CN105734155B - 软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用 - Google Patents

软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用，更具体的涉及mir‑4676及其成熟miRNA以及其靶标基因DDX58在诊治软骨母细胞型骨肉瘤中的新用途。通过对软骨母细胞型骨肉瘤患者及健康人群进行高通量测序，获得其miRNA和mRNA的表达数据，筛选出候选基因。随后，对候选miRNA和mRNA进行分子生物学验证及靶标验证，结果显示，本发明提供的miRNA及其靶基因DDX58与软骨母细胞型骨肉瘤密切相关，可用于软骨母细胞型骨肉瘤的临床诊断及预防检测。

Description

软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用
技术领域
本发明涉及疾病诊疗领域，具体的涉及软骨母细胞型骨肉瘤致病基因及其应用，更具体的涉及mir-4676及其成熟miRNA以及其靶标基因DDX58在诊治软骨母细胞型骨肉瘤中的新用途。
背景技术
骨肉瘤(osteosarcoma，OSA)是一种常见的原发恶性骨肿瘤，好发于青少年，有多种亚型，软骨母细胞型骨肉瘤是其一个亚型，内有较多的具明显异型性的软骨成分。鉴别软骨母细胞型骨肉瘤的意义在于防止其被误诊为软骨肉瘤，因为两者的治疗和预后有显著差别。软骨肉瘤的治疗方法主要为手术切除，预后与组织学分型和手术切除是否完整有关，预后相对较好。而骨肉瘤除手术切除外需辅以化疗，且总体预后较软骨肉瘤差。由于治疗方法和预后的不同，鉴别软骨母细胞型骨肉瘤和软骨肉瘤对临床治疗方案的确定具有重要意义，特别是近年来骨肉瘤的治疗强调术前化疗以提高保肢率和生存率，术前正确诊断显得尤为重要。软骨母细胞型骨肉瘤的组织病理学诊断标准是肿瘤主要由具明显异型性的软骨细胞组成，周围有纺锤型细胞恶性增生，可以直接产生骨样组织和不成熟骨。因此活检组织中存在骨样成分对于软骨母细胞型骨肉瘤的病理诊断十分重要。尽管所有活检都取自病变区，但肿瘤的不均质性常导致活检样本误差，进而直接影响正确的诊断。活检样本误差是导致软骨母细胞型骨肉瘤误诊为软骨肉瘤的重要因素。
本发明基于高通量测序方法，对3例软骨母细胞型骨肉瘤患者及10名健康对照人群进行测序，获得其miRNA和mRNA的表达数据，进而进行生物信息学分析，选取后备miRNA和mRNA进行分子生物学验证及靶标验证，结果显示，本发明提供的miR-4676-5p及其靶基因DDX58与软骨母细胞型骨肉瘤密切相关，可用于软骨母细胞型骨肉瘤的临床诊断及预防检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测mir-4676及其成熟miRNA的制剂在制备诊断骨肉瘤试剂中的应用。
mir-4676的序列见序列表SEQ ID NO 1，miR-4676-5p序列见序列表SEQ ID NO 2，miR-4676-3p序列见序列表SEQ ID NO 3。
进一步，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
进一步，诊断骨肉瘤试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录或基于免疫检测方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选所述mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因为DDX58。
优选的，骨肉瘤样本为外周血。
优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-4676及其成熟miRNA的引物，进一步优选，特异性扩增miR-4676-5p的引物序列为SEQ ID NO 4；基于探针杂交方法包括与mir-4676及其成熟miRNA的核酸序列杂交的探针；免疫检测方法包括与mir-4676及其成熟miRNA调控基因表达蛋白特异性结合的抗体，进一步优选与DDX58蛋白特异性结合的抗体。
本发明的目的在于提供mir-4676及其成熟miRNA的制剂在制备防治骨肉瘤试剂中的应用。
进一步，防治骨肉瘤试剂包括下调mir-4676或其成熟miRNA的转录，或抑制mir-4676或其成熟miRNA的活性的试剂。
优选的，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4676和/或其成熟miRNA的转录和/或阻断mir-4676和/或其成熟miRNA的活性。
本发明的目的在于提供mir-4676及其成熟miRNA的靶基因在制备诊断或防治骨肉瘤制剂中的应用。优选的，靶基因为DDX58。
进一步的，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
进一步，诊断骨肉瘤制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨肉瘤患者外周血中DDX58基因的表达。优选的，荧光定量PCR试剂盒中含有特异性扩增DDX58基因的引物；所述的基因芯片中包括与DDX58基因的核酸序列杂交的探针。更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测DDX58基因的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDNO 5，下游引物序列为SEQ ID NO 6。
进一步，骨肉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测骨肉瘤外周血中DDX58基因的表达产物。优选的，免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。进一步，检测DDX58蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售的DDX58单克隆抗体或多克隆抗体，优选市售的Anti-DDX58 antibody(ab180675)抗体。进一步，试剂盒包括：包被DDX58抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。
进一步，检测DDX58蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采用市售的DDX58单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗DDX58抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
本发明的目的在于提供上述骨肉瘤诊断制剂在制备骨肉瘤诊断工具中的应用。
本发明的目的在于提供一种防治骨肉瘤的制剂，所述试剂包含：
(a)抑制剂和/或抑制剂组合物，所述抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4676和/或其成熟miRNA的转录和/或阻断mir-4676和/或其成熟miRNA的活性；
(b)药剂学上能接受的载体。
优选的，采用反义寡核苷酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、TargetMasking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4676和/或其成熟miRNA的转录和/或阻断mir-4676和/或其成熟miRNA的活性。
进一步的，所述骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
本发明的目的在于提供一种骨肉瘤诊断试剂，骨肉瘤诊断试剂能够检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录或免疫检测方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。
进一步，骨肉瘤诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录或基于免疫方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选所述mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因为DDX58，ELISA和/或胶体金试纸条中含有与DDX58蛋白特异性结合的抗体。
本发明的目的在于提供mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因在制备诊断或防治骨肉瘤试剂中的应用。
进一步，靶基因为DDX58基因。
进一步，检测mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的制剂在制备诊断骨肉瘤试剂中的应用。
进一步，上调DDX58基因的制剂这制备防治骨肉瘤试剂中的应用。
优选的，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
本发明的目的在于提供上述防治骨肉瘤的制剂在制备骨肉瘤治疗药物或试剂中的应用。
定义：
现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
(1)Northern杂交
又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。
(2)miRNA表达谱芯片
原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片(Liquid chip)又称多功能悬浮点阵(Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片***。该***可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。
(3)核酶保护分析技术(RPA)
miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
(4)RAKE法
RAKE法(RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由***固定了的石蜡包埋的组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。
(5)原位杂交(in situ hybridization)
原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(LockedNucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方式。
(6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)
是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。
(7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)
荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。
(8)测序法
大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改进的扩增克隆法(miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3’末端。当5’端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个miRNA，明显提高了检测效率。
高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。
免疫检测方法是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，胶体金免疫层析法等。
酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合，使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底物作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果。
胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜(NC)、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中NC膜最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。NC膜可捕获一定量的包被(抗体)和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次固定于PVC板，即成试纸条。
基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(shorthairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。
基因特异性miR Mimics技术该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调节作用。
包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、***橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。
本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、***速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
附图说明
图1是RT-PCR检测软骨母细胞型骨肉瘤中miR-4676-5p相对表达水平图
图2是RT-PCR检测软骨母细胞型骨肉瘤中DDX58相对表达水平图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1样品的收集及总RNA提取
3例软骨母细胞型骨肉瘤患者，临床信息见表1，10名健康对照。软骨母细胞型骨肉瘤患者组3例及对照组10人要求空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
表1软骨母细胞型骨肉瘤患者临床信息
RNA提取标准：RNA纯度：OD260/280≧1.8，28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。RNA完整性检测方法：Agilent 2100(RNA 6000 Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度：1％琼脂糖胶；电压：5V/cm；时间：20min)。
实施例2文库构建、测序及数据分析
mRNA文库构建：真核生物mRNA 3‘末端具有ployA尾的结构，利用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，高温片段化后，以其为模板，合成cDNA。经过磁珠纯化、末端修复、3’末端加碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，构建mRNA文库。根据RNA样本检测结果，对软骨母细胞型骨肉瘤患者与正常对照组进行mRNA文库构建。
sRNA文库构建：实验采用Illumina TruSeq Small RNA试剂盒构建文库,在总RNA中回收长度18-30nt RNA，通过RT-PCR逆转录成单键cDNA，cDNA扩增后，回收cDNA产物，建成小RNAs文库。根据RNA样本检测结果，对软骨母细胞型骨肉瘤患者与正常对照组进行sRNA文库构建。
测序：运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA和miRNA进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
通过转录组数据分析软件对miRNA及mRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得到P值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达miRNA及mRNA。设定p值＜0.01且log2(Fold_change)normalized的绝对值≥3作为显著性阈值，共筛选出11个差异表达的miRNA，其中表达水平上调的miRNA 5个，表达水平下调的miRNA 6个。分析过程中设定P值＜0.05，共筛选出929个差异表达的mRNA，其中表达水平上调的基因455个，表达水平下调的基因474个。其中，表达上调明显的miR-4676-5p纳入我们的研究范围。
实施例3 Real-time PCR检测软骨母细胞型骨肉瘤组织中miR-4676-5p和DDX58基因的表达
1样品采集：
19例软骨母细胞型骨肉瘤肿瘤患者和36例健康对照的外周血均来自医院(采集时间2014年3月-2015年12月)。
2总RNA提取：
相关实验物品的去Rnase的处理：
①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。
②将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。
白细胞分离
(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h)；
(2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合，形成细胞悬液；
(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管；
(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面。离心1500rpm20min；
(5)用吸管轻轻吸出界面层入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。
RNA提取
(1)先加lml Trizol于EP管中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-l0min；
(2)加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4℃下1 2000转离心15min；
(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管，加入500：1异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；
(4)4℃1 2000g离心l0min，弃上清液，底部可见白色物质；
(5)加入lml 75％冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；
(6)4℃7500g离心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；lu1RNA样品于紫外分光光度计检测浓度，以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。
3逆转录
mRNA逆转录：
取1μg总RNA作为模板RNA，采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
miRNA逆转录：
RT体系的配制：1μg总RNA作为模板RNA；5×miScript HiSpec Buffer 4μl；10×Nucleics Mix 2μl；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μl；灭菌水补平至20μl。ABI9700型PCR仪上37℃保温60min使逆转录反应完全后，95℃5min终止反应。加入80μlNuclease-free H2O稀释至100μl储存在-20℃冰箱备用。
4荧光定量PCR
引物设计：
DDX58引物(NM_014314.3)：
正向引物：5’-GGATAGATGAATGAATGG-3’SEQ ID NO 5
反向引物：5’-AATAGAAGGTTAAGAAGTG-3’SEQ ID NO 6
扩增产物长度162bp。
mRNA的RT-PCR体系的配制：
反应组分 浓度 体积(μl)
mix 2× 10
上游引物 10uM 0.5
下游引物 10uM 0.5
cDNA - 2
Nuclease-free H2O - 补平至25μl
mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以actin作为内参。
扩增程序为：95°10min，45个循环(95℃15s，55℃60s)。
miRNA的RT-PCR体系的配制：
miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以snRNA U6作为内参。
扩增程序：95℃10min；40个循环(95℃10s，55℃30s)。
5统计学分析
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较miR-4676-5p、DDX58基因在软骨母细胞型骨肉瘤组和正常组中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中miR-4676-5p在软骨母细胞型骨肉瘤组表达水平明显高于正常对照组，约是对照的八倍多(具体见图1)，而DDX58在软骨母细胞型骨肉瘤组中的表达水平低于正常对照，约为对照组的四分之一(具体见图2),以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析的结果。
实施例4 miR-4676-5p与DDX58靶基因关系验证
一、材料准备：
(一)标本来源
人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
(二)主要试剂
LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Invitrogen)。
DDX58引物设计(见实施例3)：
miR-4676-5p序列发给合成公司，请其化学合成miR-4676-5p mimics及非特异性对照。
(三)主要溶液
1、细胞培养液
DMEM培养基+10％标准胎牛血清。
2、PBS(平衡盐溶液)
在800m1蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。
3、0.25％胰蛋白酶消化液
0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。
二、实验方法
1、细胞传代
(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25％胰蛋白酶液1m1，覆盖细胞层，瓶口消毒，加盖；
(2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10％胎牛血清的培养液终止消化；
(3)细胞计数：取上述细胞悬液0.5mI，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数：细胞总数/ml＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数；
(4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×105个细胞浓度，分装于培养瓶中(8m1/每瓶)，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2.miRNA瞬时转染
采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，操作按照LipofectaminTM2000试剂说明书进行。转染前24h将生长状态良好的细胞接种到12孔板中，细胞计数约2×104，常规培养至转染当天，细胞融合度为50-60％时进行试验。将20nM/40nM/80nM miRNA mimic加入到100u1DMEM培养基中，轻柔混匀；另用100u1 DMEM培养基稀释2u1 LipofectaminTM2000脂质体，轻柔混匀，室温孵育5min；混合DMEM-脂质体与DMEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，培养6h后更换完全培养基。其中，非特异性序列作为阴性对照。培养48h后提取细胞总RNA进行下一步实验。
3.实验结果：
将miR-4676-5p mimics转染至人骨肉瘤细胞株MG-63中，48h后提取细胞总RNA，空白对照为未转入miRNA的人骨肉瘤细胞株细胞，非特异性序列作为阴性对照。定量PCR检测靶基因DDX58的mRNA的水平变化。结果显示DDX58表达水平下调，表明DDX58是miR-4676-5p的目标靶基因。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。

Claims (7)

1.检测mir-4676及其成熟miRNA的制剂在制备诊断骨肉瘤试剂中的应用，其特征在于，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断骨肉瘤试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录的试剂或基于免疫检测方法检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况的试剂。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用northern 杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测骨肉瘤样本中mir-4676及其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，调控的靶基因为基因DDX58。
5.一种防治软骨母细胞型骨肉瘤的制剂，所述试剂包含：
（a）抑制剂和/或抑制剂组合物，所述抑制剂和/或抑制剂组合物下调mir-4676和/或其成熟miRNA的转录和/或阻断mir-4676和/或其成熟miRNA的活性；
（b）药剂学上能接受的载体。
6. 根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，采用反义寡核苷酸、 antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多靶点反义寡核苷酸的方法下调mir-4676和/或其成熟miRNA的转录和/或阻断mir-4676和/或其成熟miRNA的活性。
7.权利要求5或6所述的制剂在制备防治骨肉瘤试剂中的应用。
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