CN108368550B - 用于特发性脊柱侧凸的诊断/预后的试剂盒和方法 - Google Patents
用于特发性脊柱侧凸的诊断/预后的试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于诊断或检测特发性脊柱侧凸，特别是AIS的方法，以及一种用于在人受试者中预测该疾病的方法。
Description
技术领域
本发明一般涉及青少年特发性脊柱侧凸(AIS)检测和预后领域，更特别地涉及用于AIS的检测/预后的血浆循环microRNAs。
背景技术
在不限制本发明范围的情况下，其背景描述与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)有关。
脊柱畸形，特别是脊柱侧凸，是儿童和青少年中最普遍的矫形畸形类型。特发性脊柱侧凸代表最常见的脊柱侧凸形式(诊断为脊柱侧凸的青少年中有70-80％是特发性的)。青少年特发性脊柱侧凸(AIS；OMIM 181800)是引起多达10度的冠状面失衡的三维脊柱畸形。其影响全世界2-4％的18岁以下人口，这使其成为这个阶段最常见的脊柱畸形(Konieczny MR,Senyurt H,Krauspe R.Epidemiology of adolescent idiopathicscoliosis.J Child Orthop.2013Feb；7(1):3-9)。AIS主要影响女性个体(约85％)(Lonstein J.E.Adolescent idiopathic scoliosis.The Lancet.1994；344:1407-1412)。在严重的病例中，女性占主导地位，虽然在轻微弯曲中，男女之间的比例为1：1。但是，女性与男性的比例随着年龄而大幅增加。特别地，女性中具有较高Cobb角(>40°)的弯曲患病率升至7.2:1(Konieczny MR,Senyurt H,Krauspe R.Epidemiology of adolescentidiopathic scoliosis.J Child Orthop.2013Feb；7(1):3-9)。临床特征为疼痛、美观上畸形和肺功能改变。遗传和表观遗传学(环境相互作用、生活方式、重力和营养)是造成这种疾病的原因，所以AIS的诊断和预后使得临床决策成为挑战(Burwell R.G.,DangerfielP.H.,Moulton,A.,Grivas T.B.Adolescent idiopathic scoliosis(AIS),environment,exposome and epigenetics:a molecular perspective of postnatal normal spingrowth and the etiopathogenesis of AIS with consideration of a networkapproach and possible implications for medical therapy.Scoliosis.2011,6:26)。患者意识到，许多未知因素使其生活恶化，而且治疗往往是无效的、侵入性的、且代价高。脊柱侧凸患者由于频繁的X射线暴露而导致健康风险(癌症、白内障、皮肤变红等)增加(TheNational Scoliosis Foundation；http://www.scoliosis.org/info.php)(Knott,P.,etal.SOSORT2012consensus paper:reducing x-ray exposure in pediatric patientswith scoliosis.Scoliosis.2014；9:4)。
目前，美国的Transgenomic Inc.(www.scoliscore.com)已经有商品化的AIS预后测试。该测试基于基因突变(53个基因座)的识别，所述基因突变提供了发展严重AIS的长期易感性。然而，不幸的是，该产品对AIS进展分析没有用，因为该产品是基于对基因中53个多态性的分析，并且患者的基因不随时间而改变。此外，由ScoliScore Test提供的分析不能在医院的临床分析单元中进行，原因之一是样品必须送到Transgenomic实验室。另外，这样的测试不会改变可用的治疗选择(Julien C.,et al.Towards a comprehensivediagnostic assay for scoliosis.Personalized Medicine 2013；10(1),97-103)。
为了克服上述问题，临床医生需要新AIS诊断和预后工具来：
-在使用医院原有设备且对健康专业人员/顾客不进行特定培训或进行极少特定培训的情况下检测特发性脊柱侧凸，特别是AIS。优选地，其也应该便于早期检测和治疗，从而对长期结果(如Scoliosis Patients Europe,scolpat.eu/scoliosis/所要求的)提供积极影响，
-预测AIS患者的临床进展，
-以一致的方式安排到医院的就诊，使X射线探查减至最少，
-决定用支架和脊椎手术进行初步治疗的最佳时间，
-监测有时为AIS患者推荐的锻炼的积极效果，
-了解无数影响AIS倾向性和发病机制的因素，以及
-还应在家族性AIS病例中识别出危险患者，使年轻患者对其不仅要遭受身体限制和生理问题、而且还要遭受美学上的骨骼畸形做好心理准备。
发明内容
本发明通过提供可有助于改善患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的患者的特征的新表观遗传标志物，特别是microRNAs，解决上述问题，且本发明是基于一项以AI的表观遗传概况的实验分析为基础的前瞻性研究。
特别地，本发明包括一种用于诊断或检测特发性脊柱侧凸,特别是AIS的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs中的至少一种或组合的表达模式或水平，所述microRNAs选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品中获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的生物样品的microRNAs中的至少一种或组合的总表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNAs的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523中的至少一种或组合的表达变化指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
优选地，本发明包括一种用于诊断或检测特发性脊柱侧凸，特别是AIS的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的至少hsa-miR-223-5p的表达模式或水平；并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述生物样品的至少hsa-miR-223-5p的表达模式与来自正常受试者的生物样品的至少所述microRNA的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中至少hsa-miR-223-5p的表达变化指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
附图说明
图1.在NGS分析后，AIS中差异表达的miRNAs的分层聚类热图。通过随机森林分析和Robinson和Smyth检验选择miRNAs的表达水平。对原始计数值进行了对数转换，并根据其相应的对照组(C)或AIS患者组(P)对样品进行了整理。
图2.与对照健康受试者相比，在AIS患者血浆中发现的、具有不同表现的miRNAs的相对表达水平。通过RT-qPCR分析的miRNAs的相对表达水平的箱形图，其以miR-191作为内源性对照进行归一化，并使用2-ΔΔCt方法进行计算。a)miR-122(倍数变化，FC＝2.5；p<0.05)；b)miR-27a(FC＝1.75；p<0.05)；c)miR-223(FC＝1.75；p<0.001)；d)miR-1306(FC＝1.12；p＝0.58)；和e)miR-671(FC＝0.76；p<0.05)。根据其相应的对照组(C)或AIS患者组(P)对样品进行了整理。应用独立样品t检验。p<0.05则认为表示显著性差异。
图3.通过RT-qPCR验证的、用于诊断AIS的4-miRNA标签的接受者操作特征曲线分析。我们的模型使用由miR-122、miR-27a、miR-223和miR-1306组成的一组4-miRNA标签，得到0.95的AUC值(CI：0.89-1)。当使用最佳切点时，所有4-miRNA产生92.9％的灵敏度和72.7％的特异性。
公式1。根据确定的循环miRNA水平，计算在人受试者中患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的概率的算法。
图4.通过RT-qPCR验证的、用于AIS中高风险重度弯曲的4-miRNA标签的接受者操作特征曲线分析。我们的模型使用由miR-122、miR-27a、miR-223和miR-1306组成的一组4-miRNA标签，得到0.90的AUC值(CI：0.79-1)。当考虑50％的高风险概率，使用最佳切点时，所有4-miRNA产生33.3％的灵敏度和84.0％的特异性。
公式2。根据确定的循环miRNA水平，计算在人受试者青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中接受与高风险弯曲相关的不良预后的概率的算法。
公式3。根据从小RNA测序数据获得的确定的归一化读数值，计算在人受试者中患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的概率的算法。
图5.通过qRT-qPCR验证的、用于诊断AIS的miR-122的接受者操作特征曲线分析。AUC值为0.6652(CI：0.4923-0.8381)。
图6.通过qRT-qPCR验证的、用于诊断AIS的miR-223的接受者操作特征曲线分析。AUC值为0.8764(CI：0.767-0.9859)。考虑到ROC构建过程中获得的灵敏度值和特异性值，我们可以得到80％灵敏度值和75％特异性。
图7.通过qRT-qPCR验证的、用于诊断AIS的miR-1306的接受者操作特征曲线分析。AUC值为0.5417(CI：0.3642-0.7191)。
图8.通过qRT-qPCR验证的、用于诊断AIS的miR-27a的接受者操作特征曲线分析。AUC值为0.6358(CI：0.4132-0.8584)。
具体实施方式
本发明构成对作为AIS患者和健康对照的生物标志物的循环miRNAs的综合研究的首次报道。我们的结果表明，血浆中的循环miRNAs可以作为AIS的生物标志物，如此提供一种用于诊断和预测AIS的新方法，从而在进展监测中避免了反复的X射线照射。在这个背景下，本发明的发明人已经发现在AIS患者和对照之间显著差异表现的miRNAs新生物标签。使用这些选定的基于miRNAs差异表现的生物标签，可以以高特异性和灵敏度将AIS患者与健康受试者区分开。
在此呈现的诊断/预后方法是基于表观遗传学。表观遗传学基因调控是指染色质的特定结构和化学构型如何翻译为基因转录状态的确定结果。换句话说，细胞代谢、环境、营养和生活方式激活的分子机制如何调节我们的基因的表达。上述干预通过三种重要机制对细胞的表观遗传密码产生重大影响，该三种重要机制由DNA甲基化、非编码RNAs(micorRNAs和lncRNAs)和组蛋白翻译后修饰组成(Handbook of Epigenetics:The NewMolecular and Medical Genetics.Ed.Trygve Tollefsbol.Academic Press.ElsevierNew York.2011)。
特别地，本诊断/预后方法是基于动态生物标志物(表观遗传学：microRNAs或miRNAs)而不是静态生物标志物(遗传学：SNPs)，后者仅提供疾病的静态图片，鉴定疾病的一些遗传贡献者。因此，与包括DNA测试的常规诊断测试相比，本发明提供了颠覆性诊断技术。
具体而言，本发明提供新表观遗传标志物，特别是可以有助于改善患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的患者的表征的microRNAs，并且其首先是基于一项以AIS表观遗传概况的实验分析为基础的前瞻性研究。此研究纳入了总计30名患者和13名健康受试者，且从该组中选择17名AIS患者和10名健康受试者进行miRNAs第二代测序研究(NGS)。为了比较AIS患者样品的NGS结果与来自健康供体的样品的NGS结果，计算了随机森林模型。统计分析后，与对照相比，来自AIS患者的循环miRNAs显示差异表达模式。实际上，由6个miRNAs形成的标签能够将患者与对照区分开，提供关于这些miRNAs在此病理学中的作用的分子信息。由这6种miRNAs形成的标签的随机森林模型的交叉验证的准确度达到100％(100％灵敏度和100％敏感度)。所述6-miRNA生物标签由以下生物标志物组成：hsa-miR-671-5p、hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-223-5p和hsa-miR-122-5p。
与健康个体相比，miRNAs hsa-miR-671-5p和hsa-miR-1306-3p在AIS患者中低表达，而miRNAs hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-27a-5p在AIS患者中过表达。在hsa-miR-223-5p和hsa-miR-122-5p的情况下，这些miRNAs在患者血浆中均匀地过表达，但是在对照中其表达是不均匀的。
另外，本发明的发明人证实了上述结果，并且认识到来自上述生物标签的子集(即由hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p形成的生物标签)的曲线下面积为0.95，95％在[0.89,1]之间，并且该测试的敏感度为92.9％，且其特异性为72.7％。
最后，本发明的发明人已经验证了由6种miRNAs形成的标签和该标签的特定子集如由hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p形成的一个子集的有用性，以预测AIS患者的临床进展(参见实施例和图4)。
本发明的发明人一验证上述生物标签，他们就继续进行小RNA测序和逻辑回归法。实施例3中显示了由小RNA测序数据获得的结果。在这些结果的基础上，发明人进一步选择miRNAs：hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p，与对照相比，所有这些miRNAs在患者中都上调，而与对照相比，hsa-miR-320b和hsa-miR-4523在患者中下调。
此外，如实施例4中所示，发明人将hsa-miR-223鉴定为能够以曲线下面积为0.8764；95％CI：0.767-0.9859通过自身将病例与对照区分开的miRNA。
在这些结果的基础上，发明人构建了不同的模型，以便为AIS诊断选择最佳的miRNAs组合。为此，发明人从由小RNA测序和逻辑回归方法发现的miRNAs(“hsa-miR-27a-5p”、“hsa-miR-320b”、“hsa-miR-1226-5p”、“hsa-miR-142-5p”、“hsa-miR-4523”、“hsa-miR-223”)和/或先前通过小RNA测序和随机森林方法发现的、通过qRT-PCR验证的那些miRNAs(“hsa-miR-122-5p”、“hsa-miR-1306-3p”、“hsa-miR-27a-5p”、“hsa-miR-223”)中选择不同的miRNAs组合。由于在两种分析中均鉴定出“hsa-miR-27a-5p”、“hsa-miR-223”，且hsa-miR-223是能够以曲线下面积：0.8764；95％CI：0.767-0.9859通过自身将病例与对照区分开的miRNA，因而所分析的所有测试组合都包含miR-223。
拟合逻辑回归模型，并计算每个可能组合(2^7＝128个组合)的AIC值(赤池信息准则Akaike Information Criterion)。发明人获得了10个具有最佳AIC值的模型。每个模型中涉及的miRNAs如下：
1.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-1306-3p；
2.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-320b和hsa-miR-4523；
3.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1306-3p；
4.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-142-5p和hsa-miR-1306-3p；
5.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-320b和hsa-miR-142-5p；
6.hsa-miR-223-5p和hsa-miR.27a.5p和hsa-miR-1226-5p；
7.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-320b和hsa-miR-1226-5p；
8.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-4523和hsa-miR-1306-3p；
9.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-4523；
10.hsa-miR-223-5p和hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-20b。
因此，在一个方面，本发明包括用于诊断或检测人受试者中特发性脊柱侧凸，特别是AIS的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs中的至少一种或多种的表达模式或水平，该microRNAs选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述生物样品的所述一种或多种microRNAs的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNA/s的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523中的任何一个的表达变化指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
在该方面的一个实施例中，本发明包括一种用于诊断或检测人受试者中的青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的至少hsa-miR-223-5p的表达模式或水平；并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述一种或多种生物样品的所述microRNA的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNA的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中hsa-miR-223-5p的表达变化指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。优选地，其中hsa-miR-223-5p的过度表达或过量表达指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
在该方面的一个实施例中，本发明包括用于诊断或检测人受试者中的青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs的表达模式或水平，所述microRNAs至少选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品中获得的以下任何一个miRNAs组合：
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-142-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-4523和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-320b；
并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述一种或多种生物样品的上述microRNAs组合中的任何一个组合的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNAs组合的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中所述组合的表达变化指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
应该注意，为了进行上述确定：即确定AIS存在于受试者中，请考虑hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-142-5p，与对照组相比，所有这些miRNAs在患者中均上调，且与对照组相比，hsa-miR-320b和hsa-miR-4523在患者中下调。
在该方面的一个实施例中，本发明包括一种用于诊断或检测人受试者中的青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs的表达模式或水平，所述microRNAs至少选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述一种或多种生物样品的所述microRNAs组合的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNAs组合的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p的组合的表达变化指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
在该方面的一个实施例中，本发明包括一种用于诊断或检测人受试者中的青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的方法，其包括以下步骤：从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs的表达模式或水平，所述microRNAs至少选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；并比较来自怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述一种或多种生物样品的microRNAs组合的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNAs组合的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p的组合的过度表达或过量表达指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
优选地，在本发明的此实施例中，按照本发明的方法，通过使用血浆样品，根据以下公式计算在人受试者中患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的概率：
在此使用的hsa-miR-122-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-142-5p的“过度表达或过量表达”理解为与内源性对照hsa-miR-191相比，从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的人受试者获得的生物样品中大于1.5的表达(参见图2)。对于通过小RNA测序分析认为是hsa-miR-122-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-142-5p“过度表达或过量表达”的那些miRNAs，得到FDR<0.5和正的logFC(对数倍数变化)。
在此使用的hsa-miR-1306-3p的“过度表达或过量表达”理解为与内源性对照hsa-miR-191相比，在从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的人受试者获得的生物样品中大于1.1的表达(参见图2)。
在此使用的hsa-miR-671-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-4523的“过度表达或过量表达”理解为与内源性对照hsa-miR-191相比，从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的人受试者获得的生物样品中小于0.8的表达(参见图2)。对于通过小RNA测序分析认为是hsa-miR-671-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-4523的“低表达或表达不足”的那些miRNAs，得到FDR<0.5和负的logFC(对数倍数变化)。
在此使用的“过度表达或过量表达”或“低表达或表达不足”优选通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、实时定量PCR或测序，特别是小RNA测序，来确定。
在本发明该方面的另一个实施例中，所述方法还包括与来自正常受试者的表达相比，对hsa-miR-671-5p中的至少一种的分析；优选地，其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p的组合的过度表达或过量表达以及hsa-miR-671-5p的低表达或表达不足指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
在本发明该方面的另一个实施例中，所述一种或多种生物样品选自一种或多种生物流体、血浆样品、血清样品、血液样品、组织样品或粪便样品，优选血浆或血液样品。
在另一个实施例中，所述方法能够检测早期特发性脊柱侧凸，特别是AIS。在本发明该方面的又一个实施例中，所述方法包括90％、91％、92％、93％、94％、或95％或更大的置信区间。
在本发明该方面的另一个实施例中，通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、实时定量PCR、终点法PCR、多重终点法PCR、冷PCR(cold PCR)、微滴式数字PCR(ddPCR)、冰冷PCR(ice-cold PCR)、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交、或核酸测序，特别是小RNA测序，来测量所述microRNAs的表达水平。
在另外一个的方面，本发明包括一种用于预报(预测)人受试者中特发性脊柱侧凸，特别是AIS的临床进展的方法，其包括以下步骤：从患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs中的至少一种或多种的表达模式或水平，所述microRNAs选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；并比较来自患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述生物样品的一种或多种microRNAs的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNA/s的表达模式，其中所述正常受试者是未患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的健康受试者，并且其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523中至少一种或多种的表达变化指示不良临床进展。术语“不良临床进展”理解为疾病由轻度畸形(Cobb角为10-25)至患者需要支撑的中度弯曲(Cobb角为25°-35)且临床进展至重度弯曲(>45℃obb角)，从而导致患者的手术脊柱矫正的进程。
在一个实施例中，本发明包括一种用于预报(预测)人受试者中特发性脊柱侧凸，特别是AIS的临床进展的方法，其包括以下步骤：从患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs中的至少一种或多种microRNAs的表达模式或水平，所述microRNAs选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；并比较来自患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述生物样品的所述一种或多种microRNAs的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNA/s的表达模式，其中所述正常受试者是未患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的健康受试者，并且其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和/或hsa-miR-122-5p中至少一种或多种的过度表达或过量表达指示不良临床进展。
本发明的另外一个的实施例包括一种用于预报(预测)人类受试者中特发性脊柱侧凸，特别是AIS的临床进展的方法，其包括以下步骤：从患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs的表达模式或水平，所述microRNAs至少选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；并比较来自患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述一种或多种生物样品的microRNAs组合的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNAs组合的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中has-miR-1306-3p、has-miR-223-5p、has-miR-27a-5p和has-miR-122-5p的组合的表达变化指示不良临床进展。
本发明的另外一个实施例包括一种用于预报(预测)人受试者中特发性脊柱侧凸，特别是AIS的临床进展的方法，其包括以下步骤：从患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得一种或多种生物样品；测量microRNAs的表达模式或水平，所述microRNAs至少选自从所述受试者的所述一种或多种生物样品获得的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；并比较来自患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者的所述一种或多种生物样品的microRNAs组合的表达模式与来自正常受试者的生物样品的所述microRNAs组合的表达模式，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者，并且其中has-miR-1306-3p、has-miR-223-5p、has-miR-27a-5p和has-miR-122-5p的组合的过度表达或过量表达指示不良临床进展。
优选地，在本发明的该实施例中，根据本发明的方法，通过使用血浆样品，根据以下公式计算接受不良临床进展的概率：
在本发明该方面的另一个实施例中，所述方法还包括与来自正常受试者的表达相比，对hsa-miR-671-5p的至少一种的分析；优选地，其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p的组合的过度表达或过量表达和hsa-miR-671-5p的低表达或表达不足指示不良临床进展。
在本发明该方面的另一个实施例中，所述一种或多种生物样品选自一种或多种生物流体、血浆样品、血清样品、血液样品、组织样品、或粪便样品，优选血浆样品。在本发明该方面的又一个实施例中，所述方法包括90％、91％、92％、93％、94％或95％或更大的置信区间。
在本发明该方面的另一个实施例中，通过微阵列表达谱、PCR、逆转录酶PCR、逆转录酶实时PCR、实时定量PCR、终点法PCR、多重终点法PCR、冷PCR、微滴式数字PCR(ddPCR)、冰冷PCR、质谱分析法、原位杂交(ISH)、多重原位杂交或核酸测序，特别是小RNA测序，来测量所述microRNAs的表达水平。
在本发明的另一方面中，本发明的预后或诊断方法用于治疗处于特发性脊柱侧凸，特别是AIS风险中或患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的患者，为处于特发性脊柱侧凸，特别是AIS风险中或患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的患者选择合适疗法，开发用于诊断特发性脊柱侧凸，特别是AIS的试剂盒或其任何组合。另一方面，在此所述的方法进一步包括使用microRNAs的总表达模式或水平以进行治疗指导或监测对特发性脊柱侧凸，特别是AIS的治疗的应答。根据本发明的所述方法诊断的患者的优选治疗方法是支架或手术。临床医生很难决定用支架或手术进行初始治疗的最佳时机(Cédric Julien KFG,Marie-YvonneAkoume,Alain Moreau:Towards a Comprehensive Diagnostic Assay forScoliosis.Personalized Medicine 2013,10(1):97-103)。此外，遗传和表型异质性显然增加了研究复杂疾病如AIS的难度。因此，关于AIS患者最佳治疗的决定进一步复杂化。
在不久的将来，可以通过量身定制的药物治疗来预防脊柱侧凸，这需要症状前测试的开展和验证，以鉴定处于患上脊柱侧凸的风险中的儿童。此外，体育锻炼也显示这种治疗干预在AIS中的有益效果(Bas P,Romagnoli M,Gomez-Cabrera MC,Bas JL,Aura JV,Franco N,Bas T.Beneficial effects of aerobic training in adolescent patientswith moderate idiopathic scoliosis.Eur Spine J.2011Aug；20Suppl 3:415-9)。
作为治疗特发性脊柱侧凸的手段，调节脊柱生长的策略存在发展潜力。这种调节可能由基因表达调控或机械性质组成。据我们所知，没有任何的药物被批准用于特发性脊柱侧凸治疗。然而，在使用从小RNA测序获得的数据的我们的分析中使用的计算方法显示检测到的miRNAs参与骨代谢，从而将表观遗传学与AIS的病原学联系起来。我们的miRNAs靶向基因参与骨代谢、成骨细胞生成和破骨细胞生成。因此，在此描述的miRNAs可以用于监测将来施加的、用于改善AIS的任何疗法，主要是那些针对调节骨代谢的那些疗法的效果。
此外，存在影响骨代谢的药物(即肝素、华法林、环孢菌素(cyclosplorin)、糖皮质激素、醋酸甲羟孕酮，噻嗪类利尿剂和肽/蛋白衍生物如骨形态发生蛋白等)(Wolinsky-Friedland M.Drug-induced metabolic bone disease.Endocrinol Metab Clin NorthAm 1995；24:395；Davidge Pitts CJ,Kearns AE.Update on medications with adverseskeletal effects.Mayo Clin Proc 2011；86:338)。最近，已经提出使用褪黑激素来防止骨降解并促进骨形成。重要的是，褪黑激素可以降低RANK mRNA的表达(H.Koyama,O.Nakade,Y.Takada,T.Kaku,and K.-H.W.Lau,“Melatonin at pharmacologic dosesincreases bone mass by suppressing resorption through down-regulation of theRANKL-mediated osteoclast formation and activation,”Journal of Bone andMineral Research,vol.17,no.7,pp.1219–1229,2002)。另外，褪黑激素缺乏会诱发脊柱侧凸弯曲并减少颈椎的平均重量和长度，这可能是由于骨细胞总数的减少(M.Turgut,S.Kaplan,A.T.Turgut,et al.,“Morphological,stereological and radiologicalchanges in pinealectomized chicken cervical vertebrae,”Journal of PinealResearch,vol.39,no.4,pp.392–399,2005)。
在本发明的另一方面，如果本发明的诊断方法指示受试者中存在特发性脊柱侧凸，特别是AIS，则可以任选地通过X射线探查来确认所述诊断。从这个意义上说，目前AIS诊断的黄金标准由X射线探查组成。患有脊柱侧凸的患者在3年内平均暴露于23次射线成像术(Knott P,Pappo E,Cameron M,Demauroy J,Rivard C,Kotwicki T,Zaina F,Wynne J,Stikeleather L,Bettany-Saltikov J et al:SOSORT 2012consensus paper:reducingx-ray exposure in pediatric patients with scoliosis.Scoliosis 2014,9:4)。Ronckers等人追踪在脊柱侧凸治疗和随访期间平均暴露于23次射线成像术的5513名女性，发现AIS患者的死亡风险比一般人群高46％，约23％的病例的主要死亡原因是癌症(Ronckers CM,Land CE,Miller JS,Stovall M,Lonstein JE,Doody MM:Cancermortality among women frequently exposed to radiographic examinations forspinal disorders.Radiat Res 2010,174(1):83-90)。在这方面，有必要增加对AIS中发生的病理生理事件的了解和揭示分子生物标志物以产生准确且无风险的新诊断工具(CédricJulien KFG,Marie-Yvonne Akoume,Alain Moreau:Towards a ComprehensiveDiagnostic Assay for Scoliosis.Personalized Medicine 2013,10(1):97-103)。本发明通过提供血液衍生物中的一系列新循环miRNAs来解决这个问题，该循环miRNAs可以用于AIS的诊断，避免X射线探查的反复使用。使用在此描述的任何miRNA标签都有可能避免重复的X射线探查，并且仅使用X射线成像术进行确认性诊断并准备手术干预。
本发明的又一个方面包括用于特发性脊柱侧凸，特别是AIS检测或进程的生物标签，其中所述生物标志物至少包含microRNAs hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p，或本发明第一方面中定义的miRNAs组合中的任何一种，并且当与来自同一患者的较早时间点获得的生物样品中的上述microRNAs的总表达相比时，从患者获得的生物样品中的上述microRNAs组合中的任何一种的总表达变化，指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS进展，或者当与从健康受试者获得的生物样品中的总表达相比时，指示检查到特发性脊柱侧凸，特别是AIS。
本领域技术人员将认识到，很多时候，生物标签(试验)可以包括过表达的和低表达的(在生物流体中表达不足)的microRNAs组合。如此，在某些实施例中，本发明还包括来自各microRNAs的过表达的和低表达(或表达不足)的microRNAs组合。特别地，所述生物标签可以包括hsa-miR-671-5p和/或hsa-miR-1226-5p中的至少一个。
本发明的又一方面包括一种用于诊断和/或预报(预测)特发性脊柱侧凸的试剂盒。所述试剂盒可包括以下物质：(i)PCR引物，其用于定量确定生物样品，优选生物流体，更优选血浆和/或血清中的一种或多种miRNAs的量。在这个意义上，用于特发性脊柱侧凸的诊断和/或预后的试剂盒可以包含实施本发明的前述方面中描述的任何一种方法所必需的引物和探针。
仅作为例子，使用两种不同的方法进行逆转录：miRNA特异性或通用型逆转录。具体地，在miRNA特异性方法中，使用茎环特异性逆转录引物逆转录miRNAs。为用于miRNA特异性方法的试剂盒而设的茎环引物优选包含与miRNA 3'末端已知序列互补的区域，下表中说明了用作本发明的试剂盒的茎环引物的最小区域的这些区域：
另外，茎环引物可以含有短单链，双链部分(茎)以及含有通用引物结合序列的环。无论如何，所得cDNA随后用作定量RT-PCR的模板，定量RT-PCR使用1个miRNA特异性引物，第二通用引物和TaqMan PCR技术的探针。下表说明了用于本发明试剂盒的这些特异性引物：
在本发明该方面的一个实施例中，用通用引物对miRNA进行反转录。miRNA的3'末端分别以poly(A)尾巴延伸或与通用寡核苷酸和寡聚胸腺嘧啶(oligo(dT))或互补通用寡核苷酸作为反转录引物连接。扩增需要特异性引物和通用引物。下表说明了用于本发明试剂盒的特异性引物的实例：
在该方面的又一个实施例中，本发明包括用于诊断特发性脊柱侧凸，特别是AIS的试剂盒，其包括：生物标志物检测试剂(参见上文所述检测试剂的实例)，优选引物和探针，用于确定hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5pmicroRNAs的差异表达水平，其中hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p的组合的过度表达或过量表达指示特发性脊柱侧凸，特别是AIS，其中青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的置信区间为90％或更高。
在这个方面的又一个实施例中，本发明包括一种用于诊断特发性脊柱侧凸，特别是AIS的试剂盒，其包括：生物标志物检测试剂(参见上文)，优选引物和探针，用于确定hsa-miR-223-5p或选自以下列表的microRNAs组合的差异表达水平：
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-142-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-4523和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-320b；
-hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；或
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；
在本发明该方面的一个实施例中，所述试剂盒还包含用于检测和分析hsa-miR-671-5p和/或hsa-miR-1226-5p中的至少一种的试剂。
在另一个实施例中，所述试剂盒进一步包含用于诊断特发性脊柱侧凸，特别是AIS的风险的操作指南，其中所述操作指南包括逐步指导以在测量从怀疑患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的受试者获得的样品的表达时，比较所述microRNAs的表达水平与从正常受试者获得的样品的表达水平，其中所述正常受试者是未患有特发性脊柱侧凸，特别是AIS的健康受试者。
在另一方面，所述试剂盒进一步包括从受试者获得样品所必需的工具、容器和试剂，所述样品选自一种或多种生物流体、血浆样品、血清样品、血液样品、组织样品或粪便样品，优选血浆样品。
在本发明该方面的再一个实施例中，所述试剂盒包含用于确定上述任何一种引物组合的差异表达水平以检测microRNAs的生物标志物检测试剂，例如用于反转录反应的RT寡核苷酸引物池(茎环)、dNTPs、逆转录酶、缓冲液、用于microRNA反转录的RNase抑制剂和/或无核酸酶的水，以及DNA聚合酶，dNTPs(无dUTP)，荧光染料作为被动参照，和优选地标记的寡核苷酸引物和探针，以及PCR缓冲液以在Real-Time PCR***中进行PCR扩增反应。优选地，所述试剂盒进一步包含内源性对照，例如在大多数测序样品中显示稳定的hsa-miR-191。
本发明的所述试剂盒可以是微阵列芯片、q-PCR微流体卡、q-PCR单管，条带中的q-PCR槽或q-PCR板(96或384孔规格)的形式。
而且，本发明的另一方面涉及包含生物标志物检测试剂的试剂盒在诊断或检测人受试者特发性脊柱侧凸，特别是AIS，和/或预报(预测)人受试者特发性脊柱侧凸，特别是AIS的临床进展上的体外用途，所述生物标志物检测试剂用于测定以下任一种microRNAs组合的表达水平：
-hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和/或hsa-miR-4523，优选地至少hsa-miR-223-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-142-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-4523和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-320b；或
-hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；
-hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；或
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；
或其任何组合。
在该方面的优选实施例中，用于本发明该方面的用途的所述试剂盒如本发明的前述方面所定义。
所述试剂盒的另外的优选用途是用于治疗指导，或监测对特发性脊柱侧凸，特别是AIS治疗的应答。
本发明的又一方面包括适用于实现本发明的任何所述方法的计算机程序。此外，包含上述计算机程序的设备也形成本发明以及其在诊断/预测人受试者中青少年特发性脊柱侧凸(AIS)上的用途的一部分。
最后应注意的是，尽管在此所述的诊断和预测方法通过测量受试者的分离的生物样品中的生物标签的表达模式并比较所述测量结果与来自正常或健康受试者的生物样品的所述生物标签的表达模式来执行，这种比较也可以用已经确定的表达模式或水平，或者使用归一化和已知浓度的合成miRNAs作为参考值来执行。miRNAs合成序列应该包含表2中描述的miRNAs的共有序列。
此外，还要指出的是，在现有技术中已知有各种用于确定表达的阈值或截断水平的统计和数学方法。例如，可以基于来自接受者操作特征(Receiver OperatingCharacteristic，ROC)图的数据来选择特定生物标志物的阈值或截断表达水平。本领域技术人员将会理解，可以改变这些阈值或截断表达水平，例如，通过沿特定生物标志物或其组合的ROC图移动，以获得不同的灵敏度值或特异性值，从而影响整体测试性能。例如，如果从临床角度看，目标是提供一个稳健的诊断方法，我们应该尝试取得高灵敏度。但是，如果目标是提供一个有成本效益的方法，我们应该尝试获得高度特异性。最佳截断是指从特定生物标志物的ROC图获得的、产生最佳的灵敏度和特异性的值。在阈值(截断)范围内计算灵敏度和特异性值。因此，可以选择所述阈值或截断值使得在至少60％所测试的患者群体中，或至少65％、70％、75％或80％所测试的患者群体中，灵敏度和/或特异性为至少约70％，并且可以是，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％。
通过以下实施例来进一步说明本发明，该实施例仅举例说明本发明而不是对本发明进行限制。
实施例
实施例1.材料与方法
研究设计和群体
本研究是基于对AIS表观遗传学概况的实验分析的前瞻性研究。患者12-18岁，诊断为AIS，其Cobb角大于15°，且有明显的脊柱侧凸、下背腰痛和无神经***症状。
患者组的纳入标准为诊断为AIS，其Cobb角大于15°，且有明显的脊柱侧凸，最短随访为2年，无既往手术治疗，可用射线成像术，年龄在12-18岁之间。
排除标准为：吸烟者、提取期间有活性感染或炎症过程、摄入抗氧化剂、神经***病状、先天性综合征病状以及由于继发性病因造成的脊柱侧凸患者。
在这项研究中，在伦理委员会批准且签署知情同意后，将受到AIS影响的受试者和健康受试者纳入该研究中。还收集了对在CIBERER Biobank(www.ciberer-biobank.es)上创建的AIS公共样品库的知情同意。
物理和放射学探查
物理检查由以下参数的测量组成：年龄、性别和体重指数(BMI)(Kg/cm2)。
进行完整的神经***探查，包括运动和感觉平衡、腹壁反射以及膝盖和跟腱反射(platellar and Achielles reflexes)。
通过铅垂测试进行冠状和矢状平衡评估。
使用脊柱侧凸研究会(Scoliosis Research Society，SRS)脊柱侧凸测量仪，在Adam测试上进行椎体旋转评估，最后使用由肩、肩胛骨、胸和骨盆不对称性评估组成的躯干美学临床评估(TRACE)形式进行畸形临床评估。除了TRACE形式之外，对对照组的物理评估相同。
对所纳入的所有患者进行放射学研究，其基于两条固定的X射线，前后位和侧位视图。其强加于头骨至骨盆。采用Risser法测量骨骼成熟度，而采用Cobb法测量冠状畸形。在矢状面上，测量T5-T12脊柱后凸(正常值指定为10°至40°)、T12-S1脊柱前凸(正常值指定为37°至47°)、骨盆入射角(正常值47°-57°)和骨盆倾斜角(正常值9°-15°)。最后，考虑了冠状(C7-CSVL线)和矢状(C7-S1线)平衡。根据SRS标准，对于本研究，当畸形冠状面值达到10Cobb度时，认为诊断出脊柱侧凸。还收集了使用脊柱侧凸Lenke分类***为每个患者进行的畸形分类(表1)。
表1.参与本研究的患者的Lenke分类
PT：上胸弯；MT：主胸弯；TL/L：胸腰/腰弯
最后，所纳入的所有个体均完成了脊柱侧凸和一般健康问卷，具体地，患者组为SRS-22、CAVIDRA和SF-36，对照组为SF-36。
由于AIS的起源并没有明确的解释，单纯的遗传学分析并不能完全解释AIS的病理生理学和预后，因而我们通过第二代测序来评估表观遗传调节因子。
我们对miRNAs进行了纯化，并通过第二代测序分析来自AIS患者(n＝17)和健康受试者(n＝10)的循环miRNAs，并通过RT-qPCR分析来自AIS患者(n＝30)和健康受试者＝30)的miRNAs水平。
RNA提取和定量
将来自AIS患者和健康受试者的血液样品收集于EDTA管中。每个样品以2500RPM离心10分钟以分离血浆，然后储存在-80℃直至RNA提取。我们根据制造商方案使用miRNAeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.USA)从500uL血浆中分离出小RNA。用50μL无RNAse的水洗脱小RNA。用NanoDrop ND 2000紫外分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA)定量小RNA的浓度。
miRNA测序
-文库准备
使用来自Life Technologies(Cat#4479789)的Ion Total RNA-Seq试剂盒v2和制造商推荐的方案构建cDNA文库。纯化的miRNA样品在基于微流体的平台Agilent 2100生物分析仪上运行以评估miRNAs的产量和尺寸分布。将15ng的miRNA与Ion Adapters在热循环仪中以65℃杂交10分钟且以30℃杂交5分钟。然后将杂交的miRNA孵育30分钟。在30℃用连接酶连接接头。然后将杂交的样品与逆转录酶主混合物混合，并以42℃孵育30分钟以产生cDNA文库。使用Life Technologies Ambion(Cat#4479681)的核酸结合珠、核酸缓冲液和标准化方案纯化cDNA文库。然后使用Platinum PCR Super-Mix High Fidelity和Ion XpressBarcode反向和正向引物通过PCR扩增纯化的cDNA文库，条件如下：步骤1：在95℃下2分钟；步骤2：在94℃下30秒，50℃下30秒；在68℃下30秒，2个循环；步骤3：在94℃下30秒，在62℃下30秒；在68℃下30秒，16个循环；步骤4：在68℃下5分钟。使用核酸结合珠、结合缓冲液纯化扩增的cDNA文库，并在Agilent 2100生物分析仪上运行以确定每个文库的产量和尺寸分布。
-模板化，富集和测序
使用Life Technologies Ion PI Template OT2Solutions 200试剂盒v3(Cat#4488318)和制造商推荐的方案，将大约10pM合并的条码化文库用于模板化。简言之，将10pM合并文库与Ion PI试剂混合物TL、Ion PI PCR试剂B、Ion PI酶混合物TL和Ion PI离子球颗粒v3混合。涡旋混合物，加载到Ion PI Plus反应过滤器组件上并装配到Ion OneTouch 2仪器(Life Technologies)上。打开仪器并运行6.5小时。运行后，分离珠粒并在Qubid仪器上进行质量评估以确定多克隆珠粒的百分比。多克隆评估后，使用Ion PI TemplateOT2Solutions 200试剂盒v3(Cat#4488318)中的试剂，Ion OneTouch ES仪器和制造商提供的方案富集样品。富集后，洗涤珠粒并准备用于测序。然后按照Life Technologies IonP1Sequencing 200试剂盒v3方案的指导，将该珠粒加载到预先制备并校准的Ion P1芯片上。接着将已加载的芯片放入Ion Proton测序仪中，并使用Ion Torrent miRNAseq运行计划开始运行，所述运行计划基于文库的类型、物种、所需运行流程的数量、所需***的类型、接头修剪以及miRNAseq运行的其他特定参数而配置。
-比对和数据分析
质子运行完成后，通过Life Technologies Ion Torrent Suite比对原始序列与构建的人Hg19参考序列。将比对的BAM文件用于进一步的分析。将通过特定条形码分离的BAM文件上传到Strand NGS软件(San Francisco，CA)。通过Strand NGS程序评估质量控制，该程序确定每个样品比对前和比对后读数的质量。然后基于比对分数、匹配计数、图谱质量和平均碱基质量对比对读数进行过滤。过滤之后，通过Strand NGS程序使用Deseq算法对比对读数进行归一化和量化。
-统计建模
首先，对原始计数数据进行Deseq归一化，使用转录计数的几何平均值来估计尺寸因子。归一化之后，在建模之前应用方差稳定化变换(VST)。我们使用随机森林算法作为我们的模型的分类器，并且使用重复20次的10倍交叉验证来评估模型的性能。基于随机森林算法报告的变量重要性来进行生物标志物的选择，所述算法基于具有从重要性值较高到较低排序的所有变量的屏幕图、使用0.15的截止值来报告所述变量重要性。此外，我们还基于负二项式分布使用Robinson和Smyth负二项式精确检验，并对获得的p值应用错误发现率校正来进行差异表达分析。在进行测试之前，通过减少原始计数将样品调整到等效文库大小。所有统计分析均使用R软件(版本3.1.2)和DESeq2(版本1.6.3)，MLSeq(版本1.2.0)和NBPSeq(版本0.3.0)R软件包进行。
AIS患者和健康对照血浆中的新miRNAs标签的实时qPCR验证
使用TaqMan miRNA反转录试剂盒和miRNA特异性茎环引物(产品编号4366597，Applied Biosystems，Inc)和100ng不含输入细胞的RNA在15μL的RT反应中进行逆转录反应。在按比例缩小至10μL反应体积中，使用5μL无UNG的TaqMan 2x Universal PCR MasterMix，0.5μL的TaqMan小RNA试样(20x)[hsa-miR-122-5p(002245)；hsa-miR-27a-5p(002445)；hsa-miR-223-5p(002098)；hsa-miR-1226-5p(002758)；hsa-miR-1306-3p(241056_mat)；hsa-miR-671-5p(197646_mat)；hsa-miR-191-5p(002299)]，3.5μL的不含核酸酶的水和1μL的RT产物以一式三份进行实时PCR反应。在Applied BioSystems 7900HT热循环仪(Applied Biosystems Inc，Foster City，CA)上进行实时PCR，程序如下：在50℃下2分钟，在95℃下10分钟，然后在95℃下15秒和在60℃下1分钟，进行45个循环。用ExpressionSuit软件1.0.3版(Life Technologies)分析原始数据。
实施例2.实验结果
AIS患者的临床说明
本研究共纳入30名患者和13名健康受试者。患者组平均年龄为15.02岁(范围为12-18岁)。男女比例分别为5：1。该组的IMC平均值为19.84±3.03。13例患者的家族史为阳性，占全部组的43.33％。平均确诊年龄为10.65岁(范围为8-18)。如前所述，最小的随访时间为两年。平均初潮年龄为12.26岁(范围为10-15)。在血液测试的那一刻，2名女性患者还没有来初潮。
从临床角度来看，平均TRACE点数为6.6(范围为4-10)。平均冠状铅垂测试值为1.18厘米(范围为0-2.25)。在Adams测试中，使用脊柱侧凸测量仪，测得的胸廓平均突出为6.76°，腰段平均突出为4.41°。所有患者的神经***检查正常。
根据放射学结果，Risser法的平均骨骼成熟度为3.46(范围为1-5)。根据Lenke分类法，将患者分类。
另一方面，矢状面上的平均测量值为：T5-T12平均脊柱后凸为23.06°±11.21(范围为4-42)，T12-S1平均脊柱前凸为56.46°±11.10(范围为34-82)，而骨盆值为：平均骨盆入射角为46.77°(范围为28-64)，且平均骨盆倾斜角为11.2％(范围为1-28)(表1)。患者组放射学冠状不平衡的平均值为1.05cm(范围为0-4.2)，而X射线上测得的矢状不平衡为-0.15cm(范围为-0.88/+0.10)。脊柱侧凸专门和一般健康问卷的评估表明，SRS-22的平均点数为4.12点(范围为2.54-5)，CAVIDRA测试为39.64点(范围为21-71)，最后SF-36表格上的平均结果为83.56点(范围为39.58-98.05)。
另一方面，13名健康个体组成对照组。如前所述，通过临床和放射学排除任何脊柱侧凸症状。
该组的平均年龄为13.69岁(范围为12-18)。与患者组相比，男女比例更加平衡，分别为1：1.17。测得的平均IMC为20.4±2.54(范围为17.17-23.5)。5名个体的特发性脊柱侧凸家族史为阳性，这意味着占38.46％。共有6名女孩，其中三名仍然没来初潮。
物理探查显示平均冠状铅垂测试值为0.26厘米(范围为0-2)，胸***0.7°(范围为0-5)，而腰平均***值为1°(范围为0-4)。在神经***探查中，所有个体表现正常。
观察X射线结果，Risser评价为2.46(范围为0-5)。在前后视角上，测得的平均Cobb角为2.23°(范围为0-8)。矢状位放射分析显示平均T5-T12脊柱后凸为34.92°(范围为18-52)，平均T12-S1脊柱前凸为63.46°(范围为40-79)。临床或放射学上没有检测到冠状或矢状不平衡。这次骨盆参数为：平均骨盆入射角为43.92°(范围为33-54)，平均骨盆倾斜角为8.8°(范围为4.5-15)。SF-36表格的结果为：平均点数为85.93点(72.77-96.8)。
选择共17名AIS患者(年龄：15±2岁；IMC：19.6±2.7Kg/m2)和10名健康受试者(年龄：14±2岁；IMC：20.4±2.5Kg/m2)进行miRNAs第二代测序研究。在这种情况下，患者的平均主弯为42.8°±18.3(Cobb’s角)，脊柱后凸为19.6°±10.3，且脊柱前凸为52.3°±12.5(表1)。从这个系列，7名AIS患者表现出侵略性进展，而2例患者显示中度进展且6例患者显示良性进展。有2名AIS患者未进行界定。
通过NGS对差异表达miRNAs进行鉴定
为了比较AIS患者样品与来自健康供体的样品的NGS结果，我们首先计算了随机森林模型。
使用R进行统计分析后，与对照相比，来自AIS患者的循环miRNAs显示差异表达模式。由6个miRNAs形成的标签能够将患者与对照区分开，从而提供关于这些miRNAs在这种病理学中的作用的分子信息。我们的随机森林模型的交叉验证准确度达到100％(100％灵敏度和100％敏感度)。选择miR-122-5p、miR-671-5p、miR-223-5p、miR-1226-5p、miR-27a-5p和miR-1306-3p作为最重要的疾病预测因子。在热图(图1)中描绘我们的模型的结果。
表2.选择miRNAs作为AIS的生物标志物
根据NGS结果，我们检测到，与对照相比，miR-671-5p和miR-1306-3p在患者中低表达，而miR 1226-5p和miR 27a-5p在患者中过表达。在miR 223-5p和miR 122-5p的情况下，在患者血浆中均匀过量表达，但是其在对照中的表达是不均匀的。Robinson和Smyth负二项式精确检验的结果强化了我们随机森林模型的结果，因为之前选择的miRs中的以下三个miRs在组中显示出统计学显著差异表达：miR 122-5p(p＝0.005)，miR 671-5p(p＝0.005)和miR 223-5p(p＝0.01)。
通过RT-qPCR进行miRNA标签验证
为了验证标签，我们使用RT-qPCR，不仅纳入另外的AIS患者，但还纳入另外的健康受试者。我们总共分析了60个样品中的6-miRNA标签(验证队列)。通过该验证研究，我们认识到来自上述6种miRNAs生物标签的子集(即hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p形成的生物标签)的曲线下面积为0.95，95％在[0.89,1]之间，并且该测试的敏感度为92.9％，且其特异性为72.7％(如图3所示)。此外，所得到的该相同的生物标签足以预测AIS患者的临床进展(如图4所示)。
实际上，图3显示了通过RT-qPCR验证的、用于诊断AIS的4-miRNA标签的接受者操作特征曲线分析。我们的模型使用由miR-122、miR-27a、miR-223和miR-1306组成的一组4-miRNA标签，得到0.95的AUC值(CI：0.89-1)。当使用最佳切点时，所有4-miRNAs产生92.9％的灵敏度和72.7％的特异性。
公式1。根据通过使用4-miRNA标签确定的循环miRNA水平，计算在人受试者中患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的概率的算法。
图4显示了通过RT-qPCR验证的、用于AIS中高风险重度弯曲的4-miRNA标签的接受者操作特征曲线分析。我们的模型使用由miR-122、miR-27a、miR-223和miR-1306组成的一组4-miRNA标签，得到0.90的AUC值(CI：0.89-1)。当考虑到50％的高风险概率，使用最佳切点时，所有4-miRNAs的灵敏度为33.3％，特异性为84.0％。
公式2。根据确定的循环miRNA水平，计算在人受试者青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中接受与高风险弯曲相关的不良预后的概率的算法。
实施例3.由小RNA测序数据得到的结果
1.处理，比对和量化读数。
进行初步的质量控制检查，以确定数据是否需要过滤以去除核糖体RNA(rRNA)污染，是否需要“修整”序列读数以去除低质量的碱基，以及是否需要修剪读数以去除测序接头。基于所获得的结果，修整序列读数以去除测序接头和3'端的Phred质量阈值小于20的低质量碱基。最后，丢弃长度小于18个核苷酸的读数。运行新的FastQC，以确保在不太严苛且没有引入任何明显的新技术偏差的情况下，先前的质量修整和/或接头去除步骤成功地保留了高质量的读数。
用于执行质量控制检查和接头去除/读数过滤的软件分别是FastQC，(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和cutadapt(http://cutadapt.readthedocs.org/en/stable/)。一旦认为数据质量足够好，就将所有的数据都映射到从UCSC Genome Browser获得的构建的人Hg38参考序列。映射后，在读数的比对位置与从miRBase v21获得的miRNAs坐标之间进行交叉。比对和量化步骤分别使用Subread(Liao Y,Smyth GK and Shi W.The Subread aligner:fast,accurate and scalableread mapping by seed-and-vote.Nucleic Acids Research,41(10):e108,2013 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23558742))和RSubread(Liao Y,Smyth GK and ShiW.featureCounts:an ecient general-purpose program for assigning sequencereads to genomic features,Bioinformatics,2013 Nov 30.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24227677)软件包进行。
2.小RNA测序数据的诊断算法分析
在AIS患者和对照之间进行了miRNAs差异表达分析。此前，我们在任何一个样品中滤掉了计数为零的miRNAs。由于最小组的规模是9个，我们保留了在至少9个样品中达到每百万个(cpm)至少一个计数的miRNAs。之后，通过TMM法使用校正因子方法对表达数据进行归一化(Robinson,MD,and Oshlack,A(2010).A scaling normalization method fordifferential expression analysis of RNA-seq data.Genome Biology.2010；11:R25)。我们还用分位数调整的条件最大似然(qCML)法评估了miRNA特异性分散体(Robinson,MD,and Smyth,GK(2007).Moderated statistical tests for assessing differences intag abundance.Bioinformatics 23,2881–288)。使用精确检验进行差异表达分析(Robinson,MD,and Smyth,GK(2008).Small sample estimation of negative binomialdispersion,with applications to SAGE data.Biostatistics 9,321-332)。
结果发现，与对照组相比，在AIS患者中，我们获得了18个失调的miRNAs(FDR<0.05)，6个上调，12个下调。以11个FDR<0.01的miRNA作为变量和25个样品作为观察数据，用二项式分布拟合出LASSO逻辑回归模型(Friedman J.,Hastie T.,and Tibshirani R.,Regularization Paths for Generalized linear models via coordinate Descent.JStatistical Software,2010；33(1):1-22)。使用留一法交叉验证来评估从模型中得到的最重要的miRNAs。选择在得到最小平均交叉验证误差的λ值下具有非零系数的miRNAs。选择的miRNAs为：hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p，与对照相比，这些miRNAs全部上调，而与对照相比，hsa-miR-320b、hsa-miR-4523在患者中下调。使用以TMM法归一化的读数数据计算该算法。使用我们的模型获得的敏感度(Sn)、特异性(Sp)和曲线下面积(AUC)值为1，置信区间(CI)为95％。
公式3：根据从小RNA测序数据获得的确定的归一化读数值，计算在人受试者中患有青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的概率的算法。
所有统计分析均使用R软件(版本3.3.0)和R软件包EdgeR(版本3.12.0)，glmnet(版本2.0-2)，glmulti(版本1.0.7)和y pROC(版本1.8)进行。
实施例4.miRNAs：miR-122、miR-27a、miR-223和miR-1306的Cts归一化数据用于诊断来自病例(AIS样品)和对照组(健康受试者)的样品中的AIS。
1.miR-122对诊断病例(AIS样品)和对照(健康受试者)样品中的AIS的敏感度和特异性
**这不认为是显著的
系数：
**下面显示了每个特异性值对应的敏感度值。尽管我们计算了最小值(se.低)、最大值(se.高)和中等敏感度值(se.中等)值，但我们建议采取中等值。**
**下面显示了敏感度值对应的特异性值。尽管我们计算了最小值(sp.低)、最大值(sp.高)和中等特异性度(sp.中等)值，但我们建议采取中等值。**
曲线下面积：0.6652
95％CI:0.4923-0.8381(DeLong)(参见图5)
2.miR-223对诊断病例和对照的敏感度和特异性。
**这不认为是显著的
曲线下面积：0.8764
95％CI:0.767-0.9859(DeLong)(参见图6)
3.miR-1306对诊断病例和对照的敏感度和特异性。
**这不认为是显著的
系数：
曲线下面积：0.5417
95％CI:0.3642-0.7191(DeLong)(参见图7)
4.miR-27a对诊断病例和对照的敏感度和特异性。
**这不认为是显著的
系数：
曲线下面积：0.6358
95％CI:0.4132-0.8584(DeLong)(参见图8)。
Claims (8)
1.PCR引物用于制备用于检测人受试者青少年特发性脊柱侧凸的试剂盒的用途，所述PCR引物用于定量确定从所述人受试者获得的分离的生物样品中的hsa-miR-223-5p的表达水平。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含用于定量确定分离的生物样品中的以下任何生物标志物组合的表达水平的PCR引物：
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-142-5p；
-hsa0-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-320b和hsa-miR-1226-5p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-4523和hsa-miR-1306-3p；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-1226-5p和hsa-miR-4523；
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hs-miR-320b；
-hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p；
-hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523；或
-hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1226-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-4523。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括：
a.操作指南，所述操作指南包括逐步指导，以便：在测量从怀疑患有青少年特发性脊柱侧凸的受试者获得的样品的表达时，将所述microRNAs的表达水平与从正常受试者获得的样品的表达水平，其中所述正常受试者是未患有青少年特发性脊柱侧凸的健康受试者；
b.从受试者获得样品所必需的工具、容器和试剂，所述样品选自一种或多种生物流体、血浆样品、血清样品、血液样品、组织样品或粪便样品。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒为微阵列芯片、q-PCR微流体卡、q-PCR单管、条带中的q-PCR槽或q-PCR板的形式。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含用于定量确定分离的生物样品中的hsa-miR-1306-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-27a-5p和hsa-miR-122-5p的表达水平的PCR引物。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述生物样品选自血浆样品或血液样品。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括用于定量检测所述分离的生物样品中的hsa-miR-191的表达水平的引物。
8.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于诊断或检测人受试者中的青少年特发性脊柱侧凸的方法包括以下步骤：
测量从所述受试者分离的一种或多种生物样品中的hsa-miR-223-5p的表达水平；和
将来自怀疑患有青少年特发性脊柱侧凸的受试者的一种或多种生物样品的microRNA的表达水平，与来自正常受试者的生物样品的所述microRNA的表达水平进行比较，
其中，所述正常受试者是未患青少年特发性脊柱侧凸的健康受试者，并且其中hsa-miR-223-5p的表达的变化指示特发性脊柱侧凸。
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