CN108459101A - 一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，采用超声辅助、分散液液微萃取对养殖水样品进行前处理，配制邻苯二甲酸酯类标准品、分散染料和荧光增白剂50种标准品溶液绘制标准曲线，用超高效液相色谱‑高分辨质谱仪分析,对养殖水中邻苯二甲酸酯类、荧光增白剂和分散染料进行高通量测定。本发明可以同时测定食品接触塑料制品中50种添加物残留，灵敏度高，检测限为0.1～1.0μg/kg。本发明方法灵敏、快速、简单、准确、省时、稳定，实用性强，能满足目前市场的检测需求。

Description

一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法

【技术领域】

本发明涉及一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，特别是一种利用超声辅助分散液液微萃取-超高效液相色谱-高分辨质谱测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，属于食品化学分析技术领域。

【背景技术】

近年来，我国的经济发展速度十分迅猛，随着而来的我国城市化进程也在不断加快，我国的工业化水平也取得了突飞猛进的发展，但由于我国的发展经济的过程中没有充分考虑到经济发展对环境的影响，导致了水体被严重污染，这种现状非常不利于水产养殖的健康发展。水产养殖非常依赖于干净、清洁的水环境，只有水体干净了，水产养殖物的生产和产量及品质才会提高，水产养殖的发展也才会有良好的发展前景。邻苯二甲酸酯类(PAEs)是应用最为广泛的一类塑化剂，荧光增白剂(fluorescent whitening agents，FWAs)和分散染料常作为有色染料广泛的用于纺织、塑料等制品中，这三类物质容易从环境中向养殖水中迁移，会在养殖水产品中富集，对食用者的健康造成潜在危害。

目前未见有关于检测养殖水中邻苯二甲酸酯类、荧光增白剂和分散染料检测方法的相关报道。

四极杆/静电场轨道阱高分辨(Q-Exactive)质谱仪具有分辨率高及定量能力好的优点，不同于三重四极杆低分辨质谱使用多反应监测(MRM)模式对目标物的离子对进行定量分析，Q-Exactive质谱可以利用目标物母离子精确的相对分子质量直接定量，无需对目标物逐个优化子离子及相关参数，对于多目标物的分析，可以极大地降低检测的时间，同时又能很好地避免低分辨质谱易受基质干扰而产生假阳性的现象。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种使用UA-DLLEM-UPLC-Q Exactive Orbitrap MS高通量检测养殖水中31种邻苯二甲酸酯类、7种荧光增白剂和12种分散染料的检测方法，填补现有检测技术的空白。

本发明为了实现上述目的，采用以下技术方案：

一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)配制标准溶液

将选定的邻苯二甲酸酯类标准品、荧光增白剂标准品和分散染料标准品配制成1mg/mL的标准储备液；

(2)超声辅助提取

称取50mL养殖水样品，在5℃条件下14000r/min离心10min，取上清液5.0ml，50℃超声提取10min，上清液移入10ml锥形离心管中并加入0.03gNaCl，涡旋溶解2min，用乙酸溶液调pH至6.0；

(3)分散液液微萃取

将250μL分散剂和50μL萃取剂混合，用1mL的玻璃注射器迅速注入步骤(2)提取的溶液中，轻晃离心管，混合形成水、乙腈、三氯甲烷的乳浊液，以4500r/min离心5min，离心后的下层溶液用微型注射器取20μL，进行超高效液相色谱—高分辨质谱检测；

(4)超高效液相色谱-高分辨质谱仪分析。

本发明中，邻苯二甲酸酯类标准品分别为：邻苯二甲酸单甲酯(MHP)、邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二异丙酯(DIPrP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二苄酯(DBzP)、邻苯二甲酸单-2-乙基己基酯(MEHP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸正戊异戊酯(IPP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异戊酯(DIPP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(HEHP)、邻苯二甲酸双庚酯(DHP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DIOP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二月桂酯(DLP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)。

其中邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸单-2-乙基己基酯(MEHP)标准品，称取定量标准品，用体积比为1：1：1的甲醇-丙酮-正己烷混合溶剂溶解后再用正己烷定容，用甲醇稀释，制成1mg/mL的标准储备液，其余邻苯二甲酸酯类标准品，称取定量，用正己烷配制成1mg/mL的单一标准储备液。

本发明中分散染料标准品和荧光增白剂标准品分别为：纯度≥99.0％的分散黄23、纯度≥97.0％的分散红11、分散红1纯度≥97.5％、分散黄39纯度≥99.0％、分散黄3纯度≥99.0％、分散橙37纯度≥96.0％、分散橙3纯度≥95.0％、分散橙11纯度≥91.5％、分散蓝106纯度≥99.0％、分散蓝102纯度≥98.0％、分散红17纯度≥92.0％、分散蓝124纯度≥99.0％，C.I.184纯度≥98.0％、C.I.140纯度≥94.0％、C.I.135纯度≥95.0％、C.I.185纯度≥98.0％、C.I.367纯度≥98.0％、C.I.162纯度≥94.0％、C.I.368纯度≥98.0％，配制标准储备液时称取适量标准品用甲醇溶解定容，制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液。

本发明超声辅助提取时用的微型射器为50μL微型注射器。

本发明中，分散液液微萃取中，所述的分散剂为乙腈，所述的萃取剂为CHCl₃。

本发明中，超高效液相色谱-高分辨质谱仪的参数为：

色谱：CAPCELL PAK MGⅡC18柱，150mm×2.0mm，5μm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A为甲醇，含0.04％甲酸，B为20mmoL/L乙酸铵水溶液，含0.04％甲酸；梯度洗脱程序0～40.0min，流动相A的比例由35％线性变化至80％；40.0～45.0min，流动相A的比例由80％线性变化至95％；45.0～55.0min，保持A相为95％；55.0～60.0min，保持35％A；

质谱：加热电喷雾离子源温度为350℃，离子传输温度为325℃，鞘气为40bar，辅助气为10bar，毛细管电压为3.2KV；

FuLL scan/ddms2扫描模式：采集范围为100～1500Da，正离子模式采集；一级质谱分辨率为70000FWHM，二级质谱分辨率为17500FWHM；碰撞池能量NCE为20，40，60eV。

各目标化合物的质量分析参数见表1。

表1：

本发明与现有技术相比，有以下优点：

1、采用本方法测定养殖水中50种污染物残留，灵敏度高，检测限为0.1μg/kg～1.0μg/kg。

2、本方法只需少量分散剂、萃取剂(乙腈250μL，三氯甲烷50μL)，能够减少对检测人员的毒害作用，保护环境。

3、本方法的样品前处理时间短(<25min)，节省了分析时间，因此适用于大批量检测养殖水样品。

本发明将分散液液微萃取技术运用于养殖水中邻苯二甲酸酯类、荧光增白剂和分散染料检测，结合四极杆/静电场轨道阱高分辨(Q-Exactive)质谱分辨率高及定量能力好的优势，建立了快速、准确省时的高通量检测养殖水中邻苯二甲酸酯类、荧光增白剂和分散染料的检测方法。

【附图说明】

图1为浓度为10.0μg/L的50种污染物标准混合溶液的色谱图。

【具体实施方式】

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明首先确定最优条件的控制参数。影响超声辅助萃取(UAE)和分散液液微萃取(DLLME)效率的主要因素包括：萃取剂的类型和用量、超声时间、分散剂的用量、pH值和盐浓度的影响。

超声辅助萃取(UAE)考察了不同萃取剂(三氯甲烷、二氯甲烷和环已烷)对回收率的影响，每组实验平行测定三次。结果表明，三氯甲烷作为萃取剂对目标物的回收率达到最大。二氯甲烷与分散剂无法形成稳定的两相体系；相同体积下不同的萃取剂所形成的沉积相的体积液不同，沉积相体积四氯化碳为25μL，氯苯为50μL，三氯甲烷为50μL，实验表明，三氯甲烷有较高的回收率，萃取效果最好，因此选用三氯甲烷作为萃取剂。

超声时间的确定：充足的超声时间能够保证足够的萃取效率，但是过长的时间存在导致分析物被破坏的可能，另外超声的热效应使得水温上升，这些都会对萃取效果产生影响。对萃取时间分别是4、6、8、10、12min的萃取效率进行考察，结果表明，随着萃取时间增加，萃取效率不断提高，10min时50种目标物萃取效率达到最高，进一步延长超声时间，部分目标化合物萃取效率降低，因此，本发明选择10min作为最优超声时间。

分散剂的用量：考察了乙腈体积100μL～600μL对回收率的影响。分散剂体积为250μL时50种目标化合物回收率最高。这是因为分散剂体积较小时，萃取剂不能均匀分散在水相中，回收率低；分散剂体积较大时，分析物在水中的溶解度增大不易被萃取。因此实验选用乙腈的最佳体积为250μL。

pH值和盐浓度的影响：pH值影响50种目标化合物分子在水溶液中的存在方式，进而影响到萃取效率，因此，以乙酸和NaOH溶液调节水样的酸度，考察酸性pH＝4.5、pH＝6.0、中性pH＝7.0和碱性pH＝8.5、pH＝10.0条件对萃取效率的影响，发现pH＝6.0时萃取效果最好。向超纯水溶液中加入NaCl(0.00～0.045g)，考察了盐效应对回收率的影响。实验表明，在加入0.00～0.030g的NaCl时，回收率随着盐浓度的增加而增加，并且在加入0.030g NaCl时回收率最大；加入0.03～0.045g的NaCl，回收率降低。这可能是因为增加离子强度，会降低目标化合物在水相的溶解度，提高其在有机相的分配系数；但当盐浓度过大时，样品溶液的粘度变大，目标物与盐离子之间的静电作用力增强，导致其传质能力降低，从而降低了回收率。因此，本实验选择加入0.030g的NaCl。

实施例：

(1)标准溶液配制

分别称取适量邻苯二甲酸单甲酯(MHP)、邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸二(2－甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二(2－乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、邻苯二甲酸二异丙酯(DIPrP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二苄酯(DBzP)、邻苯二甲酸单－2－乙基己基酯(MEHP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2－丁氧基)乙酯(DBEP)、邻苯二甲酸正戊异戊酯(IPP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二异戊酯(DIPP)、邻苯二甲酸二戊酯(DPP)、邻苯二甲酸二(4－甲基－2－戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸二(2－乙基己)酯(HEHP)、邻苯二甲酸双庚酯(DHP)、邻苯二甲酸二(2－乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DIOP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)、邻苯二甲酸二壬酯(DNP)、邻苯二甲酸二异癸酯(DIDP)、邻苯二甲酸二月桂酯(DLP)、邻苯二甲酸二甲酯(DMP)等31种邻苯二甲酸酯类标准品，用正己烷配制成1mg/mL的单一标准储备液，其中MBP、MEHP用体积比为1：1：1的甲醇－丙酮－正己烷混合溶剂溶解后再用正己烷定容，用甲醇稀释，制成1mg/mL的标准储备液；

分别称取适量分散黄23(纯度≥99.0％)、分散红11(纯度≥97.0％)、分散红1(纯度≥97.5％)、分散黄39(纯度≥99.0％)、分散黄3(纯度≥99.0％)、分散橙37(纯度≥96.0％)、分散橙3(纯度≥95.0％)、分散橙11(纯度≥91.5％)、分散蓝106(纯度≥99.0％)、分散蓝102(纯度≥98.0％)、分散红17(纯度≥92.0％)、分散蓝124(纯度≥99.0％)，以上标准品购于德国Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；C.I.184(纯度≥98.0％)、C.I.140(纯度≥94.0％)、C.I.135(纯度≥95.0％)、C.I.185(纯度≥98.0％)、C.I.367(纯度≥98.0％)、C.I.162(纯度≥94.0％)、C.I.368(纯度≥98.0％)用甲醇溶解定容，制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液；

(2)超声辅助提取

称取50mL养殖水样品，在5℃条件下14000r/min离心10min，取上清液5.0ml，50℃超声提取10min，，上清液移入10ml锥形离心管中并加入0.03gNaCl，涡旋溶解2min，用乙酸溶液调pH至6.0；

(3)分散液液微萃取

将250μL乙腈(分散剂)和50μLCHCl₃(萃取剂)混合，用1mL的玻璃注射器迅速注入(2)溶液中，轻晃离心管，混合形成水、乙腈、三氯甲烷的乳浊液，以4500r/min离心5min，离心后的下层溶液用50μL微型注射器取20μL，进行超高效液相色谱—高分辨质谱检测；

(4)超高效液相色谱-高分辨质谱仪分析：

色谱：CAPCELL PAK MGⅡC18柱(150mm×2.0mm，5μm)；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A为甲醇(含0.04％甲酸)，B为20mmol/L乙酸铵水溶液(含0.04％甲酸)；梯度洗脱程序0～40.0min，流动相A的比例由35％线性变化至80％；40.0～45.0min，流动相A的比例由80％线性变化至95％；45.0～55.0min，保持A相为95％；55.0～60.0min，保持35％A；

质谱：加热电喷雾离子源温度为350℃，离子传输温度为325℃，鞘气为40bar，辅助气为10bar，毛细管电压为3.2KV；Full scan/ddms2扫描模式：采集范围为100～1500Da，正离子模式采集；一级质谱分辨率为70000FWHM，二级质谱分辨率为17500FWHM；碰撞池能量NCE为20，40，60eV。

实施例的方法线性范围、相关系数和精密度试验

准确量取(1)的44种标准品储备液适量，用甲醇-水(65:35，v/v)溶液稀释成系列梯度的标准工作液，按照实验方法用UPLC-Q Exactive Orbitrap进行测定，并绘制标准工作曲线，50种目标化合物组分的线性范围、线性方程及相关系数r见表2。

通过在阴性养殖水样品中进行加标回收试验。分别对上述样品进行3个水平的加标回收率测定，每个水平进行6次平行试验，结果表明，50种添加物的平均加标回收率为73.9％～108.7％，相对标准偏差为2.3～12.7％(见表3)。

表2：50种目标化合物的、线性方程、相关系数

表3：阴性样品加标回收率和相对标准偏差

验证例：

利用本发明方法检测15批养殖水样品，其中在1批养殖水样品中同时检出邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(HEHP)和分散红17，检出含量分别为54μg/kg和69μg/kg。

本发明采用将分散液液微萃取技术运用于养殖水中50种污染物残留的检测对养殖水样品进行前处理，为了提高萃取效率，同时加入了超声萃取作为辅助，同时利用Q-Exactive高分辨的分析能力，能够准确的对目标化合物进行定量、定性分析，避免了假阳性的现象出现。

本发明利用超声辅助分散液液微萃取技术结合超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱法(UA-DLLME-UPLC-Q Exactive Orbitrap HRMS)建立了养殖水中31种邻苯二甲酸酯类、7种荧光增白剂和12种分散染料进行高通量测定方法，该法灵敏、准确、省时、稳定、精密度高、重现性好等优点，适合实验室大批量养殖水样品的检测。

Claims (6)

1.一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)配制标准溶液

将选定的邻苯二甲酸酯类标准品、荧光增白剂标准品和分散染料标准品配制成1mg/mL的标准储备液；

(2)超声辅助提取

称取50mL养殖水样品，在5℃条件下14000r/min离心10min，取上清液5.0ml，50℃超声提取8～12min，上清液移入10ml锥形离心管中并加入0.02～0.045gNaCl，涡旋溶解2min，用乙酸溶液调pH至4.5～8.5；

(3)分散液液微萃取

将200～300μL分散剂和50μL萃取剂混合，用1mL的玻璃注射器迅速注入步骤(2)提取的溶液中，轻晃离心管，混合形成水、乙腈、三氯甲烷的乳浊液，以4500r/min离心5min，离心后的下层溶液用微型注射器取20μL，进行超高效液相色谱—高分辨质谱检测；

(4)超高效液相色谱-高分辨质谱仪分析。

2.根据权利要求1所述的一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于所述的邻苯二甲酸酯类标准品分别为：邻苯二甲酸单甲酯、邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯、邻苯二甲酸二烯丙酯、邻苯二甲酸二异丙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二苯酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二苄酯、邻苯二甲酸单-2-乙基己基酯、邻苯二甲酸丁苄酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯、邻苯二甲酸正戊异戊酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二异戊酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯、邻苯二甲酸二己酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸双庚酯、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯、邻苯二甲酸二异辛酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸二异壬酯、邻苯二甲酸二壬酯、邻苯二甲酸二异癸酯、邻苯二甲酸二月桂酯、邻苯二甲酸二甲酯。

3.根据权利要求2所述的一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于所述的邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸单-2-乙基己基酯标准品，称取定量标准品，用体积比为1：1：1的甲醇-丙酮-正己烷混合溶剂溶解后再用正己烷定容，用甲醇稀释，制成1mg/mL的标准储备液，其余邻苯二甲酸酯类标准品，称取定量，用正己烷配制成1mg/mL的单一标准储备液。

4.根据权利要求1所述的一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于所述的分散染料标准品和荧光增白剂标准品分别为：纯度≥99.0％的分散黄23、纯度≥97.0％的分散红11、分散红1纯度≥97.5％、分散黄39纯度≥99.0％、分散黄3纯度≥99.0％、分散橙37纯度≥96.0％、分散橙3纯度≥95.0％、分散橙11纯度≥91.5％、分散蓝106纯度≥99.0％、分散蓝102纯度≥98.0％、分散红17纯度≥92.0％、分散蓝124纯度≥99.0％，C.I.184纯度≥98.0％、C.I.140纯度≥94.0％、C.I.135纯度≥95.0％、C.I.185纯度≥98.0％、C.I.367纯度≥98.0％、C.I.162纯度≥94.0％、C.I.368纯度≥98.0％，配制标准储备液时称取适量标准品用甲醇溶解定容，制成质量浓度为1mg/mL的标准储备液。

5.根据权利要求1所述的一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于所述的分散液液微萃取中，所述的分散剂为乙腈，所述的萃取剂为CHCl₃。

6.根据权利要求1所述的一种测定养殖水中多种污染物残留的分析方法，其特征在于所述超高效液相色谱-高分辨质谱仪的参数为：

色谱：CAPCELL PAK MGⅡC18柱，150mm×2.0mm，5μm；柱温：40℃；进样量：10μL；流动相：A为甲醇，含0.04％甲酸，B为20mmoL/L乙酸铵水溶液，含0.04％甲酸；梯度洗脱程序0～40.0min，流动相A的比例由35％线性变化至80％；40.0～45.0min，流动相A的比例由80％线性变化至95％；45.0～55.0min，保持A相为95％；55.0～60.0min，保持35％A；

质谱：加热电喷雾离子源温度为350℃，离子传输温度为325℃，鞘气为40bar，辅助气为10bar，毛细管电压为3.2KV；FuLL scan/ddms2扫描模式：采集范围为100～1500Da，正离子模式采集；一级质谱分辨率为70000FWHM，二级质谱分辨率为17500FWHM；碰撞池能量NCE为20，40，60eV。