CN113943761A - 一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种小分子β‑1,3‑葡聚糖的制备方法。本发明方法以根瘤菌GL‑1803发酵所得大分子不溶性β‑1,3‑葡聚糖为底物，通过内切型β‑1,3‑葡聚糖酶进行水解，经过滤浓缩可得纯度≥90%的小分子β‑1,3‑葡聚糖；所述根瘤菌GL‑1803保藏编号为：CGMCC No.23416。所述制备方法简单，生产成本低，对环境友好，所得小分子β‑1,3‑葡聚糖纯度高，为小分子β‑1,3‑葡聚糖大规模生产提供了可能。

Description

一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法。
背景技术
β-1,3-葡聚糖是一类主链由β-1,3-糖苷键连接而成的多聚糖，通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,2-糖苷键、β-1,4-糖苷键、β-1,6-糖苷键连接的支链。β-1,3-葡聚糖具有能增强免疫活力、抗肿瘤、抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇、降血脂等生物活性，是一种良好的生物效应调节剂。同时，还具有保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性等功效，广泛应用在医药、食品、化妆品、动物饲料添加剂等多个领域。
目前，β-1,3-葡聚糖主要来源于酵母、食用真菌和植物（如香菇、燕麦、青稞），受限于技术的复杂和成本的高昂，β-1,3-葡聚糖主要为低纯度的粗产物，生产过程产生的副产物也较多，产量受原材料成本制约。利用微生物发酵生产β-1,3-葡聚糖，具有不受季节限制、原料来源稳定易得、过程无副产物产生、批次间质量稳定的优点。
微生物发酵产生的直链β-1,3-葡聚糖具有成分简单，结构单一的特点，适用于开发β-1,3-葡聚糖衍生物产品。但由于高聚合度直链β-1,3-葡聚糖本身的特殊分子构象，使其不溶于水及大多数常见有机溶剂，限制了β-1,3-葡聚糖的应用范围。高聚合度直链β-1,3-葡聚糖因其凝胶特性，现多用于食品添加剂，市场规模和商业价值有限。
为提高β-1,3-葡聚糖的应用范围，一种方法是制备β-1,3-葡聚糖可溶性衍生物，另一种方法时降解β-1,3-葡聚糖得到可溶性小分子度β-1,3-葡聚糖。衍生物制备方法存在工艺复杂、生产条件苛刻等问题。降解制备方法，根据现有的、专利公开的和文献介绍，主要是通过物理、化学、生物等方法降解高聚合度的β-1,3-葡聚糖，存在生产工艺复杂、降解效率低、降解产物成分复杂等问题，物理、化学等方法还存在三废产出大、污染严重等问题。
发明内容
为解决以上所述问题，本发明提供一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法。本发明所述小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法，以根瘤菌GL-1803发酵所得大分子不溶性β-1,3-葡聚糖为底物，通过内切型β-1,3-葡聚糖酶进行水解，所得的小分子β-1,3-葡聚糖；所述根瘤菌GL-1803保藏编号为：CGMCC No.23416。所得的小分子β-1,3-葡聚糖纯度高达90%（w/w）以上。本发明所述制备方法简单，生产成本低，对环境无污染，为小分子β-1,3-葡聚糖大规模生产提供了可能。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：将根瘤菌GL-1803进行发酵培养；发酵结束后将发酵液进行过滤浓缩，得到含有大分子不溶性β-1,3-葡聚糖的浓缩液；向所得浓缩液中加入酸溶液调节pH至4.5～5.5，加入内切型β-1,3-葡聚糖酶于45～60℃反应1～4小时；反应结束后加入碱溶液调节pH至6.5～7.0，得转化液；将转化液进行陶瓷膜过滤，得小分子β-1,3-葡聚糖混合液；小分子β-1,3-葡聚糖混合液进行超滤膜过滤，得到含盐小分子β-1,3-葡聚糖液；将含盐小分子β-1,3-葡聚糖液纳滤膜过滤浓缩；所述根瘤菌GL-1803保藏编号为：CGMCC No.23416。
进一步地，将根瘤菌GL-1803进行发酵培养包括种子培养和发酵培养；种子培养：将根瘤菌GL-1803接种到种子培养基中，28～32℃、150～240r/min振荡培养16～24小时，得到种子培养液；发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，28～32℃，起始pH7.0，搅拌转速120～200r/min，通风量0.35～0.65vvm，发酵培养66～72小时。
更进一步地，所述种子培养基的组成：以质量百分比计，蔗糖1.0%～2.0%，(NH4)2HPO4 0.5%～1.0%，KH2PO4 0.15%～0.2%，MgSO4•7H2O 0.1%，CaCO3 0.3%，玉米浆粉0.15%～0.5%，pH调节至7.2；所述发酵培养基的组成为：以质量百分比计，蔗糖5.0%，(NH4)2HPO40.1%～1.0%，KH2PO4 0.15%～0.25%，MgSO4•7H2O 0.1%，CaCO3 0.15%～0.3%，玉米浆粉0.1%～0.5%，pH调节至7.0。
进一步地，发酵结束后，将发酵液进行陶瓷膜过滤浓缩，温度控制在30～35℃，浓缩过程中不断向浓缩液中添加水，当加水量达到发酵液初始体积0.5～1.5倍时，停止添加水，并继续浓缩至大分子不溶性β-1,3-葡聚糖固形物含量为40-80g/L，得到含有大分子不溶性β-1,3-葡聚糖的浓缩液。
进一步地，所述内切型β-1,3-葡聚糖酶包括但不仅限于pbBgl64A，所用酶加入量为0.5～2 U/mL。
所述pbBgl64A为专利PCT/CN2016/105187所述蛋白质a)、b）、c)中任意一种。
进一步地，将转化液进行陶瓷膜过滤，过滤过程中不断向转化液中加水，并收集滤出液，当滤出液电导率值达到500～1500μs/cm时，小分子β-1,3-葡聚糖大部分洗脱进入滤出液，停止加水，将滤出液混合，得小分子β-1,3-葡聚糖混合液；
采用超滤膜过滤过程中不断向小分子β-1,3-葡聚糖混合液中加水，并收集滤出液，当滤出液电导率值在500～1500μs/cm时，小分子β-1,3-葡聚糖大部分洗脱进入滤出液，停止加水，将滤除液混合得含盐小分子β-1,3-葡聚糖液。
进一步地，将含盐小分子β-1,3-葡聚糖液进行纳滤膜过滤浓缩时，不断向含盐小分子β-1,3-葡聚糖液中加水，滤出液外排，当排出的滤出液电导率值在500～1000μs/cm时，停止加水；并继续浓缩至小分子β-1,3-葡聚糖最终质量比≥20%。
进一步地，所用陶瓷膜的膜孔径为50～200nm；所用超滤膜的截留分子量为5000～10000Da；所用纳滤膜的截留分子量为100～200Da。
所述根瘤菌GL-1803的保藏信息：
所述根瘤菌(Rhizobium sp.)GL-1803已于2021年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23416，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明采用根瘤菌GL-1803进行发酵培养生产大分子不溶性β-1,3-葡聚糖，产量高；将所得发酵液进行浓缩后可直接做底物，与内切型β-1,3-葡聚糖酶进行水解反应；经过滤浓缩，可得纯度≥90%的小分子β-1,3-葡聚糖，提取总收率≥80%。
本发明所述方法步骤简单，生产成本低，对环境友好，所得小分子β-1,3-葡聚糖纯度高，为小分子β-1,3-葡聚糖大规模生产提供了可能。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”、“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作以及它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
S1、将产β-1,3-葡聚糖菌株进行活化，接入500mL种子培养基培养，制备种子培养液；
所述产β-1,3-葡聚糖菌株为根瘤菌GL-1803（CGMCC No. 23416）。
所述种子培养基的组成：以质量百分比计，蔗糖2.0%，(NH4)2HPO4 0.5%，KH2PO40.15%，MgSO4•7H2O 0.1%，CaCO3 0.3%，玉米浆粉0.15%，pH调节至7.2。
所述种子培养温度30℃、220r/min振荡培养24小时，得到种子培养液。
S2、将种子培养液接入6L发酵培养基中，进行发酵培养。
所述发酵培养基的组成为：以质量百分比计，蔗糖5.0%，(NH4)2HPO4 0.2%，KH2PO40.2%，MgSO4•7H2O 0.1%，CaCO3 0.2%，玉米浆粉0.2%，pH调节至7.0。
所述发酵培养温度为30℃，起始pH7.0，搅拌转速200r/min，通风量0.5vvm，发酵培养72小时，得到发酵液，发酵液中大分子不溶性β-1,3-葡聚糖含量为35g/L。
S3、发酵结束后，将发酵液进行陶瓷膜过滤浓缩，控制操作温度在30℃，滤出液外排，浓缩过程中不断向浓缩液中添加纯净水，当纯净水加量达到发酵液初始体积1倍时，停止添加纯净水，并继续浓缩至大分子不溶性β-1,3-葡聚糖固形物含量为80g/L，得到含有大分子不溶性β-1,3-葡聚糖的浓缩液。
所述陶瓷膜的膜孔径为200nm。
S4、将含有大分子不溶性β-1,3-葡聚糖的浓缩液转入转化罐，向上述浓缩液中加入盐酸溶液，调节pH至5.0；
所述盐酸溶液的浓度为2mol/L。
S5、加入酶制剂，将转化罐内转化液升温至55℃，搅拌反应2.5小时。
所述酶制剂的酶为pbBgl64A。所述pbBgl64A为专利PCT/CN2016/105187所述蛋白质a)。
所述酶制剂的加量为1U/mL。
S6、转化结束，向转化液中加入氢氧化钠溶液，中和至pH6.8，得转化液。
所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L。
S7、将转化液进行陶瓷膜过滤，过滤过程中向转化液中添加纯净水，收集滤出液，当滤出液电导率降为1000μs/cm时，停止添加纯净水，将滤出液混合，得到小分子β-1,3-葡聚糖混合液。
所述陶瓷膜的膜孔径为50nm。
S8、将小分子β-1,3-葡聚糖混合液利用超滤膜过滤，过滤过程中向小分子β-1,3-葡聚糖混合液中添加纯净水，收集滤出液，当滤出液电导率降为1000μs/cm时，停止添加纯净水，将滤除液混合，得到含盐小分子β-1,3-葡聚糖液。
所述超滤膜的截留分子量为10000Da。
S9、将上述含盐小分子β-1,3-葡聚糖液利用纳滤膜过滤浓缩，滤出液外排，浓缩过程中不断向浓缩液中添加纯净水，当排出的滤出液电导率降为600μs/cm时，停止添加纯净水，并继续浓缩至小分子β-1,3-葡聚糖最终质量比为20%，得到小分子β-1,3-葡聚糖浓缩液。
所述纳滤膜的截留分子量为200Da。
S10、将上述小分子β-1,3-葡聚糖浓缩液利用喷雾干燥塔烘干，雾干燥塔的进风温度为130℃，出风温度为80℃；得到小分子β-1,3-葡聚糖粉末，包装成为小分子β-1,3-葡聚糖产品。
所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为90.45%，提取总收率81.45%。
实施例2
与实施例1相比，区别在于，步骤S3中发酵结束后对发酵液进行陶瓷膜过滤浓缩，浓缩至大分子不溶性β-1,3-葡聚糖固形物含量为40g/L，其它步骤均与实施例1相同。所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为91.05%，提取总收率83.65%。
实施例3
与实施例1相比，区别在于，步骤S3中发酵结束后对发酵液进行陶瓷膜过滤浓缩，浓缩至大分子不溶性β-1,3-葡聚糖固形物含量为60g/L，其它步骤均与实施例1相同。所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为91.21%，提取总收率82.34%。
实施例4
与实施例1相比，区别在于，步骤S5中加入酶制剂后将转化罐内转化液升温至60℃，搅拌反应1小时，其它步骤均与实施例1相同。所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为90.41%，提取总收率80.02%。
实施例5
与实施例1相比，区别在于，步骤S5中加入酶制剂后将转化罐内转化液升温至45℃，搅拌反应4小时，其它步骤均与实施例1相同。所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为90.37%，提取总收率80.72%。
实施例6
与实施例1相比，区别在于，步骤S7中，滤出液电导率降为1400μs/cm时，停止添加纯净水，其它步骤均与实施例1相同。所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为90.32%，提取总收率80.84%。
实施例7
与实施例1相比，区别在于，步骤S7中，滤出液电导率降为600μs/cm时，停止添加纯净水，其它步骤均与实施例1相同。所得小分子β-1,3-葡聚糖产品纯度为90.57%，提取总收率81.82%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种小分子β-1,3-葡聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将根瘤菌GL-1803进行发酵培养；发酵结束后将发酵液进行过滤浓缩，得到含有大分子不溶性β-1,3-葡聚糖的浓缩液；向所得浓缩液中加入酸溶液调节pH至4.5～5.5，加入内切型β-1,3-葡聚糖酶于45～60℃反应1～4小时；反应结束后加入碱溶液调节pH至6.5～7.0，得转化液；将转化液进行陶瓷膜过滤，得小分子β-1,3-葡聚糖混合液；小分子β-1,3-葡聚糖混合液进行超滤膜过滤，得到含盐小分子β-1,3-葡聚糖液；将含盐小分子β-1,3-葡聚糖液纳滤膜过滤浓缩；
所述根瘤菌GL-1803保藏编号为：CGMCC No.23416。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将根瘤菌GL-1803进行发酵培养包括种子培养和发酵培养；
种子培养：将根瘤菌GL-1803接种到种子培养基中，28～32℃、150～240r/min振荡培养16～24小时，得到种子培养液；
发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，28～32℃，起始pH7.0，搅拌转速120～200r/min，通风量0.35～0.65vvm，发酵培养66～72小时。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的组成：以质量百分比计，蔗糖1.0%～2.0%，(NH4)2HPO4 0.5%～1.0%，KH2PO4 0.15%～0.2%，MgSO4•7H2O 0.1%，CaCO3 0.3%，玉米浆粉0.15%～0.5%，pH调节至7.2；所述发酵培养基的组成为：以质量百分比计，蔗糖5.0%，(NH4)2HPO4 0.1%～1.0%，KH2PO4 0.15%～0.25%，MgSO4•7H2O 0.1%，CaCO30.15%～0.3%，玉米浆粉0.1%～0.5%，pH调节至7.0。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵结束后，将发酵液进行陶瓷膜过滤浓缩，温度控制在30～35℃，浓缩过程中不断向浓缩液中添加水，当加水量达到发酵液初始体积0.5～1.5倍时，停止添加水，并继续浓缩至大分子不溶性β-1,3-葡聚糖固形物含量为40-80g/L，得到含有大分子不溶性β-1,3-葡聚糖的浓缩液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述内切型β-1,3-葡聚糖酶为pbBgl64A，所用酶加入量为0.5～2 U/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将转化液进行陶瓷膜过滤，过滤过程中不断向转化液中加水，并收集滤出液，当滤出液电导率值达到500～1500μs/cm时，小分子β-1,3-葡聚糖大部分洗脱进入滤出液，停止加水，将滤出液混合，得小分子β-1,3-葡聚糖混合液；
采用超滤膜过滤过程中不断向小分子β-1,3-葡聚糖混合液中加水，并收集滤出液，当滤出液电导率值在500～1500μs/cm时，小分子β-1,3-葡聚糖大部分洗脱进入滤出液，停止加水，将滤除液混合得含盐小分子β-1,3-葡聚糖液。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将含盐小分子β-1,3-葡聚糖液进行纳滤膜过滤浓缩时，不断向含盐小分子β-1,3-葡聚糖液中加水，滤出液外排，当排出的滤出液电导率值在500～1000μs/cm时，停止加水；并继续浓缩至小分子β-1,3-葡聚糖最终质量比≥20%。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所用超滤膜的截留分子量为5000～10000Da；所用纳滤膜的截留分子量为100～200Da。
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