CN108387537A - 一种重金属离子的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重金属离子的定量检测方法。本发明是在待测样品中加入标记有一段特定核酸序列的螯合剂，利用包被有重金属离子抗体的酶标板富集螯合产物，清洗去除游离核酸后，加入扩增和显色溶液并孵育，检测吸光值，计算待测样品中的重金属离子浓度。本发明方法具有快速、简便、可实现定量检测重金属离子的优点，可用于食品、水质、血清及体液和环境样品中的重金属离子快速检测。

Description

一种重金属离子的定量检测方法
技术领域
本发明属重金属离子快速检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种重金属离子的快速定量检测方法。
背景技术
重金属镉是一种稀有的分散元素，自然界中镉为+1价和+2价存在，其中绝大多数为+2价离子，多以硝酸镉、硫化镉、氯化镉、乙酸镉等形式存在。镉离子被广泛应用于电镀、电池、汽车、航空、颜料、油漆、印刷及塑料等行业。有研究推算，全球每年有2.2万吨镉进入土壤，2014年，环境保护部和国土资源部发布全国土壤污染状况调查公报中提到镉污染物点位超标率达到7.0％，是其他污染物的好几倍。镉并不是人体必需元素，现已成为一种主要的重金属污染物。
镉的化合物具有不同的毒性，过度摄入镉可导致人发生镉中毒。镉引起人中毒的剂量平均为100mg。急性中毒症状主要表现为恶心、流涎、呕吐、腹痛、腹泻，继而引起中枢神经中毒症状。严重者可因虚脱而死亡。当环境受到镉污染后，镉可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起慢性中毒。镉的生物半衰期为10～30年，且生物富集作用显著，即使停止接触，大部分以往蓄积的镉仍会继续停留在人体内。长期摄入含镉食品，可使肾脏发生慢性中毒，主要是损害肾小管和肾小球，导致蛋白尿、氨基酸尿和糖尿。同时，由于镉离子取代了骨骼中的钙离子，从而妨碍钙在骨质上的正常沉积，也妨碍骨胶原的正常固化成熟，导致软骨病。
世界卫生组织将镉列为重点研究的食品污染物；国际癌症研究机构(IARC)将镉归类为人类致癌物，会对人类造成严重的健康损害；美国毒物和疾病登记署(ATSDR)将镉列为第7位危害人体健康的物质；我国也是将镉列为实施排放总量控制的重点监控指标之一。因镉离子污染事件屡见报端，上世纪60年代日本大范围的“痛痛病”被确定为日本四大公害病之一，2013年3月，湖南镉超标大米引起大范围的恐慌。
针对镉的毒性，世界上多个国家相继制定了限制标准。我国《食品中污染物限量》(GB2762～2012)规定大米中镉限量标准是0.2mg/kg，欧盟已将标准提高至0.1mg/kg；而日本与国际食品法典委员会(CAC)规定大米中镉限量标准是0.4mg/kg。
目前重金属检测存在诸如仪器价格昂贵、检测费用高、需要专业的技术人员操作等问题，不适合普通实验室开展检测，限制了该类方法的推广与普及，镉离子检测也是如此。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种可快速定量检测重金属离子的方法。
本发明方法包括如下步骤：
在待测样品中加入0.1-50μL、10mM的、标记有一段特定核酸序列的螯合剂(可以螯合重金属离子，螯合产物可被重金属离子抗体识别)，利用每孔包被有0.01～5μg重金属离子抗体的酶标板富集螯合产物，在富集过程中，被标记在螯合剂上的核酸被间接富集，再经清洗去除游离核酸后，加入扩增和显色溶液并孵育(产物经SDA扩增后产生大量的与标记核酸互补的单链富G核酸，经折叠后形成G四聚体，其可氧化显色液，使反应液显色)，反应终止后检测吸光值，计算待测样品中的镉离子浓度；其中，所述特定核酸序列的长度为20～100nt，且其3’端有一段4～10nt的随机核酸序列引物，所述引物紧连有一个切刻酶位点，其余区段为富C序列。
优选地，所述螯合剂为EDTA、EGTA或PEI。
优选地，可通过将所述重金属离子抗体以静电结合或共价键结合等方式偶联于颗粒物载体上，以代替将重金属离子抗体包被于酶标板。
优选地，所述颗粒物载体的粒径为0.1～1μm，其为磁珠、PS微球或氧化硅微球。
优选地，所述颗粒物载体的外层修饰有氨基、羧基、羟基或环氧基。
所述扩增和显色溶液，可以是同时含有TMB显色液成分的等温链置换反应扩增体系，扩增体系含有：一条扩增引物、一种切刻酶、一种聚合酶、dNTP及对应的缓冲液；TMB显色液含有：TMB、双氧水和柠檬酸缓冲体系等。
也可以将上述等温链置换反应扩增体系与显色体系分开，先进行五分钟的扩增，然后转入显色体系中显色20min。
本发明采用核酸修饰的螯合剂螯合重金属离子，利用标记于抗体识别捕获富集核酸，鸡儿采用等温链置换和G四聚体两次放大信号，最终通过读取吸光值，测算重金属离子的含量。
需要说明的是，本发明上述方法是一种通用技术平台，适合各种重金属离子和小分子的检测的单一检测或复合检测，只要更换相应的抗体即可实现。本发明多以镉离子作为代表说明，但并不代表本发明实施方案仅适用于镉离子。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明方法快速简便、成本低、不需要繁杂的前期纯化步骤，也不需要复杂的设备，可在硬件设施较少的实验室开展监测，且本发明方法将重金属离子经过信号转化后，再两次放大信号，使监测的灵敏度更高，远高于国标要求，具有良好的应用前景和市场价值，可用于环境样品、化妆品、体液及食品安全检测等领域。
附图说明
图1为本发明重金属离子检测方法的原理图。
图2为本发明重金属离子检测方法的特异性实验结果图，具体为镉离子、铅离子、汞离子、铬离子、铜离子、镍离子利用镉离子检测试剂进行检测的检测结果。
以上样品分别以氯化镉，二氯化铅，硝酸汞，三氯化铬，二氯化铜，硫酸镍配置成0.1um的母液，检测时用双蒸水稀释10倍后检测。
图3为本发明重金属离子检测方法的检测灵敏度结果图，自左至右依次镉离子的浓度为：0.00,0.02,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.20ng/ml镉离子标准品(该标准品采用氯化镉配制：药物浓度分别为0.00,0.33,0.163,0.326,0.652,1.304,1.956ng/ml的氯化镉溶液)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1
以双蒸水稀释的氯化镉为标准品检测体系的灵敏度为例：
(1)以10mM PBS溶液稀释镉离子抗体至0.5μg/mL，取该抗体溶液以100μL/孔包被酶标板；
(2)37度包被2小时后，去除抗体溶液，用200uL的1wt％脱脂奶粉封闭30分钟；
(3)用PBST溶液清洗酶标板三次，烘干备用；
(4)取400μL不同浓度的氯化镉标准品，加入50μL、10mM的修饰的EGTA螯合剂，混匀后室温静置5分钟；
(5)用纯净水定容样品到500μL；
(6)取80μL步骤(5)所得的溶液加入酶标孔(同期标准品孔也要加入相应浓度镉离子标准品)，室温反应5分钟反应后，PBST清洗一次，PBS清洗三次；
(7)加入100μL的反应液，37度反应30分钟后，加入50μL、2M硫酸溶液终止反应；
(8)酶标仪450nm出检测吸光值。
(9)计算：扣除背景值后，以标准品建立标准曲线。
原始吸光值结果如下：
说明：前三列为0ppb对照，4-6列为标准品，自A至H行分别为：1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.00ng/mL的镉离子含量，每个标准品三个重复孔。经以上数据算得空白对照的平均值为：0.15425，标准差为：0.014195。
用0.05至0.8ng/mL样本建立回归曲线方程：y＝2.9966x+0.1283，以空白加三倍标准差为检测限，算得本检测方法检测镉离子的检测限为：0.023ng/mL。
实验检测梯度的孔如图2所示。
实施例2
以检测含有不同离子的样品，测试镉离子检测体系的特异性：(1)按照实施例1中的(1)-(3)步骤，准备检测酶标板；
(2)分别以氯化镉，二氯化铅，硝酸汞，三氯化铬，二氯化铜，硫酸镍用双蒸水配置成0.1um的母液，用双蒸水稀释10倍后作为检测样本。
(3)取400μL步骤2中的检测样本，加入30μL、10mM核酸修饰的EGTA螯合剂，混匀后室温静置5分钟。
(4)用纯净水定容样品到500μL。
(5)取80μL步骤(4)所得的溶液加入酶标孔(同期标准品孔也要加入相应浓度镉离子标准品)，室温反应5分钟反应后，PBST清洗一次，PBS清洗三次。
(6)加入100μL的反应液，37度反应30分钟后，加入50μL、2M硫酸溶液终止反应。
(7)酶标仪450nm出检测吸光值。
(8)计算：扣除背景值后，以标准品建立标准曲线，测算检测样品的镉离子含量。结果：含有镉离子的样本吸光值为2.97，其余离子吸光值均小于检测限，接近本底，故未检出。结论：本发明检测方法特异性良好，与其它离子无交叉反应。检测结果见图3。
实施例3
以检测工业排放废水中的镉离子检测为例：
1.按照实施例1中的(1)-(3)步骤，准备检测酶标板；
2.取400μL工业排放废水，0.1M Tris-HCl调节pH值至8.0，加入60μL、10mM核酸修饰的EGTA螯合剂，混匀后室温静置5分钟；3.用纯净水定容样品到500μL；4.取80μL步骤(3)所得的溶液加入酶标孔(同期标准品孔也要加入相应浓度镉离子标准品)，室温反应5分钟反应后，PBST清洗一次，PBS清洗三次；5.加入100μL的反应液，37度反应30分钟后，加入50μL、2M硫酸溶液终止反应；6.酶标仪450nm出检测吸光值。7.计算：扣除背景值后，以标准品建立标准曲线，测算检测样品的镉离子含量。
根据标准品获得的标准曲线为：y＝2.9973x+0.128，样品吸光值平均值为:1.9525，算得的检测样本的含量为:0.61ng/ml。
实施例4其它离子检测(以检测汞离子为例)
硝酸汞为检测靶标，双蒸水梯度稀释至不同浓度(同实施例1)：
1.以10mM PBS溶液稀释汞离子抗体至0.4μg/mL，取该抗体溶液以100μL/孔包被酶标板；
2.37度包被2小时后，去除抗体溶液，用200uL的1wt％脱脂奶粉封闭30分钟；
3.用PBST溶液清洗酶标板三次，烘干备用；
4.用双蒸水分别稀释汞离子浓度至1.2ng/mL，0.8ng/mL，0.4ng/mL，0.2ng/mL，0.1ng/mL，0.05ng/mL，0.02ng/mL，0.00ng/mL作为检测标准品。检测样品以10倍梯度稀释4个梯度，编号检测；
5.取400μL步骤4中的检测样本，加入40μL 10mM核酸修饰的EGTA螯合剂，混匀后室温静置5分钟；
6.用双蒸水定容样品到500μL；
7.取80μL步骤(5)所得的溶液加入酶标孔，室温反应5分钟反应后，PBST清洗一次，PBS清洗三次；
8.加入100μL的反应液，37度反应30分钟后，加入50μL 2M硫酸溶液终止反应；
9.酶标仪450nm出检测吸光值。
10.计算：扣除背景值后，以标准品建立标准曲线，测算检测样品的镉离子含量。
结果：原始吸光值标准如下：
说明：前三列为0ppb对照，4-6列为标准品，自A至H行分别为：1.2、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.00ng/mL的汞离子含量，每个标准品三个重复孔；7-9列为检测样本，A至D行分别为原始样本、稀释101倍样本、稀释102倍样本和稀释103倍样本。
经以上数据算得空白对照的平均值为：0.15425，标准差为：0.011577。用0.02至0.8ng/mL样本建立回归曲线方程：y＝3.0068x+0.1155，以空白加三倍标准差为检测限，算得本检测方法检测镉离子的检测限为：0.025ng/mL。检测样本中，稀释101倍样本在现行区间内，根据此吸光值和回归曲线算得此样品中汞离子浓度C＝10X((0.712+0.731+0.725)/3-0.1155)/3.0068＝2.019ng/mL。
实施例5多重离子检测(以检测镉离子和汞离子为例)
硝酸汞为检测靶标，双蒸水梯度稀释至不同浓度(同实施例1)：
1.以10mM PBS溶液稀释镉离子抗体浓度值0.5μg/mL和汞离子抗体至0.4μg/mL，取该混合抗体溶液以100μL/孔包被酶标板；
2.37度包被2小时后，去除抗体溶液，用200uL的1wt％脱脂奶粉封闭30分钟；
3.用PBST溶液清洗酶标板三次，烘干备用；
4.用双蒸水分别稀释汞离子和镉离子浓度至1.2ng/mL，0.8ng/mL，0.4ng/mL，0.2ng/mL，0.1ng/mL，0.05ng/mL，0.02ng/mL，0.00ng/mL作为检测样本。
5.取400μL步骤4中的检测样本，加入50μL 10mM核酸修饰的EGTA螯合剂，混匀后室温静置5分钟；
6.用双蒸水定容样品到500μL；
7.取80μL步骤(5)所得的溶液加入酶标孔，室温反应5分钟反应后，PBST清洗一次，PBS清洗三次；
8.加入100μL的反应液，37度反应30分钟后，加入50μL 2M硫酸溶液终止反应；
9.酶标仪450nm出检测吸光值。
10.计算：扣除背景值后，以标准品分别建立两种离子的标准曲线。
结果：若设定超过0.3ng/mL为超标样品，通过标准曲线算出镉离子和汞离子样品的对应吸光值分别为1.027和1.017，若样品的吸光值大于1.027则样品中，两种离子的浓度之和一定大于0.3ng/mL，若吸光值小于1.017则两种离子总浓度小于0.3ng/mL，若检测样品吸光值在1.017至1.027之间，则需利用单一抗体标记酶标板分开鉴定该样品。
根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (7)

1.一种重金属离子的定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
在待测样品中加入0.1-50μL、10mM的标记有一段特定核酸序列的螯合剂，用于螯合重金属离子，利用每孔包被有0.01～5μg重金属离子抗体的酶标板富集螯合产物，清洗去除游离核酸后，加入扩增和显色溶液并孵育，反应终止后检测吸光值，计算待测样品中的重金属离子浓度；其中，所述特定核酸序列的长度为20～100nt，且其3’端有一段4～10nt的随机核酸序列引物，所述引物紧连有一个切刻酶位点，其余区段为富C序列。
2.根据权利要求1所述的重金属离子的定量检测方法，其特征在于，所述螯合剂为EDTA、EGTA或PEI。
3.根据权利要求1所述的重金属离子的定量检测方法，其特征在于，通过将所述重金属离子抗体偶联于颗粒物载体上，以代替将重金属离子抗体包被的酶标板。
4.根据权利要求33所述的重金属离子的定量检测方法，其特征在于，所述颗粒物载体的粒径为0.1～1μm，其为磁珠、PS微球或氧化硅微球。
5.根据权利要求4所述的重金属离子的定量检测方法，其特征在于，所述颗粒物载体的外层修饰有氨基、羧基、羟基或环氧基。
6.根据权利要求1所述的重金属离子的定量检测方法，其特征在于，所述扩增和显色溶液用于在30～40℃下，扩增产生大量的单链富G核酸，并发生显色反应。
7.根据权利要求1所述的重金属离子的定量检测方法，其特征在于，所述重金属离子为镉离子。
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