CN108395459B - 利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法 - Google Patents

利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将干燥的苹果花粉末与萃取剂混合后于室温进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成。验证试验中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量为145.4 mg/g。与传统的提取方法相比，加入离子液体后苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总提取率可达25.4%。结果表明，本发明采用离子液体结合响应曲面法筛选最佳提取工艺，且苹果花甲醇提取液对酪氨酸酶具有一定的激活作用，而甲醇离子液体提取液对酪氨酸酶具有一定的抑制作用。对苹果花的能源开发及利用提供了科学依据。

Description

利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷 的方法
技术领域
本发明属于医药或/和保健品技术领域，具体涉及一种利用离子液体结合响应曲面法从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法。
背景技术
苹果花为蔷薇科苹果属植物苹果Malus pumila Mill的干燥花。苹果花的化学成分主要有二氢查耳酮类如根皮苷、根皮素，以及其它黄酮类成分如槲皮素、山柰素、芦丁等。苹果花茶具有补血，疏解神经痛、肝斑，明目，治疗黑斑、面疱、粉刺，养颜美容，帮助消化，保肝活血等功效。药理学研究表明：黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫、抗衰老、降血脂、抗肿瘤等药理作用。此外还有文献报道，有的黄酮类化合物可抑制黑色素的合成，可用来治疗黄褐斑等色素沉着相关疾病；有的黄酮类化合物可刺激黑色素合成，用于治疗白癜风等色素脱失病。
离子液体(ionic liquid，IL)是一种新型的绿色有机溶剂，又称室温熔盐，由特定的、体积相对较大的、结构不对称的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子组成，具有良好的热稳定性和化学稳定性、粘度范围宽、可调节性和溶解性好等特点。不仅减少了对环境的污染，还能破坏纤维素的结构，从而促进有效成分的溶出，继而提高了提取率。近年来，有文献报道，离子液体应用于中药活性化合物的提取，未见离子液体对苹果花中黄酮类成分萃取研究的报道。
因此，本发明采用离子液体-超声波辅助萃取-高效液相色谱法，应用 Design-Expert8.06 统计分析软件，设计 Box-Benhnken 5因素3水平的中心组合实验，利用HPLC法同时对苹果花中的根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种成分进行含量测定，筛取最佳的提取工艺，并对其进行了酪氨酸酶的活性研究。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种利用离子液体从苹果花中优化提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，该提取方法操作简单，提取效率高。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用离子液体从苹果花中优化提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将干燥的苹果花粉末与萃取剂混合后于室温（25－30℃）进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得。
具体的，上述提取方法中，所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为［BMIM］BF4、［BMIM］Br、［BMIM］PF6或［HMIM］PF6；萃取剂中离子液体浓度为0.1－1.0 mol/L（其中，优选为0.4－0.8 mol/L）。文中如无特殊说明，甲醇均指的是体积浓度。
进一步的，可以将苹果花粉末与萃取剂按照固液比1g：20－100 mL （其中，优选1g：60－1g：100 mL）进行添加，苹果花粉末的适宜目数范围在10－90目（其中，优选50－70目）。
为了获得较好的提取效果，超声萃取时间以10－60 min为宜（其中，优选40－60min），离心转速以2000－9000 r/min为宜（其中，优选7000－9000 r/min）。
本发明利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法构思步骤如下：
1）首先选择合适的溶剂来溶解离子液体并确定最佳的萃取剂类型；分别比较甲醇、乙腈、乙酸乙酯、70%乙醇和水来溶解离子液体并对苹果花进行提取，筛选出甲醇对目标分析物的提取率最好。接着分别比较了［BMIM］BF4/甲醇，［BMIM］Br/甲醇，［BMIM］PF6/甲醇，［HMIM］PF6/甲醇四种萃取剂对目标分析物的萃取率，最终确定［BMIM］Br/甲醇为最佳萃取剂；
2）在步骤1）的基础上，设计提取条件的因素水平，以提取苹果花工艺中的不同控制参数为因子，通过单因素分析法来确定响应曲面方法的因素水平；筛选多个提取工艺的控制参数后，选取影响最大的几个控制参数为因子：以固液比（倍）、萃取剂浓度（mol/L）、超声时间（min）、离心转速（r/min）、粉碎目数（目）为五个因子，进行试验；
3）采用Design-Expert 8.06设计响应曲面试验，通过方差分析并确定根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的最大提取率以及其对应的因子水平；
4）根据根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的最大提取率对应的控制参数因子水平，在最优条件下提取苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷，检测提取率（将供试品溶液用高效液相色谱仪在270 nm处检测峰面积，与根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷标准曲线比较，计算根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总萃取量）。将实际提取率与传统溶剂检测值相比较，确定离子液体萃取的先进性；
5）在相同体系下，对苹果花的离子液体提取液、甲醇提取液和离子液体进行酪氨酸酶的活性测定。
本发明提供了一种利用离子液体结合响应曲面实验法优化提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的工艺，应用 Design-Expert8.06 统计分析软件，设计 Box-Benhnken 5因素3水平的中心组合实验，利用HPLC法同时对苹果花中的根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种成分进行含量测定，筛取最佳的提取工艺，并对其进行了酪氨酸酶的活性研究。本发明为中药研究者们提供了新的思路和途径，本实验建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为苹果花的综合利用提供实验依据。此外，本发明提取方法操作简单，提取效率高，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1苹果花供试品（a）与混合对照品（b）的HPLC图，图中，1.根皮苷 2.紫云英苷 3.阿福豆苷；
图2不同提取溶剂对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮类化合物萃取率的影响；
图3萃取剂种类对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响；
图4粉碎目数对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响；
图5萃取剂浓度对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响；
图6超声时间对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响；
图7固液比对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响；
图8离心转速对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响；
图9交互作用对苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷3种黄酮化合物萃取率的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
仪器与试剂。
紫云英苷(批号17042804)购于成都普菲德生物技术有限公司，HPLC检测纯度大于98%；阿福豆苷和根皮苷，HPLC检测纯度均大于98%。1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[HMIM]PF6(赛默飞世尔科技公司，美国)、溴化1-丁基-3-甲基咪唑[BMIM]Br(默克股份两合公司，德国)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐[BMIM]BF4(默克股份两合公司，德国)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[BMIM]PF6(默克股份两合公司，德国)。乙腈、甲醇(HPLC级)，磷酸(天津市富宇精细化工有限公司)，水为纯净水(杭州娃哈哈百利食品有限公司)。
岛津LC-20AT系列高效液相色谱仪(日本岛津)：LC-20AT液相色谱输液泵、CTO-10AS柱温箱、SPD-20A紫外检测器、LC-Solution色谱数据处理***；KQ-500DB型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，江苏)； AB135-S型十万级电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，瑞士)。
实验方法与结果。
2.1根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷含量测定方法的建立。
2.1.1对照品溶液的制备
取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度分别为0.204、0.196和0.199 mg/mL的混合对照品溶液。
2.1.2供试品溶液的制备
精密称取苹果花样品粉末（70目）10 mg，加入萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］Br与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］Br浓度为0.52 mol/L。）1mL，室温超声萃取60min后，7000 r/min离心3 min，吸取上层清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得供试品溶液（上述所述粉碎目数、萃取剂、固液比、超声时间以及离心转速均为筛选出来的最优条件）。
2.1.3色谱条件和***适用性实验。
表1 苹果花含量测定的色谱条件
Figure 586643DEST_PATH_IMAGE001
。
按照上述色谱条件，分别进样对照品溶液和供试品溶液，进样体积10 μL，记录色谱图，见图1。在此色谱条件下，样品中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的色谱峰与对照品出峰时间一致，三种化合物分离度良好。
2.1.4线性关系考察。
精密吸取不同浓度的混合对照品溶液，按2.1.3项下色谱条件进样测定，记录各组分峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，进样质量（X，μg）为横坐标，作图得回归方程：根皮苷：Y=643736X+158998，r=0.9987；紫云英苷：Y=518051X+145776，r=0.9979；阿福豆苷Y=835408X-359973，r=0.9942。结果表明，根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷进样量分别在0.4080~14.28 μg、0.3920~13.72 μg和0.3980~13.93 μg时与峰面积响应值呈良好的线性关系。
2.1.5重复性实验。
精确称量苹果花样品6份，按上述2.1.2条件制备样品，并按照2.1.3项下色谱条件进样10 μL，结果显示：根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的RSD分别为1.16%、1.8%和2.1%，表明本试验方法重复性好。
2.1.6精密度实验。
精密吸取混合对照品溶液10 μL，按照2.1.3项下色谱条件连续进样6次，结果显示：根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的RSD分别为0.61%、0.73%和0.51%，表明仪器精密度良好，可以准确反映物质的量。
2.1.7稳定性实验。
精密称取苹果花1份，按上述2.1.2条件制备样品，并按照2.1.3项下色谱条件进样分别在0，4，8，12，16，20，24 h进样10 μL，结果显示：根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的RSD分别为2.58%、0.97%和1.42%，表明供试液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷在24 h内基本稳定。
2.1.8加样回收试验。
称取已知根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷含量的苹果花样品6份，按上述2.1.2条件制备供试品溶液，测定样品中所含根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的含量，再分别加入相当于样品中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷质量的80%的标准品，按照2.1.3项下色谱条件进样10μL，根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的平均加样回收率分别为97.70%、101.32%和106.0%，其RSD值分别为0.90%、1.23%和2.08%，说明其反应的测试结果的准确度符合要求。
2.2单因素试验。
2.2.1萃取剂的选择。
萃取剂类型的选择对目标分析物萃取率的影响很大。本实验首先选取[BMIM]BF4，[BMIM]Br，[BMIM]PF6，[HMIM]PF6 4种类型的离子液体作为萃取剂，这4种离子液体均为咪唑类，在空气和溶液中稳定，能够与木质纤维素竞争性结合，从而使纤维素高效溶解，使植物细胞内的成分更加完全的溶出，增加萃取率。但由于离子液体多为粘稠的液体，且[BMIM]Br呈固体结晶状，所以选择合适的溶剂来溶解离子液体尤为重要。试验比较了70%乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯和水5种溶剂，按照上述2.1.2项下条件制备样品，并通过上述2.1.3项色谱条件注入HPLC分析，比较3种目标分析物根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷含量。结果显示，乙腈只能提取出苹果花中两种黄酮类成分，如图2所示，甲醇对目标分析物的提取率最好，故选择甲醇为提取溶剂。
图3比较了[BMIM]BF4/甲醇，[BMIM]Br/甲醇，[BMIM]PF6/甲醇，[HMIM]PF6/甲醇4种萃取溶剂对目标分析物的萃取结果，结果显示，[BMIM]Br/甲醇对目标分析物的萃取率最高，这可能与离子液体的自身组成结构有关。故本试验选择[BMIM]Br/甲醇作为萃取剂。
2.2.2粉碎目数的选择。
按照上述试验方法，其他试验条件相同，分别考察了粉碎目数为10、40、50、60、70和90目对目标分析物萃取量的影响。如图4显示，随着粉碎目数的增大，萃取量有随之增大的趋势，而当粉碎目数为60目时，对目标分析物的萃取率达到最大。这可能是因为离子液体具有黏性，随着粉末粒度的逐渐减小，样品中的化学成分越易被提取，但若当粉末粒度太小时，又容易被离子液体凝聚成团，反而阻碍其化学成分的释放。
2.2.3萃取剂浓度的选择。
如图5所示，在萃取剂浓度为0.1~1.0 mol/L时，随着萃取剂浓度的增大，目标分析物的萃取率呈增加的趋势，而随着萃取剂浓度的进一步增加，反而呈降低趋势。这可能是因为随着离子液体浓度的增加，溶剂的扩散力降低，很难进入药材内部，不能够充分地提取药材中的成分，而造成萃取率下降。因此，选择0.6 mol/L为最佳的萃取剂浓度。
2.2.4超声时间的选择。
分别选择10、20、30、40、50、和60 min为超声时间，萃取剂浓度为0.6 mol/L,按照上述试验条件，比较不同超声时间对目标分析物萃取率的影响，结果如图6所示。随着超声时间的延长，对目标分析物的萃取率基本呈现逐渐增加的趋势；当超声时间为50 min时，对目标分析物的萃取率达到最大，之后随着时间的增加，目标分析物的萃取率呈现下降趋势。上述原因可能是因为超声时间过长会破坏离子液体和目标分析物的结构，具体的原因需要进一步的研究。
2.2.5固液比的选择。
考察固液比为1:20、1:40、1:50、1:60、1:80和1:100时，离子液体对目标分析物的萃取率。结果如图7所示，当固液比达到1:80时，萃取率达到最大值，当继续增加比例时，萃取率反而下降。这可能是因为离子液体自身结果和物理特性的原因。
2.2.6离心转速的选择。
在上述优化的最佳条件下，选择2000、4000、6000、7000、8000和9000 r·min-1考察离心速度对目标分析物萃取率的影响，如图8所示，萃取率在8000 r·min-1时达到最大，故试验选择8000 r·min-1作为响应面因素水平的中心点“0”水平。
2.3响应面法优化试验设计。
根据 Box-Benhnken 的中心组合试验设计原理，以苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量为响应值（Y），选取粉碎目数（A）、萃取剂浓度（B）、超声时间（C）固液比（D）、离心转速（E）5个因素，采用5因素3水平的响应面分析方法。试验因素与水平设计见表2。
表2 响应面因素水平设计表
Figure 136704DEST_PATH_IMAGE002
。
为考察各影响因素及其交互作用对提取工艺的影响，利用 Design Expert 8.06软件对表2 中的数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程Y=125.10+4.05A-0.95B-1.97C+23.88D+E-2.93AB-1.38AC+12.54AD+0.88AE-3.29BC-3.52BD+1.65BE+2.43CD-6.81CE+0.47DE+1.42A2-0.89B2-2.68C2+24.76 D2-3.28E2。拟合二次多项式模型的方差分析见表3，模型P<0.0001表明高度显著，可用来进行响应值的预测；模型失拟项不显著，说明回归方程在整个回归空间内的拟合度较好，多元相关系数为R2=0.9572， R2adj=0.9230， R2pre=0.8472，说明模型对试验实际情况拟合较好。响应曲面法中，模型系数效应标志着响应值的表现，当一个系数出现正效应时，响应模式随着变量增加而增加；当一个系数具有负效应时，响应模式随着随着变量的增加而减少。系数的绝对值越高，响应变量的权重越重要。此试验中固液比为最显著的因素，因此固液比对整个试验的影响最大。
表3回归方程显著性检验
Figure 660089DEST_PATH_IMAGE003
*** 极显著(P<0. 001),** 高度显著(P<0. 01),* 显著(P<0. 05) 。
2.3.1响应曲面图分析。
响应曲面图如图9所示，表明了自变量的作用和交互作用与响应值之间的关系。在图9中，a和c图所示，超声时间一定时，随着粉碎目数的增大，响应值呈线性上升；粉碎目数不变时，随着离子液体浓度的增大或超声时间的延长对萃取量的影响不明显。b、d、e、g图所示，当另一个因素确定时，固液比越大，目标分析物的萃取率越大，这可能是当料液比变大时，苹果花与溶剂的接触面积和接触机会也相对变大，能够使有效成分更多的与溶剂接触，更好地溶解，同时溶剂量的增多使有效成分在溶剂中的溶解量增大，能够使更多的目标分析物溶解在溶剂中。f图所示，离心转速和超声时间交互作用对目标分析物的萃取率影响较小。
2.3.2提取工艺参数的优化及模型验证。
根据响应面分析，得出苹果花的最佳提取条件：粉碎目数70目，萃取剂浓度0.52mol/L，超声时间59.52 min，固液比1:99.90，离心转速7052.37 r/min，由于实际操作的限制，将最佳该条件改为：粉碎目数70目，萃取剂浓度0.52 mol/L，超声时间60 min，固液比1:100，离心转速7000 r/min，测得苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量为145.4mg/g，与模型计算值相差不大，因此采用响应曲面法得到的提取参数准确可靠，具有实际应用价值。
2.4酪氨酸酶活性测定。
取45 μL磷酸缓冲液(pH 6.8)，5 μL样品溶液(或甲醇)，25 μL 0. 2 U·mL-1 的酪氨酸酶水溶液，37℃温育 10 min 后加入0. 5 g·L-1 左旋多巴溶液25 μL，振荡均匀，37℃反应 5 min，用酶标仪在 492 nm 下测吸光度。同时做相同体系下离子液体［BMIM］Br和甲醇混合提取液、纯甲醇提取液、以及纯离子液体［BMIM］Br的平行试验，以及加入8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)的激活剂作为阳性对照组。
表4不同物质对酪氨酸酶的激活率 (X ± s，n =3)
Figure 89934DEST_PATH_IMAGE004
注: 8-MOP为阳性对照；与8-MOP比较*** P≤0. 001
表5不同溶剂提取液对酪氨酸酶的激活率(X± s，n =3)
Figure 331559DEST_PATH_IMAGE005
注:与离子液体比较 *** P≤0. 001
采用体外酪氨酸酶多巴速率氧化微量法，测定根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷不同终浓度下对酪氨酸酶活性的影响。结果见表4，与阳性对照 8-MOP 相比，同一终浓度下，紫云英苷和阿福豆苷对酪氨酸酶的激活率均高于阳性对照；根皮苷在终浓度为1 mmol/L和0.5 mmol/L时对酪氨酸酶的激活率均极显著高于阳性对照(P≤0. 001)，而在终浓度为2mmol/L时，根皮苷对酪氨酸的激活作用不如阳性对照好(P≤0. 001)，相反，它对酪氨酸酶有极很强的抑制作用。这说明浓度对酪氨酸酶的活性作用方向不同。测定苹果花不同溶剂提取液对酪氨酸酶活性的影响，结果见表 5，同一条件下，甲醇提取液对酪氨酸酶的激活率均极显著高于离子液体(P≤0. 001)；甲醇离子液体提取液对酪氨酸酶有极显著的抑制作用 (P≤0. 001)，这可能是因为甲醇提取出更多激活酪氨酸酶活性的物质，而离子液体提取出更多抑制酪氨酸酶活性的物质。
对照例1
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，精密称取苹果花样品粉末（50目）0.5 g，加入20 mL的甲醇，于室温超声萃取30 min后，3000 r/min离心3 min，吸取上层清液，即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量82.77mg/g (n=3).。
实施例1
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将0.5g干燥的苹果花粉末（50目）与20 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF4与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］BF4浓度为0.7 mol/L。）混合后，于室温超声萃取30 min，超声萃取结束后，3000 r/min离心3 min，取上清液即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量88.54 mg/g (n=3)。
实施例2
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将0.5g干燥的苹果花粉末（50目）与20 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］Br与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］Br浓度为0.7 mol/L。）混合后，于室温超声萃取30 min，超声萃取结束后，3000 r/min离心3 min，取上清液即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量99.98 mg/g (n=3)。
实施例3
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将0.5g干燥的苹果花粉末（50目）与20 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF6与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］BF6浓度为0.7 mol/L。）混合后，于室温超声萃取30 min，超声萃取结束后，3000 r/min离心3 min，取上清液即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量92.66 mg/g (n=3)。
实施例4
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将0.5g干燥的苹果花粉末（50目）与20 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［HMIM］BF6与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［HMIM］BF6浓度为0.7 mol/L。）混合后，于室温超声萃取30 min，超声萃取结束后，3000 r/min离心3 min，取上清液即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量90.96 mg/g (n=3)。
对照例2
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，精密称取苹果花样品粉末（70目）10 mg，加入1 mL的甲醇，于室温超声萃取60 min后，7000 r/min离心3 min，吸取上层清液，即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量115.7mg/g (n=3).。
实施例5
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将10mg干燥的苹果花粉末（70目）与1 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］Br与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］Br浓度为0.52 mol/L。）混合后，于室温超声萃取60 min，超声萃取结束后，7000 r/min离心3 min，取上清液即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量145.4 mg/g (n=3)。
实施例6
一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其将10mg干燥的苹果花粉末（70目）与1 mL萃取剂（所述萃取剂由离子液体［BMIM］BF4与甲醇混合组成，萃取剂中离子液体［BMIM］BF4浓度为0.52 mol/L。）混合后，于室温超声萃取60 min，超声萃取结束后，7000 r/min离心3 min，取上清液即得。
经检测可知：上清液中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的总含量121.8 mg/g (n=3)。
结论：本发明首次采用离子液体-超声波辅助萃取-高效液相色谱法，以[BMIM]Br/甲醇溶液为萃取剂，粉碎目数为70目，萃取剂浓度为0.52 mol/L，超声时间为60 min，固液比为1:100，离心转速7000 r/min，得到苹果花中根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的萃取率提高了25.4%，可为苹果花的开发利用提供理论基础。但是本文尚未发现离子液体类型与不同活性成分的规律性，需要进一步的深入研究。本发明为中药研究者们提供了新的思路和途径，本发明建立的最佳提取条件是科学可行的，可用于优化选取合适工业扩大化生产的提取技术，改善陈旧工艺，提高效率，为苹果花的综合利用提供实验依据。
本发明结果显示：紫云英苷和阿福豆苷对酪氨酸酶有明显的激活作用，并且随着浓度的增加，激活率不断增加，有望开发为白癜风的治疗药物；根皮苷在终浓度为2 mmol/L时对酪氨酸酶有抑制作用；在终浓度为1 mmol/L、0.5 mmol/L对酪氨酸酶有激活作用，但激活作用随浓度的降低而增加，这可能是因为不同浓度的根皮苷影响酪氨酸酶活性有不同机制，可再进行深入研究。

Claims (4)

1.一种利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，将干燥的苹果花粉末与萃取剂混合后于室温进行超声萃取，超声萃取结束后，离心，取上清液即得；
所述萃取剂由离子液体与甲醇混合组成，所述离子液体为［BMIM］BF4、［BMIM］Br、［BMIM］PF6或［HMIM］PF6；萃取剂中离子液体浓度为0.1－1.0 mol/L。
2.如权利要求1所述利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，苹果花粉末与萃取剂按照固液比1g：20－100 mL进行添加，苹果花粉末目数为10－90目。
3.如权利要求1至2任一所述利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，超声萃取时间为10－60 min。
4.如权利要求3所述利用离子液体从苹果花中提取根皮苷、紫云英苷和阿福豆苷的方法，其特征在于，离心转速为2000－9000 r/min。
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