CN204287198U - 全程c-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,包括底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素和吸水垫;所述试纸条由样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素、吸水垫依次搭接粘贴在底板上构成。所述荧光标记物结合垫含有链霉亲和素标记荧光蛋白和生物素标记的全程C-反应蛋白单克隆抗体;所述硝酸纤维膜上有检测线和质控线,检测线被全程C-反应蛋白单克隆抗体,其与上述生物素标记的全程C-反应蛋白单克隆抗体具有不同的识别表位。本实用新型与目前常见的检测全程C-反应蛋白的方法相比(如:化学发光法/免疫增强比浊法/胶体金法),不仅大大缩短了检测时间,同时还提高了检测灵敏度。
Description
技术领域
本实用新型属于免疫检测领域,具体涉及一种高灵敏度全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条。
背景技术
人类C反应蛋白(CRP)是在感染和组织损伤时血浆浓度快速,急剧升高的主要的急性期蛋白。C-反应蛋白可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用,从而清除入侵机体的病原微生物和损伤,坏死,凋亡的组织细胞,在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于C-反应蛋白的研究已经有70多年的历史,传统观点认为C-反应蛋白是一种非特异的炎症标志物,但近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病,并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。
C-反应蛋白的检测在八十年代以前作为炎症和组织损伤的非特异性标志物大量应用于临床。但由于过去C-反应蛋白的检测方法较为落后,假阳性和假阴性很高,影响了它在临床上的价值,而逐渐被临床所忽视。近年来,由于检测技术的更新,测定C-反应蛋白的快速、简便和可靠的方法已迅速建立,使C-反应蛋白在临床应用领域大大增加。
目前检测C-反应蛋白的常用方法有:
1单向免疫扩散法(简称单扩法)
单扩法是一种经典的抗原抗体沉淀试验,其基本原理是在琼脂胶中混入一定量的抗体,使待测抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散,在沉淀区域内形成可见的沉淀环,沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关。单扩法作为简易抗原定量的方法有特异性高,重复性好,操作简单,价格低廉,不需要特殊仪器检测等优点。因而,在一些中小型医院应用得较多。但此法最大的缺点是在抗原过量时,反应体系不出现沉淀,CRP浓度过高时,会出现较高的假阴性。因此,用单向免疫扩散法检测CRP未出现沉淀环时,必须稀释标本后复检,以避免漏诊。此外,由于该法的敏感性较差,制约了其临床上的广泛应用。
2胶乳凝集法
胶乳凝集法是临床较常用的血清学方法,属于间接的凝集试验。胶乳试剂用纯化的抗人CRP抗体致敏,能和病人血清中CRP发生特异性反应,数分钟内呈现清晰的凝集颗粒,出现凝集者为阳性,未出现凝集者为阴性。此方法操作简单、快速,敏感性、特异性较高。但易受补体、类风湿因子(RF)等因素的干扰,产生假阳性结果。因此,为了提高结果的准确性,检测时应对待测标本进行预处理,以去除干扰因素。
3速率散射比浊法
速率散射比浊法是Sternberg 1977年创建的微量免疫沉淀法,是以测定溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射,碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射,散射强度与 抗原抗体免疫复合物的含量成正比。
此法是一种抗原抗体结合反应的动态测定法,可快速、准确地测量样品中抗原的含量,并且可在多种自动化检测仪上测定结果。目前应用较广泛的自动化仪器是Backman-Coulter公司生产的全自动蛋白分析仪。速率散射比浊法在临床上已作为CRP常规检测手段。有研究显示:速率散射比浊法在检测时间、操作方法、结果精确度、重复性、灵敏度方面均优于单扩法。在灵敏度、准确度上与胶乳凝集法相比也具有显著性差异(P<0.05),明显高于胶乳凝集法。
4免疫透射比浊法
免疫透射比浊法是实验室常用检测CRP的方法,目前许多厂家也都用此法,英科新创(厦门)科技有限公司的CRP就是该法。免疫透射比浊法也是一种微量的免疫沉淀测定法。其与速率散射比浊法不同的是以测定透过溶液的光量来反映待测抗原的含量。当光线透过反应体系时,溶液中的抗原抗体免疫复合物可对光线加以吸收和反射,使透射光减少。免疫复合物越多,吸收的光线越多,透射光越少,这种变化可用吸光度表示。若抗体量固定,所测吸光度与免疫复合物的量成正比,也与待测抗原的量成正比。以一系列已知浓度的抗原标准品作对照,即可以测出受检物含量。
5胶乳增强免疫透射比浊法
在上述的比浊法中,检测CRP的敏感性方面仍不够理想。这就需要建立更敏感、更精确、在血清CRP浓度较低的情况下仍具有较 高准确度的检测CRP方法。于是人们对检测方法进行了改进和更新,创立了胶乳增强免疫透射比浊法。
胶乳增强免疫透射比浊法基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上,当遇到相应的抗原时,抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内,光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集时,可阻碍光线透过,使透射光减少,其减少程度与胶乳凝集的程度成正比,亦与抗原量成正比。此方法是测定高敏C-反应蛋白(Hs-CRP)一种新型的高敏检测方法,具有快速、方便、准确等优点。
6免疫标记技术
免疫标记技术用于CRP测定的免疫标记方法有放射免疫法、酶免疫法、金标免疫法、荧光标记免疫法等。由于放射免疫法存在放射性同位素半衰期短,放射性污染不易保存,稳定性差等缺点,使用中有诸多不便,尤其是酶免疫法的广泛应用,使该方法现在临床上已很少采用。目前,临床应用较多方法是以酶联免疫吸附试验(ELISA)为主的酶免疫标记技术。该方法是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来,根据酶作用底物后颜色变化,通过酶标仪对检测样品进行定量测定和分析,并用标准曲线对照计算出CRP含量。ELISA法具有高度的敏感性、特异性,而且它的试剂比较稳定,无放射性污染。尤其是商品试剂盒和自动化酶标仪的应用,使其成为适用于各级检验部门的检测手段。同时,也是测定患者血清Hs-CRP常用的方法之一。
用金标法及荧光标记免疫层析法进行定量CRP的检测,在检测灵敏度及测试快捷性方面得到比较好的统一。优点是检测标本用量少,检测快速,可与血常规一起检测,特异性高,在临床检测中也显示出良好的应用前景。目前国产产品以及韩国、加拿大进口产品已经在国内有了一定的应用。
生物素-亲和素***(biotinavidin system,BAS),是一种新型生物反应放大***。随着各种生物素衍生物的问世,BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该***应用于免疫组化,酶联免疫,荧光免疫,放射免疫等检测技术中,可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性,使方法更简便,有助于临床快速诊断,并利于进行大规模流行病学调查,成为研究免疫反应的有力工具。由于BAS检测***经济快速,又无放射物质污染,不需复杂仪器,充分显示了此***的巨大潜力和应用的可能性。
生物素-亲和素***检测原理:BAS是在常规ELISA原理的基础上,结合生物素与亲和素间的高度放大作用,而建立的一种检测***。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,分子量为68kDa,由4个亚单位组成,对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质,链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能 结合一个生物素,因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。利用生物素-亲和素***研制降钙素原检测试快速诊断试剂尚无报道。
实用新型内容
本实用新型的目的,在于提供一种全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大***,提供高灵敏度全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条。使用本实用新型时,提高了检测灵敏度和检测稳定性,降低了非特异性结合,检测时间不大于10分钟,大大提高了诊断效率。
本实用新型解决其技术问题的解决方案是:全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其包括底板,所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区,所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上,所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的全程C-反应蛋白单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白;所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别全程C-反应蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
作为上述技术方案的进一步改进,所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫,所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方,所述第二荧光标记物结合垫 交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
作为上述技术方案的进一步改进,所述第一荧光标记物结合垫中***样品垫下方的一端设有定位条,所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
作为上述技术方案的进一步改进,还包括卡壳,所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内,所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗,卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
作为上述技术方案的进一步改进,所述观察窗为长方形孔。
作为上述技术方案的进一步改进,所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
作为上述技术方案的进一步改进,所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
作为上述技术方案的进一步改进,所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
作为上述技术方案的进一步改进,所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳,所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
本实用新型与现有技术相比,具有如下优点:
(1)本实用新型将荧光蛋白作为标记物,此标记物稳定性良好,有利于提高检测稳定性。
(2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大***”,提高检测灵敏度,降低非特异性结合,有利于提高试剂盒性能。
(3)利用本实用新型进行降钙素原的检测时间不大于10分钟,检测线性范围为0.10ng/ml~100.00ng/ml,极大地提高了检测效率。
(4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读,可实现自动化,减少主观因素的影响,提供便利、快速、可靠的诊断结果。
(5)本使用新型卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗,根据分析仪器判定结果,准确可靠。
(6)本实用新型制作方便,体积小、便于携带。
(7)本实用新型检测成本较低。
(8)本实用新型可批量生产,适用于临床快速诊断和现场快速诊断;易于保存,有利于基层单位推广。
附图说明
为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然,所描述的附图只是本实用新型的一部分实施例,而不是全部实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
图1是本实用新型实施例一的结构示意图;
图2是本实用新型实施例二的结构示意图;
图3是本实用新型实施例三的结构示意图;
图4是本实用新型实施例四的结构示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本实用新型的构思、具体结构及产生 的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本实用新型的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本实用新型的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本实用新型的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本实用新型保护的范围。另外,文中所提到的所有联接/连接关系,并非单指构件直接相接,而是指可根据具体实施情况,通过添加或减少联接辅件,来组成更优的联接结构。
参照图1,全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其包括底板5,所述底板5上依次设有样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4,所述吸水垫4和荧光标记物结合垫2分别交叠压在硝酸纤维素膜3的两端后在硝酸纤维素膜3的表面形成检测区,荧光标记物结合垫2为玻璃纤维膜,所述样品垫1交叠压在荧光标记物结合垫2上,所述荧光标记物结合垫2上固定有生物素标记的全程C-反应蛋白单克隆抗体(浓度0.3~1.5mg/mL)和链霉亲和素标记(或亲和素)的荧光蛋白(使用激发光波长530nm,发射光波长570nm,浓度0.1~1.0mg/mL);所述检测区内的硝酸纤维素膜3上固定有识别全程C-反应蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线T(浓度0.5~3mg/mL)和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线C(浓度0.2~2.0mg/mL),质控线C用于检测试纸条的有效性。
将生物素标记的C-反应蛋白单克隆抗体和链霉亲和素(或亲和素)标记的荧光蛋白固定在荧光标记物结合垫2上,将有识别C-反应蛋白另外一个表位的单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于 硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C。当待测样品加到样品垫1上后,通过层析作用向前移动,样品中C-反应蛋白与荧光标记物结合垫2上结合荧光标记物(荧光蛋白)的C-反应蛋白抗体(Mab-CRP*Fluoro)反应形成复合物CRP-Mab-CRP*Fluoro,在层析作用下反应复合物继续向前移动经过硝酸纤维膜上包被的CRP抗体(检测线)时,反应复合物被包被的CRP抗体捕获形成复合物(Mab-CRP-CRP-Mab-CRP*Fluoro)(检测线),通过荧光免疫分析仪读取检测线的反应信号,在激发光源的作用下,荧光物质发射特定波长的荧光信号,荧光免疫分析仪俘获荧光信号,通过信号转化及设定的标准曲线自动转化为定量数值,计算出样本中C-反应蛋白的浓度,得到C-反应蛋白检测结果。
作为上述技术方案的进一步改进,参照图3,所述荧光标记物结合垫2包括层叠的第一荧光标记物结合垫20和第二荧光标记物结合垫21,所述第一荧光标记物结合垫20的一端垫在样品垫1的下方,所述第二荧光标记物结合垫21交叠压在硝酸纤维素膜3的一端。荧光标记物结合垫2的分层设置,便于将荧光标记物结合垫2安装在样品垫1和硝酸纤维素膜3之间。
作为上述技术方案的进一步改进,参照图3所述第一荧光标记物结合垫20中***样品垫下方的一端设有定位条22,所述样品垫1的下端面设有能容纳定位条22的定位槽。通过定位条22便于荧光标记物结合垫2和样品垫1之间的安装固定。
作为上述技术方案的进一步改进,参照图2和图4,还包括卡壳, 所述底板5、样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4均置于卡壳6内,所述卡壳6壳面上对应于硝酸纤维膜3的位置设有观察窗8,卡壳6壳面上对应于样品垫1的位置设有加样孔7。
作为上述技术方案的进一步改进,所述观察窗8为长方形孔。
作为上述技术方案的进一步改进,所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
作为上述技术方案的进一步改进,所述样品垫1为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。样品垫由玻璃纤维构成,经表面活性剂缓冲液浸泡处理,干燥后使用。所述样品垫1的裁剪宽度为0.3~0.5cm。
作为上述技术方案的进一步改进,所述底板5为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
作为上述技术方案的进一步改进,所述卡壳6包括塑料上壳60和塑料下壳61,所述塑料上壳61扣合塑料下壳61上后形成卡壳6。
以上是对本实用新型的较佳实施方式进行了具体说明,但本发明创造并不限于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (9)
1.全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:其包括底板,所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区,所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上,所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的全程C-反应蛋白单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白;所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别全程C-反应蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
2.根据权利要求1所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫,所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方,所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
3.根据权利要求2所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述第一荧光标记物结合垫中***样品垫下方的一端设有定位条,所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
4.根据权利要求1至3任一项所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:还包括卡壳,所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内,所述 卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗,卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
5.根据权利要求4所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述观察窗为长方形孔。
6.根据权利要求4所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
7.根据权利要求4所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
8.根据权利要求4所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
9.根据权利要求4所述的全程C-反应蛋白免疫层析定量检测试纸条,其特征在于:所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳,所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
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