CN108384756A - 中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中国人胰腺癌细胞系sipanc‑187建立方法，包括以下步骤：1.标本采集2.组织消化3.PDX裸鼠荷瘤4.成瘤细胞培养与传代。本发明有益的效果：本发明构建的中国人胰腺癌细胞系sipanc‑187生物学特征为胰腺导管腺癌，其成瘤性良好，具有一定的耐药性，可较好地应用胰腺癌肿瘤、化疗耐药机制研究及中国人胰腺癌相关基因谱系分析等。

Description

中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法
技术领域
本发明涉及一种胰腺癌原代肿瘤细胞建系的方法，主要是一种中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法。
背景技术
胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是最常见的胰腺肿瘤，早期即发生转移，而症状不明显，发现时多数已是晚期，预后极差，确诊后五年生存率往往不足5％，被称为“癌中之王”[1-3]，位于我国男性癌症患者死亡率的第六位[4]。过去基础和临床研究中所用到的胰腺癌细胞系多来源于国外ATCC细胞库，比如Panc-1，Bxpc-3，Miapaca-2，ASPC-1等，其细胞系来源于白种人胰腺癌患者，对我国胰腺癌研究来讲，可能存在一定的种群结构、基因等水平差异。此外，由于胰腺癌本身乏血供[5]、且多肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAF)富集的特性，传统的肿瘤原代细胞建系方法在胰腺癌中的应用受到极大的限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法，该方法包括如下步骤：
(1)、标本采集并制成组织块；
(2)、组织消化：将上述组织块用5mlPBS重悬，加入700ul灭菌水配置的IV型胶原酶，工作浓度1437u/ml；25ul的无菌CaCl2溶液，工作浓度1M；25-30mgBSA粉末，摇床37℃，200转/分，孵育30分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlPBS洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlPBS洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后使用1mlPBS重悬；
(3)、PDX模型建立：将上述细胞计数，计取1*106个细胞，并取100ulPBS重悬稀释，接种5-6周大小裸鼠皮下，接种部位为腋下，荷瘤12-14天后皮下荷瘤模型成瘤；
(4)、组织处理：脱颈椎法处死裸鼠，安全通风柜内手术完整分离PDX肿瘤组织，立即浸入20ml完全培养基，完全培养基采用RPMI 1640配置，含终浓度10％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，安全通风柜内使用20mlPBS反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm3大小组织块；
(5)、组织消化：将上述小组织块用5mlPBS重悬，加入700ul灭菌水配置的IV型胶原酶，工作浓度1437u/ml；25ul的无菌CaCl2溶液，工作浓度1M；25-30mgBSA粉末，摇床37℃，200转/分，孵育30分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlPBS洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlPBS洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后使用1ml完全培养基重悬；
(6)、细胞培养与传代：将上述细胞悬液铺至预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔板2孔，工作浓度10ug/ml，100ul铺孔过夜16小时，第二天1mlPBS反复冲洗3次洗板；加入新的无菌完全培养基，完全培养基采用RPMI 1640配置，含终浓度20％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，放置培养箱培养：37℃，5％CO2(v/v％)，1.5-2小时后小心吸取并弃去未贴壁细胞，重新添加4-5ml完全培养基；隔天换液，定期观察细胞生存情况，细胞长满至70-80％经胰酶消化后转移至25cm2培养瓶培养传代。
作为优选，所述的标本采集：无菌法收集新鲜胰腺癌肿瘤样本，立即浸入20ml完全培养基，完全培养基采用RPMI 1640配置，含终浓度10％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，安全通风柜内使用20mlPBS反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm3大小组织块。
本发明的有益效果为：本发明构建的中国人胰腺癌细胞系sipanc-187生物学特征为胰腺导管腺癌，其成瘤性良好，具有一定的耐药性，可较好地应用胰腺癌肿瘤、化疗耐药机制研究及中国人胰腺癌相关基因谱系分析等。
附图说明
图1为本发明的sipanc-187细胞系普通光镜下形态示意图。
图2为本发明的sipanc-187对常见胰腺癌化疗药物敏感性示意图。
图3为本发明的sipanc-187裸鼠皮下成瘤示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
本发明的建系方法：
1.标本来源：标本取自浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科74岁女性患者，病理诊断：胰腺导管腺癌，TNM分期：T3N1M0。
2.标本采集：无菌法收集新鲜胰腺癌肿瘤样本，立即浸入20ml完全培养基(RPMI1640配置，含终浓度10％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml)，安全通风柜内使用20mlPBS反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm3大小组织块。
3.组织消化：将上述组织块用5mlPBS重悬，加入700ul灭菌水配置的IV型胶原酶(工作浓度1437u/ml)，25ul的无菌CaCl2溶液(工作浓度1M)，25-30mgBSA粉末，摇床37℃，200转/分，孵育30分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlPBS洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlPBS洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后使用1mlPBS重悬。
4.PDX(patient-derived-xenograft)模型建立：将上述细胞计数，计取1*106个细胞，并取100ulPBS重悬稀释，接种5-6周大小裸鼠皮下，接种部位为腋下。荷瘤12-14天后皮下荷瘤模型成瘤。
5.组织处理：脱颈椎法处死裸鼠，安全通风柜内手术完整分离PDX肿瘤组织，立即浸入20ml完全培养基(RPMI 1640配置，含终浓度10％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml)，安全通风柜内使用20mlPBS反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm3大小组织块。
6.组织消化：将上述小组织块用5mlPBS重悬，加入700ul灭菌水配置的IV型胶原酶(工作浓度1437u/ml)，25ul的无菌CaCl2溶液(工作浓度1M)，25-30mgBSA粉末，摇床37℃，200转/分，孵育30分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlPBS洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlPBS洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后使用1ml完全培养基重悬。
7.细胞培养与传代：将上述细胞悬液铺至预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔板2孔(工作浓度10ug/ml，100ul铺孔过夜16小时，第二天1mlPBS反复冲洗3次洗板)，加入新的无菌完全培养基(RPMI 1640配置，含终浓度20％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml)，放置培养箱培养(37℃，5％CO2(v/v％))，1.5-2小时后小心吸取并弃去未贴壁细胞，重新添加4-5ml完全培养基；隔天换液，定期观察细胞生存情况，细胞长满至70-80％可经胰酶消化后转移至25cm2培养瓶培养传代，一般3-4天左右传代一次。目前该sipanc-187传代次数已经超过50代。
本发明建立的中国人胰腺癌细胞系对于研究国人胰腺癌发病机制，侵袭、转移等生物学特征，化疗耐药的分子机制，以及开发抗胰腺癌治疗新药等均有十分重要意义；同时，本发明中公开的中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建系方法也有较大的实际应用价值。
可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)、标本采集并制成组织块；
(2)、组织消化：将上述组织块用5mlPBS重悬，加入700ul灭菌水配置的IV型胶原酶，工作浓度1437u/ml；25ul的无菌CaCl2溶液，工作浓度1M；25-30mgBSA粉末，摇床37℃，200转/分，孵育30分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlPBS洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlPBS洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后使用1mlPBS重悬；
(3)、PDX模型建立：将上述细胞计数，计取1*106个细胞，并取100ulPBS重悬稀释，接种5-6周大小裸鼠皮下，接种部位为腋下，荷瘤12-14天后皮下荷瘤模型成瘤；
(4)、组织处理：脱颈椎法处死裸鼠，安全通风柜内手术完整分离PDX肿瘤组织，立即浸入20ml完全培养基，完全培养基采用RPMI 1640配置，含终浓度10％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，安全通风柜内使用20mlPBS反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm3大小组织块；
(5)、组织消化：将上述小组织块用5mlPBS重悬，加入700ul灭菌水配置的IV型胶原酶，工作浓度1437u/ml；25ul的无菌CaCl2溶液，工作浓度1M；25-30mgBSA粉末，摇床37℃，200转/分，孵育30分钟后，将上述组织悬液自摇床取出，70um级滤网过滤除去未消化组织块，将滤过的细胞悬液加10mlPBS洗涤后，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清，加入5ml裂红液冰上裂解5分钟，再次加10mlPBS洗涤，1500转/分4℃离心5分钟，弃去上清后使用1ml完全培养基重悬；
(6)、细胞培养：将上述细胞悬液铺至预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔板2孔，工作浓度10ug/ml，100ul铺孔过夜16小时，第二天1mlPBS反复冲洗3次洗板；加入新的无菌完全培养基，完全培养基采用RPMI 1640配置，含终浓度20％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，放置培养箱培养：37℃，5％CO2(v/v％)，1.5-2小时后小心吸取并弃去未贴壁细胞，重新添加4-5ml完全培养基；隔天换液，定期观察细胞生存情况，细胞长满至70-80％经胰酶消化后转移至25cm2培养瓶培养传代。
2.根据权利要求1所述的中国人胰腺癌细胞系sipanc-187建立方法，其特征在于：所述的标本采集：无菌法收集新鲜胰腺癌肿瘤样本，立即浸入20ml完全培养基，完全培养基采用RPMI 1640配置，含终浓度10％FBS(v/v％)及青霉素/链霉素双抗各100mg/ml，安全通风柜内使用20mlPBS反复冲洗组织，洗净并去除肉眼可见血块及坏死组织，取直径1*1*1-1.5*1.5*1.5cm大小肿瘤，将其剪碎成为1mm3大小组织块。
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