である。

それから、液体培地（菌糸を含む）をドラム真空乾燥機に入れて、菌糸が満遍なく濾過器の底に呼着し、ベルトで１５メートルの恒温乾燥トンネルに送り、乾燥する。温度が６０℃で、満遍なく熱を受け、酸化されて、出口に行くともう８０％の水分がなくなった。続いて、カッターで０．８ｃｍの断片に切り、沸騰乾燥機で素早く乾燥した。そして、粉粋し篩にかけて最終製品を得た。

対比例１：菌類を液体培地に移入し、またテーブルに置く。１２℃の状況で１２日間培養する。その後、ステップ１の開始容器に移入し、１２℃の状況で１０日間発酵させ、培地（体積）の１０倍に拡大させ、徐々に発酵させた。需要される量になったら、取り出して濾過すればよい。その液体培地は（重量のパーセンテージで示す）：カイコのさなぎ粉１．５％、蛋白ペプトン０．１％、トウモロコシ粉２％、蔗糖２％、少量の燐酸二水素化カリウム、および少量の硫酸マグネシウムが入っていて、他は水である。

実験例１：
実験材料：
冬虫夏草の抽出液の調製：人工の冬虫夏草の菌粉と前もって用意した自然の冬虫夏草の菌粉とを３０分ほど煮てから、抽出する。かすを、アルコールと酵素の加水分解という方法で再度、抽出し、抽出液を混合して濃縮した。濃度は０．８ｇ（酵素）：ｇ（抽出液）である。

腎臓中毒の模型の調製：２５ｍｇ：キログラム（体重）という基準に、ＣｓＡを白鼠に皮下注射し、それを腎臓中毒模型にさせる。

実験方法：
無作為で健康のＳＤ鼠を９０匹を抽出し、体重は３５０ｇ土５０ｇに限られる。それを腎臓有毒模型にする。９０匹の鼠を一組当たり３０匹の３組に分けた。その中の１組に本発明の産品を使い、ほかの２組に同類のほかの産品（例えば：寧心宝）を使い、それを対比に、自然の冬虫夏草と比較する。毎日それを観察し、１００日後その生存率を計る。

上述の量で、毎日二回、実施例１の組と比較例１の組、及び自然の冬虫夏草の組に、抽出液を飲ませる。

結果：本発明が作った中国の冬虫夏草無性型菌中国被毛胞子の発酵産品は鼠のＣｓＡ中毒への治療効果が明確に比較例１より高く、その生存率は自然の冬虫夏草の組の生存率に近い。

実施例２：毎年産地へ新菌類を分離し、この菌類に対し、有性繁殖型及び無性繁殖型発育周期の培養（即ち子実体の産出と分生胞子）、即ち１６℃で培養を行い、新しく分離した菌類を獲得した後、５００ｍｌの三角フラスコにつなげ、５℃で培養を行い、子実体を産出できる菌類は、冬虫夏草菌であり、そうでなければ、淘汰する。生産に用いられ、純化され１０代以上繁殖した菌類は、高栄養固形培地で、５℃で５代以上若返えらさなければならない。比較の結果、仮に若返った菌類の分生胞子と胞子茎とが、新しく産地から分離された菌類のものと同一であり、三角フラスコ内に子実態を発達することができコロニーを形成することができれば、変異は無いか、もしくはほとんど変異は無く、そのため、上記菌類は依然として、生産に用いることができる。

上述の培養に用いた培地調合法：総重量は１０００ｇで、牛肉スープ４００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物４０ｇ、酵母粉２ｇ、ブドウ糖３０ｇ、ミルク１５０ｇ、核酸０．７ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、燐酸二水素化カリウム０．８ｇ，ビタミン複合物１ｇ，寒天１８ｇ，および水５００ｇである。その内固形培地のｐＨ値は７．６である。

上述の段取りで処理された菌類を液体培地に移入し、振とう装置に置いた。温度は１６℃である。それから、ステップ１の開始容器に移入し、１６℃の温度で、１０日以上発酵させる。それから、培地を１０倍に拡大し、徐々に発酵させた。ステップ４において２０〜３０トンの生産容器に移すまで、発酵はと液体培地で行われた。上記液体培地（重量パーセンテージで計算する）は、水１０００ｇごとに、ローヤルゼリー２ｇ、オート麦粉２０ｇ、ミルク粉１５ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、燐酸二水素化ナトリウム０．６ｇ、ビタミン１ｇである。上記液体培地のｐＨ値は７．２である。

それから、液体培地（菌糸を含む）をドラムドラム真空乾燥機に送入し、菌糸は万遍なく濾過器の底に吸着し、ベルトで１８メートルの恒温乾燥のトンネルを徐々に移動させ、乾燥させる。温度は６０℃である。菌糸は万遍なく受熱し、続いて酸化も起こった。出口では、すでに７０％の水分を喪失し、１．０×１．０ｃｍの断片にして、沸騰乾燥機で素早く乾燥した。その後粉粋し、篩にかけることで、最終製品を得た。

実施例３：毎年産地へ新菌類を分離し、この菌類に対し、有性及び無性繁殖型発育周期の培養（即ち子実体の産出と分生胞子）、即ち２０℃で培養を行い、新しく分離した菌類を獲得した後、５００ｍｌの三フラスコに入れ、１０℃で培養を行い、子実体を産出できる菌類は、冬虫夏草菌であり、そうでなければ、淘汰する。生産に用いられ、純化され１０代以上繁殖した菌類は、高栄養固形培地で、１０℃で５代以上若返えらさなければならない。比較の結果、仮に若返った菌類の分生胞子と胞子茎とが、新しく産地から分離された菌類のものと同一であり、三角フラスコ内に子実態を発達することができコロニーを形成することができれば、変異は無いか、もしくはほとんど変異は無く、そのため、上記菌類は依然として、生産に用いることができる。

上述の培養に用いた培地調合法：総重量は１０００ｇで、牛肉スープ５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５ｇ、酵母粉１０ｇ、ブドウ糖２０ｇ、ミルク１００ｇ、核酸１ｇ、硫酸マグネシウム０．４ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６ｇ、ビタミン複合物０．５ｇ，寒天２０ｇ、および水６００ｇ。その内培地のｐＨ値は８である。

上述の段取りで処理された菌類を液体培地に移入し、振とう装置に置き、温度は１８℃である。それから、一級菌類缶に移入し、１８℃の温度で、８日発酵させる。それから、培地を８倍に拡大し、徐々に発酵させた。ステップ４において２０〜３０トンの生産容器に入るまで、発酵はともに液体培地で行われた。上記液体培地（重量のパーセンテージで計算する）は、水１０００ｇごとに、カイコのさなぎ粉１５ｇ、蛋白ペプトン２ｇ、トウモロコシ粉１０ｇ、ムギかす１５ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物２ｇ、ブドウ糖２０ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、および燐酸二水素化カリウム０．６ｇである。上記液体培地のｐＨ値は７．５である。

それから、液体培地（菌糸を含む）をドラムドラム真空乾燥機に送入し、菌糸は万遍なく濾過機の底に吸着し、ベルトで２０メートルの恒温乾燥のトンネルを徐々に移動させ、乾燥させる。温度は６０℃である。菌糸は万遍なく受熱し、続いて酸化も起こった。出口では、すでに７０％の水分を喪失し、１．０×１．０ｃｍの断片にして、沸騰乾燥機で素早く乾燥した。そして粉粋し、篩にかけることにより最終製品を得た。

上記最終製品は、この方法でも得られる。即ち、菌糸を含む培地をドラム真空濾過機で、ろ過する。生じたろ液を膜で再び濾過しいくつかの低分子物質を除く。その後、上記濾液を霧吹き乾燥し、生じた製品を菌粉に加えて、均一な混合物になるように混ぜた。

最近の実験：冬虫夏草は四つのステップの発酵を通し、菌糸ができた後、直接均質化され、膜で一部分の低分子物質を濾過して除く。その後、霧吹き乾燥することにより、冬虫夏草人工菌粉を獲得できる。この方法を用いることにより、培地中の菌誘導物の量が増加するため効果が更によくなり、成分は一層天然の冬虫夏草に近づく。

本文で述べた具体的な実施例は本発明の精神について、例を挙げながら説明するだけである。本発明の属している技術分野の技術者は、上記具体的な実施例に対して、いろいろな修正や補充、あるいは類似している方式で取って代わることができるが、それは本発明の精神を離れることや、付属書の特許請求の範囲が定義した範囲を超えることはない。

図１は本発明で発酵する時の菌体成長の曲線タイヤグラフである。 図２は本発明の菌類の子実体の写真である。

Claims (7)

1. 中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法は、以下のステップを含む；
   １）産地から新菌類を分離することと、
   １０〜２０℃で培養することと、
   新菌類を獲得した後、連続培養するために得られた菌類をフラスコへ移すことと、を含む菌類の分離ステップを行うことと、；
   ２）フラスコに移入された上記新菌類を０〜１０℃で培養することと、
   培養された新菌類が子実体を産出できるかどうかをチェックすることと、
   子実体を産出できる菌類を生産に用いるために選択することと、を含む検定ステップを行うことと、；
   ３）生産するためにステップ２で選択された菌類を純化し、繁殖することと、
   固形培地による培養によって１０代以上純化され、繁殖された菌類に対し、若返らせて培養することと、上記菌類は、培養温度０〜１０℃の低温条件で５代以上繁殖されるものであって、
   若返らせて培養することを経て成長した分生胞子と胞子茎とが、上記産地から分離された菌体の分生胞子と胞子茎と同一であること、および子実体を産生することができることを比較し、確認することと、を含み
   上記固形培地は、ｐＨ値が７〜８であって、１０００ｇ中、牛肉スープ（１：２）３００〜５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５〜１０ｇ、酵母粉１ｇ、ブドウ糖２０〜４０ｇ、ミルク１００〜２００ｇ、核酸０．５〜１ｇ、硫酸マグネシウム０．１〜０．４ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６〜１ｇ、ビタミン複合物０．５〜２ｇ、寒天１５〜２０ｇ、水３００〜６００ｇを含む固形培地である、若返らせて培養するステップを行うことと、；
   ４）上記菌類を液体培地に移入することと、
   上記ステップ３由来の同一の分生胞子と胞子茎とを有する菌類を培養温度が１２〜２０℃の液体培地に移入することと、
   上記液体培地を振とう装置に置き、温度１２〜２０℃で６〜１２日培養することとを含む二次培養ステップを行うことと、；
   ５）上記ステップ４で培養された菌類をステップ１の開始容器に移入することと、
   ステップ４の液体培地で、温度１２〜２０℃で、８〜１２日発酵させることと、
   上記液体培地を８〜１２倍に拡大することと、
   徐々に発酵させることと、
   上記容器から発酵した菌類を取り出して、乾燥させることとを含み、
   上記液体培地は、水に重量パーセンテージで、炭源０．５〜５ｗｔ％、窒源０．５〜２ｗｔ％、微量元素０．１〜０．２ｗｔ％、または、ビタミン０．１〜０．２ｗｔ％を少なくとも１種以上含む液体培地である、発酵ステップを行うことと、を含む方法。
2. 上記若返らせて培養するステップは、ｐＨ値が７．２〜７．６であって、１０００ｇ中、牛肉スープ（１：２）３００〜５００ｇ、ラクトアルブミン加水分解産物５〜１０ｇ、酵母粉１ｇ、ブドウ糖２０〜４０ｇ、ミルク１００〜２００ｇ、核酸０．５ｇ、硫酸マグネシウム０．２ｇ、燐酸二水素化カリウム１ｇ、ビタミン複合物１ｇ、寒天１５ｇ、および水４００〜５００ｇを含む固形培地を用いた培養を含む請求項１に記載の中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法。
3. 上記液体培地の中の窒源として、カイコのさなぎ粉、蛋白ペプトン、ミルク粉、酵母粉、およびラクトアルブミン加水分解産物の中から少なくとも１種以上を含み、その含有量は重量パーセンテージで０．５〜２％であって、上記液体培地の中の炭源として、ローヤルゼリー、オート麦粉、ムギかす、蔗糖、トウモロコシ粉、およびブドウ糖の中から少なくとも１種以上含み、その含有量は重量パーセンテージでは０．５〜５％であって、微量元素は硫酸マグネシウム、燐酸二水素化カリウム、および希土類元素の中から少なくとも１種以上含み、その含有量は重量パーセンテージで０．１〜０．２％である請求項１に記載の中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法。
4. 上記液体培地は、ｐＨ値が、７．０〜７．５であり、水１０００ｇ当たり、カイコのさなぎ粉１５ｇ、蛋白ペプトン２ｇ、トウモロコシ粉１０ｇ、ムギかす１５ｇ、ブドウ糖２０ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、および燐酸二水素化カリウム０．６ｇを含む液体培地である請求項１あるいは３に記載の中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法。
5. 上記液体培地はｐＨ値が７．０〜７．５であって、水１０００ｇ当たり、ローヤルゼリー２ｇ、オート麦粉２０ｇ、ミルク粉１５ｇ、蔗糖２０ｇ、硫酸マグネシウム０．３ｇ、燐酸二水素化カリウム０．６ｇ、希土類１ｇ、およびビタミン１ｇである請求項１あるいは３に記載の中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法。
6. 上記ビタミン複合物はビタミンＢ１、ビタミンＢ２、チアミン、およびリボフラビンと水との混合物である請求項１に記載の中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法。
7. 上記ステップ５由来の菌糸を含む液体培地を高位貯蓄缶に入れることと、
   上記菌糸が万遍なく底に吸着されるように、ゆっくりドラム真空乾燥機に導入することと、
   乾燥トンネルの出口に達する頃には７０〜８０％の水分を喪失するように、徐々に１５〜２０ｍの長い乾燥トンネルに上記菌糸を送ることと、
   カッターで０．８〜１．２ｃｍの断片にすることと、
   最終製品を得るために煮沸し乾燥した後に、粉砕してから篩にかけることと、
   をさらに含む請求項１あるいは２に記載の中国冬虫夏草無性型中国被毛胞子の工業発酵生産方法。

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