具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1 样品的收集及总RNA提取
3例转移性骨肉瘤患者、3例原发性骨肉瘤患者及3名健康人。转移组选取肿瘤转移病灶,转移部位为肺部,原发组选取肿瘤原发病灶,健康对照选取截肢标本距肿瘤远端的标本。所有的血样和病理结果应真实可靠,研究经伦理委员会批准,患者知情同意。
RNA提取标准:RNA纯度:OD260/280≧1.8,28S/18S≧1;RNA完整性:RIN值≧7.0。RNA完整性检测方法:Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度:1%琼脂糖胶;电压:5V/cm;时间:20min)。
lncRNA和mRNA测序要求:
样品需求量:≥200ng;样品浓度:C≥20ng/μL;样品纯度:RIN≥7.0,28S/18S≥1.0。
miRNA测序要求:
样品需求量(单次):≥1μg;样品浓度:15ng/μL≤c≤500ng/μL;样品纯度:OD260/280=1.8~2.2;OD260/230≥2.0;28S:18S≥1.5;RIN≥8.0。
实施例2 测序及数据分析
测序:
lncRNA和mRNA测序平台:hiseq2500 125PE,完成9个人的链特异性转录组测序(lncRNA),每个样品的产出不低于10Gb数据。
mRNA和lncRNA分析:
1tophat比对到参考基因组上,参考基因组来自于Ensembl V84;
2.cuffquant定量lncRNA和mRNA的表达量并标准化输出;
3.cuffdiff包比较两组之间lncRNA和mRNA的表达差异。
筛选标准P<0.01,abs(log2(fold change))>2;筛选到了307个差异表达基因(106上调,201下调);50个差异表达lncRNA(27上调,23下调)。综合分析及人工筛查后,AACS基因及调控其表达的非编码RNA—ENSG00000279233进入我们的研究范围。AACS基因在转移组高表达(转移组VS原发组),但是在原发组和健康对照组间却没有差异,显示其仅与骨肉瘤转移相关,AACS基因是长链非编码RNA—ENSG00000279233的nearby gene,同时数据分析显示也是lncRNA的靶基因,二者共表达相关系数高达96%。
实施例3 Real-time PCR检测骨肉瘤样本中AACS基因及调控其表达的lncRNA的表达情况
1样品采集:
14例转移性骨肉瘤肿瘤患者、15例原发骨肉瘤患者和20例健康对照的外周血均来自医院。
2总RNA提取:
相关实验物品的去Rnase的处理:
①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡,120℃高压20min,180℃高温烤干2小时以上。
②将塑料器皿(如:EP管/枪头)使用前需用0.1%DEPC水侵泡过夜,后控干液体,120℃高压20min,烤箱烤干备用。
白细胞分离
(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h);
(2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合,形成细胞悬液;
(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管;
(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm 20min;
(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次,最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中,离心去上清,用于提取RNA。
RNA提取
(1)先加lml Trizol于EP管中,若冻存细胞直接加入Trizol,不需解冻,吹打裂解后室温静置5-l0min;
(2)加入0.2m1氯仿,剧烈震荡15s,室温静置2-3min,在4℃下1 2000转离心15min;
(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层),加入500:1异丙醇,颠倒混匀,室温静置10min;
(4)4℃1 2000g离心l 0min,弃上清液,底部可见白色物质;
(5)加入lml 75%冷乙醇旋转洗涤,清洗异丙醇;
(6)4℃7500g离心5min,去除乙醇后晾5-l0min,半透明即可,以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA样本,于1.5%琼脂糖凝胶中电泳;lu1RNA样品于紫外分光光度计检测浓度,以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。
3逆转录
mRNA逆转录:
取1μg总RNA作为模板RNA,采用
III Reverse Transcriptase(invitrogen,货号18080-044)进行cDNA反转录,实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
4荧光定量PCR
引物设计:
ENSG00000279233
上游引物:5’-TCTTTCCCTTTCCTCTACC-3’(SEQ ID NO 2)
下游引物:5’-AATACAGCAGCATCCTCT-3’(SEQ ID NO 3)
AACS基因(NM_001319839.1)
上游引物:5’-GTCCGTTGAGTCATATTC-3’(SEQ ID NO 4)
下游引物:5’-CACAACCTCATCATACAC-3’(SEQ ID NO 5)
mRNA和lncRNA的RT-PCR体系的配制:
反应组分 |
浓度 |
体积(μl) |
mix |
2× |
10 |
上游引物 |
10uM |
0.5 |
下游引物 |
10uM |
0.5 |
cDNA |
- |
2 |
Nuclease-free H<sub>2</sub>O |
- |
补平至25μl |
mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应,以actin作为内参。
扩增程序为:95°10min,45个循环(95℃15s,55℃60s)。
5统计学分析
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚,扩增曲线整体平行性好,表明各反应管的扩增效率相近,极限平而无上扬现在,曲线指数期斜率较大,说明扩增效率较高;样本扩增产物溶解曲线都是单峰,说明扩增产物只有一条,为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2-ΔCt×100%,比较AACS基因和ENSG00000279233在骨肉瘤原发组、转移组组和正常对照组中的表达水平。结果显示:相对于原发组AACS基因和ENSG00000279233在骨肉瘤转移组高表达,表达量分别在2.14倍和2.53倍左右,二者在原发组和对照组间差异表达无统计学意义(具体见附图1)。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析的结果。
实施例4 AACS基因和ENSG00000279233与骨肉瘤转移关系验证
一、材料准备:
(一)标本来源
人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
(二)主要试剂
LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen)。
(三)主要溶液
1、细胞培养液
DMEM培养基+10%标准胎牛血清。
2、PBS(平衡盐溶液)
在800m1蒸馏水中溶解8g NaCl,0.25g KCl,1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4用HCl调节溶液的pH值至7.4,加水定容至1L,高压灭菌,室温保存。
3、0.25%胰蛋白酶消化液
0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中,滤器过滤灭菌,分装备用。
4、siRNA构建与合成
依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/),根据AACS基因和ENSG00000279233中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成,siRNA对照由公司提供。
二、实验方法
1、细胞传代
(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去,加入0.25%胰蛋白酶液1m1,覆盖细胞层,瓶口消毒,加盖;
(2)倒置显微镜下观察细胞变化,随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,细胞间质回缩,细胞间隙加大,在还未漂起时将胰酶弃去,加入5ml含10%胎牛血清的培养液终止消化;
(3)细胞计数:取上述细胞悬液0.5mI,适当稀释后滴入血细胞计数板内,按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数,计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞,成堆的细胞按一个细胞计算,将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数:细胞总数/ml=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数;
(4)根据细胞计数结果,用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×105个细胞浓度,分装于培养瓶中(8m1/每瓶),放置于37℃,5%CO2培养箱中培养。
细胞分组:空白对照组(转染脂质体组);阴性对照组(转染非特异性的siRNA组);转染AACS-siRNA组;转染ENSG00000279233-siRNA组;同时转染AACS-siRNA和ENSG00000279233-siRNA组。
2.瞬时转染
转染:按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent提供的步骤进行。
①转染前24h,取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数,用DMEM培养基调整细胞浓度为1×105/ml,取2m1接种于六孔板,放置于37℃,5%CO2培养箱中培养,在细胞达80%融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。
②配制转染液体:
A液:250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA,温和混匀;
B液:250u1无血清培养基稀释10u1 Lipofectamine,温和混匀,室温放置5min;
③转染:A液与B液混合在一起,室温保温20min,直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。在CO2培养箱中37℃保温24-48h,6h后换液,加入含血清的培养基。
应用Real-time PCR方法检测转染前后AACS基因、ENSG00000279233表达的变化:提取各组细胞的RNA,测定RNA浓度和纯度,进行逆转录反应,每组DNA模板同时进行AACS基因、ENSG00000279233和内参的Real-time PCR反应,实验重复三次,具体步骤参照实施例3。
3.Transwell迁移实验
检测细胞迁移情况时,首先采用胰酶消化细胞,并加入无血清的培养基制备单细胞悬液;将1×105个细胞接种于Transwell小室内,下层内室内放置600u1含10%FBS的培养基,置于37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养;24h后采用棉签小心将小室内未迁移的细胞刮掉;无水甲醇固定1-5min,小室翻转晾干;采用0.1%的结晶紫染色20min;采用PBS清洗2次;将小室转移至含有PBS的24孔板内;倒置显微镜下观察细胞迁移情况,随机取6-8个视野,进行细胞计数。
4.实验结果
Real-time PCR检测转染效率。用双标准曲线的方法比较各组AACS基因或ENSG00000279233的表达。结果显示(见图2):脂质体转染组、非特异性转染组基因的表达基本相似,差异无统计学意义;转染AACS-siRNA组AACS基因表达下降了71%,转染ENSG00000279233-siRNA组ENSG00000279233表达下降了65%,值得一提的是,转染AACS-siRNA组ENSG00000279233表达下降了7%,转染ENSG00000279233-siRNA组AACS基因表达下降了9%,同时转染AACS-siRNA和ENSG00000279233-siRNA组中,AACS基因和ENSG00000279233的表达分别下降79%和70%,显示AACS基因和ENSG00000279233之间在表达上具有很好的相关性。
转染AACS-siRNA组和转染ENSG00000279233-siRNA组的MG63细胞迁移的数目均显著低于空白对照组(p<0.05),表明抑制AACS基因和ENSG00000279233表达将抑制骨肉瘤细胞迁移,转染AACS-siRNA组、转染ENSG00000279233-siRNA组和同时转染AACS-siRNA和ENSG00000279233-siRNA组细胞迁移数目分别为133、139和120个,空白对照组细胞迁移数目为172个,阴性对照组(转染非特异性序列)细胞迁移数目为190个,与空白对照组无统计学差异。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明,但本领域技术人员理解,可进行各种变化,并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外,可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此,本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案;相反地,本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3467
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ttttgtggtg tccacacgtt tcctttgtgt tctggttctg catgggaaga gccctgcagc 60
ttggggcttt ccatccatct ctttcttttt cccttatttt tggttggtga ctcttggcgg 120
ctctctgtgg ggacactgat gctctccaag aaggtacttc ttgaatcagt gacccttatt 180
gtctttttct gatgagggtc taaggttttc cttcagtgaa tcagtgctgt cttatctgga 240
acattttagg gaactggaat ttgcatttat ccccttggct ttatattatt gaaaaagaac 300
ttaggtcttt tgctgccaaa acagttgtta ccaaaccata tttgatcacg agagtagtgg 360
aacaatttat tatgaagggg gaaaactcag cacctttctt tccctggttg tcctggcttt 420
tgtgggcttg cgtccagggc acccagctgg gctctgggct ctttctctcc ccagataagg 480
tctcctcctg ggtgcattcg ggaagttatt tggagggttc ttccagattt ttgaatgccc 540
ttacattttc gagccctcac ggcaggctta ggagaggatt tacctctttt attgctgagc 600
tagggagggg tccagcctcc acagggaggt gacacggcgt ggccccagcc tgcccattca 660
ggaactggac ccacttcagg gtcagaagag gacaactgag gtctcatctg caaagtcccg 720
gggccttgct gaggcaggag agcctgttgc aggtctgacc cttcacatgt tgcttgtagg 780
gagtgggcta cccacccctc accaccccga gaacagcctg agcccggggc gcatctctgt 840
ctctgtgtgg agagacactg ccgcttctgt tccctgggaa gccagtgcca ttttcagcat 900
ttagggggtt cctggtgagg gctcaggaga gatctgggcc cagagccagc cacactcctt 960
gtgttgagta agactcatcc catctctgat ctgtgacacg aggagaggag cccctcactc 1020
acccgccaca gctcagggtg gtgatgcggc accattggag tgagcggccc cgggggactg 1080
gggaggctct ggccggcgta gtccttgccg ccagccttca cagcgggttc tctgagggtc 1140
tttatgcaca ggggctctgt cacttagctc tggccccccc tctgcccctg aggcatgact 1200
ttgggcaacg cagcatccaa gcctcagttt ccccatctct aagatgagtt gacaacagag 1260
cctctctggt gggtgccgtg ggccacaggg tgcccagaac gcagtccccg tgcctctgtt 1320
tctgtgctgc ctccactcac cgtcagcctt cattcggagt aggtgcgcat gctgtgcaaa 1380
gcccttccac acacctgatc tcagttgctc tctgtgcaaa agtcagagag gctttccctg 1440
catttcctgt ttgaacagtg tcctggcctc catctttagc tttgacagtg tttaccatgg 1500
gggtgctgag ggtgagttct tgtgtatgtg cacatctttc tggtggagtg gaggcctctt 1560
gaggacagga accttgtggg tctacctcct tttcttcgga gctcagctga ctgcctggca 1620
aacagcagat gcttttggtg tctggtgagt gaatgggggg tggggagctg gtcctgtgac 1680
cctggtgagg cgggacaaac ttgtcttcct cacacccatc ttacttcctc ttatgaggaa 1740
acccagagag atgaggggtc ttgcccaagg aaggggtgtc catagtcagc tctgccttct 1800
gctcacccag aataaagacc tggggacccc gcgagggtca tggccaagtg gaatggactc 1860
ctggcatttg agggcttccc gactgcagcc ctcaggcagc catggctgtc ccaagtccag 1920
cgggcctttg ctcgggtcat ggctgggatg tctggccctt cctgacagga ggctgctggg 1980
ctcctgtcta cttggggacg cctcatgcag gagctggtgt gggggtgggc aggggggcgg 2040
tggcttcttc ctttctcttt ccctttcctc taccttttcc cctctcccca gaggaaatgg 2100
tagcaggatt tcttttaaga ggatgctgct gtattttgcc agcgggtgga aggtggcggt 2160
attagctccc gtgagctgca cgtggacccc tgtgtgaagc gtagcagggc acagagcagg 2220
cgagacgttt gcatctcaca gcgggagggc cggcgacatc acatgaagtg acaggcaggc 2280
ccttggaagc cggtgcttag atccttaatt agttcacacg tcgactgaat tttcaagtga 2340
atgaatttta attacatctc aggttaaaaa aaaaaaaagg cgccagtgat cgaggactcg 2400
tcactgggct ctgttgctcc tgaagtttcc tagcccacaa cacaccaaca ctgccaaggg 2460
ctcttctgga ttcaaggtga aacacatgtg ccataaatct tggagctctg aatgtttgga 2520
aagggcccga ctgtgagaag aagtaacaca ccgtcccgtg cagatggctg gctctgagga 2580
ggagttcatg ggagcttggg gacactcttg cctctagttc taggaagctg ggccacttct 2640
gaagtaatgg caatatcaat aaagtaatgg tctttatcat agaataacgt gataaaatat 2700
atagagaagt aaaaaagtat aaataaaagt aaaatcatca taaaacatag tagctaggca 2760
cttctgaagc tgtgtgtgca ctgattcatt cacccagtga ctcacagcct tatagcctag 2820
gtgctggcac ccctactttc attcgaggaa gtgaactcag gttcaggaat ttacccagca 2880
tcccccagat ggggtggcag gagccacatc ttccctgaaa actttcttgc ccagggtgtc 2940
tgctgggatt taggaatggt ctatgcctgc atttttatcc tggtcaggct gaccctgaac 3000
cctgagagat actctttttt atattcccat ctggaatatg cactgccggg gtcagtgggg 3060
tgtctggagg gccctctcga ggccagcttg gatgtgacac gtgtcgtggg tcccaacggg 3120
gcccagtaga gtgtgcagcg ttagaaaaat gaacatgctc ggctgggcgc ggtggctcac 3180
gcctgtgatc ctagcacttt gggaggccaa gatgggtgga tcatgaggtc aggagatcaa 3240
gaccatcctg gctaacatga gaccatcctg gtgaaacccc atctctacta aaaatacaaa 3300
aaattagctg ggcgtggtgg caggtgccta tggtcccagc tactcaggag gctgaggtag 3360
gagaatggtg tgaacctggg agggggagct tgcagtaagc ggagattgca ccactgcact 3420
ccagcctggg tgacagagtg cgactctgtc tcaaaaaaaa aaaaaag 3467
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctttccctt tcctctacc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatacagcag catcctct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtccgttgag tcatattc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacaacctca tcatacac 18
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ucaaaaaaua uaaaaaugga c 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccauuuuuau auuuuuugaa a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acguuauucu augauaaaga c 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cuuuaucaua gaauaacgug a 21