CN108430493A - 超稳胰岛素类似物在聚合物熔体中的包囊 - Google Patents

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Abstract

一种胰岛素组合物，包含胰岛素类似物和聚合物共混物。所述胰岛素类似物包含位置B4和A10处的半胱氨酸置换(以形成胱氨酸B4‑A10)，以及选自以下的一个或多个额外的置换：胰岛素A‑和B结构域之间5‑11个氨基酸的连接结构域；位置A8处的非β分支氨基酸置换；位置A14处的非β分支酸性或极性侧链；PheB24的邻位卤素修饰；以及位置B29处的赖氨酸被Glu、Ala、Val、Ile、Leu、氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸置换。胰岛素类似物与包括在温度范围90‑120℃内的一个或多个步骤的制造过程相容。包囊的胰岛素类似物可任选包含游离PEG或PEG化。胰岛素类似物包囊的聚合物共混物可铸造为用于局部给予的微针贴片或用于皮下注射的微丸。

Description

超稳胰岛素类似物在聚合物熔体中的包囊
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2015年12月23日提交的待决的美国临时申请号62/387,459的益处。
关于联邦资助研究或开发的声明
本申请在政府支持下在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号DK040949和DK074176以及国家科学基金授予的资助号DMR0423914下做出。美国政府在本发明中具有一定的权利。
发明背景
本发明涉及多肽激素类似物的聚合物包囊，所述多肽激素类似物显示提高的热学和热力学稳定性，包括增强的对聚集-偶联的错折叠和室温以上热原纤维形成的抗性。这种提高的稳定性使得激素类似物能够在具有需要温度在90-120℃范围内的步骤的制造过程之后维持活性。更具体地，本发明涉及用聚合物熔体包囊超稳胰岛素类似物，所述超稳胰岛素类似物由两个更稳定化的元件组成，其一为残基B4和A10之间额外的二硫键。第二个元件由选自以下的一个或多个元件组成：(a) A和B结构域之间缩短的连接(C)结构域；(b) α-螺旋C-CAP位置A8处的非β分支氨基酸置换；(c) A14处的非β分支酸性或极性侧链；(d) PheB24的芳香环在芳香侧链邻位的卤素修饰(6的环位置2；卤素选自氟、氯或溴)；和/或(e) LysB29被精氨酸、谷氨酸或具有中性脂肪族侧链的天然氨基酸(选自Ala、Val、Ile或Leu)或具有中性脂肪族侧链的非天然氨基酸侧链(氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸)置换。任选地，在双链或单链类似物中，N端残基(包括残基B1、残基B1和B2或残基B1-B3)可从B链(或B结构域)删除，并且AsnA21还可任选被Asp、Ala、Gly或Ser置换。SCI、A链或B链的N端可任选如所描述的通过PEG化修饰，以确保在聚合物共混物中更均匀分布(Lee, P.等人. Macromol. Biosci.15:1332-7 (2015))。
给予胰岛素长期以来一直被确立为用于糖尿病的治疗法。在糖尿病患者中常规胰岛素替代疗法的一个主要目标为控制血糖浓度以防止其偏离健康人受试者典型的正常范围以上或以下。偏离正常范围以下与即时肾上腺素能或神经低血糖症状有关，这在严重发作时导致抽搐、昏迷和死亡。偏离正常范围以上与增加的微血管疾病的长期风险有关，包括视网膜病变、失明和肾衰竭。尽管1型糖尿病的治疗通常需要通过皮下注射给予的基础胰岛素制剂(或长效胰岛素类似物制剂)和膳食胰岛素制剂(或速效胰岛素类似物制剂)的组合，但在许多情况下2型糖尿病仅可用基础胰岛素制剂(或长效胰岛素类似物制剂)治疗。本发明涉及这样的基础胰岛素疗法。
胰岛素为在脊椎动物代谢中发挥核心作用的小的球状蛋白。胰岛素包含两条链，包含21个残基的A链，和包含30个残基的B链。该激素作为Zn2+-稳定的六聚体储存在胰腺β细胞，但在血流中作为无Zn2+的单体发挥功能。胰岛素为单链前体，胰岛素原的产物，在胰岛素原中连接区域(35个残基)连接B链的C端残基(残基B30)与A链的N端残基(图1A)。许多证据表明其由胰岛素样核心和无序的连接肽组成(图1B)。认为三个特异性二硫键(A6–A11，A7–B7和A20–B19；图1A和1B)的形成与粗面内质网(ER)中胰岛素原的氧化折叠相偶联。从ER输出至高尔基体不久，胰岛素原组装以形成可溶的Zn2+-配位的六聚体。内切蛋白酶解的消化和转化为胰岛素发生在不成熟的分泌颗粒中，接着形态浓缩。成熟储存颗粒中的锌胰岛素六聚体的晶体阵列已经通过电镜术(EM)可视化。胰岛素的序列在图1C中以示意形式显示。个体残基通过氨基酸的同一性(通常使用标准的三字母代码)、链和序列位置(通常作为上标)指示。与本发明有关的为新的缩短的6-11个残基长的C结构域代替人胰岛素原特有的36个残基的野生型C结构域的发明。
胰岛素和常规胰岛素类似物在液体或微晶制剂中对物理降解和化学降解二者易感。物理降解导致形成原纤维，而化学降解涉及化学键的破裂，伴随丧失分子内原子的重排或在不同胰岛素分子之间形成化学键。物理和化学降解在室温以上显著加速，并且在55℃以上更是如此。这种降解损伤生物学活性。胰岛素和常规胰岛素类似物在液体或微晶制剂中对各种形式的降解的易感性当前妨碍其包囊在聚合物熔体内，所述包囊需要在温度范围90-120℃内的一个或多个制造步骤。这种聚合物熔体的一个实例由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PL-GA；以不同的分子比率，包括但不限于50:50)提供，其可经由球磨机或研钵和研杵研磨成粉末并与冻干的SCI (或常规的双链胰岛素类似物)在固体状态混合。共混的粉末(负载超稳的胰岛素类似物)可在熔解过程中在温度范围90-120℃挤压至少10 min并在室温固化。这种聚合物熔体可铸造成各种形状，包括包含微针用于施用于皮肤的薄片(sheet)和用于皮下注射的微丸。PL-GA在本领域中已知为无毒的并且在体内经历缓慢的溶解至无毒的降解产物，使得其在各种医疗装置和药物递送***中使用成为可能(参见Ahmed, T.(2015); Ortega-Oller, I.等人 (2015); 和Rahimian, S.,等人 (2015))。其在医疗装置中的使用因此已经被美国食品药品监督局批准。
本发明受医学和社会需求激励而工程改造基础的每周一次、每月两次或每月一次的胰岛素类似物递送方法以提高用于治疗糖尿病的胰岛素替代疗法的便利性、安全性和功效。
发明概述
因此，本发明的一个方面为提供双链或单链胰岛素类似物的聚合物熔体，所述双链或单链胰岛素类似物具有足够的热学和热力学稳定性，以在包括一个或多个在温度范围90-120℃内的必须步骤的制造过程之后维持生物学活性。更具体地，本发明涉及用聚合物熔体包囊超稳胰岛素类似物，所述超稳胰岛素类似物由两个更稳定化的元件组成，其一为残基B4和A10之间额外的二硫键。第二个元件由选自以下的一个或多个元件组成：(a) A和B结构域之间缩短的连接(C)结构域；(b) α-螺旋C-CAP位置A8处的非β分支氨基酸置换；(c) A14处的非β分支酸性或极性侧链；(d) PheB24的芳香环在芳香侧链邻位的卤素修饰(6的环位置2；卤素选自氟、氯或溴)；和/或(e) LysB29被谷氨酸或具有中性脂肪族侧链的天然氨基酸(选自Ala、Val、Ile或Leu)或具有中性脂肪族侧链的非天然氨基酸侧链(氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸)置换。任选地，在双链或单链类似物中，残基B1或B2可从B链(或B结构域)删除，并且AsnA21还可任选被Asp、Ala、Gly或Ser置换。
本发明的类似物在位置B10处包含组氨酸，因此规避关于与在该位置酸性置换(天冬氨酸或谷氨酸)有关的致癌作用的关注。本发明的一个额外的方面为双链或单链胰岛素类似物对于IR-A和IR-B的绝对体外亲和力在相对于野生型人胰岛素5-150%的范围内，因此不太可能呈现显著延长的在激素-受体复合体中的滞留时间。
本发明因此预期胰岛素类似物在聚合物熔体中的包囊，所述胰岛素类似物由通过三个二硫键(天然桥B7-A7、B19-A20，经工程改造的桥B4-A10；以及另外A链内的胱氨酸A6-A11)连接的两个多肽链(指定为A和B)组成，包含一个或多个修饰(b-e)。或者，本发明的范围包括包含4个二硫键(B4-A10、B7-A7、B19-A20和A6-A11)和一种或多种修饰(a-e)的单链胰岛素类似物(SCI)的聚合物熔体包囊。SCI包含5-11个残基长的缩短的连接结构域，其N端两个残基包含至少一个酸性残基。本发明的聚合物熔体内包含的双链或单链胰岛素类似物可任选在A或B结构域中的其它位点包含标准或非标准的氨基酸置换。
位置B4和A10 (如在野生型双链胰岛素中所定义的)之间的第四个二硫键本身的可行性在本领域在活性SCI的背景中未知。在双链或单链类似物中，与另一个稳定化元件组合用于聚合物包囊的目的，包含这样的第四个二硫键的胰岛素类似物也未知。
非标准蛋白质包括治疗剂和疫苗的工程改造可能具有广泛的医学和社会益处。天然存在的蛋白质—一般如在人类、其它哺乳动物、脊椎动物有机体、非脊椎动物有机体或真核细胞的基因组中编码的—常常赋予多个生物学活性。非标准蛋白质的一个益处将为达到足够的热学和热力学稳定性以允许包囊在聚合物熔体内，而不损失生物学活性，其制造过程包括在温度范围90-120℃内的一个或多个步骤。社会益处的另一个实例将为使用这种包含胰岛素类似物的聚合物熔体以帮助转运、分配以及使用这种聚合物熔体，用于在具有糖尿病的人类患者或的其它哺乳动物，例如(但不限于)狗或猫中治疗糖尿病。包含胰岛素类似物的聚合物熔体可制造成施用于皮肤的微针贴片(microneedle patch)，以致微针的缓慢溶解提供皮下胰岛素给予持续至少1周的时期，并且任选持续多达1个月的时期的长期方法。或者，包含胰岛素类似物的聚合物熔体可制造成用于皮下注射的可注射可溶解的微丸；其在皮下空间的缓慢溶解将同样地提供胰岛素的缓慢释放贮库，持续至少1周并且任选多达1个月。
本发明的社会益处在电和冷藏不是一贯可用的发展中世界的地区将尤其显著。胰岛素和胰岛素类似物的液体和微晶制剂的物理降解造成的挑战在19世纪30年代首次认识到。该挑战的严重性在过去的十年受到非洲和亚洲未解决的糖尿病流行而加深。包含位置B4和A10之间的第四个二硫键组合至少一个其它稳定化元件的超稳双链胰岛素类似物或超稳SCI的聚合物包囊可提高胰岛素替代疗法在这种有挑战的地区的安全性和功效。
附图简述
图1A为人胰岛素原序列(SEQ ID NO: 1)的图示，包括A-和B-链以及连接区域，伴随侧接的二元切割位点(实心圆)和C-肽(开环)显示。
图1B为胰岛素原的结构模型，由胰岛素样部分和无序的连接肽(虚线)组成。
图1C为野生型人胰岛素A-链(SEQ ID NO:2)和B-链(SEQ ID NO:3)的序列的图示，标示二硫键的定位和B-链中残基B24的位置。
图2：通过第四个二硫键稳定化的SCI的3D模型。星号指示B4-A10二硫键。双链胰岛素类似物中相应的经工程改造的胱氨酸(即，在两个个体多肽链中位置B4和A10之间)可组合位置A8、A14、B24或B29处的至少一个额外的稳定化修饰。
图3A为包含修饰胰岛素(包括具有第四个二硫键的SCI)的蛋白质-聚合物共混物(共混物条)的小瓶的照片(拇指/手指在底部，用于比例)。
图3B为显示响应从图3A中显示的蛋白质-聚合物共混物回收的不包含第四个二硫键的SCI的大鼠的血糖水平的图。
图3C为显示响应从图3A中显示的蛋白质-聚合物共混物回收的包含第四个二硫键的修饰SCI的大鼠的血糖水平的图。
图4为显示在磷酸缓冲盐水(pH 7.4和37℃)中超稳单链类似物(SCI)从PLGA聚合物(50-50%)洗脱的图。横轴表示浸泡时间。纵轴表示胰岛素类似物(深灰色三角)或在包含鸡卵清溶菌酶 (浅灰色正方形)或无蛋白(深灰色菱形)的对照聚合物中相对Bradford-活性物质的纳克数。后者代表在Bradford测定中由于非蛋白质物质引起的背景信号。第10-15天的水平平台期代表无进一步的蛋白质从聚合物洗脱。样品用5% PEG (平均分子量8 kDa)制作以优化1-10天之间SCI洗脱的近似线性速率。部分物质的立即爆发释放未示出。
图5为显示对于具有(正方形；SEQ ID NO: 15)和不具有(灰色菱形；SEQ ID NO:16)第四个二硫键(残基B4和A10之间)的57mer SCI，在糖尿病雄性Lewis大鼠中皮下注射之后随时间的血糖水平的图。
发明详述
本发明涉及包含双链或单链胰岛素类似物的聚合物熔体的组合物，所述胰岛素类似物呈现显著的热学和热力学稳定性增加以致于其可经受在温度范围90-120℃内持续至少10分钟的聚合物熔解过程而(a)在哺乳动物的真皮内或在皮下空间内溶解聚合物时不损失生物学活性或(b)在体外在生理缓冲液或在稀酸溶液中在37℃在温和搅拌下孵育而溶解聚合物时不损失生物学活性。
本发明的一个特点为胰岛素类似物的等电点可(i)在范围3.0-6.0内以允许可溶解的制造中间体作为中性pH下的溶液或(ii)在范围6.5和8.0内，以致于可溶性制剂可在酸性条件(pH 3.0-5.5)下获得。当在体内从聚合物熔体释放时，后者的类似物将预期在皮下贮库经历等电沉淀，这是因为pH移动至几乎中性。这种沉淀可提高聚合物装置在一个或多个微针或微丸突然溶解或比基于母体聚合物熔体的整体性质所预期的更迅速地溶解出现时的安全性。
在一个实施方案中，聚合物可选自聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PLGA)、聚(己内酯)、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(羟丁酸)、壳聚糖、聚(癸二酸)、聚酸酐、聚膦腈、聚(原酸酯)、聚(乳酸-己内酯)共聚物、聚(羟丁酸酯-戊酸酯)及其混合物和共聚物。另外或备选地，致孔剂(porogen)例如聚乙二醇、NaCl和/或糖类可任选也存在以调节胰岛素从聚合物组合物释放的速率。
聚合物分子量可根据具体应用的需求和期需的胰岛素释放速率选择。在一个实施方案中，聚合物分子量，例如聚乙二醇的分子量，可具有小于200道尔顿、200-1000道尔顿、1000-4500道尔顿、4500-9000道尔顿、9000-15000道尔顿、15000道尔顿-25000道尔顿或大于25000道尔顿的平均分子量。在一个具体的实施方案中，可使用约8000道尔顿的PEG。
作为非限制性实例，预期单链或双链胰岛素类似物可用从动物胰岛素，例如猪、牛、马和犬胰岛素衍生的A-和B-链序列制造。另外或备选地，本发明的胰岛素类似物可包含残基B1、残基B1-B2或残基B1-B3缺失，或可与缺乏赖氨酸的变体B链组合以避免前体多肽在毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisciae)或其它酵母表达物种或菌株中在酵母生物合成中Lys-引导的蛋白水解。不希望受理论束缚，我们预期在位置A8处的非β分支置换将保护双链胰岛素类似物和SCI免于物理和化学降解二者，这是因为其在α螺旋内和/或在α螺旋的C端位置处更佳的性质。稳定化A8置换的实例由精氨酸、谷氨酸和组氨酸提供，但不限于此。不希望受理论束缚，我们预期位置A14处的带电的或极性的非β分支置换将保护双链胰岛素类似物和SCI免于物理和化学降解二者，这是因为其缓和与野生型人胰岛素中TyrA14的溶剂暴露有关的反向疏水作用。在规定的(proscribed)稳定化元件集合中，我们还预期PheB24环位置2处的卤素修饰(即邻F-PheB24、邻Cl-PheB24、邻Br-PheB24；意在提高热力学稳定性和对原纤维形成的抗性)提供免于化学降解和物理降解二者的分子机制。我们同样预期去除位置B29处天然存在的正电荷(如LysB29提供的)将递增性提高包含胱氨酸B4-A10的双链胰岛素类似物或包含胱氨酸B4-A10的SCI在提高的温度对原纤维形成的抗性。B29置换可为谷氨酸或中性脂肪族标准或非标准氨基酸。标准的中性脂肪族残基将选自Ala、Val、Ile或Leu；非标准的这种残基将选自氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸。
此外，鉴于人和动物胰岛素之间的相似性，和过去动物胰岛素在具有糖尿病的人类患者中的使用，还预期可引入胰岛素序列中的其它较小修饰，特别是认为“保守的”那些置换。例如，额外的氨基酸置换可在具有相似侧链的氨基酸组内进行，而不脱离本发明。这些包括中性疏水氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样，中性极性氨基酸可在其甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)的组内彼此置换。认为碱性氨基酸包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另外指出或从上下文在任何地方显而易见，本文所指的氨基酸应认为是L氨基酸。标准氨基酸也可被属于同一化学类别的非标准氨基酸置换。作为非限制性实例，碱性侧链Lys可被更短侧链长度的碱性氨基酸(鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)置换。Lys也可被中性脂肪族电子等排体正亮氨酸(Nle)置换，后者可继而被包含更短脂肪族侧链的类似物(氨基丁酸或氨基丙酸)置换。
举例来说，制备蛋白质-PG-LA聚合物共混物，其包含胰岛素赖脯胰岛素(lispro)(SEQ ID NOs: 2和13)，额外包含CysA10、CysB4置换的赖脯胰岛素(LysB28, ProB29-人胰岛素)类似物(SEQ ID NOs: 2和14)、59个氨基酸残基的SCI (SEQ ID NO: 9)和用CysA10、CysB4置换修饰以在残基B4和A10之间包含第四个二硫键的相应的59-mer SCI (SEQ ID NO: 10)。这些SCI包含序列EEGSRRSR的C结构域。A结构域在A8处修饰以包含精氨酸而非苏氨酸。B结构域经修饰以包含精氨酸而非赖氨酸以避免在酵母毕赤酵母中的蛋白酶消化。该SCI的等电点因此位于范围6.5-7.5的范围内但在pH范围2-4内容易溶解。其对胰岛素受体的A-和B-同种型的亲和力在相对于野生型人胰岛素的10-150%范围内，而其对1型IGF受体的亲和力为野生型胰岛素的1/10。该SCI的三维模型和预测的半胱氨酸B4-A10的位置在图2中示出。
上述三种聚合物共混物铸造成条(图3A)。聚合物在0.01%三氟乙酸中在20℃经2天溶解以评估功能激素的潜在回收。尽管未回收到活性赖脯胰岛素，但大鼠检验证明~40%的SCI回收(图3B)和包含第四个二硫键的功能性修饰SCI的基本完全回收(图3C)。该“超稳”胰岛素类似物对高温蛋白质-聚合物共混物挤压的稳健性特别有希望作为技术，从而为治疗糖尿病提供长期可溶解的治疗性聚合物共混物。应指出在该实例中利用呈现接近pH 7.4的等电点的单链胰岛素类似物。这表明可能利用其基础PK/PD性质作为未来的安全性机制：如果微针皮下破碎和迅速溶解，释放的类似物将会经历沉淀，避免急性低血糖症。
还检查了在磷酸缓冲盐水(PBS)中在pH7.4时胰岛素类似物蛋白从聚合物熔体的洗脱。测试圆柱状聚合物用包含25%重量比的通过残基B4和A10之间的第四个二硫键稳定化的单链胰岛素(SCI)类似物的50%-50% PLGA制备。该类似物(指定为4SS-81-06；SEQ ID NO:12)包含序列EEGPRR的6-残基接头、A结构域中的两个置换 (ThrA8被His置换和TyrA14被Glu置换)和B结构域中的一个置换(LysB29被Glu置换)。将混合的粉末加热至95℃，持续10分钟，然后使用专门的注射器挤出机通过冲压(force through)迅速挤压。挤出的聚合物圆柱体(1 mm直径和8 mm长；10 mg)使用包含0、5或10%聚乙二醇(PEG;平均分子量8 kDa)的PL、GA和SCI粉末混合物制备。为了检验游离PEG分子对SCI从聚合物释放的速率的作用，将圆柱体在pH 7.4和37℃下放置在磷酸缓冲盐水中并伴随温和振动，每日置换缓冲液。每日收集500μL溶液并用500 μL含有(0.1%)叠氮化钠的新鲜PBS置换。第0天的下午期间将聚合物放置在溶液中，之后大致每24小时收集样品。第0天的样品在聚合物浸入溶液后立即(<5分钟)收集。
PEG不存在时(0%)在10天的过程中少量蛋白质释放，而加入10% PEG导致在1-2天内大量释放。加入5% PEG导致大约一半的负载蛋白在10天的时期内几乎线性的释放(图4中三角形；胰岛素类似物浓度通过Bradford测定测量，通过ELISA校准)。相似的洗脱概况在包含鸡卵清溶菌酶代替胰岛素类似物的类似共聚物的对照研究中观察到(图4中正方形；任意单位)。在两种情况下在第10-15天均观察到水平平台期，表明无蛋白质从聚合物进一步释放。释放的蛋白质的累积量还在表1中提供。在该表中，Bradford测定所对应的胰岛素的微克数通过ELISA确认，而对于溶菌酶的读数未通过独立的测定校准。
表1
每日释放的蛋白质的累积量
天 A (纯净的- PLGA) B (溶菌酶 + 5%PEG) C (8106-4SS + 5%PEG)
0 0.0104 0.0432 0.024
1 -0.0071 0.135 0.1766
2 0.0036 0.2289 0.2504
3 0.0127 0.2759 0.2896
4 0.0213 0.3104 0.3184
5 0.0365 0.3383 0.3574
6 0.0546 0.3978 0.4316
7 0.0482 0.3987 0.455
8 0.0574 0.44 0.5197
9 0.0679 0.5212 0.6054
10 0.0809 0.6783 0.7418
11 0.0828 0.7366 0.7452
12 0.0795 0.7297 0.7185
13 0.0802 0.7556 0.7246
14 0.0802 0.7556 0.7246
15 0.0915 0.7718 0.7387
所释放的SCI激素类似物(在用5%PEG制备的聚合物熔体中)的生物学活性在糖尿病雄性Lewis大鼠(平均重量约300 g；用链脲佐菌素致使糖尿病，平均糖血400 mg/dL)中检验；将新鲜SCI的血糖降低活性与第1天和第5天后洗脱的蛋白质的活性相比。这三个样品的生物学活性无差别，证明热熔解挤压过程和在体温在生理学缓冲液中逐步释放与效能损失无关。
表2
胰岛素 对于第一个半小时每小时的△ SE 对于第一个小时每小时的△ SE 动物数目
C-1 (PLGA +25% 4SS-81-06 +5% PEG; 20 μg) -320.10 48.90 -315.11 6.96 2
C-5 (PLGA + 25% 4SS-81-06 +5% PEG; 5 μg) -312.60 22.20 -224.36 2.36 2
胰岛素 30 min时基线的百分比 SE 60 min时基线的百分比 SE 动物数目
C-1 (PLGA + 25% 4SS-81-06 +5% PEG; 20 μg) 0.6296 0.0504 0.2964 0.0014 2
C-5 (PLGA + 25% 4SS-81-06 +5% PEG; 5 μg) 0.950 0.005 0.814 0.043 2
比较57mer SCI (本文称为81-04；SEQ ID NO: 16)及其包含第四个二硫键的衍生物(4SS 81-04; SEQ ID NO: 15)的生物学活性。每300 g大鼠提供20 μg的剂量，生物学活性基本相同(参见图5)。81-04的序列与SEQ ID NO: 12相似，除了缺少CysA10、CysB4；此外，残基B28为天冬氨酸，残基B29为脯氨酸。这证明向单链胰岛素类似物分子内引入第四个二硫键不改变SCI的基础性生物学活性。考虑到现有技术，这是令人惊讶的，现有技术表明当引入第四个二硫键时在双链类似物中发生显著的药效反应延长。
还测定了类似物81-04和类似物4SS 81-04的受体结合亲和力。4SS 81-04对胰岛素受体A同种型的亲和力经测定为相对于人胰岛素120±20% (并且考虑到误差存在，实际上可能与野生型人胰岛素相同；数据未示出)。其对胰岛素受体B同种型的亲和力相对于野生型人胰岛素减少5-10倍。对A同种型的这种偏好与81-04母体类似物相似。此外，4SS 81-04对促有丝***的IGF I型受体(IGF-1R)的亲和力相对于野生型人胰岛素减少5-10倍(数据未示出)。根据长期使用的潜在致癌作用的视角，这种受损的对IGF-1R的结合为期需的。
本文所公开的多肽的序列如下提供。为了比较目的，人胰岛素原的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 1提供。
SEQ ID NO: 1 (人胰岛素原)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
人胰岛素的A链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 2提供。
SEQ ID NO: 2 (人A链)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
人胰岛素的B链的氨基酸序列作为SEQ ID NO: 3提供。
SEQ ID NO: 3 (人B链)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
本发明的单链胰岛素类似物的氨基酸序列在SEQ ID NO: 4中给出，其在位置B4和A10处包含第四个半胱氨酸，并对应于长度56、57、57、58、59、60、61和62的多肽，以致于SCI在一个或多个指示的位置包含至少一个其它的稳定化修饰。
SEQ ID NO: 4
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr-[缩短的C结构域]-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa3-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Xaa4-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa5
其中Xaa1指示Phe或Phe在邻或2-环位置被卤素原子(F、Cl或Br)修饰；Xaa2指示Glu、Ala、Ile、Leu、Val、正亮氨酸、氨基丙酸或氨基丁酸；其中Xaa3为His、Glu、Lys、Arg或另一种非β分支极性或带电氨基酸；其中Xaa4为Tyr (如在野生型胰岛素中)、Glu或另一种非β分支极性或带电氨基酸；和任选地其中Xaa5为Gly、Ala、Asp或Ser。加括号的术语“[缩短的C结构域]”标示在第一个(N端)或第二个肽位置(即，单链胰岛素类似物的残基31或32)包含酸性残基的5-11个残基长的连接肽结构域。任选地，PheB1可缺失以产生des-B1类似物或PheB1和ValB2二者均可省略以产生des-[B1, B2]类似物。
本发明的双链胰岛素类似物的氨基酸序列在SEQ ID NO 5-8中给出，对应于在位置B4处包含半胱氨酸的B链(SEQ ID NOS: 5, 7和8)和在位置A10处包含半胱氨酸的A链(SEQ ID NO: 6)以致于完整的胰岛素类似物包含位置B4和A10之间的第四个二硫键和在指定位置处的至少一个其它稳定化修饰。
SEQ ID NO: 5 (变体B链)：
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
其中Xaa1指示Phe或Phe在邻或2-环位置被卤素原子(F、Cl或Br)修饰；Xaa2指示Glu、Ala、Ile、Leu、Val、正亮氨酸、氨基丙酸或氨基丁酸；
SEQ ID NO: 6 (变体A链)：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa3-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Xaa4-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa5
其中Xaa3为His、Glu、Lys、Arg或另一种非β分支极性或带电氨基酸；其中Xaa4为Tyr(如在野生型胰岛素中)、Glu或另一种非β分支极性或带电氨基酸；和任选地其中Xaa5为Gly、Ala、Asp或Ser。
SEQ ID NO: 7 (变体des-[B1]-B链)：
Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
其中Xaa1指示Phe或Phe在邻或2-环位置被卤素原子(F、Cl或Br)修饰；Xaa2指示Glu、Ala、Ile、Leu、Val、正亮氨酸、氨基丙酸或氨基丁酸。
SEQ ID NO: 8 (变体des-[B1, B2]-B链)：
Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
其中Xaa1指示Phe或Phe在邻或2-环位置被卤素原子(F、Cl或Br)修饰；Xaa2指示Glu、Ala、Ile、Leu、Val、正亮氨酸、氨基丙酸或氨基丁酸。
单链胰岛素(SCI)类似物作为SEQ ID NOs: 9-12、15和16提供。
SEQ ID NO: 9
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Arg-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO: 10
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-Thr-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Arg-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO: 11
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr- Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO:12 (81-066-4SS)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu- Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO: 13 (人B链，KP)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
SEQ ID NO: 14 (人B链，Cys B4, KP)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
SEQ ID NO: 15 (4SS 81-04; 57mer)
Phe-Val-Asn-Cys-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Cys-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
SEQ ID NO: 16 (81-04; 57mer)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr- Asp-Pro-Thr-Glu-Glu-Gly-Pro-Arg-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-His-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Glu-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
基于前述公开内容，现在应显而易见的是，所提供的单链胰岛素类似物将实施上文所阐述的目标。即，这些胰岛素类似物呈现提高的对原纤维形成的抗性同时保留期需的药代动力学和药效学特征(赋予长效)并维持至少部分野生型胰岛素的生物学活性。因此应理解，可确定明显落入所要求的发明的范围内的任何变更以及因此，特定组分要素的选择而不脱离本文公开和描述的本发明的精神。
引用下列文献以证明本文所描述的检验和测定方法将被本领域普通技术人员所理解。
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权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种胰岛素组合物，包含胰岛素类似物和聚合物共混物，其中所述胰岛素类似物包含相对于野生型胰岛素在残基B4和A10所对应的位置处的半胱氨酸置换，胰岛素类似物的A和B结构域之间5-11个氨基酸的连接结构域，以及选自以下的一个或多个额外的置换：
(a) 野生型胰岛素的位置A8所对应的位置处的非β分支氨基酸置换；
(b) 野生型胰岛素的位置A14所对应的位置处的非β分支酸性或极性侧链；
(c) 野生型胰岛素的位置B24所对应的位置处的Phe的芳环在芳香侧链的邻位的卤素修饰；和
(d) 野生型胰岛素的位置B29所对应的位置处的赖氨酸被谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸置换；
其中胰岛素类似物与包括在温度范围90-120℃内的一个或多个步骤的制造过程相容。
2. 权利要求1的胰岛素组合物，其中所述聚合物由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PL-GA)构成。
3. 权利要求2的胰岛素组合物，其中所述聚合物由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PL-GA)构成，以致于PL的百分比在25-75%之间。
4. 权利要求3的胰岛素组合物，其中所述聚合物由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PL-GA)构成，以致于PL的百分比为50%。
5.权利要求2的胰岛素组合物，额外地包含聚乙二醇。
6. 权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物为单链胰岛素类似物，其包含以下的至少一种：
在野生型胰岛素的位置A8所对应的位置处的丙氨酸、组氨酸、谷氨酸或精氨酸置换，和
在野生型胰岛素的位置A14所对应的位置处的丙氨酸、谷氨酸或精氨酸置换。
7.权利要求6的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物在连接肽的前两个位置的至少一个处包含谷氨酸。
8. 权利要求7的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物具有选自SEQ ID NOs: 10、12和15的序列。
9. 权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物包含SEQ ID NO:5。
10. 权利要求9的胰岛素组合物，额外地包含SEQ ID NO: 6。
11.权利要求10的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物为双链胰岛素类似物。
12.权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中将胰岛素组合物制造成用于局部施用的微针贴片。
13.权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中将胰岛素组合物制造成用于皮下注射的微珠悬液。
14.用于在人类患者或哺乳动物中治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予包含胰岛素类似物和聚合物共混物的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物包含相对于野生型胰岛素，残基B4和A10所对应的位置处的半胱氨酸置换，胰岛素类似物的A和B结构域之间5-11个氨基酸的连接结构域，以及选自以下的一个或多个额外的置换：
(a) 野生型胰岛素的位置A8所对应的位置处的非β分支氨基酸置换；
(b) 野生型胰岛素的位置A14所对应的位置处的非β分支酸性或极性侧链；
(c) 野生型胰岛素的位置B24所对应的位置处的Phe的芳环在芳香侧链的邻位的卤素修饰；和
(d) 野生型胰岛素的位置B29所对应的位置处的赖氨酸被谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸置换；
其中胰岛素类似物与包括在温度范围90-120℃内的一个或多个步骤的制造过程相容。
15.权利要求14的方法，其中胰岛素组合物通过连接至皮肤的装置给予。
16.权利要求14的方法，其中胰岛素组合物通过皮下注射给予。
17.权利要求1-5中任一项的胰岛素类似物，其用作药物。
18.权利要求1-5中任一项的胰岛素类似物用于制造用于治疗糖尿病的药物的用途。
19.权利要求1-5中任一项的胰岛素类似物，其用于治疗糖尿病。

Claims (19)

1.一种胰岛素组合物，包含胰岛素类似物和聚合物共混物，其中所述胰岛素类似物包含相对于野生型胰岛素在残基B4和A10所对应的位置处的半胱氨酸置换，以及选自以下的一个或多个额外的置换：
(a) 胰岛素类似物的A和B结构域之间5-11个氨基酸的连接结构域；
(b) 野生型胰岛素的位置A8所对应的位置处的非β分支氨基酸置换；
(c) 野生型胰岛素的位置A14所对应的位置处的非β分支酸性或极性侧链；
(d) 野生型胰岛素的位置B24所对应的位置处的Phe的芳环在芳香侧链的邻位的卤素修饰；和
(e) 野生型胰岛素的位置B29所对应的位置处的赖氨酸被精氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸置换；
其中胰岛素类似物与包括在温度范围90-120℃内的一个或多个步骤的制造过程相容。
2. 权利要求1的胰岛素组合物，其中所述聚合物由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PL-GA)构成。
3. 权利要求2的胰岛素组合物，其中所述聚合物由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PL-GA)构成，以致于PL的百分比在25-75%之间。
4. 权利要求3的胰岛素组合物，其中所述聚合物由聚(乳酸-乙醇酸)共聚物 (PL-GA)构成，以致于PL的百分比为50%。
5.权利要求2的胰岛素组合物，额外地包含聚乙二醇。
6. 权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物为单链胰岛素类似物，其包含以下的至少一种：
在野生型胰岛素的位置A8所对应的位置处的丙氨酸、组氨酸、谷氨酸或精氨酸置换，和
在野生型胰岛素的位置A14所对应的位置处的丙氨酸、谷氨酸或精氨酸置换。
7.权利要求6的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物在连接结构域(C结构域)的前两个位置的至少一个处包含谷氨酸。
8. 权利要求7的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物具有选自SEQ ID NOs: 10、12和15的序列。
9. 权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物包含SEQ ID NO:5。
10. 权利要求9的胰岛素组合物，额外地包含SEQ ID NO: 6。
11.权利要求10的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物为双链胰岛素类似物。
12.权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中将胰岛素组合物制造成用于局部施用的微针贴片。
13.权利要求1-5中任一项的胰岛素组合物，其中将胰岛素组合物制造成用于皮下注射的微珠悬液。
14.用于在人类患者或哺乳动物中治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予包含胰岛素类似物和聚合物共混物的胰岛素组合物，其中所述胰岛素类似物包含相对于野生型胰岛素，残基B4和A10所对应的位置处的半胱氨酸置换，以及选自以下的一个或多个额外的置换：
(a) 胰岛素类似物的A和B结构域之间5-11个氨基酸的连接结构域；
(b) 野生型胰岛素的位置A8所对应的位置处的非β分支氨基酸置换；
(c) 野生型胰岛素的位置A14所对应的位置处的非β分支酸性或极性侧链；
(d) 野生型胰岛素的位置B24所对应的位置处的Phe的芳环在芳香侧链的邻位的卤素修饰；和
(e) 野生型胰岛素的位置B29所对应的位置处的赖氨酸被精氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、氨基丙酸、氨基丁酸或正亮氨酸置换；
其中胰岛素类似物与包括在温度范围90-120℃内的一个或多个步骤的制造过程相容。
15.权利要求14的方法，其中胰岛素组合物通过连接至皮肤的装置给予。
16.权利要求14的方法，其中胰岛素组合物通过皮下注射或植入给予。
17.权利要求1-5中任一项的胰岛素类似物，其用作药物。
18.权利要求1-5中任一项的胰岛素类似物用于制造用于在人类患者或其它哺乳动物中治疗糖尿病的药物的用途。
19.权利要求1-5中任一项的胰岛素类似物，其用于治疗糖尿病。
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