CN115184497A - 一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法 - Google Patents

一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种测定铁皮石斛中2,4‑表芸苔素内酯含量的方法，属于农药残留检测技术领域。本发明以乙腈与水为提取剂，将超声提取与涡旋提取联用，提取后再经固相萃取小柱净化，使样品基质效应降低，相较常规衍生化处理操作简单；本发明在流动相中添加适量甲酸铵，可以提高2,4‑表芸苔素内酯电离效率，进而保证所得待测液适用于高效液相色谱‑串联质谱(HPLC‑MS/MS)检测，经外标法定量检出，最终能够实现铁皮石斛中2,4‑表芸苔素内酯的简单、快速、灵敏测定，对铁皮石斛用药安全有重要意义。

Description

一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法
技术领域
本发明涉及农药残留检测技术领域，尤其涉及一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale KimuraetMigo)为我国最早记录的兰科草本植物之一，是一种药食两用的中药材，有“千金草”、“神仙草”之称，具有益胃生津、滋阴清热、轻身延年等功效。铁皮石斛含量成分复杂，内含多糖、黄酮以及多酚等活性成分；其主要功效具有降血糖、降血脂、保护胃肠道功能、提高机体免疫力、抗肿瘤等。因野生铁皮石斛产量低，已列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》，现多以人工种植为主。
芸苔素内酯的化学式为C28H48O6(如图1中的(a))是一种新型绿色环保植物生长调节剂，属于第六类植物生长调节剂，其在低浓度下，可以显著增加植物营养体生长和促进受精作用。芸苔素内酯在天然化合物中含量极低且提取工艺较为繁杂，无法满实际生产需求，因此人工合成芸苔素内酯已成为趋势。目前在我国已登记的合成芸苔素内酯中，2,4-表芸苔素内酯(如图1中的(b))因合成效率高、生物活性好、成本低而应用最为广泛。
随着2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛种植中广泛使用，农药滥用现象时有发生，铁皮石斛安全性问题也越来越受关注。但2,4-表芸苔素内酯不含共轭结构以及光电响应基团，采用常规紫外检测器或荧光检测器对其含量进行检测具有诸多困难与不便。随着仪器技术不断推陈出新，高效液相色谱检测技术以及气相色谱法在分析检测领域中广泛应用，但对2,4-表芸苔素内酯进行检测前往往需要衍生化处理，操作复杂，且柱上衍生化有时会损伤色谱柱。此外，铁皮石斛中成分复杂，受生长环境影响其品质差异较大，有关2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中残留分析目前未见报道。因此，如何实现铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的简单和灵敏检测，是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法，本发明提供的方法操作简单且灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法，包括以下步骤：
将铁皮石斛、乙腈与水混合进行超声提取，将所得超声提取体系与NaCl和MgSO4混合进行涡旋提取，将所得涡旋提取体系分层得到水相与乙腈相，去除所述乙腈相中溶剂得到第一剩余物，以丙酮-正己烷溶液为复溶剂将所述第一剩余物进行第一复溶，得到第一复溶液；
以丙酮-正己烷溶液为洗脱剂，采用C18固相萃取小柱对所述第一复溶液进行净化，去除所得净化液中溶剂得到第二剩余物，采用乙腈对所述第二剩余物进行第二复溶，所得第二复溶液作为待测液；
将所述待测液进行高效液相色谱-串联质谱检测，得到待测液的色谱图；
根据2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质标准曲线以及待测液的色谱图，得到铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的含量；
所述高效液相色谱-串联质谱检测的高效液相色谱条件包括：
流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为甲酸-甲酸铵-水溶液，所述流动相B中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸铵的浓度为2～5mmol/L；采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序为：0～0.5min，所述流动相A的体积分数保持10％；0.5～2.5min，所述流动相A的体积分数由10％增加至92％；2.5～4.0min，所述流动相A的体积分数保持92％；4.0～4.01min，所述流动相A的体积分数由92％降低至10％；4.01～5.5min，所述流动相A的体积分数保持10％。
优选地，进行所述超声提取时，所述铁皮石斛、乙腈与水的用量比为10g：(10～20)mL：(4～6)mL。
优选地，所述超声提取的温度为15～40℃，时间为13～30min，功率为220～280Hz。
优选地，所述NaCl、MgSO4与超声萃取所用乙腈的用量比为(1.3～1.7)g：(5～7)g：(10～20)mL。
优选地，所述涡旋提取的温度为15～40℃，时间为1.5～2.5min。
优选地，所述复溶剂和洗脱剂中丙酮与正己烷的体积比独立地为6:4～8:2。
优选地，所述复溶剂、洗脱剂与铁皮石斛的用量比为(1.5～2.5)mL：(20～25)mL：10g。
优选地，所述C18固相萃取小柱为Cleanert PestiCarb/NH2小柱、Oasis HLB小柱、Cleanert PEP-2小柱、Cleanert TPH小柱或Cleanert NANO小柱。
优选地，所述高效液相色谱条件还包括：
流动相体系的流速为0.4mL/min，色谱柱为C18柱，柱温箱的温度为40℃，进样体积为2.0μL。
优选地，所述高效液相色谱-串联质谱检测的质谱条件包括：
电离方式为ESI+，采用MRM多反应监测；毛细管电压为4.0kV；鞘气温度为350℃；鞘气气流量为11L/min。
本发明提供了一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法，本发明以乙腈与水为提取剂，将超声提取与涡旋提取联用，提取后再经固相萃取小柱净化，使样品基质效应降低，相较常规衍生化处理操作简单；本发明在流动相中添加适量甲酸铵，可以提高2,4-表芸苔素内酯电离效率，进而保证所得待测液适用于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测，经外标法定量检出，最终能够实现铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的简单、快速、灵敏测定，对铁皮石斛用药安全有重要意义。实施例的结果显示，采用本发明提供的方法对铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯进行检测，2,4-表芸苔素内酯在0.0005～1mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，2,4-表芸苔素内酯的平均回收率为81.9～103.2％，变异系数为1.1～9.4％，检测限为0.005mg/kg。说明本发明提供的方法净化分离效果好，重复性好，检测限低，完全符合铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯残留检测的技术要求，适用于大量样品的快速检测。
附图说明
图1为芸苔素内酯以及2,4-表芸苔素内酯的结构式；
图2为2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质溶液标准曲线；
图3为2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛实际样品中的谱图；
图4为不同条件对2,4-芸苔素内酯回收率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法，包括以下步骤：
将铁皮石斛、乙腈与水混合进行超声提取，将所得超声提取体系与NaCl和MgSO4混合进行涡旋提取，将所得涡旋提取体系分层得到水相与乙腈相，去除所述乙腈相中溶剂得到第一剩余物，以丙酮-正己烷溶液为复溶剂将所述第一剩余物进行第一复溶，得到第一复溶液；
以丙酮-正己烷溶液为洗脱剂，采用C18固相萃取小柱对所述第一复溶液进行净化，去除所得净化液中溶剂得到第二剩余物，采用乙腈对所述第二剩余物进行第二复溶，所得第二复溶液作为待测液；
将所述待测液进行高效液相色谱-串联质谱检测，得到待测液的色谱图；
根据2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质标准曲线以及待测液的色谱图，得到铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的含量；
所述高效液相色谱-串联质谱检测的高效液相色谱条件包括：
流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为甲酸-甲酸铵-水溶液，所述流动相B中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸铵的浓度为2mmol/L；采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序为：0～0.5min，所述流动相A的体积分数保持10％；0.5～2.5min，所述流动相A的体积分数由10％增加至92％；2.5～4.0min，所述流动相A的体积分数保持92％；4.0～4.01min，所述流动相A的体积分数由92％降低至10％；4.01～5.5min，所述流动相A的体积分数保持10％。
本发明将铁皮石斛、乙腈与水混合进行超声提取，得到超声提取体系。本发明优选以铁皮石斛的叶和茎作为样品进行检测；所述铁皮石斛的叶和茎在使用前优选进行干冰粉粹制样，所得样品优选于-20℃条件下保存。在本发明中，所述铁皮石斛、乙腈与水的用量比优选为10g：(10～20)mL：(4～6)mL，更优选为10g：15mL：5mL。本发明优选向铁皮石斛中先加入水，然后再加入乙腈，将所得混合体系进行超声提取；本发明先向铁皮石斛中先加入水，能够使铁皮石斛被充分浸润，再加乙腈进行超声提取，可以有效提高提取效率。在本发明中，所述超声提取的温度优选为15～40℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温(25℃)条件下进行所述超声提取；所述超声提取的时间优选为13～30min，更优选为15min；所述超声提取的功率优选为220～280Hz，更优选为250Hz。
得到超声提取体系后，本发明将所述超声提取体系与NaCl和MgSO4混合进行涡旋提取，得到涡旋提取体系。在本发明中，所述NaCl、MgSO4与超声萃取所用乙腈的用量比优选为(1.3～1.7)g：(5～7)g：(10～20)mL，更优选为1.5g：6g：15mL。在本发明中，所述涡旋提取的温度优选为15～40℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温(25℃)条件下进行所述涡旋提取；所述涡旋提取的时间优选为1.5～2.5min，更优选为2min。在本发明中，所述NaCl和MgSO4起到盐析作用，为了便于后续分层得到水相与乙腈相。
得到涡旋提取体系后，本发明将所述涡旋提取体系分层得到水相与乙腈相，去除所述乙腈相中溶剂得到第一剩余物。本发明优选将所述涡旋提取体系进行离心以便于分层；所述离心的转速优选为7000～9000r/min，更优选为8000r/min，离心的时间优选为8～12min，更优选为10min；所述离心优选在2～6℃条件下进行，更优选为4℃。本发明优选通过旋蒸去除所述乙腈相中溶剂，具体是将所述乙腈相在40℃水浴条件下旋蒸近干。
得到第一剩余物后，本发明以丙酮-正己烷溶液为复溶剂将所述第一剩余物进行第一复溶，得到第一复溶液。在本发明中，所述复溶剂中丙酮与正己烷的体积比优选为6:4～8:2，更优选为6:4；所述复溶剂与铁皮石斛的用量比优选为(1.5～2.5)mL：10g，更优选为2mL：10g。
得到第一复溶液后，本发明以丙酮-正己烷溶液为洗脱剂，采用C18固相萃取小柱对所述第一复溶液进行净化，得到净化液。在本发明中，所述洗脱剂的组成优选与复溶剂相同，在此不再赘述；所述洗脱剂与铁皮石斛的用量比优选为(20～25)mL：10g，更优选为25mL：10g。在本发明中，所述C18固相萃取小柱优选为Cleanert PestiCarb/NH2小柱、OasisHLB小柱、Cleanert PEP-2小柱、Cleanert TPH小柱或Cleanert NANO小柱，更优选为Cleanert PestiCarb/NH2小柱；在本发明的实施例中，所述Cleanert PestiCarb/NH2小柱的规格优选为500mg/6mL，所述Oasis HLB小柱的规格优选为500mg/6mL，所述Cleanert PEP-2小柱的规格优选为500mg/6mL，所述Cleanert TPH小柱的规格为2g/12mL，所述CleanertNANO小柱的规格为1mL。在本发明中，所述C18固相萃取小柱使用前优选进行活化，所述活化所用试剂优选与复溶剂相同，在此不再赘述，在本发明中，所述活化所用试剂的体积优选为8～12mL，更优选为10mL。本发明优选将所述第一复溶液上样于活化后的C18固相萃取小柱，然后采用洗脱剂淋洗所述C18固相萃取小柱，得到净化液。
得到净化液后，本发明去除所述净化液中溶剂得到第二剩余物，采用乙腈对所述第二剩余物进行第二复溶，所得第二复溶液作为待测液。本发明优选通过旋蒸去除所述净化液中溶剂，具体是将所述净化液在40℃水浴条件下旋蒸近干。本发明优选将乙腈与所述第二剩余物混合超声溶解1min，将所得混合液过0.22μm滤膜得到待测液。
待测液后，本发明将所述待测液进行高效液相色谱-串联质谱检测，得到待测液的色谱图。在本发明中，所述高效液相色谱-串联质谱检测的高效液相色谱条件包括：
流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为甲酸-甲酸铵-水溶液，所述流动相B中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸铵的浓度为2mmol/L；采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序为：0～0.5min，所述流动相A的体积分数保持10％；0.5～2.5min，所述流动相A的体积分数由10％增加至92％；2.5～4.0min，所述流动相A的体积分数保持92％；4.0～4.01min，所述流动相A的体积分数由92％降低至10％；4.01～5.5min，所述流动相A的体积分数保持10％。
在本发明中，所述高效液相色谱条件优选还包括：流动相体系的流速为0.4mL/min，色谱柱为C18柱，柱温箱的温度为40℃，进样体积为2.0μL。
在本发明中，所述高效液相色谱-串联质谱检测的质谱条件优选包括：电离方式为ESI+，采用MRM多反应监测；毛细管电压为4.0kV；鞘气温度为350℃；鞘气气流量为11L/min。
得到测液的色谱图后，本发明根据2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质标准曲线以及待测液的色谱图，得到铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的含量。在本发明中，所述2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质标准曲线优选为加标铁皮石斛空白基质溶液中2,4-表芸苔素内酯质量浓度与加标铁皮石斛空白基质溶液的色谱图中2,4-表芸苔素内酯色谱峰面积的线性回归方程，所述加标铁皮石斛空白基质溶液中2,4-表芸苔素内酯的浓度优选分别为0.0005mg/L、0.001mg/L、0.0025mg/L、0.025mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L以及1mg/L。在本发明中，所述加标铁皮石斛空白基质溶液具体是利用铁皮石斛空白基质溶液将2,4-表芸苔素内酯标准母液稀释得到；所述铁皮石斛空白基质溶液的制备方法优选与所述待测液的制备方法相同，在此不再赘述；所述2,4-表芸苔素内酯标准母液的浓度优选为100mg/L，溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述加标铁皮石斛空白基质溶液的色谱图优选将加标铁皮石斛空白基质溶液进行高效液相色谱-串联质谱检测得到；对所述加标铁皮石斛空白基质溶液进行高效液相色谱-串联质谱检测的条件优选与对待测液进行高效液相色谱-串联质谱检测的条件一致，在此不再赘述。本发明根据2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质标准曲线以及待测液的色谱图，可以得到待测液中2,4-表芸苔素内酯的含量，进而可以得到铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的含量。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、材料与方法
1.1主要仪器设备和化学试剂
主要仪器设备：高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(G 6470，美国安捷伦(Agilent)公司)；Agilent Masshunter Qualitative Analysis 8.0软件用于数据采集与分析；色谱柱为Waters C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；超声波清洗器(SK-7200H，上海科导超声仪器有限公司)；涡旋振荡器(NMSG-12，泰州米诺医疗科技有限公司)；高速冷冻离心机(6430R，pendorf公司)。
主要试剂和耗材：2,4-表芸苔素内酯原药(纯度93％，CAS：78821-43-9)购自浙江世佳科技股份有限公司；2,4-表芸苔素内酯标准品(纯度≥98％，CAS：78821-43-9)购自合肥博美生物科技有限责任公司；甲醇、乙腈(HPLC级，Merck公司)；甲酸(HPLC级，美国ACS公司)；甲酸铵(HPLC级，德国Honeywell公司)，丙酮，正己烷(AR级)购自国药集团化学试剂有限公司。萃取盐包(含1.5gNaCl和6g MgSO4)购自杭州易镁创科技有限公司；CleanertPestiCarb/NH2(CARB/NH2)固相萃取(SPE)小柱(500mg，6mL)购自上海安普实验科技股份有限公司；陶瓷均质子购自合肥博美生物科技有限责任公司；屈臣氏蒸馏水(购自屈臣氏集团有限公司)。
1.2方法
1.2.1仪器条件
高效液相色谱条件：
色谱柱：Waters C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；
流动相：包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为甲酸-甲酸铵-水溶液，所述流动相B中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸铵的浓度为2mmol/L；采用梯度洗脱，具体如表1所示；
流速：0.4mL/min；
柱温箱：40℃；
进样体积：20μL；
运行时间：5.5min。
表1流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0003749889340000081
质谱条件：
电离方式：ESI+，采用MRM多反应监测；
毛细管电压：4.0kV；
鞘气温度：350℃；
鞘气气流量：11L/min；
检测参数见表2。
表2质谱检测参数
Figure BDA0003749889340000091
*为定量离子对。
1.2.2样品前处理
提取：分别称取10.00g铁皮石斛叶和茎样品于50mL离心管中，依次加入5.0mL水和15.0mL乙腈，超声提取15min，然后加入1.5g NaCl和6.0g MgSO4，在每个离心管中放置一只陶瓷均质子，涡旋震荡2min后，在4℃条件下以8000r/min离心10min，取所有上层乙腈相转移至圆底烧瓶，在40℃水浴条件下旋蒸近干，然后用2mL丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷的体积比为6：4)复溶，得到复溶液；
净化：采用10mL丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷的体积比为6：4)对SPE小柱(CARB/NH2)进行活化，之后将2mL所述复溶液上样，再用25mL丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷的体积比为6：4)淋洗小柱，收集所有净化液，40℃水浴旋蒸近干，再用乙腈复溶，超声1min，过0.22μm滤膜后待测。
2、结果
2.1分析方法线性关系的测定
准确称取2,4-表芸苔素内酯标准品0.0111g于100mL容量瓶中，采用乙腈定容至刻度线，配制成100mg/L的标准母液，4℃下保存；采用铁皮石斛空白基质溶液(按“1.2.2样品前处理”方法制备得到)进行稀释，配制成浓度为0.0005mg/L、0.001mg/L、0.0025mg/L、0.025mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、1mg/L的标准溶液，按“1.2.1仪器条件”方法进行测定，重复3次，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。结果如表3所示，对于2,4-表芸苔素内酯在0.0005～1mg/L的浓度范围内，基质标准曲线的回归方程为y＝2E+06x+7520.9(如图2所示)，相关系数：R2＝0.9988。
表3 2,4-表芸苔素内酯的标准曲线
Figure BDA0003749889340000101
2.2方法的回收率和检出限
在铁皮石斛中空白基质溶液中添加2,4-表芸苔素内酯标准溶液，进行0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg三个浓度的添加回收试验，每个浓度设6个平行；其中，具体是按“1.2.2样品前处理”方法进行提取以及净化，按“1.2.1仪器条件”方法进行检测，完成添加回收率试验，得到铁皮石斛样品中2,4-表芸苔素内酯的添加回收率和相对标准偏差(RSDs)，具体数据见表4。
表4 2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中的添加回收率试验结果
Figure BDA0003749889340000111
由表4可知，2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛中添加浓度分别为0.005mg/kg、0.05mg/kg和0.5mg/kg时，平均回收率分别为94.1％、95.7.0％和81.9％，相对标准偏差分别为3.3％、3.9％和2.6％；2,4-表芸苔素内酯平均回收率在81.9～103.2％之间，变异系数为1.1～9.4％。
根据2,4-表芸苔素内酯在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，以及铁皮石斛样品中2,4-表芸苔素内酯最低添加浓度0.005mg/kg的样品在仪器上响应值均大于仪器的3倍信号噪音比，得出2,4-表芸苔素内酯在铁皮石斛样品中的最低检测浓度为0.005mg/kg。因此本发明提供的方法完全能够满足农药残留分析中对准确度、精密度和灵敏度的要求。
3、实际样品检测
将铁皮石斛市售样品5份，按照“1.2方法”进行检测，结果显示均未检测到2,4-表芸苔素内酯(图3)。
测试例1
本测试例考察了提取方式、提取时间、提取剂种类、提取剂体积、SPE小柱种类、洗脱剂种类以及洗脱剂体积对2,4-表芸苔素内酯回收率(％)的影响(结果如图4所示)，具体操作步骤如下(以下步骤中未涉及到的条件按照“1.2方法”进行)：
(1)提取方式选用超声、涡旋、抽滤、超声与涡旋联用，提取时间为17min，当采用超声与涡旋联用时，超声时间为15min，涡旋时间为2min；提取剂为乙腈-水溶液(乙腈为15mL，水为5mL)，用Cleanert PestiCarb/NH2小柱(500mg，6mL)净化，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6：4)，洗脱剂的体积为25mL(图4中的a)。
(2)固定提取方式为超声与涡旋联用，提取剂为乙腈-水溶液(乙腈为15mL，水为5mL)，用Cleanert PestiCarb/NH2小柱(500mg，6mL)净化，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6：4)，洗脱剂的体积为25mL；其中，提取时间分别为10min、15min、20min、30min(图4中的b)。
(3)固定提取方式为超声与涡旋联用，提取剂体积为15mL，提取时间为15min，用Cleanert PestiCarb/NH2小柱(500mg，6mL)净化，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6：4)，洗脱剂的体积为25mL；其中，提取剂分别为乙腈、丙酮、甲醇、乙腈-水溶液(乙腈与水体积比为3：1，具体是先向待测样品中加入水，再加入乙腈)(图4中的c)。
(4)固定提取方式为超声与涡旋联用，提取剂为乙腈-水溶液，提取时间为15min，用Cleanert PestiCarb/NH2小柱(500mg，6mL)净化，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6：4)，洗脱剂的体积为25mL；其中，提取剂的体积以乙腈：水表示分别为5mL：5mL、10mL：5mL、15mL：5mL、20mL：5mL(图4中的d)。
(5)固定提取方式为超声与涡旋联用，提取剂为乙腈-水溶液(乙腈为15mL，水为5mL)，提取时间为15min，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6：4)，洗脱剂的体积为25mL；其中，所用SPE小柱分别为Cleanert NH2小柱(500mg，6mL)、CleanertPestiCarb/NH2小柱(500mg，6mL)、Oasis HLB小柱(500mg，6mL)、Cleanert PEP-2小柱(500mg，6mL)、Cleanert TPH小柱(2g，12mL)、Cleanert NANO小柱(1mL)(图4中的e)。
(6)固定提取方式为超声与涡旋联用，提取剂为乙腈-水溶液(乙腈为15mL，水为5mL)，提取时间为15min，用Cleanert PestiCarb/NH2(500mg，6mL)净化，洗脱剂的体积为25mL；其中，洗脱剂分别为乙腈-甲苯溶液(乙腈与甲苯体积比为3:1)、丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为8:2)、丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6:4)、丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为2:8)(图4中的f)。
(7)固定提取方式为超声与涡旋联用，提取剂为乙腈-水溶液(乙腈为15mL，水为5mL)，提取时间为15min，用Cleanert PestiCarb/NH2(500mg，6mL)净化，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷体积比为6:4)；其中，洗脱剂体积分别为10mL、15mL、20mL、25mL(图4中的g)。
由图4中的a可知，超声提取与涡旋提取联用效果最佳。
由图4中的b可知，在15min时提取效率最优。同时可以看出，提取时间进一步延长提取效率反而呈下降趋势，推测可能是由于长时间提取导致其他杂质浸出，使得基质效应增强从而影响回收率。
由图4中的c可知，不同提取剂对回收率影响很大，丙酮虽回收率效果最好，但对脂类、色素等物质有较强的溶解性，且在提取过程中同时会有大量杂质不易净化，导致基质效应增强，因此选用乙腈-水溶液作为提取剂。
由图4中的d可知，在其他条件固定下，乙腈与水的用量在15mL以及5mL时回收效率最佳，当乙腈与水的用量为20mL以及5mL时回收率降低，可能由于乙腈比例增大导致铁皮石斛其他杂质溶出较多导致基质效应影响回收率。
由图4中的e可知，除Cleanert NH2小柱(500mg，6mL)外，其他SPE小柱回收率均达标(≥70％)，由于基质复杂且含有大量叶绿素，综合考虑选择Cleanert PestiCarb/NH2小柱。
由图4中的f可知，洗脱剂为丙酮-正己烷溶液且丙酮与正己烷体积比为6:4时回收率最好。
由图4中的g可知，在超声与涡旋联用时，用乙腈-水溶液(乙腈为15mL，水为5mL)提取15min，用Cleanert PestiCarb/NH2小柱(500mg，6mL)净化，净化时用25mL丙酮-正己烷溶液(丙酮与正己烷的体积比为6：4)洗脱，回收率为103.2％。
测试例2
本测试例考察了流动相以及色谱柱对检测结果的影响，具体如下：
(1)以表5所示梯度洗脱条件进行检测，其它条件按照实施例1中“1.2.1仪器条件”进行，结果显示，目标物的色谱峰有拖尾，峰形较差，保留时间为2.4min。而以表1所示梯度洗脱条件进行检测，目标物的色谱峰峰形较好，保留时间为3.4min左右。因此最终选择表1所示梯度洗脱条件。
表5对比流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0003749889340000141
(2)采用T3色谱柱，目标物的保留时间在1.6min左右，运行程序一般在7～15min之间不等(检测方法为HPLC或HPLC-MS/MS)。
本发明选用C18色谱柱，并按照实施例1中“1.2.1仪器条件”方法进行检测，目标物的保留时间为3.4min左右，运行时间为5.5min，缩短了检测时间，并且目标物的出峰时间适中，避免了出峰时间过短导致样品中杂质会影响检测结果的问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种测定铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯含量的方法，包括以下步骤：
将铁皮石斛、乙腈与水混合进行超声提取，将所得超声提取体系与NaCl和MgSO4混合进行涡旋提取，将所得涡旋提取体系分层得到水相与乙腈相，去除所述乙腈相中溶剂得到第一剩余物，以丙酮-正己烷溶液为复溶剂将所述第一剩余物进行第一复溶，得到第一复溶液；
以丙酮-正己烷溶液为洗脱剂，采用C18固相萃取小柱对所述第一复溶液进行净化，去除所得净化液中溶剂得到第二剩余物，采用乙腈对所述第二剩余物进行第二复溶，所得第二复溶液作为待测液；
将所述待测液进行高效液相色谱-串联质谱检测，得到待测液的色谱图；
根据2,4-表芸苔素内酯的铁皮石斛空白基质标准曲线以及待测液的色谱图，得到铁皮石斛中2,4-表芸苔素内酯的含量；
所述高效液相色谱-串联质谱检测的高效液相色谱条件包括：
流动相体系包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲醇，所述流动相B为甲酸-甲酸铵-水溶液，所述流动相B中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸铵的浓度为2～5mmol/L；采用梯度洗脱程序，所述梯度洗脱程序为：0～0.5min，所述流动相A的体积分数保持10％；0.5～2.5min，所述流动相A的体积分数由10％增加至92％；2.5～4.0min，所述流动相A的体积分数保持92％；4.0～4.01min，所述流动相A的体积分数由92％降低至10％；4.01～5.5min，所述流动相A的体积分数保持10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述超声提取时，所述铁皮石斛、乙腈与水的用量比为10g：(10～20)mL：(4～6)mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述超声提取的温度为15～40℃，时间为13～30min，功率为220～280Hz。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述NaCl、MgSO4与超声萃取所用乙腈的用量比为(1.3～1.7)g：(5～7)g：(10～20)mL。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述涡旋提取的温度为15～40℃，时间为1.5～2.5min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复溶剂和洗脱剂中丙酮与正己烷的体积比独立地为6:4～8:2。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述复溶剂、洗脱剂与铁皮石斛的用量比为(1.5～2.5)mL：(20～25)mL：10g。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C18固相萃取小柱为CleanertPestiCarb/NH2小柱、Oasis HLB小柱、CleanertPEP-2小柱、Cleanert TPH小柱或CleanertNANO小柱。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件还包括：
流动相体系的流速为0.4mL/min，色谱柱为C18柱，柱温箱的温度为40℃，进样体积为2.0μL。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱-串联质谱检测的质谱条件包括：
电离方式为ESI+，采用MRM多反应监测；毛细管电压为4.0kV；鞘气温度为350℃；鞘气气流量为11L/min。
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