JP6989863B2 - 大腸癌の診断方法 - Google Patents
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Description
(i)便潜血試験(FOBT):この試験は、「癌とは出血するものであり、それゆえ化学的アッセイまたは免疫学的アッセイによって便中から検出できる」「通常は、顕著な大きさの腫瘍は、大便中に血液が検出される前に存在しているはずである」という仮定に基づいている;
(ii)画像法(仮想結腸内視鏡検査など);および、
(iii)肉眼的異常を同定する侵襲的方法(S状結腸内視鏡検査または結腸内視鏡検査など)。
piRNA-hsa-5937の発現レベルを、体液サンプルにおいて決定する工程と、
その次に、上記サンプルにおけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルを、健常なヒトの体液におけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルと比較する工程と、
を含み、
上記サンプルにおけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルが、健常なヒトの体液におけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルよりも低い場合に、サンプルにおいて大腸癌と診断する方法である。
下記から選択される1つ以上のmiRNAの体液サンプルにおける発現レベルを決定する工程と、
miR-23a-3p(配列:AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC(配列番号3));
miR-27a-3p(配列:UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC(配列番号4));
miR-142-5p(配列:CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(配列番号5));
発現レベルを、健常なヒトの体液中における同じmiRNAの発現レベルと比較する工程と、をさらに含み、
上記サンプル中の上記miRNAの発現レベルが、健常なヒトの体液中の上記miRNAの発現レベルよりも高い場合に、サンプルにおいて大腸癌と診断する。
Dxスコア=-0.8895+62.92648×X(miR-23a)-8.08928×X(miR-27a)+73.16745×X(miR-142-5p)-1.6757×X(piR-5937)。
体液サンプル中における、下記piRNAのうち1つ以上のpiRNAの発現レベルを決定する工程と、
上記発現レベルを、健常なヒトの体液中の同じpiRNAの発現レベルと、それぞれ比較する工程と、
健常なヒトの体液中における同じpiRNAの発現レベルと比較して、上記piRNAの発現レベルが大腸癌に決定的な変化を示す場合に、上記サンプルにおいて大腸癌と診断する工程と、
をさらに含んでもよい。
piRNA-hsa-5937の発現レベルを、体液サンプル中において決定する工程と、
その次に、piRNA-hsa-5937の発現レベルを、基準発現レベルと比較する工程と、を含み、
上記サンプル中におけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルが、上記基準発現レベルよりも高い場合には、良好な全生存予後が予測され、
上記サンプル中におけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルが、上記基準発現レベルよりも低い場合は、不良な全生存予後が予測される。
本発明のpiRNAバイオマーカーおよびmiRNAバイオマーカーの検出は、公知の方法によって実施してもよい(リアルタイムPCRアッセイ、マイクロアレイアッセイ、組織化学アッセイ、免疫学的アッセイ、シーケンシングアッセイなど)。
受信者動作特性曲線(ROC曲線)は、診断試験を評価するための、標準的な分析ツールである。バイオマーカーの診断精度は、最も一般的には、感度および特異度を計算することによって測られる。感度とは、真に疾患を有している患者のうち、「疾患を有している」と正しく分類された患者の割合である。同様に、特異度とは、真に疾患を有していない全ての患者のうち、「疾患を有していない」と正しく分類された患者の割合である。ほとんどの診断バイオマーカーの結果は、連続的なスケールによって提供される。そのため、試験の感度および特異度は、選択した特定の閾値に依存する。ROC解析は、このような特定の閾値を同定するための統計的手法である。ROC曲線下面積(AUC)は、特異度の範囲全体にわたる、バイオマーカーの平均感度である。一般的に、AUCは、バイオマーカーの全体的な性能を表す要約統計量として使用される。予測に関与しないバイオマーカーのAUCは、0.5である(この線は、上向きの対角線(偶然線)によって表される)。一方、疾患を完全に予測できるバイオマーカーのAUCは、1である。
[患者]
血清サンプルは、piRNAプロファイリング研究に参加した、144例の大腸癌症例(TNMステージIの患者:36人、TNMステージIIの患者:36人、TNMステージIIIの患者:36人、TNMステージIVの患者:36人。男性:82人、女性:62人。平均年齢:65歳)およびコントロール96人(男性:48人、女性:48人;平均年齢62歳)から収集した。候補piRNAを、独立して検証するために、さらに80例(TNM臨床ステージIの患者:19人、TNM臨床ステージIIの患者:21人、TNM臨床ステージIIIの患者:21人、TNM臨床ステージIVの:患者19人。男性:44人、女性:36人。平均年齢65歳)およびコントロール80人(男性:47人、女性:33人。平均年齢:60歳)が参加した。また、疾患が初期ステージにある、さらに90例の大腸癌症例(TNMステージ1の患者:40人、TNMステージ2の患者:50人。男性:50人、女性:40人。平均年齢:61歳)およびコントロール100人(男性:52人、女性:48人。平均年齢:59歳)を利用して、同定されたmiRNA/piRNAバイオマーカーおよびモデルを評価した。研究に登録された全ての被験者は、同じ民族的背景を有しており(ヨーロッパ系)、大腸癌患者は、ネオアジュバント治療を全く受けなかった。溶血はいくつかのmiRNAの発現に影響を及ぼしうるので、溶血している血清サンプルは研究から除外した。全ての参加者(患者および健常なドナー)から書面によるインフォームドコンセントを得た。この研究は、Masaryk Memorial Cancer Instituteの地域倫理委員会によって承認された。
RNA抽出の前に、全てのサンプルの溶血を確認した。この確認には、3点における(380nm、415nmおよび450nm)Allen補正法によってヘモグロビン濃度を定量化する、Harboeの分光光度法を利用した。ヘモグロビン濃度が5mg・dL-1よりも低いサンプルのみを、研究において使用した。血清から、小型RNAを多く含んでいる全RNAを単離した。この単離にはQiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen, GmbH, Hilden, Germany)を用い、製造者のプロトコルを改変したものに従った。簡潔に述べると、250μLの血清を氷上で解凍し、4℃、14000×gにて5分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。次に、200μLの上清を、1mLのQIAzol Lysis Reagentで溶解させた。各サンプルに、1.25μLの0.8 μg・μl-1 MS2 RNA carrier(cat. no. 10165948001, Roche, Basel, Switzerland)を、1mLのQIAzol溶液に添加した。抽出したRNAを、2×20μLの予熱したElution Solutionで溶出させた。ライブラリを作製するために、RNAは常に、12個のサンプルから別々に単離した(12×250μL。結腸癌患者の場合、12人の患者は全員同じステージであった)。相分離の後、12個のサンプルの全てから上層の水相を集め、1.5容量の100%エタノールと混合し、1個のRNeasy MinElute spin columnにピペットで移した。溶出には、14μLの予熱したElution Solutionを用いた。RNAの濃度および純度は、光学密度(A260/280>2.0;A260/230>1.8)を測定することによって、分光光度法で測定した。測定には、NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA)を用いた。また、NGS用にプールしておいたサンプルのRNA濃度および品質は、Qubit 2.0蛍光光度計(Thermo Fisher Scientific)およびAgilent 2100バイオアナライザ(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を用いて測定した。サンプルは、-80℃にて保存するか、またはさらなる処理に供した。
全てのライブラリは、Illumina TruSeq Small RNA protocol(Illumina, San Diego, CA, USA)を使用して、製造者の説明書に従って調製した。簡潔に述べると、小型RNAを多く含んでいる全RNAを1μg以上使用して、一対のアダプタをpiRNAの3’末端および5’末端に連結した。次に、固有のバーコードで標識した増幅プライマーを用いて、PCRにより13サイクル増幅させた。次に、6%ネイティブ-ポリアクリルアミドゲル上で、サイズによる選抜を行った。次に、piRNAの集合に対応している145~160bpのcDNA断片を、ゲルから切り出し、溶出させ、エタノール沈澱によって沈澱させた。最終的に得られたcDNAペレットを風乾させ、ヌクレアーゼを含まない水8μL中で再懸濁した。調製したライブラリの濃度を、High Sensitivity DNA chipおよびAgilent 2100バイオアナライザ(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を用いて測定した。各ライブラリを等モル量ずつ、cDNAの最終濃度が2nMとなるようにプールした。次に、サンプルをフローセル上でシーケンシングした。シーケンシングには、MiSeqシーケンサ(Illumina, San Diego, CA, USA)を使用し、50bpのsingle-end readでリードした。
数基準のmiRNA発現データを、fastqファイルから、Chimira toolによって生成した。全ての配列からアダプタをトリミングし、piRBase上にマッピングした。このとき、1配列当たり2個までのミスマッチを許容した。次に、R/Bioconductorパッケージを用いてさらに分析を行った。プールされている17個超のサンプルにおいて、100万回当たり1回未満しかリードされなかったpiRNAを除外した。edgeRパッケージで正規化因子を加えることにより、リード回数を予め正規化した。さらに、LIMMAパッケージで、voom関数によってサンプル間での正規化を施した。正規化された発現レベルを決定した後、大腸癌患者と健常なコントロールとの間での発現に差異があるpiRNAをスクリーニングした。スクリーニングには、線形モデルフィッティングおよびBayes approachを適用した。多重検定のために、得られたP値をBenjamini-Hochberg法で調整した。
TaqMan MicroRNA Assayプロトコル(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)に従って、遺伝子特異的プライマーを用いて、全RNAから相補的DNAを合成した。逆転写酵素反応には、以下を使用した:10ngのRNAサンプル、50nMのステム-ループRTプライマー(miR-23a-3p、miR-27a-3p、miR-142-5pおよびpiR-5937由来のもの;Applied Biosystems, Thermo Fisher, USA)、1×RT緩衝液、0.25mMずつのdNTP、3.33U・μL-1のMultiScribe逆転写酵素、および0.25U・μL-1のRNA分解酵素阻害剤(全てTaqMan MicroRNA Reverse Transcription kitのもの;Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。反応混合物(10μL)を16℃にて30分間、42℃にて30分間、85℃にて5分間インキュベートし、その後、4℃にて保持した(T100TM Thermal Cycler; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。QuantStudio 12K Flex Real-Time PCRシステム(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて、リアルタイムPCRを行った。20μLのPCR反応混合物には、以下が含まれていた:1.33μLのRT産物、1×TaqMan (NoUmpErase UNG) Universal PCR Master Mix、1μLのプライマー(miR-23a-3pアッセイ、miR-27a-3pアッセイ、miR-142-5pアッセイおよびpiR-5937アッセイのもの)、および、TaqMan MicroRNA Assay kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)のプローブミックス。96ウェル光学プレート中において、95℃にて10分間インキュベートした。次に、95℃にて15秒間および60℃にて1分間を、40サイクルインキュベートして、反応させた。
Ct値のデータは、QuantStudio 12K Flexソフトウェア(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)によって計算した。リアルタイムPCR反応は全て、3組ずつ行った。測定されたmiRNAの平均発現レベルは全て、miR-93-5p(Assay No. 001090; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)によって正規化した後、2-ΔCt方法によって分析した。標準的なgeNormおよびNormFinderアルゴリズムの組合せを通して、miR-93-5pを内因性コントロールとして選択した(Vychytilova-Faltejskova et al, 2016を参照)。結腸癌患者の血清サンプル中における分析されたmiRNAのレベルと、健常なドナーの血清サンプル中における分析されたmiRNAのレベルとの間の統計的差異を、両側ノンパラメトリックMann-Whitney検定で評価した。手術前後の対になったサンプルを、対になったサンプル関して、両側ノンパラメトリックWilcoxon検定で分析した。Kaplan-Meier生存曲線およびログ・ランク検定の分析をって、piR-5937による予後予測能力を評価した。全ての計算には、GraphPad Prism version 5.00(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)およびR environment(R Development koa Team)を用いた。P値が0.05未満であるときに、統計的に有意であるとみなした。
144人の大腸癌患者および96人の健常なコントロールの血清サンプルから精製したRNAの小型RNAを、MiSeqシーケンサ(Illumina)でシーケンシングした。合計20個の小型RNAライブラリを作製してシーケンシングした(結腸癌患者に対して12個のライブラリ、および、健常なコントロールに対して8個のライブラリ。各ライブラリには、12人の患者/健常ドナーからのRNAサンプルが含まれる)。平均すると、リードの96%超について、Qスコアが30超であった。それゆえ、得られたデータは高品質であると考えられた。シーケンシングされたサンプルは、平均して8,925,000±2,139,597のリードを含んでおり、8,219,664±1,954,177のリードがフィルタを通過した。合計すると、大腸癌患者においては470のpiRNAが、健常なドナーにおいては453のpiRNAが、それぞれ検出可能であった(リード100万回当たり50コピー超)。このことから、健常なドナーと比較すると、大腸癌患者の血清サンプル中においては、39個のmiRNAが有意に異なるレベルであることが判った(10個は上方制御、29個は下方制御;表1;調整P値<0.005)。
合計で、80人の大腸癌患者および80人の健常なドナーに由来する血清サンプルを、研究の検証フェーズに使用した。小型RNAのシーケンシングによって同定された、健常なコントロールと比較すると大腸癌患者の血清中におけるレベルが有意に低い39個のpiRNAのうち、piR-5937およびpiR-28876を独立検証にとって最も有望なものとして選択した。これらのpiRNAはいずれも、健常なドナーと比較すると、大腸癌患者の血清中において有意に減少することが示された。piR-5937は、P<0.0001、AUC:0.916、感度:92.5%、特異度:82.5%であった。piR-28876は、P<0.0001、AUC:0.896、感度:92.5%、特異度:72.5%であった。さらに、血清中のpiR-5937レベルの高値は、このレベルの低値と比較して、良好な生存と有意に関連していた(P<0.0001、HR:0.09、CI:0.02~0.036、図2)。このことは、piR-5937レベルによる予後予測効果を示している。
血清中のpiRNA/miRNAレベルに基づく大腸癌診断モデル(Dxスコア)を、(診断用の)ロジスティック回帰によって開発した。診断に関連するシグネチャーを生成するために、piR-5937、piR-28876、および、Vychytilova-Faltejskova et al.の研究(2016年、背景技術欄に記載)において同定された上位4個のmiRNA(miR-23a-3p、miR-27a-3-p、miR-142-5p、miR-376c-3p)を、サンプルの訓練用データセットとして、双方向ステップワイズロジスティック回帰モデルに導入した。最終的なモデルは、Akaike情報基準を最大化するモデルとした。Dxスコアをさらに分析するために、ROC曲線(受信者動作特性曲線)を作成した。最大Youden指数を利用して、健常なドナーと結腸癌患者とを識別するための最適なカットオフ値を得た。次に、サンプルの各セットについてROC曲線分析を行い、Dxスコアの感度および特異度を計算した。得られたモデルおよびカットオフ値の検証を、疾患の初期ステージにあるサンプルの独立した検証用データセットで実行した。
Dxスコア1=-0.8895+(62.92648×miR-23a)-(8.08928×miR-27a)+(73.16745×miR-142-5p)-(1.6757×piR-5937)。
この診断スコアは、以下の式により計算した。
Dxスコア2=-0.64243+(39.96723×miR-23a-3p)-(1.62861×piR-5937)。
Claims (8)
- (1)piRNA-hsa-5937(配列:TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCA(配列番号1))の発現レベルと、
下記から選択される1つ以上のmiRNAの、体液サンプル中における発現レベルと、
miR-23a-3p(配列:AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC(配列番号3));
miR-27a-3p(配列:UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC(配列番号4));および、
miR-142-5p(配列:CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(配列番号5));
を、体液サンプル中において決定する工程と、
(2)その次に、上記サンプル中におけるpiRNA-hsa-5937および上記1つ以上のmiRNAの発現レベルを、健常なヒトの体液中におけるpiRNA-hsa-5937および上記1つ以上のmiRNAの発現レベルと比較する工程と、
(3)上記サンプル中におけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルが健常なヒトの体液中におけるpiRNA-hsa-5937の発現レベルよりも低く、かつ、上記サンプル中における上記1つ以上のmiRNAの発現レベルが健常なヒトの体液中における上記miRNAの発現レベルよりも高い場合に、上記サンプルにおいて大腸癌と同定する工程と、
を含むことを特徴とする、大腸癌の診断補助方法。 - piRNA-hsa-5937、miR-23a-3p、miR-27a-3pおよびmiR-142-5pの全ての発現レベルを、体液サンプル中において決定する、請求項1に記載の方法。
- サンプル中における診断マーカーである、下記(i)および(ii)からなる群より選択される1つ以上の発現レベルを、体液中における含有量が定常的な物質によって正規化する、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法:
(i)piRNA-hsa-5937;
(ii)miR-23a-3p、miR-27a-3pおよびmiR-142-5p。 - 上記体液中における含有量が定常的な物質は、miR-93-5p(配列:CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG(配列番号2))である、請求項4に記載の方法。
- サンプル中における診断マーカーである、下記(i)および(ii)からなる群より選択される1つ以上の発現レベルを、所定のカットオフ値と比較する工程を含む、
請求項1~5のいずれか1項に記載の方法:
(i)piRNA-hsa-5937;
(ii)miR-23a-3p、miR-27a-3pおよびmiR-142-5p。 - サンプル中における診断マーカーである、piRNA-hsa-5937、miR-23a-3p、miR-27a-3pおよびmiR-142-5pの発現レベルを用いて、診断スコアを計算する工程と、
その次に、上記診断スコアを、所定のカットオフ値と比較する工程と、
を含む、
請求項2~6のいずれか1項に記載の方法。 - 上記体液は、血液、血清、血漿、尿および唾液から選択される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
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