CN108441514A - 一种表达非洲猪瘟病毒cp204l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法 - Google Patents

一种表达非洲猪瘟病毒cp204l基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，属于基因工程技术领域。该方法利用腺病毒穿梭载体pKO‑FH、pAD‑EF1a‑GFP，经一系列中间过程，得到重组腺病毒表达质粒pAD‑CP204L。将最后得到的线性化重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞；根据腺病毒感染形成的细胞病变筛选重组病毒，最终实现腺病毒包装过程，并通过扩增、浓缩和鉴定得到能够直接感染真核细胞的重组腺病毒，从而实现了CP204L基因在真核细胞中正常表达的目的，为研究基于表达CP204L的腺病毒载体疫苗奠定基础。

Description

一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体、构建方 法及重组腺病毒制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CP204L基因过表达腺病毒载体及其构建方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性出血热、高度接触传染性疾病，其临床症状和病理变化表现为高热、皮肤充血、水肿及脏器广泛性出血以及呼吸***和神经***功能的改变，致死率高达100％。2007年6月，ASF在格鲁吉亚高加索地区得到确认，并已蔓延至邻国。自2009年以来，本病经格鲁吉亚等国传播到与我国接壤的俄罗斯部分地区并多次爆发，目前已对我国养猪业的持续发展构成巨大威胁。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报类动物疫病，该病已受到世界各国的高度重视，我国已将此病规定为一类动物疾病。
ASFV为非洲猪瘟病毒科唯一已知的代表种，是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒；其基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，大小为170-190kb，整个基因组含有150个开放阅读框，可以编码150-200种蛋白，已从ASFV感染细胞中分离鉴定出86种病毒蛋白多肽。
ASFV的P30蛋白是一种很重要的结构蛋白，由CP204L基因编码。研究发现P30能够诱导宿主细胞产生抑制细胞内化的中和抗体，从而使得疾病发作延迟甚至保护细胞抵抗病毒感染，因此P30在阻断病毒与细胞相互作用中有着重要的作用。P30作为病毒的早期蛋白，感染细胞后主要分布于细胞质中，在感染后4小时即可在胞浆内检测到；P30也是最具有抗原性的ASFV蛋白之一，有很强的免疫原性，在感染动物体内能诱导机体产生病毒中和抗体，因此通常被用做诊断抗原。此外，P30蛋白和P54蛋白与易感细胞上的两个不同的受体或结合位点相互作用，能缓和病程。因此，开发基于P30的抗ASFV的候选疫苗，对于防止ASF具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法，以制备过表达CP204L基因的重组腺病毒，用于研究ASFV候选疫苗。
腺病毒是目前最高效可靠的重组病毒表达***之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。并且具有病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。因此，利用腺病毒进行表达CP204L基因重组腺病毒载体的构建及重组腺病毒的包装，对研究基于表达非洲猪瘟p72蛋白的候选疫苗具有重要意义。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、***pAD-EF1α-GFP腺病毒载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒CP204L基因。CP204L基因的序列如SEQ No.1所示。所述多克隆位点为AsisI和MluI的酶切位点。
一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：
1)将CP204L序列在基因合成公司合成，该序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ；
2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列CP204L和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到CP204L基因片段和pKO线性化载体片段；将得到的CP204L基因片段和pKO载体片段进行连接，得到pKO-CP204L；
3)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤2)得到的pKO-CP204L和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化CP204L基因片段和腺病毒pAD载体片段；
4)将所述步骤3)得到的线性化CP204L基因片段和腺病毒pAD载体片段进行连接，得到pAD-CP204L，使用CMV-F与FH-R进行测序；
5)将所述步骤4)得到的质粒pAD-CP204L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒进行后续实验。
优选的，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下表1：
表1双酶切体系
CP204L基因片段或pKO-FH载体 20uL
10×Buffer 3μL
AsisⅠ 1μL
MLuⅠ 1μL
ddH2O 5μL
总计 30μL
所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。
优选的，所述步骤2)中连接体系如下表2：
表2连接体系
目的基因CP204L片段 2～6μL
pKO载体片段 2～4μL
10×T4Buffer 1μL
T4DNA连接酶(10U/μL) 1μL
总计 10μL
所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。
优选的，所述步骤2)中连接后还包括：对所述连接得到重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。
优选的，所述步骤3)中双酶切的反应体系如下表3：
表3双酶切反应体系
所述双酶切的酶切程序如下表4：
表4双酶切反应程序
体积 50ul
37℃ 2.5h
65℃ 20min
4℃ 保持
优选的，所述步骤4)中连接体系如下表5：
表5连接体系
目的基因CP204L片段 2～6μL
腺病毒pAD载体片段 2～4μL
10×T4Buffer 1μL
T4DNA连接酶(10U/μL) 1μL
总计 10μL
所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。
优选的，所述步骤5)中单酶切的酶切反应体系如下表6：
表6单酶切反应体系
所述单酶切程序为37℃，3hr；95℃，5min。
表达CP204L基因的重组腺病毒的方法由以下步骤制备得到：
Ⅰ.将pAD-CP204L重组质粒使用PEI转染试剂转染HEK293细胞。
Ⅱ.将出现CPE的细胞连同培养基吹下，扩大培养，培养3天后收毒。
本发明提供了表达非洲猪瘟病毒CP204L基因的重组腺病毒的制备方法，具体由以下步骤制备得到：
a)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μL DMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上。将前述步骤5)中得到的重组阳性质粒与250μL DMEM培养基制成混合液Mix2。将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟。
b)在细胞板上铺满细胞数0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞。
c)将步骤a)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于CO2培养箱培养2-3天。
d)收集具有CPE效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中，离心后收集上清和细胞沉淀，上清过滤得到含CP204L基因表达的重组腺病毒。
本发明提供了含有CP204L基因的腺病毒扩增与收毒、纯化与浓缩以及滴度检测、特异性检测。
步骤4)具体为：
收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用A195回溶得到回溶液；EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存或-80℃保存；
病毒的预处理：
A)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用A195将病毒沉淀重悬，收集到管中；
B)细胞沉淀处理：细胞沉淀用A195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和细胞沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用A195重悬后加入5mol/L NaCl至终浓度为1moL/L；
C)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s，至液体不粘稠；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min；离心后，与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合；
用电动移液器在离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇；先加入60％碘克沙醇溶液4.2mL形成第一层，再加入40％碘克沙醇溶液5mL形成第二层，其次加入25％碘克沙醇溶液6mL形成第三层，最后加入15％碘克沙醇溶液9mL形成第四层；
将经过病毒的预处理步骤的病毒液加入到离心管最上层，48000rpm离心2小时30分钟；离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内；
离心完毕，弃前5mL，收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS、PF68的混合液稀释至体积15mL，然后用0.20μm的滤膜过滤，将过滤后的液体置于超滤管中，3500g离心50min。
将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×；
所述的5×A195为含30％胎牛血清的DMEM培养基，PF68为含10％甘油、10％DMSO的DMEM，百分比为质量分数；PBS、PF68的混合液中，PBS、PF68体积比为1：1，其中PBS溶液：NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。
相对于现有技术，本发明提供了一种表达CP204L基因的重组腺病毒载体pAD-CP204L，以pAD-EF1a-GFP腺病毒表达载体为基础，在多克隆位点处引入CP204L基因。本发明通过将外源基因CP204L替换多克隆位点中非必要的序列，来构建表达CP204L基因的重组腺病毒载体，所述该载体携带CMV强启动子，能在真核细胞中过表达其携带的基因，同时该载体在多克隆载体后带有绿色荧光序列用于筛选阳性细胞，使P30蛋白直接在真核细胞中表达。本发明还提供了表达CP204L基因的重组腺病毒，实现重组腺病毒包装过程，得到能够直接感染真核细胞的腺病毒，从而实现了CP204L基因在真核细胞中正常表达，为进一步研究表达CP204L基因重组腺病毒候选疫苗提供了工具。
附图
图1为实施例5中重组腺病毒载体pAD-CP204L的PacI酶切线性化图，1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳显示两条带，一条为3kb或5kb左右，一条30kb左右，根据重组机制的不同，酶切后条带大小不同；
图2是本发明实施例5中质粒转染一周后细胞CPE图；
图3是本发明实施例5中质粒转染一周后细胞的荧光表达图；
图4为本发明的pKO-FH载体结构图；
图5为本发明的pAD-EF1α-GFP载体结构图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
本发明对所述混合的方法没有特殊限制，采用的培养方案没有特殊限制。
本发明中，所述过滤的方法优选采用微滤。所述微滤的孔径优选为0.2μm。
本发明中，所述离心的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞离心方案即可。
本发明中，所述细胞系的种类优选为HEK293细胞。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒及其构建方法，以pAD-EF1a-GFP腺病毒表达载体为基础，引入CP204L基因；所述CP204L基因具有如序列表中SeqID No.1所示的核苷酸序列。
实施例1
非洲猪瘟CP204L基因序列来源于GenBank：KJ195684.1。直接合成目的基因片段，并加酶切位点AsisⅠ/MLuⅠ。非洲猪瘟病毒CP204L基因，由上海生工有限公司合成并加入酶切位点XhoI、AsisI。
实施例2
用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因合成序列CP204L和腺病毒穿梭质粒载体pKO-FH(图4)进行双酶切，分别得到线性化CP204L基因片段和pKO载体片段。双酶切反应的酶切反应体系如下表1：
表1双酶切体系
CP204L基因片段或pKO-FH载体 20uL
10×Buffer 3μL
AsisⅠ 1μL
MLuⅠ 1μL
ddH2O 5μL
总计 30μL
其中CP204L基因片段优选为100ng/ul，所述双酶切的温度为37℃，所述双酶切的时间为1小时。
反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段。载体pKO-FH做同样的酶切，胶回收载体序列。
实施例3
用T4连接酶将线性化CP204L基因片段和pKO载体片段进行连接，得到pKO-CP204L。连接体系如下表2：
表2连接体系
目的基因CP204L片段 2～6μL
pKO载体片段 2～4μL
10×T4Buffer 1μL
T4DNA连接酶(10U/μL) 1μL
总计 10μL
混匀后微离心，22℃连接2h。
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。涂布于含卡那霉素抗性的LB平板进行筛选，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，Asis Ⅰ和MLu Ⅰ双酶切鉴定阳性克隆，并测序验证，获得正确的pKO-CP204L克隆，使用CMV-F(SEQ No.2:5’CAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCA-3’)与FH-R(SEQ No.3:5’CTTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCG-3’)进行测序。
转化过程如下：
(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中。
(2)待DH5a感受态细胞融化后，取1μL连接产物于20μL DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。
(3)将离心管放入42℃水浴锅中40秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。
(4)向离心管中加入200μL的无菌的LB培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，200rpm，振摇1小时。涂布到卡那霉素抗性的固体培养基平皿中。
(5)37℃培养箱中培养过夜。
实施例4
用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对连接产物pKO-CP204L和腺病毒pAD-EF1α-GFP载体(图5)双酶切线性化，胶回收相应片段。连接酶连接CP204L基因片段和pAD载体片段，将连接产物转化大肠杆菌扩增，而后提取质粒，鉴定正确后获得pAD-CP204L。双酶切的反应体系如下表3：
表3双酶切反应体系
所述双酶切的酶切程序如下表4：
表4双酶切反应程序
体积 50ul
37℃ 2.5h
65℃ 20min
4℃ 保持
连接酶连接CP204L基因片段和pAD载体片段时，连接体系如表5所示：
表5连接体系
目的基因CP204L片段 2～6μL
腺病毒pAD载体片段 2～4μL
10×T4Buffer 1μL
T4DNA连接酶(10U/μL) 1μL
总计 10μL
将提取的质粒(pAD-CP204L)用PacⅠ单酶切(线性化酶切)后，线性化重组质粒与PEI混匀离心，静置，加入DMEM培养基。单酶切反应体系如表6。
表6单酶切反应体系
重组质粒pAD-CP204L 20μL(约2-3μg)
10×Buffer 5μL
ddH2O 24.5μL
PacⅠ 0.5μL
总计 50μL
单酶切反应条件：37℃，3hr；95℃，5min，50μl体系。
将重组腺病毒质粒载体混合液转染HEK293细胞，病毒包装完成，即得到含有CP204L基因重组腺病毒(图2和图3)。由图2和图3可知，重组病毒包装成功。转染过程如下：
1.250μl DMEM和8μl PEI配成Mix1，静置5min以上。
2.250μl DMEM和单酶切后的重组质粒配成Mix2。
3.将Mix1和Mix2混合，震荡混匀，离心后静置30min。
4.静置期间铺6孔板HEK293细胞，细胞数约0.3-0.5×106个/孔。
5.将静置后的混合液逐滴加入至6孔板的细胞中。十字混匀后置于CO2培养箱中培养。
在以上技术方案中，所述pKO-CP204L质粒双酶切后回收的条带大小为目的基因CP204L基因序列大小加上1.2kb。
在以上技术方案中，所述连接酶为T4DNA连接酶，所述大肠杆菌为DH5α大肠杆菌；
在以上技术方案中，所述HEK293细胞装于10cm细胞盘中，十字摇匀后置于CO2培养箱培养2-3天。
实施例5
观察转染后细胞的CPE出现情况，将出现CPE的细胞进行扩增，收毒。步骤如下：
1)将六孔板中有CPE的细胞连同培养基吹下加入10cm盘中，摇匀后置于CO2培养箱中培养，2-3天后收毒。
2)收集具有CPE效应的10cm盘细胞，用电动移液枪移至15ml离心管中，并做好相应的标记；3500rpm，离心7min；
3)离心完成后，取出离心管，倒掉上清(需要大量扩增的病毒需要将上清倒入一个新的15ml管中备用，短时间保存可以放在4℃冰箱中，长时间保存需要放在-80℃冰箱中)，残余部分用200μl枪吸干净。然后沉淀用1ml的1╳A195回溶；
4)用A195不断地吹打沉淀，保证完全回溶，然后分别吸到1.5ml EP管中，并做好相应标记；
5)将准备好的EP管放入干冰中冻6-10min，然后放入干式恒温器中，设置温度为37.0℃，待到管中残余一点冰块的时候取出用手颠倒混匀，如此反复冻融四次；
6)冻融完成后，EP管12000g离心2min；
7)将上清用1ml枪移到管中，然后存放于-80℃的冰箱中。
实施例6
将收集起来的病毒上清进行大量扩增及收毒，步骤如下：
1)将收集起来的病毒上清平均滴加到10个10cm盘中，混匀后置于CO2培养箱中培养，2-3天后收毒。
2)收集具有CPE效应的10个10cm盘细胞，用电动移液枪分别移至50ml离心管中，并做好相应的标记；
3)3500rpm，离心7min，分别收集上清和细胞沉淀；
4)病毒上清中加入NaCl和PEG8000后摇匀，每30min摇匀一次，共摇三次，4℃直立放置过夜。细胞沉淀置于-80℃保存，后续实验用。
实施例7
将病毒上清及细胞沉淀的纯化前的处理。
1.病毒上清处理
(1)将4℃过夜的上清离心，3500g，4℃，离心30min；
(2)离心后弃掉上清，收集病毒沉淀；
(3)用2ml A195将病毒沉淀重悬，收集到15ml管中。
2.细胞沉淀处理
(1)细胞沉淀用6ml A195重悬，混匀，反复冻融四次。冻融时把样品放在干冰中冻12-15分钟，然后拿到37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；
(2)冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀(细胞碎片)；
(3)上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用2ml A195重悬后加入0.5ml 5mol/L NaCl至终浓度为1mol/L。
3.超声破碎细胞
(1)重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次(AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s)，至液体不粘稠；
(2)超声完毕后，将液体分装到2个EP管中，12000rpm，4℃离心10min；
(3)离心完后，超声破碎细胞步骤获得的样品与病毒上清(病毒上清处理获得的产物、细胞沉淀处理步骤中获得的上清)和细胞沉淀处理后的样品(细胞沉淀处理步骤获得的细胞碎片重悬后产物)混合。
实施例8
病毒纯化与浓缩，具体步骤如下：
纯化：
1)用电动移液器在50mL离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入60％碘克沙醇层4.2mL，再加入40％碘克沙醇层5mL，其次加入25％碘克沙醇层6mL，最后加入15％碘克沙醇层9mL。碘克沙醇溶液的浓度为质量浓度，溶剂为150mmol/L KCl、30mmol/L MgCl2、120mmol/L三甲基甘氨酸的KOH溶液，pH7.8。
2)将处理好的病毒液加入到最上层，48000rpm离心2小时30分钟。离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内。
浓缩：
(1)离心完毕后，将超滤管底用针头刺破，弃掉前5ml，收集第6ml到第10ml溶液至15ml管中。
(2)将收集的5ml液体用PBS+PF68稀释至体积15ml，然后用0.20μm的滤膜过滤。
(3)将过滤后的液体置于一个15ml的超滤管中，3500g离心50min。如果超滤管中剩下的液体体积还不到理想体积，需要将离心下去的液体弃掉，向超滤管中加入PBS+PF68稀释，再次离心。时间长短可以根据溶液的粘稠程度而定。
(4)将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×，标明名称和日期。
(5)将收集起来的病毒涡旋震荡混匀后离心，吸10μl病毒液进行滴度检测。
所述的5×A195为含30％胎牛血清的DMEM培养基，PF68为含10％甘油、10％DMSO的DMEM，百分比为质量分数；PBS、PF68的混合液中，PBS、PF68体积比为1：1，其中PBS溶液：NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。选取的A195、PF68配方，使得对病毒损伤小。
实施例9
对已制备好的病毒进行滴度检测，具体步骤如下：
1)去除病毒外壳，各组成体系如下表7：
表7滴度检测组成成分
37℃孵育30min，然后95℃维持5min使酶失活。
2)12,000rpm离心2min，取上清。
3)设置7个梯度稀释浓度分别为：2.58╳1012vp/μl，2.58╳1011vp/μl，2.58╳1010vp/μl，2.58╳109vp/μl，2.58╳108vp/μl，2.58╳107vp/μl，并将超纯水作为阴性对照。
4)PCR检测，总共20μL体系，具体反应体系如下表8：
表8滴度检测具体反应体系
组成成分 体积
2X SYBRGreen缓冲液 10μL
F、R引物混合物 0.8μL
超纯水 7.2μL
病毒样品或标准品 2μL
总计 20μL
所述步骤4)中PCR如下95℃5min；95℃15sec；60℃15sec；72℃15sec；40个循环。
5)病毒颗粒数(个/mL)＝与标准品相对值×1000。病毒颗粒数
检测结果为8╳1010pfu/μl。
实施例10
病毒特异性检测，具体步骤如下：
1)去除病毒外壳，各组成体系如下表9：
表9特异性检测组成成分
组成成分 体积
病毒液 5μL
蛋白酶K(5μg/μL) 1μL
超纯水 4μL
37℃孵育30min，然后95℃维持5min使酶失活。
2)12,000rpm离心2min，取上清。
3)PCR反应，总共20μL体系，具体反应体系如下表10：F、R引物分别有特异性引物与通用引物，两者PCR体系一样；
表10PCR反应体系
步骤2)中所得上清 1.5μL
10×Taq酶buffer 2μL
dNTP 0.4μL
Taq酶 0.3μL
DMSO 1μL
F,R引物混合物 4μL
超纯水 10.8μL
总计 20μL
所述步骤3)中PCR反应程序如下：
95℃4min；95℃30sec；64℃45sec；72℃1min 1cycles
95℃30sec；62℃45sec；72℃1min 2cycles
95℃30sec；60℃45sec；72℃1min 3cycles
95℃30sec；58℃45sec；72℃1min 26cycle
72℃10min；4℃无限。
4)PCR产物跑胶，胶回收测序。PCR产物跑胶，扫胶，比对条带大小，若特异性引物的PCR产物条带不明显，稀释通用引物的PCR产物：加超纯水3倍测序，比对序列。将PCR产物与CP204L序列进行序列比对，结果为同源性100％。
以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
<130> xhx2018032702
<141> 2018-03-27
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 1
atggatttta ttttaaatat atccatgaaa atggaggtca tcttcaaaac ggatttaaga 60
tcatcttcac aagttgtgtt tcatgcgggt agcctgtata attggttttc tgttgagatt 120
atcaatagcg gtagaattgt tacgaccgct ataaaaacat tgcttagtac tgttaagtat 180
gatattgtga aatctgctcg tatatatgca gggcaagggt atactgaaca tcaggctcaa 240
gaagaatgga atatgattct gcatgtgctg tttgaagagg agacggaatc ctcagcatct 300
tcggagaaca ttcatgaaaa aaatgataat gaaaccaatg aatgcacatc ctcctttgaa 360
acgttgtttg agcaagagcc ctcatcggag gtacctaaag actccaagct gtatatgctt 420
gcacaaaaga ctgtgcaaca tattgaacaa tatggaaagg cacctgattt taacaaggtt 480
attagagcac ataattttat tcaaaccatt tatggaaccc ctctaaagga agaagaaaaa 540
gaggtggtaa gactcatggt tattaaactt ttaaaaaaaa taagctttta tctcacctac 600
att 603
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 2
caatgggagt ttgttttggc acca 24
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> African swine fever virus
<400> 3
cttattagtg gtggtggtgg tggtgctcg 29

Claims (10)

1.一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体，其特征在于，包括pAD-EF1α-GFP腺病毒载体、***pAD-EF1α-GFP腺病毒载体多克隆位点的非洲猪瘟病毒CP204L基因；所述CP204L基因具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体，其特征在于，所述多克隆位点为AsisI和MluI的酶切位点。
3.权利要求1所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)人工合成非洲猪瘟病毒CP204L基因序列，该基因序列两端加酶切位点AsisⅠ和MLuⅠ；
2)用限制性内切酶AsisⅠ和MLuⅠ分别对基因序列CP204L和pKO-FH载体进行双酶切，分别得到线性化CP204L基因片段和pKO-FH载体片段；将得到的线性化CP204L基因片段和pKO-FH载体片段进行连接，得到pKO-CP204L；
3)用限制性内切酶PI-SCE和I-CEU分别对所述步骤2)得到的pKO-CP204L和pAD-EF1α-GFP腺病毒载体进行双酶切，分别得到线性化CP204L基因片段和pAD-EF1α-GFP载体片段；
4)将所述步骤3)得到的线性化CP204L基因片段和pAD-EF1α-GFP载体片段进行连接，得到pAD-CP204L，测序；
5)将所述步骤4)得到的质粒pAD-CP204L用限制性内切酶PacⅠ进行单酶切，挑选重组阳性质粒用于后续实验。
4.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中连接后还包括如下步骤：对所述连接得到的重组质粒进行阳性菌落的构建和鉴定。
5.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2)中双酶切反应的酶切反应体系如下：
所述双酶切反应的温度为37℃，所述双酶切反应的时间为1小时；
所述步骤2)中连接体系如下：
连接反应的温度为22℃，连接反应的时间为2小时。
6.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3)中双酶切反应的反应体系如下：
所述双酶切反应的酶切程序如下：
37℃ 2.5小时
65℃ 20分钟
7.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中连接体系如下：
所述连接的温度为22℃，所述连接的时间为2小时。
8.根据权利要求3所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤5)中单酶切的酶切反应体系如下：
单酶切反应程序如下：
37℃ 3小时
95℃ 5分钟
9.一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，由以下步骤制备得到：
a)将8μL的聚醚酰亚胺PEI和250μL DMEM培养基配制成混合液Mix1，静置5分钟以上；将权利要求2所述的重组阳性质粒与250μL DMEM培养基制成混合液Mix2；将混合液Mix1和Mix2均匀混合并震荡混匀，离心并静置30分钟；
b)在细胞板上铺满细胞数0.3-0.5×106个/孔的HEK293细胞；
c)将步骤a)得到的静置后的混合液逐滴加入细胞板，十字混匀后置于CO2培养箱中培养2-3天；
d)收集具有CPE效应的细胞，破碎细胞，转移至离心管中，离心后收集上清和细胞沉淀，上清过滤得到含CP204L基因表达的重组腺病毒。
10.根据权利要求9所述的一种表达非洲猪瘟病毒CP204L基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于，步骤4)具体为：
收集具有CPE效应的细胞，用电移液枪移至离心管中，并做好相应的标记，离心弃上清，沉淀用1*A195回溶；EP管分装回溶液后先干冰冻存6-10min，再置于37℃，待管中冰块即将融化时取出摇匀，反复冻融4次后，12000g离心2min，取上清备用，4℃保存或-80℃保存；
病毒的预处理：
A)病毒上清处理：将在4℃条件下保存的上清离心，3500g，4℃，离心30min；离心后弃上清，收集病毒沉淀；用A195将病毒沉淀重悬，收集到管中；
B)细胞沉淀处理：细胞沉淀用A195重悬，混匀，反复冻融四次；冻融时样品置于干冰中冻12-15分钟，然后转移至37℃水浴锅中融2-3分钟，如此反复四次；冻融完毕后，3500g，4℃，离心30min，分别收集上清和细胞沉淀；上清与重悬后的病毒沉淀混合；细胞碎片用A195重悬后加入5mol/L NaCl至终浓度为1moL/L；
C)超声破碎细胞:重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次,AMPL值为30％，30s/次，每次间隔20-30s，至液体不粘稠；超声完毕后，12000rpm，4℃离心10min；离心后，与病毒上清和细胞沉淀处理后样品混合；
用电动移液器在离心管中逐层加入不同浓度的碘克沙醇；先加入60％碘克沙醇溶液4.2mL形成第一层，再加入40％碘克沙醇溶液5mL形成第二层，其次加入25％碘克沙醇溶液6mL形成第三层，最后加入15％碘克沙醇溶液9mL形成第四层；
将经过病毒的预处理步骤的病毒液加入到离心管最上层，48000rpm离心2小时30分钟；离心前应将对应的离心管配平，误差控制在0.1g以内；
离心完毕，弃前5mL，收集6-10mL液体至15mL离心管并用PBS、PF68的混合液稀释至体积15mL，然后用0.20μm的滤膜过滤，将过滤后的液体置于超滤管中，3500g离心50min；
将超滤管中剩下的液体反复吹打后吸至病毒储存管中，最后加入5×A195储存液至储存液终溶度为1×；
所述的5×A195为含30％胎牛血清的DMEM培养基，PF68为含10％甘油、10％DMSO的DMEM，百分比为质量分数；PBS、PF68的混合液中，PBS、PF68体积比为1：1，其中PBS溶液：NaCl137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L，KH2PO4 2mmol/L。
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