CN208443851U - 用于检测猫血清淀粉样蛋白a的免疫荧光层析检测卡 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡;旨在提供一种灵敏度高,检测结果可靠的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡;其技术要点包括底板,在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY,所述的硝酸纤维膜设有一条包被SAA单克隆抗体的检测T线,以及一条包被鸡IgY的质控C线;属于动物疫病检测领域。
Description
技术领域
本实用新型公开了一种免疫荧光层析检测卡,具体地说,是一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(SAA)是存在于许多物种中的一种主要的急相蛋白,包括人、犬、猫和马等。一旦机体受到感染、创伤及外科手术等引起炎症刺激后,SAA的浓度会在数小时内迅速升高;同时SAA半衰期非常短,随着炎症源的清除,SAA的浓度水平又会迅速下降。
SAA的基因序列在脊椎动物中高度保守。人SAA含有104个氨基酸。而猫的SAA 相当于在人的SAA分子中间区域***了额外的111个氨基酸序列。
SAA是一种灵敏的炎症和组织损伤标志物。在兽医学中,测定血液中的SAA可以用于诊断亚临床炎症、监控动物炎症和感染的治疗效果以及监控病患外科手术进程。
现有的SAA检测方法主要是酶联免疫法,由于酶联免疫测定周期长,不能在自动生化分析仪上使用,不适合急诊的快速检测,是SAA检测试剂盒普及的弊端,而胶乳增强免疫比浊法操作简单,经济,可以在绝大多数医院的自动生化分析仪上使用,特别是急诊能实现快速定量检测,其基本原理是:将抗体包被在胶乳颗粒上,与相应抗原发生免疫反应后,形成聚集颗粒,在一定波长下,通过测定聚集物所产生的浊度,即可测出标本中被检物含量。
中国专利ZL 201210575603.5一种快速定量检测血清淀粉样蛋白A试剂盒,所述试剂盒包括由SAA单抗包被于胶体金制成的冻干抗SAA免疫胶体金、反应板、样品稀释液、冻干胶体金复溶液、洗涤液和封闭液;所述反应板为胶体金检测板,反应板上的硝基纤维膜由针对另一反应决定簇的另一纯化SAA单抗或多抗包被;但是该方法采用免疫渗滤法,需要溶解抗SAA金标液冻干品并稀释、稀释样本、滴加封闭液、渗入、滴加稀释好的抗SAA金标液、加洗涤液、最后检测等一系列步骤,非常繁琐费时,不利于疾病早期快速诊断与治疗。另外该专利采用胶体金作为示踪物,免疫标记物依靠静电吸附,存在灵敏度较低、难以定量、重复性和稳定性较差等缺陷,无法完全满足临床的检测需求。
中国专利ZL201510497125.4公开了一种人血清淀粉样蛋白A检测试剂盒,所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述的试剂R1为适当的缓冲液;所述的试剂R2是用人血清淀粉样蛋白A抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、置于适当的缓冲液中组成,但是该方法使用到两种缓冲液,液体需要冷藏,检测时需要采用日立7080型等自动生化分析仪,体积比较庞大,不合适现场检测,不能对进行进行尽早的诊断与治疗。
中国专利ZL201511020151.4公开了一种血清淀粉样蛋白A的荧光免疫层析检测试剂盒,包括试剂盒体以及稀释液瓶,所述试剂盒体包括免疫层析检测卡,所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸,所述样品垫搭接在探针固定垫上,所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧,所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线,所述检测线内包被有血清淀粉样蛋白 A单克隆抗体,所述控制线内包被有羊抗兔IgG;所述探针固定垫由血清淀粉样蛋白A 单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒组成的混合荧光胶乳微粒干燥制得;但是该方法存在下述缺点:荧光乳胶微粒需要先与白蛋白进行偶联,然后再与血清淀粉样蛋白A单克隆抗体进行偶联,虽然可以减少检测过程中双夹心结构的空间阻力,同时也增加了偶联的步骤,可能影响检测的重复性。
实用新型内容
针对上述问题,本实用新型的目的是提供一种灵敏度高、重复性好、定量准确的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡。
为此,本申请提供的技术方案是这样的:
一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,包括壳体,所述的壳体内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,所述用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板,在底板上依次衔接有样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫,所述结合垫上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡IgY,所述的硝酸纤维膜设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。
进一步的,上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,还包括盒体,所述盒体内设有样品稀释瓶和用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡。
进一步的,上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述盒体内还设有吸管。
进一步的,上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述的壳体上设有与样品垫相适配的加样孔,与结合垫相适配的观察窗口。
进一步的,上述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述的壳体上表面还设有防滑条。
与现有技术相比,本实用新型提供的技术方案具有如下优点:
1、本实用新型操作步骤简单,对样品预处理方法进行优化,只需要用采集猫血清,稀释后加入到检测卡的加样孔中即可检测,检测速度快,10分钟出结果,结果即可定性观察又可定量测定,大大降低检测成本,减少工作量。
2、本申请提供的技术方案,通过对样品垫处理液和标记荧光微球稀释液的优化,相比传统工艺,灵敏度明显高,最低检测限(LOD)可达到1.55mg/L(原工艺3.26mg/L),线性更好,剂量-反应曲线的决定系数由0.9953提升到0.9996;重复性好,低中高三个水平质控变异系数均低于10%(8.52%、7.95%和5.63%)。
3、本申请提供的技术方案对结合垫、硝酸纤维膜制备过程严格考究、优化,进一步提高了检测卡的精密度与可靠性。
附图说明
图1是本实用新型提供的检测试纸卡结构示意图;
图2是本实用新型提供的检测试纸条结构示意图;
图3是本实用新型提供的另一种检测试纸卡结构示意图;
图4是本实用新型提供的检测卡判定结果为阳性时示意图;
图5是本实用新型提供的检测卡判定结果为阴性示意图;
图6是本实用新型本实用新型提供的检测卡判定结果为无效时一种示意图;
图7是本实用新型本实用新型提供的检测卡判定结果为无效时另一种示意图;
图8是本申请提供的病毒抗原浓度检测的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式,对本发明的权利要求作进一步的详细说明。
实施例1
本发明提供的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,参阅图1至图2,包括壳体7,所述的壳体7内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,所述用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板1,在底板1 上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体31和荧光微球标记的羊抗鸡IgY32,所述的硝酸纤维膜4 设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72,与结合垫3相适配的观察窗口71,所述的壳体7上表面还设有防滑条73,方便试剂卡的取出与放入。
实施例2
本申请提供的另一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,参阅图1 至图3,包括盒体9,所述的体9内设有样品稀释液瓶6,吸管8以及用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,所述的用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡位于壳体7内,所述用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板1,在底板1上依次衔接有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维膜4和吸水垫5,所述结合垫3上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体31和荧光微球标记的羊抗鸡IgY32,所述的硝酸纤维膜4设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被SAA单克隆抗体的检测 T线。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔72,与结合垫3相适配的观察窗口71,所述的壳体7上表面还设有防滑条73,方便试剂卡的取出与放入。
更为具体的说,所述的样品稀释液瓶中样品稀释液为含1%S9、1%SDS、0.1%Triton X-100的0.1M pH7.8的Tris-盐酸缓冲液。
实施例3
实施例1或者2中提供的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡的制备方法,在温度(18~26)℃、湿度≤30%的环境下进行装配,在底板1上依次衔接有硝酸纤维膜4、吸水垫5、结合垫3和样品垫2;将粘贴好的大板切成4.0mm宽的试纸条,装入塑料卡壳7内,即SAA检测卡;将每一检测卡置于铝膜袋中,加入干燥剂1包,热合封口备用。
具体地说:
1.1结合垫的制备
1.1.1 SAA单克隆抗体的标记
1)稀释荧光微球:取一离心管,加入1ml标记缓冲液0.1M MES(2-(N-***啉) 乙磺酸)缓冲液,加入荧光微球1mg,涡旋混匀;所述的微球采用含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球;密度:1.05g/cm3;折射率:1.59@589nm,25℃;直径300nm;功能基团:羧基;外观:白色。
2)微球的活化:在步骤1)离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B,旋转培养器上反应30min;
所述的标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES 缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸);所述标记活化剂B为含50mg/mL1-(3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸)。
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球20000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入5000μl淬灭剂,超声2s;所述的淬灭剂为含0.25%甲醇的0.1M的MES缓冲液;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入20-200μg SAA单克隆抗体,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入2ml标记封闭液,超声2s,间歇5s,重复3次,超声完成后置于旋转培养器上反应30min;所述的标记封闭液为含0.1%人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入2ml标记荧光微球稀释液,超声,工作2S,间歇5S,重复3次。所述的荧光微球稀释液含1%人血清白蛋白、3%蔗糖的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液。
1.1.2质控C线抗体的标记
1)稀释微球:取一离心管,加入1ml的标记缓冲液0.1M MES缓冲液,取荧光微球1.0mg,涡旋混匀;所述的微球为含有稀土铕元素的荧光错配物的聚苯乙烯微球;密度:1.05g/cm3;折射率:1.59@589nm,25℃;直径300nm;功能基团:羧基;外观:白色。
2)微球的活化:在上述离心管中加入20μl-50μl标记活化剂A和20μl-50μl标记活化剂B,旋转培养器上反应30min;
所述的标记活化剂A为含50mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的0.05M的MES 缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸);所述标记活化剂B为含50mg/mL1-(3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的0.05M MES缓冲液(2-(N-***啉)乙磺酸)。
3)活化淬灭:将活化后的荧光微球19000g离心30min,弃上清,留取沉淀,加入 2ml淬灭剂,90W超声,工作2s,间歇5s,重复1次;所述的淬灭剂为含0.25%甲醇的 0.1M的MES缓冲液;
4)抗体的标记:在超声重悬后的荧光微球中加入100μg羊抗鸡IgY,涡旋混匀,置于旋转培养器上反应30min;
5)封闭:加入500μl标记封闭液,封闭30min;所述的标记封闭液为含0.1%人血清白蛋白的0.2M甘氨酸缓冲液;
6)纯化:完成上述反应后,19000g离心30min,吸去上清,留取沉淀,加入2ml标记荧光微球稀释液,90W超声,工作2s,间歇5s,重复3次,所述的荧光微球稀释液含 1%人血清白蛋白、3%蔗糖的pH9.0 0.1M的甘氨酸缓冲液。
1.1.3喷膜
1)将璃纤维裁切为(10±1)mm×(300±10)mm大小为结合垫;
2)将标记后的T、C线抗体按20:1(V:V)混合均匀,90W超声,工作2s,间歇 5s,重复3次;
3)按3.5μl/cm、0.02MPa喷至剪裁后的结合垫上;
4)喷完后,37℃干燥箱中干燥过夜(16~18)h。
1.2反应膜的制备
1)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将鸡IgY稀释到1mg/mL,即为C线工作液。
2)用含3%蔗糖的pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)将另一株SAA单克隆抗体稀释到1mg/mL,即为T线工作液。
3)取PVC底板,粘贴硝酸纤维膜。
4)在硝酸纤维膜上划T线和C线,划线浓度均为1μL/cm。
5)完成后将片材放置在37℃干燥箱中干燥过夜(16~18)h。
1.3样品垫制备
1)配制样品垫处理液:含0.1%人血清白蛋白、0.5%牛IgG、2%聚乙二醇4000、0.3%Triton X-100、4%氯化钠和0.05%Prolin 300的0.2M pH9.0硼酸盐缓冲液。
2)以10μl/cm的浓度将缓冲液喷涂于玻璃纤维上。
检测方法
为了便于使用本申请提供的检测卡,下面给出本申请提供的检测卡提供两种检测方法。
方法一:采用紫外灯照射,结果参阅图4至图7:用手持式紫外线灯照射观察窗口,当质控线和检测线都有量荧光出现时(图4),说明样品中SAA抗原为阳性;当只有质控线有荧光而检测线无荧光出现时(图5),说明样品中SAA抗原为阴性;质控线未出现荧光(图6、图7),则代表操作有误或检测结果无效,需重复试验。
方法二:本申请实施例3制备的免疫荧光检测仪检测结果:
1)收集猫血清;
2)取10μl加入含有1.0ml样品稀释液(含1%S9、1%SDS、0.1%Triton X-100的0.1M pH7.8的Tris-盐酸缓冲液)的样品管中,充分混匀;
3)取出检测卡,打开干式免疫荧光检测仪;
4)吸取稀释后的样本75μl,加入到检测卡的加样孔中,将检测卡放入到仪器的卡槽中,开始计时;
5)10min后,点击仪器上的“测试”按键,仪器将开始测试;
6)荧光强度与样品中的SAA浓度成正比,通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算,剂量反应曲线Log(Y)=0.6706Log(X)–0.5366,R=0.9996(R2=0.9998),参阅图3。
免疫荧光检测仪检测结果:
1、线性范围
1.1.1将SAA校准品用阴性血清分别稀释到0mg/L、5mg/L、8mg/L、12mg/L、20 mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、 700mg/L和800mg/L;
1.1.2将以上各浓度样本分别取75μL,加入至制备好的猫SAA检测试剂中,每浓度重复测试2次;
1.1.3反应10min后,将试纸放入干式免疫荧光分析仪中,读取T/C值,通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。
1.1.4测试结果显示:试剂在检测5~300mg/L的SAA线性拟合关系较好,r>0.9900,当SAA浓度增加到400mg/L时,线性拟合r值小于0.9900,T/C增长减缓,SAA在400~500mg/L时T/C值平缓,SAA达到800mg/L时,T/C值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到400mg/L。
2、最低检出限
将阴性血清,重复测试20次,计算T/C均值,将其代入剂量-反应曲线中,得出本方法的最低检出限为1.55mg/L,具体见表1和图8;
表1
3、精密度
将SAA校准品用阴性血清稀释至20mg/L、60mg/L、150mg/L,用本方法检测卡每浓度重复测试10次,计算测试浓度的变异系数。结果表2所示,由此可以看出,本试剂盒检测的变异系数均小于10%(三个浓度分别为8.52%、7.95%和5.63%),因此本检测方法具有较高的精密度。
表2
浓度 | 变异系数(CV) | |
质控Ⅰ | 20mg/L | 8.52% |
质控Ⅱ | 60mg/L | 7.95% |
质控Ⅲ | 150mg/L | 5.63% |
为了更好的说明本发明型的有益效果,下面给出采用本发明型提供的检测试剂与传统的免疫比浊法、免疫层析法在检测SAA时的检测性能能对比结果。
表3
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,包括壳体(7),所述的壳体(7)内设有用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,所述用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡包括底板(1),在底板(1)上依次衔接有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维膜(4)和吸水垫(5),其特征在于,所述结合垫(3)上设有荧光微球标记的SAA单克隆抗体(31)和荧光微球标记的羊抗鸡IgY(32),所述的硝酸纤维膜(4)设有一条包被鸡IgY的质控C线,以及一条包被SAA单克隆抗体的检测T线。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,还包括盒体(9),所述盒体(9)内设有样品稀释瓶(6)和用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述盒体(9)内还设有吸管(8)。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述的壳体(7)上设有与样品垫(2)相适配的加样孔(72),与结合垫(3)相适配的观察窗口(71)。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测猫血清淀粉样蛋白A的免疫荧光层析检测卡,其特征在于,所述的壳体(7)上表面还设有防滑条(73)。
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GR01 | Patent grant | ||
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