CN108431034A - 用于位点-特异性缀合的变体抗体 - Google Patents

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Abstract

在Fc区中的选择位置处具有半胱氨酸取代的变体抗体可经由取代进入的半胱氨酸的巯基缀合。

Description

用于位点-特异性缀合的变体抗体
相关申请的交叉参照
本申请依据35 U.S.C. §119(e)，要求2015年12月21日提交的美国临时申请系列号62/270,245的权益；其公开内容通过引用并入本文。
序列表
名为“12642WOPCT_ST25.txt”的序列表通过引用以其整体并入本文，其包含SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:8，包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列。序列表已通过EFS-Web以ASCII文本格式一并提交，因此构成纸件和其计算机可读形式二者。序列表首先于2015年10月30日使用PatentIn 3.5创立，且大小为大约22 KB。
发明背景
本发明涉及适用于位点-特异性缀合于药物部分的变体抗体和从这样的变体抗体制得的抗体-药物缀合物，以及制备和使用这样的变体抗体和缀合物的方法。
产生浓厚兴趣的一类抗癌剂是抗体-药物缀合物(ADC，也称为免疫缀合物)。在ADC中，治疗剂(也称为药物、有效载荷或弹头)共价连接于由癌细胞表达的抗原(肿瘤相关抗原)的抗体。抗体，通过结合于抗原，将ADC递送至癌症部位。在那里，共价连接的裂解或抗体的降解导致治疗剂的释放。相反，虽然ADC在血液***中循环，但治疗剂由于其共价连接于抗体而保持为无活性的。因此，用于ADC的治疗剂由于其定位释放，可能比普通化疗剂更加有效(即，细胞毒性)。对于有关ADC的评述，见Schrama等人2006。
ADC的结构一般可表示为：
Ab—L—D (I)
其中Ab是抗体，L是接头部分，和D是药物。在制备缀合物中的一个关键步骤是抗体和接头-药物组分之间形成键，通常称为缀合步骤。(本领域技术人员将意识到，为清晰起见简化了式(I)，并且其中抗体被缀合至多接头-药物组分或接头携带多个药物的实施方案可存在)。
经常用于缀合步骤的化学反应是Michael反应，其中抗体上的巯基用作亲核基团，并在接头-药物组分中的马来酰亚胺基团上加入：
该反应是有利的，因为它容易在温和的水性条件下进行。
采用Micahel 反应的一个障碍是在天然抗体中缺乏反应性巯基。虽然抗体具有许多半胱氨酸残基，但它们的巯基在二硫键中受到束缚，无法参与Michael加成。因此，抗体引入反应性巯基的一些修饰是必要的。
将反应性巯基引入抗体的一个方法需要用2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut试剂)处理，以将赖氨酸残基的–(CH2)4-NH2侧链转化为具有如下所示的反应性巯基的半胱氨酸代用物：
该方法的限制是缺乏对被修饰的赖氨酸残基的数量和位置的控制，导致具有不同抗体-药物比率(DAR)的异质ADC产物。为此理由，该方法被称为随机缀合方法。
另一种在抗体中生成反应性巯基的方法是减少天然二硫键，尽管面临影响抗体三级结构的风险。
将反应性巯基引入抗体的又一种方法是经由位点-特异性突变，其中内源性(天然)氨基酸被半胱氨酸替换。如此目的的半胱氨酸取代的实例包括Bhakta等人2016、Christie等人2016、Eigenbrot等人2009、Gao等人2015、Geierstanger等人2015和2016、Junutula等人2008和2010、Lloyd等人2015、Marquette等人2016、McDonagh等人2013、Shen等人2012和Stimmel等人2000。半胱氨酸取代可通过对抗体的其它修饰，例如其糖基化状态的修饰或其它非-半胱氨酸氨基酸取代来实现。半胱氨酸取代的位点 – 即缀合位点 – 影响ADC的稳定性和治疗活性(Shen等人2012)。由于半胱氨酸在预定的位置引入，这样的缀合被称为位点-特异性缀合。
用于非-缀合目的，例如“结进孔(knob-into-holes)”异源二聚化或调节FcγR或FcRn结合的位点-特异性半胱氨酸取代也已被公开。见例如，Chamberlain等人2006和2012、Merchant等人1998和Sondermann等人2007。
涉及Fc区中的取代的其它文件包括Lazar等人2007、2008和2009和Hansen等人2011。
本文引用的文件的完整引用通过第一作者或发明人和年份在本说明书的末尾列出。
发明简述
本发明提供新的位点-特异性半胱氨酸取代的变体抗体，其中在其Fc区中内源性氨基酸已用半胱氨酸替换，以提供适合缀合的反应性巯基。
在第一个实施方案中，提供了具有IgG同种型的变体抗体，其包含在位置271、289、337、340、341、343、362、402、413、414、415、419、439、440和441之一处具有半胱氨酸取代的Fc区，位置的编号依据Kabat中的EU索引。优选地，半胱氨酸取代在位置271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440和441之一处。(对抗体Fc区中的氨基酸位置的提及使用按照如在Kabat等人，“Sequences of proteins of immunological interest”，第5版，Pub.No. 91-3242，U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991；此后称为“Kabat”中阐述的EU索引的编号。所述编号本身被称为EU、EU/Kabat或Kabat编号中的EU)。
在第二个实施方案中，提供了一种依据式(II)的抗体-药物缀合物
Ab(—L—(D)n)m (II)
其中
Ab是本发明的变体抗体，
L是接头部分，
D是药物，
n是从1至30的整数(优选1至5，和更优选1)，和
m是1、2、3、4、5或6 (优选地1或2)，
其中Ab在Fc区A的位置271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440和441之一处经由半胱氨酸结合于L，位置的编号依据Kabat中的EU索引。在优选的实施方案中，n是1和m是1或2。
接头L可以具有可裂解或非-可裂解类型的任一个。可裂解的接头依赖于ADC在靶细胞中的内在化和存在于其中的因子或试剂的作用，以裂解接头并释放药物D。当接头含有肽基时，它可通过细胞内的酶例如组织蛋白酶之一，特别是组织蛋白酶B裂解。可用来裂解含肽的接头的另一种酶是天冬酰胺内肽酶(Legumain)。或者，接头可含有二硫基，其裂解受在靶细胞内与例如谷胱甘肽的二硫键交换影响。或者，接头可以是肼基，其可在ADC内在化后被包含在内的细胞内体例如溶酶体内发现的较低pH条件下裂解。
如果接头L具有非-可裂解的类型，它依赖于变体抗体的降解以释放药物D。在这样的情况下，接头L仍附接于药物D且应该被设计以使它不干扰药物D的生物活性。
在第三个实施方案中，提供了一种在罹患癌症的受试者中治疗这样的癌症的方法，其包括施用治疗有效量的如上所述的抗体-药物缀合物。
附图简述
图1示意地显示抗体的结构，包括Fc区(CH2和CH3结构域)的位置，其中已进行本发明的位点-特异性半胱氨酸取代。
图2显示对于IgG抗体的Fc区的共有序列，突出显示用于依据本发明的位点-特异性半胱氨酸取代的位置。
图3显示位点-特异性半胱氨酸取代在CH2和CH3结构域的带状图上的定位。
图4示意地显示制备携带两个不同有效载荷的ADC的正交化学的应用。
图5显示用于计算缀合物中的平均DAR值的色谱迹线。
发明详述
抗体包含通过二硫键互相连接的两个重(H)链和两个轻(L)链。轻链可具有κ或λ类型。每个重链包含重链可变区(VH)和含有3个区或结构域(CH1、CH2和CH3)的重链恒定区。CH2和CH3区被共同称为Fc区。CH2和CH3区通过称为铰链区的氨基酸序列与CH1区分隔。每个轻链包含轻链可变区(VL或VK, 依据轻链具有λ还是κ)和包含单一结构域(CL)的轻链恒定区。二硫桥连接每个重链与其配对轻链，两个重链，以及每个重链内的不同位置。VH和VL区可进一步细分为超可变区，称为互补决定区(CDR)，其与较保守的框架区(FR)交替。每个VH和VL包含3个CDR和4个FR，按以下次序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。图1示意地显示抗体的结构。可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。恒定区可介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。如果抗体以5 x 10-8 M或更少，更优选1 x 10-8 M或更少，更优选6 x 10-9 M或更少，更优选3 x 10-9 M或更少，甚至更优选2 x 10-9 M或更少的KD结合于抗原X，则认为抗体“特异性地结合”于抗原X。抗体可以是嵌合的、人源化的、或者优选是人的。正常地，抗体在重链的位置N297被糖基化，但糖基化类型或程度(包括任何糖基化的消除)可被工程设计以延长抗体半衰期，增强或减少与效应细胞或补体***的相互作用，或调节一些其它特性。
IgG-Fc结构域的CH2和CH3结构域通常由总共213个氨基酸组成。这些氨基酸的每一个以不同的方式有助于分子在体内的折叠、稳定性、活性和寿命。为选择这些氨基酸的哪一个可最有效靶向适合缀合于药物的Cys取代(突变)，许多因素，包括残基可及性(residueaccessibility)、对适当的蛋白质折叠、表达和稳定性的影响都被考虑在内。例如，将新的Cys残基引入蛋白质可引起与天然Cys残基的不适宜的S-S (二硫化物)键形成的竞争，导致错误折叠或不稳定的蛋白质。在CH2和CH3氨基酸的每一个处具有取代的蛋白质的强制表达、纯化和表征需要大量的资源、时间和专业知识来完成。213种可能性的分类被用来减少可能性的数目，其需要在连续更加资源密集的评价阶段中进一步评价。
为有效地确定CH2和CH3氨基酸的哪一个子集可适合于Cys取代，分子建模和序列分析被用作初始筛选以减少要生产、纯化并评价缀合的各个蛋白质的数量。MOE分子建模工具被用来构建模型并收集晶体结构3WJJ (PDB参考代码；见下文)的CH2和CH3结构域中的所有可能的Cys突变位置的结构统计学。对用于缀合可及性的足够的侧链表面暴露(大于20%)，已知的抗体-附接的碳水化合物、抗体二聚链或CD32结合区的接近(在4.5埃内的任何原子)的缺乏，与可能参与异常S-S键的天然Cys残基的距离，和对与天然结构的潜在原子冲突(失稳潜在性)的检查，评价了每个潜在的突变位置。最后，对于作为Cys突变位置而潜在包含在内，检查了由于表面暴露分析的尺寸而可能已被消除的天然残基例如A、G和Pro。应用这些测量，初始213个位置减少至89个。这个数目的全长Ab蛋白质被认为通过表达进一步评价在技术上是可行的。代表这89个突变的序列然后如下所述表达并进一步评价稳定性和/或缀合效果，以实现本发明的特异性Cys取代位点。
晶体结构3WJJ可从蛋白质数据库(PDB)下载。用于下载文件的url的终端部分是“rcsb.org/pdb/explore/explore.dostructureId=3wjj”，其可通过在其前面***“http://www.”转化为有效链接。
图2显示人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型的Fc区的共有氨基酸序列，其中依据本发明的半胱氨酸取代位点用粗体和下划线突出显示。序列中的氨基酸通过EU/Kabat编号鉴定，这对于IgG Fc区是常规的。为进一步符合惯例，可通过按顺序列出取代退出的原始(内源性)氨基酸、EU位置编号和取代进入的氨基酸，如P271C、T289C等等，以缩写格式提及取代。值得注意的是，依据本发明鉴定的每个取代位点在IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型中是保守的，除了在EU位置419外，其在IgG1、IgG2和IgG3中为谷氨酰胺(Q)，但IgG4中为谷氨酸(E)。图3显示使用基于3WJJ晶体结构的带状图，CH2和CH3结构域中的位点特异性半胱氨酸取代的定位。
相应的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 Fc序列还分别在SEQ ID NO:1、NO:2、NO:3和NO:4中提供。SEQ ID NO:1在图2中突出显示的半胱氨酸取代的每个位点处用MISC_FEATURE备注注释，以提供EU编号和序列表编号之间的相关性。SEQ ID NOs:2-4不具有这样的注释，但类似的相关性可通过参照SEQ ID NO:1导出。
在一个优选的实施方案中，本发明的变体抗体在EU位置337、340、341和343之一处具有半胱氨酸取代。
在另一个优选的实施方案中，本发明的变体抗体在EU位置413和415之一处具有半胱氨酸取代。
在又一个优选的实施方案中，本发明的变体抗体在EU位置439、440和441之一处具有半胱氨酸取代。
在又一个实施方案中，本发明的变体抗体在位置271、340、341、343、402和439之一处具有半胱氨酸取代。在这样的位置处的半胱氨酸取代在产生具有高DAR和/或低聚集的缀合物方面是有利的。
半胱氨酸取代位点可依据彼此的物理接近性分组。粗略地，依据图3的带状结构，位置P271和T289可位于A组；位置S337、K340、G341、P343和G402可位于B组；和位置Q362、D413、K414、S415、Q419、K439、S440和L441可位于C组。本发明的变体抗体可具有多个半胱氨酸取代。在这样的情况下，可优选的是选择空间隔开的取代以减少它们之间二硫键形成的可能性。例如，建议组合P271C (A组)和K340C (B组)，同样组合Q362C (C组)和G402C (B组)。然而，避免组合Q362C和D413C (均为C组)可能是优选的。
在一个实施方案中，每个变体抗体重链具有一个半胱氨酸取代，优选在每个链的相同位置(如，均具有P343C取代或均具有S337C取代)。这样的实施方案导致具有2的理论DAR的ADC。在另一个实施方案中，每个变体抗体重链具有两个半胱氨酸取代(如，每个具有P271C和K340C取代)，导致具有4的理论DAR的ADC。其中每个重链具有甚至更大数目的半胱氨酸取代或不相同取代的变体抗体，也在本发明的范围内。
人IgG抗体以许多同种异型存在(Jefferis和Lefranc 2009)。例如，G1m3同种异型具有在CH3区中的E356和M358，代替如在图2中所示的D356和L358。本发明的范围不限于在图2中所示的同种异型。更确切地说，具有本文教导的半胱氨酸取代但具有其它同种异型的人IgG抗体也包括在本发明的范围内。
本发明的变体抗体可具有任何IgG同种型，但优选具有IgG1或IgG4同种型，且更优选具有IgG1同种型。抗体可以是嵌合的、人源化的、或者优选是人的。更优选地，抗体是具有IgG1或IgG4同种型的人单克隆抗体，并且更优选具有IgG1同种型。
当抗体经重组产生时，一些重链C-末端链赖氨酸残基(在图2中的氨基酸447)通常在表达或纯化步骤期间，通过来自生产宿主细胞的酶除去，导致异质产物(存在两个赖氨酸，除去一个赖氨酸，或除去两个赖氨酸)。这种异质性是不可取的。为获得更加异质的产物，两个赖氨酸可通过初始产物的进一步酶法处理，或者通过从用于重组表达的核苷酸序列消除C-末端赖氨酸的密码子而有目的地除去。McDonough等人1992。缺乏重链C-末端赖氨酸残基的具有本文公开的半胱氨酸取代的变体抗体也在本发明的范围内。其中C-末端甘氨酸和赖氨酸二者已被除去的变体抗体也是已知的并且包括在本发明的范围内。
除了本文公开的半胱氨酸取代外，本发明的变体抗体还可具有相对于天然类型的其它变化类型，包括，但不限于在下文描述的那些。
IgG同种型的抗体具有在天冬酰胺297 (N297)的糖基化位点。糖苷基团的存在可阻断对抗体上的某些氨基酸的接近。在熟知的实例中，当抗体在N297被糖基化时，谷氨酰胺295 (Q295)不是转谷氨酰胺酶的胺受体底物，但酶的去糖基化使得Q295可用作转谷氨酰胺酶底物(Jeger等人2010)。类似地，依据本发明的一些半胱氨酸取代位点可以被糖苷基团空间阻塞(即使仅部分地)。在这样的情况下，糖苷基团的去除可使得它们更加可用于缀合。去糖基化可通过用酶例如PNGase F (肽-N-糖苷酶F)翻译后处理以除去糖苷基团，或通过用位点-特异性取代例如N297A除去N297糖基化位点进行。类似的效果可通过代替完全除去糖基，而是除去其上的一个或多个糖单位，因而改变它的空间体积来实现。
本发明的用于位点-特异性缀合的方法可与其它位点-特异性方法组合，以产生多个正交缀合化学，并能够制备递送预定的相对量的两个不同的药物的缀合物。其它位点-特异性缀合方法应该是包括并非半胱氨酸巯基的化学的方法，以产生正交性。这个概念在图4中，用转谷氨酰胺酶-介导的缀合作为示例性正交缀合化学举例说明。举例的抗体在其重链中具有能够用作转谷氨酰胺酶的胺受体的谷氨酰胺(Q)和依据本发明的半胱氨酸取代(C)。谷氨酰胺与胺供体H2N-L1-D1的转谷氨酰胺酶介导的缀合，其中L1是第一接头部分和D1是第一药物，实现缀合以提供携带第一药物D1的中间体ADC。随后与马来酰亚胺药物-接头化合物的缀合
其中L2是第二接头部分和D2是不同于药物D1的第二药物，实现缀合以提供携带两个不同的药物D1和D2的最终ADC。(本领域技术人员将意识到缀合步骤的次序可以颠倒)。这样的ADC在联合疗法中是特别需要的，其中两个不同的药物被用来同时攻击癌症。
在图4中说明的转谷氨酰胺酶-介导的缀合是直接方法或一步方法。或者，可采用间接方法或两步方法，如在Innate Pharma 2013中公开的。
所用的正交缀合化学不限于转谷氨酰胺酶偶合。又一种缀合技术涉及将非-天然氨基酸引入抗体，所述非-天然氨基酸提供用于正交缀合化学的官能团。非-天然氨基酸可通过工程改造用于通过重组表达生产抗体的核苷酸序列来引入，如在Tian等人, WO 2008/030612 A2 (2008)中教导的。非-天然氨基酸也可使用无细胞方法掺入抗体或其它多肽中，如在Goerke等人, US 2010/0093024 A1 (2010)和Goerke等人, Biotechnol. Bioeng.2009, 102 (2), 400-416中教导的。如果引入非-天然氨基酸p-乙酰基苯丙氨酸，则正交缀合化学可以是用具有NH2基团的接头-药物化合物形成肟。如果引入非-天然氨基酸p-叠氮基苯丙氨酸，则正交缀合化学可以是“点击化学(click chemistry)”，其中叠氮基与接头-药物化合物上的环辛炔基团反应，形成1,2,3-***环(Agard等人, J. Amer. Chem. Soc.2004, 126, 15046; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571)。
正交缀合化学也可通过变体抗体的糖基基团的合适修饰来实现。在一种方法中，酮基被引入糖基基团中，以用作通过肟形成的缀合位点，如由Zhu等人, mAbs 2014, 6, 1教导的。在另一种糖工程改造变化中，抗体的糖基基团可经修饰以引入用于通过“点击化学”缀合的叠氮基。见Huang等人, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308和Wang, US 8,900,826 B2 (2014)和US 7,807,405 B2 (2010)。
除了上述半胱氨酸取代，本发明的变体抗体还可在其它氨基酸位置具有保守的取代。这样的保守修饰形式包括在本发明的范围内。“保守的修饰”或“保守的取代”意指，对于抗体，其中的氨基酸用另一种具有类似的侧链的氨基酸替换。具有类似的侧链的氨基酸家族是本领域已知的。这样的家族包括具有碱性侧链(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷的极性侧链(天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、小侧链(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸)、链方向改变侧链(甘氨酸、脯氨酸)和芳族侧链(酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。多个保守的取代/修饰可以存在。优选地，当保守的取代存在时，它们的数量在1和3之间。
可以依据本发明经半胱氨酸取代的抗体包括识别以下抗原的那些：间皮素、***特异性膜抗原(PSMA)、CD19、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4 (也称为O8E)、蛋白质酪氨酸激酶7 (PTK7)、磷脂酰肌醇聚糖-3、RG1、岩藻糖基-GM1、CTLA-4和CD44。抗体可以是动物的(如，鼠)、嵌合的、人源化的、或者优选是人的。抗体优选地是单克隆的，特别是单克隆人抗体。针对一些前述抗原的人单克隆抗体的制备在Korman等人, US 8,609,816 B2 (2013;B7H4，也称为08E；特别是抗体2A7、1G11和2F9)；Rao-Naik等人, 8,097,703 B2 (2012;CD19；特别是抗体5G7、13F1、46E8、21D4、21D4a、47G4、27F3和3C10)；King等人, US 8,481,683 B2 (2013; CD22；特别是抗体12C5、19A3、16F7和23C6)；Keler等人, US 7,387,776 B2(2008; CD30；特别是抗体5F11、2H9和17G1)；Terrett等人, US 8,124,738 B2 (2012;CD70；特别是抗体2H5、10B4、8B5、18E7和69A7)；Korman等人, US 6,984,720 B1 (2006;CTLA-4；特别是抗体10D1、4B6和1E2)；Vistica等人, US 8,383,118 B2 (2013，岩藻糖基-GM1，特别是抗体5B1、5B1a、7D4、7E4、13B8和18D5) Korman等人, US 8,008,449 B2 (2011;PD-1；特别是抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4)；Huang等人, US 2009/0297438 A1(2009; PSMA，特别是抗体1C3、2A10、2F5、2C6)；Cardarelli等人, US 7,875,278 B2(2011; PSMA；特别是抗体4A3、7F12、8C12、8A11、16F9、2A10、2C6、2F5和1C3)；Terrett等人,US 8,222,375 B2 (2012; PTK7；特别是抗体3G8、4D5、12C6、12C6a和7C8)；Terrett等人,US 8,680,247 B2 (2014; 磷脂酰肌醇聚糖-3；特别是抗体4A6、11E7和16D10)；Harkins等人, US 7,335,748 B2(2008; RG1；特别是抗体A、B、C和D)；Terrett等人, US 8,268,970B2 (2012; 间皮素；特别是抗体3C10、6A4和7B1)；Xu等人, US 2010/0092484 A1 (2010;CD44；特别是抗体14G9.B8.B4、2D1.A3.D12和1A9.A6.B9)；Deshpande等人, US 8,258,266B2 (2012; IP10；特别是抗体1D4、1E1、2G1、3C4、6A5、6A8、7C10、8F6、10A12、10A12S和13C4)；Kuhne等人, US 8,450,464 B2 (2013; CXCR4；特别是抗体F7、F9、D1和E2)；和Korman等人, US 7,943,743 B2 (2011; PD-L1；特别是抗体3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4)中公开；其公开内容通过引用并入本文。
以下重复的式(II)中的下标n表示结合于接头的药物D的数目。通常，一个药物D附接于每个接头– 即，n是1 – 如通过批准的ADC MYLOTARG™、KADCYLA™和ADCETRIS™举例说明的。然而，可使用分支接头以使多个药物D附接于单一接头(即，n大于1)。对于分支接头的实例，见King等人2004和Yurkovetsky 2015。
Ab(—L—(D)n)m (II)
用于本发明的变体抗体的缀合物的药物(治疗剂)通常是可杀死靶细胞的细胞毒性剂。实例包括以下类型的化合物和它们的类似物和衍生物：
(a)烯二炔例如刺孢霉素(见例如Lee等人, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464和3466)和uncialamycin (见例如Davies等人, WO 2007/038868 A2 (2007)；Chowdari等人,US 8,709,431 B2 (2012)；和Nicolaou等人, WO 2015/023879 A1 (2015))；
(b) tubulysin (见例如Domling等人, US 7,778,814 B2 (2010)；Cheng等人, US 8,394,922 B2 (2013)；和Cong等人, US 8,980,824 B2 (2015))；
(c) DNA烷化剂例如CC-1065的类似物和倍癌霉素(duocarmycin) (见例如Boger, US6,5458,530 B1 (2003)；Sufi等人, US 8,461,117 B2 (2013)；和Zhang等人, US 8,852,599 B2 (2014))；
(d) epothilones (见例如Vite等人, US 2007/0275904 A1 (2007)和US RE42930 E(2011))；
(e) 阿里他汀(见例如Senter等人, US 6,844,869 B2 (2005)和Doronina等人, US7,498,298 B2 (2009))；
(f) 吡咯并苯并二氮杂䓬(PBD)二聚体(见例如Howard等人, US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013)；和WO 2013/041606 A1 (2013))；和
(g) 美坦生类化合物例如DM1和DM4 (见例如Chari等人, US 5,208,020 (1993)和Amphlett等人, US 7,374,762 B2 (2008))。
优选地，药物是DNA烷化剂、tubulysin、阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂䓬、烯二炔或美坦生类化合物，例如：
,
,
,
,
,
,
或
。
在其上进行缀合的官能团是胺(-NH2)基团(在上面前5个药物的情况下)和甲基胺(-NHMe)基团(在后两个药物的情况下)。
为使药物缀合至抗体，需要接头基团。药物用接头结合以形成接头-药物化合物，其然后被缀合至adnectin。因此，抗体-药物缀合物可通过使本发明的变体抗体与接头-药物化合物反应来制备，其中所述接头具有马来酰亚胺基团。
一种优选的接头化合物可由式(III)表示：
其中
D是药物；
T是自灭基团(self-immolating group)；
t是0或1；
AAa和每个AAb独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
u是0或1；
q是2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；和
s是0或1。
在式II中，-AAa-[AAb]p-表示长度由p值确定的多肽(如果p是1则是二肽，如果p是3则是四肽，等等)。AAa在多肽的羧基末端且其羧基与药物D的胺氮(或自灭基团T，如果存在的话)形成肽(酰胺)键。相反地，最后的AAb在多肽的氨基末端且其α-氨基与下式形成肽键，
或 ，
这取决于s分别是1还是0。优选的多肽-AAa-[AAb]p-是Val-Cit、Val-Lys、Lys-Val-Ala、Asp-Val-Ala、Val-Ala、Lys-Val-Cit、Ala-Val-Cit、Val-Gly、Val-Gln，和Asp-Val-Cit，以常规N至C方向书写，如在H2N-Val-Cit-CO2H中。更优选地，多肽是Val-Cit、Val-Lys或Val-Ala。优选地，多肽-AAa-[AAb]p-是可由靶(癌)细胞内发现的酶，例如组织蛋白酶且特别是组织蛋白酶B裂解的。
如果下标s是1，药物-接头(I)含有聚(乙二醇) (PEG)基团，其可有利地改进药物-接头(I)的溶解性，促进与抗体的缀合 – 一个在水性介质中执行的步骤。此外，PEG基团可用作抗体和肽-AAa-[AAb]p-之间的间隔基，以使大体积的抗体不空间干扰肽-裂解酶的作用。
如由下标t等于0或1指示的，自灭基团T是任选地存在的。自灭基团是这样的基团，即从AAa或AAb的裂解(视可能的情况而定)启动反应顺序，导致自灭基团使本身与药物D键断裂，并释放出后者以发挥其治疗功能。当存在时，自灭基团T优选地是p-氨基苄基氧基羰基(PABC)基团，其结构在下文示出，其中星号(*)表示键合于药物D的胺氮的PABC的末端，波浪线()表示键合于多肽-AAa-[AAb]p-的末端。
另一种可使用的自灭基团是取代的噻唑，如在Feng, US 7,375,078 B2 (2008)中公开的。
当下标u是0时，接头既不含有多肽-AAa-[AAb]p-，也不含有自灭基团T，而是具有非-可裂解的类型。
式(III)中的马来酰亚胺基团用作经由Michael加成反应连接于抗体中的反应性巯基的反应性官能团，如上讨论的。经由马来酰亚胺和本发明的变体抗体中的半胱氨酸巯基的缀合产生依据式(IV)的抗体-药物缀合物：
其中
Ab是具有IgG同种型的变体抗体，其包含在位置271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440和441之一处具有半胱氨酸取代的Fc区，位置的编号依据Kabat中的EU索引；
D是药物；
T是自灭基团；
t是0或1；
AAa和每个AAb独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
u是0或1；
q是2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；
s是0或1，和
m是1、2、3、4、5或6 (优选1或2)。
抗体Ab通过在马来酰亚胺双键上加入巯基，经由取代进入的半胱氨酸(EU 271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440或441)的巯基键合于接头-药物化合物。当在每个取代进入的半胱氨酸(每个重链1个)中的游离巯基与马来酰亚胺基团接头反应时，下标m是2。偶尔，只有一个巯基反应，产生具有仅一个附接的接头-药物部分的抗体-药物缀合物 – 即m是1。
本发明的实践可通过参考以下实施例得到进一步理解，所述实施例通过举例说明且不受限制的方式提供。
实施例1 – 变体抗体的制备
具有依据本发明的半胱氨酸取代的变体抗体使用命名为MSN-A的抗-间皮素抗体和/或命名为CD70-A的抗-CD70抗体制备。抗体MSN-A的重链和轻链氨基酸序列分别在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中给出。抗体CD70-A的重链和轻链氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7和SEQID NO:8中给出。
将MSN-A和CD70-A的VH和VK片段克隆到含有恒定区的多种哺乳动物表达载体中用于IgG1抗体表达。这些表达载体还含有嘌呤霉素或新霉素抗性基因以允许用于抗体生产的稳定转染。此外，这些表达载体包括在重链CH3结构域后含有内含子和跨膜结构域的哺乳动物展示载体，以允许自相同转染细胞的可溶性和表面-结合抗体同时表达。
重链CH2和CH3中的初始集合89个Cys取代根据其3D结构进行选择，如上讨论的。合成含有这些Cys突变的DNA片段并克隆到如上所述的哺乳动物表达载体中以替代野生型片段。对于这些构建体的分子克隆用in-fusion克隆技术或DNA连接和大肠杆菌(E. coli)转化来实现。含有这些Cys取代的构建体使用Sanger方法通过DNA测序确认。
这些构建体被转染到CHO-S细胞内，在补充有嘌呤霉素和/或新霉素的培养基中形成稳定库或克隆。用表达具有不同Cys突变的变体抗体的哺乳动物展示载体转染的稳定库在FACS研究中用PE-缀合的抗-人κ和APC-缀合的CD64染色。保持CD64结合，可很好地表达，并可通过蛋白A纯化的变体被选择用于进一步研究。
实施例2 – 变体抗体的缀合
以下程序通常可用于本发明的变体抗体的缀合。
变体抗体在CHO细胞中表达并使用蛋白A色谱纯化。然后于37℃，将纯化的抗体在缓冲的水溶液(pH 7-9)中，用过量(10-100摩尔当量)的还原剂TCEP (三(2-羧乙基)膦)处理0.5-3小时。使还原的变体抗体通过Sephadex G-25柱除去TCEP。然后于4-37℃，将纯化的、还原的抗体用过量(10-100摩尔当量)的二硫化物形成试剂例如CuSO4 (硫酸铜(II))、dhAA (脱氢抗坏血酸)、空气、H2O2 (过氧化氢)、N-CS (N-氯代琥珀酰亚胺)或O2 (分子氧)在缓冲的水溶液(pH 4-9)中处理0.5-24 h。再氧化的抗体通过离子交换或者尺寸排阻色谱纯化。每抗体的游离巯基的比例通过从蛋白质溶液在280 nm的吸收测定蛋白质浓度，和从蛋白质与DTNB (5,5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)，Ellman试剂)的反应测定巯基浓度来估算。
如上所述还原和氧化后，在缓冲的水溶液(pH 7-10)中的抗体用1-10摩尔当量的含有半胱氨酸-反应性官能团(马来酰亚胺、碘乙酰胺，或类似的反应物)的药物-接头处理。药物-接头通常溶于有机溶剂(DMSO、DMA或类似物)中，其也被加入到反应混合物中。使反应于4-37℃进行1-4 h。此后，抗体-药物缀合物通过离子交换、尺寸排阻、蛋白A或疏水相互作用色谱，或多种类型的色谱的组合纯化。进行分析试验例如SDS-PAGE、蛋白质印迹、HIC和质谱，以确认药物接头在工程改造位置处连接。
实施例3 – 缀合物特性
缀合物按照以上程序，使用马来酰亚胺-结尾的接头与作为药物组分的tubulysin类似物(见例如，Cheng等人, US 8,394,922 B2 (2013)和Cong等人, US 8,980,824 B2(2013))制备，具有通常如下所示的结构：
。
使用疏水相互作用色谱和对峰面积积分，对缀合物的平均DAR进行分析。具有G341C取代的抗体的代表性色谱迹线示于图5中。本领域技术人员将理解，平均DAR是统计学平均数，且各个抗体分子可具有0、1或2的DAR值。结果于表I中提供。
实施例4
针对人胃癌(N87)和人间皮瘤(H226)癌细胞，对按照前述实施例的具有P343C取代的抗体MSN-A和tubulysin类似物/接头化合物的缀合物的制备物进行体外测试。采用3H胸苷掺入试验(Cheng等人, US 8,394,922 B2 (2013))。EC50值针对N87细胞是0.55 nM和针对H226细胞是0.30 nM。
本发明的先前详细描述包括主要或专门关注本发明的特定部分或方面的段落。要理解这是为了清楚和方便起见，一个特定的特征可能不只是与它被公开的段落相关，并且本文的公开内容包括在不同的段落中发现的信息的所有适当组合。类似地，虽然本文的各个附图和描述涉及本发明的特定实施方案，要理解当特定特征在具体附图或实施方案的上下文中公开时，这样的特征也可与另一个特征组合用于(在合适的程度上)另一个特征或实施方案的上下文中，或用于整个本发明中。
此外，虽然本发明已根据某些优选的实施方案进行了具体描述，但本发明不限于这样的优选的实施方案。而是，本发明的范围受所附权利要求书的限定。
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序列表
。

Claims (20)

1.具有IgG同种型的变体抗体，其包含在位置271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440和441之一处具有半胱氨酸取代的Fc区，位置的编号依据Kabat中的EU索引。
2.依据权利要求1的变体抗体，其中半胱氨酸取代在位置337、340、341和343之一处。
3.依据权利要求1的变体抗体，其中半胱氨酸取代在位置413和415之一处。
4.依据权利要求1的变体抗体，其中半胱氨酸取代在位置439、440和441之一处。
5. 依据权利要求1的变体抗体，其是具有IgG1同种型的人单克隆抗体。
6. 一种依据式(II)的抗体-药物缀合物
Ab(—L—(D)n)m (II)
其中
Ab是依据权利要求1的变体抗体，
L是接头部分，
D是药物，
n是从1至30的整数，和
m是1、2、3、4、5或6，
其中Ab经由Fc区A的位置271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440和441之一处的半胱氨酸键合于L，位置的编号依据Kabat中的EU索引。
7.依据权利要求6的抗体-药物缀合物，其中药物D是DNA烷化剂、tubulysin、阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂䓬、烯二炔或美坦生类化合物。
8.依据权利要求6的抗体-药物缀合物，其中n是1和m是1或2。
9.依据权利要求6的抗体-药物缀合物，其中变体抗体Ab是具有IgG1同种型的人单克隆抗体。
10.一种抗体-药物缀合物，其具有依据式(IV)的结构：
其中
Ab是具有IgG同种型的变体抗体，其包含在位置271、337、340、341、343、402、413、415、419、439、440和441之一处具有半胱氨酸取代的Fc区，位置的编号依据Kabat中的EU索引；
D是药物；
T是自灭基团；
t是0或1；
AAa和每个AAb独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
u是0或1；
q是2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；
s是0或1，和
m是1、2、3、4、5或6。
11.依据权利要求10的抗体-药物缀合物，其中药物D是DNA烷化剂、tubulysin、阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂䓬、烯二炔或美坦生类化合物。
12.依据权利要求10的抗体-药物缀合物，其中u是1。
13.依据权利要求10的抗体-药物缀合物，其中抗体Ab是具有IgG1同种型的人单克隆抗体。
14.一种制备抗体-药物缀合物的方法，其包括使依据权利要求1的变体抗体与接头-药物化合物反应，其中所述接头具有半胱氨酸-反应性官能团。
15.依据权利要求14的方法，其中接头-药物化合物具有依据式(III)的结构：
其中
D是药物；
T是自灭基团；
t是0或1；
AAa和每个AAb独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
p是1、2、3或4；
u是0或1；
q是2、3、4、5、6、7、8、9或10；
r是1、2、3、4或5；和
s是0或1。
16.依据权利要求15的方法，其中药物D是DNA烷化剂、tubulysin、阿里他汀、吡咯并苯并二氮杂䓬、烯二炔或美坦生类化合物。
17.依据权利要求15的方法，其中u是1。
18.依据权利要求14的方法，其中变体抗体是具有IgG1同种型的人单克隆抗体。
19.一种在罹患癌症的受试者中治疗这样的癌症的方法，其包括向这样的受试者施用治疗有效量的依据权利要求6的抗体-药物缀合物。
20.一种在罹患癌症的受试者中治疗这样的癌症的方法，其包括向这样的受试者施用治疗有效量的依据权利要求10的抗体-药物缀合物。
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