CN108359731A - AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用 - Google Patents

AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用。现有研究表明AACS基因参与脂肪酸合成和神经元细胞的发育等等，本申请发现了其新的用途，AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移中差异表达，抑制他们的表达后，骨肉瘤细胞的转移受到抑制，表明本申请在精准医疗领域具有重要的意义。

Description

AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的涉及AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用，更具体的涉及AACS及调控其表达的lncRNA-ENSG00000279233在诊疗骨肉瘤转移中的应用。
背景技术
现有研究显示，AACS基因参脂肪酸合成(Acetoacetyl-CoA synthetase gene isabundant in rat adipose,and related with fatty acid synthesis in matureadipocytes，Biochem Biophys Res Commun.2005Sep 16；335(1):215-9.)和神经元细胞的发育(Acetoacetyl-CoA synthetase is essential for normal neuronal development，Biochem Biophys Res Commun.2012Oct 19；427(2):398-403)等重要代谢活动，但是，没有研究显示其与骨肉瘤间的关系。
lncRNA为一类转录本长度大于200nt，缺少有效开放性阅读框，不编码蛋白质的RNA分子。其受RNA聚合酶Ⅱ催化转录合成，主要分布于细胞核，少量存在于细胞浆中。研究发现，lncRNA多倾向于折叠成热力学稳定的二级或更高级结构行使功能，部分lncRNA经过剪接成为具有类似于mRNA的polyA尾与启动子结构，且其可在组织器官分化过程中动态的表达与不同的剪接方式，因此lncRNA具有时间及空间特异性。目前lncRNA按转录位置的不同可分为5类:位于基因间区的lncRNA；天然反义链lncRNA；内含子区lncRNA；正义链lncRNA；双向lncRNA。miRNA是一类不具有开放性阅读框架、长度为18-25nt的非编码短序列RNA，其广泛存在于真核生物中。成熟的miRNA 5'端有一磷酸基团3'端为羟基，这一特点使它与大多数寡核苷酸和功能RNA的降解片段区别开来.绝大多数miRNA具有高度的保守性、时序性和组织特性。
申请人之前曾采用高通量测序研究转移性骨肉瘤患者及健康人的miRNA的表达数据，发现miR-4520-3p、miR-1299和骨肉瘤转移相关(ZL2016100688631和ZL2016100686566)，本申请中，发明人进一步对骨肉瘤转移患者、原发患者及正常人群，从mRNA到miRNA到lncRNA进行多维度研究。本发明提供与骨肉瘤转移密切相关的AACS基因、调控AACS基因表达的lncRNA-ENSG00000279233，为骨肉瘤机制研究提供很好的思路，为骨肉瘤临床诊断提供新的分子标志物，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供检测AACS基因及调控其表达的非编码RNA制剂在制备诊断骨肉瘤转移试剂中的应用，所述非编码RNA为lncRNA。
进一步，lncRNA为ENSG00000279233。
ENSG00000279233的序列见序列表SEQ ID NO 1。
进一步，诊断骨肉瘤转移试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中AACS或ENSG00000279233转录或基于免疫检测方法检测样本中AACS蛋白的表达情况。
优选的，采用northern杂交方法、表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中AACS或ENSG00000279233的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测样本中AACS蛋白的表达情况。
优选的，基于定量PCR方法包括特异性扩增AACS或ENSG00000279233的引物；基于探针杂交方法包括与AACS或ENSG00000279233的核酸序列杂交的探针；所述免疫检测方法包括与AACS蛋白特异性结合的抗体。
本发明的目的在于提供一种防治骨肉瘤转移试剂，包括下调AACS或ENSG00000279233的转录和/或抑制AACS或ENSG00000279233的活性的试剂。
本领域人员熟知抑制基因或lncRNA的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：包括但不限于通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因降解的microRNA、导入促进目的基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。
即通过激活AACS基因的抑制基因、激活抑制AACS基因表达的蛋白、导入抑制AACS基因表达的siRNA、激活促进AACS mRNA降解的microRNA、导入促进AACS蛋白降解的分子、抑制促进AACS基因表达的因子及蛋白的表达；或激活ENSG00000279233基因的抑制基因、激活抑制ENSG00000279233基因表达的蛋白、导入抑制ENSG00000279233表达的siRNA、激活促进ENSG00000279233降解的microRNA、抑制促进ENSG00000279233基因表达的因子及蛋白的表达。
进一步，所述试剂还包含药剂学上能接受的载体。
本发明的目的在于提供上述防治骨肉瘤转移试剂在制备治疗骨肉瘤转移药物或制剂中的应用。
本发明的目的在于提供上述骨肉瘤转移诊断制剂在制备骨肉瘤转移诊断工具中的应用。
包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、***橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。
本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、***速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
附图说明
图1是RT-PCR检测各组AACS基因和ENSG00000279233表达情况
图2是检测转染后各组AACS基因或ENSG0000027923的表达情况
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1样品的收集及总RNA提取
3例转移性骨肉瘤患者、3例原发性骨肉瘤患者及3名健康人。转移组选取肿瘤转移病灶，转移部位为肺部，原发组选取肿瘤原发病灶，健康对照选取截肢标本距肿瘤远端的标本。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
RNA提取标准：RNA纯度：OD260/280≧1.8，28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。RNA完整性检测方法：Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度：1％琼脂糖胶；电压：5V/cm；时间：20min)。
lncRNA和mRNA测序要求：
样品需求量：≥200ng；样品浓度：C≥20ng/μL；样品纯度：RIN≥7.0,28S/18S≥1.0。
miRNA测序要求：
样品需求量(单次)：≥1μg；样品浓度：15ng/μL≤c≤500ng/μL；样品纯度：OD260/280＝1.8～2.2；OD260/230≥2.0；28S:18S≥1.5；RIN≥8.0。
实施例2测序及数据分析
测序：
lncRNA和mRNA测序平台：hiseq2500 125PE，完成9个人的链特异性转录组测序(lncRNA)，每个样品的产出不低于10Gb数据。
mRNA和lncRNA分析：
1 tophat比对到参考基因组上，参考基因组来自于Ensembl V84；
2.cuffquant定量lncRNA和mRNA的表达量并标准化输出；
3.cuffdiff包比较两组之间lncRNA和mRNA的表达差异。
筛选标准P<0.01，abs(log2(fold change))>2；筛选到了307个差异表达基因(106上调，201下调)；50个差异表达lncRNA(27上调，23下调)。综合分析及人工筛查后，AACS基因及调控其表达的非编码RNA—ENSG00000279233进入我们的研究范围。AACS基因在转移组高表达(转移组VS原发组)，但是在原发组和健康对照组间却没有差异，显示其仅与骨肉瘤转移相关，AACS基因是长链非编码RNA—ENSG00000279233的nearby gene，同时数据分析显示也是lncRNA的靶基因，二者共表达相关系数高达96％。
实施例3 Real-time PCR检测骨肉瘤样本中AACS基因及调控其表达的lncRNA的表达情况
1样品采集：
14例转移性骨肉瘤肿瘤患者、15例原发骨肉瘤患者和20例健康对照的外周血均来自医院。
2总RNA提取：
相关实验物品的去Rnase的处理：
①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。
②将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。
白细胞分离
(1)取2m1抗凝外周血(采血时间不超过3h)；
(2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合，形成细胞悬液；
(3)加入4m1淋巴细胞分离液于另一离心管；
(4)吸取4m1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面(注意勿与淋巴细胞分离液混合)。离心1500rpm 20min；
(5)用吸管轻轻吸出界面层(白膜)入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。
RNA提取
(1)先加lml Trizol于EP管中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-l0min；
(2)加入0.2m1氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4℃下1 2000转离心15min；
(3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管(注意不要抽到蛋白层)，加入500：1异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min；
(4)4℃1 2000g离心l 0min，弃上清液，底部可见白色物质；
(5)加入lml 75％冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；
(6)4℃7500g离心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1DEPC水溶解RNA。取3u1RNA样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；lu1RNA样品于紫外分光光度计检测浓度，以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。
3逆转录
mRNA逆转录：
取1μg总RNA作为模板RNA，采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
4荧光定量PCR
引物设计：
ENSG00000279233
上游引物：5’-TCTTTCCCTTTCCTCTACC-3’(SEQ ID NO 2)
下游引物：5’-AATACAGCAGCATCCTCT-3’(SEQ ID NO 3)
AACS基因(NM_001319839.1)
上游引物：5’-GTCCGTTGAGTCATATTC-3’(SEQ ID NO 4)
下游引物：5’-CACAACCTCATCATACAC-3’(SEQ ID NO 5)
mRNA和lncRNA的RT-PCR体系的配制：
反应组分 浓度 体积(μl)
mix 2× 10
上游引物 10uM 0.5
下游引物 10uM 0.5
cDNA - 2
Nuclease-free H2O - 补平至25μl
mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以actin作为内参。
扩增程序为：95°10min，45个循环(95℃15s，55℃60s)。
5统计学分析
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较AACS基因和ENSG00000279233在骨肉瘤原发组、转移组组和正常对照组中的表达水平。结果显示：相对于原发组AACS基因和ENSG00000279233在骨肉瘤转移组高表达，表达量分别在2.14倍和2.53倍左右，二者在原发组和对照组间差异表达无统计学意义(具体见附图1)。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析的结果。
实施例4 AACS基因和ENSG00000279233与骨肉瘤转移关系验证
一、材料准备：
(一)标本来源
人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
(二)主要试剂
LipofectamineTM2000Transfection Reagent(Invitrogen)。
(三)主要溶液
1、细胞培养液
DMEM培养基+10％标准胎牛血清。
2、PBS(平衡盐溶液)
在800m1蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。
3、0.25％胰蛋白酶消化液
0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。
4、siRNA构建与合成
依据在线设计软件siDirect version 2.0(http://design.rnai.jp/)，根据AACS基因和ENSG00000279233中序列设计相应的siRNA。设计后送往合成公司合成，siRNA对照由公司提供。
二、实验方法
1、细胞传代
(1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25％胰蛋白酶液1m1，覆盖细胞层，瓶口消毒，加盖；
(2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10％胎牛血清的培养液终止消化；
(3)细胞计数：取上述细胞悬液0.5mI，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数：细胞总数/ml＝4大格细胞总数/4×104×稀释倍数；
(4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3×105个细胞浓度，分装于培养瓶中(8m1/每瓶)，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
细胞分组：空白对照组(转染脂质体组)；阴性对照组(转染非特异性的siRNA组)；转染AACS-siRNA组；转染ENSG0000027923-siRNA组；同时转染AACS-siRNA和ENSG0000027923-siRNA组。
2.瞬时转染
转染：按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent提供的步骤进行。
①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×105/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。
②配制转染液体：
A液：250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA，温和混匀；
B液：250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；
③转染：A液与B液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在CO2培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。
应用Real-time PCR方法检测转染前后AACS基因、ENSG0000027923表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行AACS基因、ENSG0000027923和内参的Real-time PCR反应，实验重复三次，具体步骤参照实施例3。
3.Transwell迁移实验
检测细胞迁移情况时，首先采用胰酶消化细胞，并加入无血清的培养基制备单细胞悬液；将1×105个细胞接种于Transwell小室内，下层内室内放置600u1含10％FBS的培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养；24h后采用棉签小心将小室内未迁移的细胞刮掉；无水甲醇固定1-5min，小室翻转晾干；采用0.1％的结晶紫染色20min；采用PBS清洗2次；将小室转移至含有PBS的24孔板内；倒置显微镜下观察细胞迁移情况，随机取6-8个视野，进行细胞计数。
4.实验结果
Real-time PCR检测转染效率。用双标准曲线的方法比较各组AACS基因或ENSG0000027923的表达。结果显示(见图2)：脂质体转染组、非特异性转染组基因的表达基本相似，差异无统计学意义；转染AACS-siRNA组AACS基因表达下降了71％，转染ENSG0000027923-siRNA组ENSG0000027923表达下降了65％，值得一提的是，转染AACS-siRNA组ENSG0000027923表达下降了7％，转染ENSG0000027923-siRNA组AACS基因表达下降了9％，同时转染AACS-siRNA和ENSG0000027923-siRNA组中，AACS基因和ENSG0000027923的表达分别下降79％和70％，显示AACS基因和ENSG0000027923之间在表达上具有很好的相关性。
转染AACS-siRNA组和转染ENSG0000027923-siRNA组的MG63细胞迁移的数目均显著低于空白对照组(p<0.05)，表明抑制AACS基因和ENSG0000027923表达将抑制骨肉瘤细胞迁移，转染AACS-siRNA组、转染ENSG0000027923-siRNA组和同时转染AACS-siRNA和ENSG0000027923-siRNA组细胞迁移数目分别为133、139和120个，空白对照组细胞迁移数目为172个，阴性对照组(转染非特异性序列)细胞迁移数目为190个，与空白对照组无统计学差异。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> AACS及其调控lncRNA在骨肉瘤转移诊疗中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3467
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ttttgtggtg tccacacgtt tcctttgtgt tctggttctg catgggaaga gccctgcagc 60
ttggggcttt ccatccatct ctttcttttt cccttatttt tggttggtga ctcttggcgg 120
ctctctgtgg ggacactgat gctctccaag aaggtacttc ttgaatcagt gacccttatt 180
gtctttttct gatgagggtc taaggttttc cttcagtgaa tcagtgctgt cttatctgga 240
acattttagg gaactggaat ttgcatttat ccccttggct ttatattatt gaaaaagaac 300
ttaggtcttt tgctgccaaa acagttgtta ccaaaccata tttgatcacg agagtagtgg 360
aacaatttat tatgaagggg gaaaactcag cacctttctt tccctggttg tcctggcttt 420
tgtgggcttg cgtccagggc acccagctgg gctctgggct ctttctctcc ccagataagg 480
tctcctcctg ggtgcattcg ggaagttatt tggagggttc ttccagattt ttgaatgccc 540
ttacattttc gagccctcac ggcaggctta ggagaggatt tacctctttt attgctgagc 600
tagggagggg tccagcctcc acagggaggt gacacggcgt ggccccagcc tgcccattca 660
ggaactggac ccacttcagg gtcagaagag gacaactgag gtctcatctg caaagtcccg 720
gggccttgct gaggcaggag agcctgttgc aggtctgacc cttcacatgt tgcttgtagg 780
gagtgggcta cccacccctc accaccccga gaacagcctg agcccggggc gcatctctgt 840
ctctgtgtgg agagacactg ccgcttctgt tccctgggaa gccagtgcca ttttcagcat 900
ttagggggtt cctggtgagg gctcaggaga gatctgggcc cagagccagc cacactcctt 960
gtgttgagta agactcatcc catctctgat ctgtgacacg aggagaggag cccctcactc 1020
acccgccaca gctcagggtg gtgatgcggc accattggag tgagcggccc cgggggactg 1080
gggaggctct ggccggcgta gtccttgccg ccagccttca cagcgggttc tctgagggtc 1140
tttatgcaca ggggctctgt cacttagctc tggccccccc tctgcccctg aggcatgact 1200
ttgggcaacg cagcatccaa gcctcagttt ccccatctct aagatgagtt gacaacagag 1260
cctctctggt gggtgccgtg ggccacaggg tgcccagaac gcagtccccg tgcctctgtt 1320
tctgtgctgc ctccactcac cgtcagcctt cattcggagt aggtgcgcat gctgtgcaaa 1380
gcccttccac acacctgatc tcagttgctc tctgtgcaaa agtcagagag gctttccctg 1440
catttcctgt ttgaacagtg tcctggcctc catctttagc tttgacagtg tttaccatgg 1500
gggtgctgag ggtgagttct tgtgtatgtg cacatctttc tggtggagtg gaggcctctt 1560
gaggacagga accttgtggg tctacctcct tttcttcgga gctcagctga ctgcctggca 1620
aacagcagat gcttttggtg tctggtgagt gaatgggggg tggggagctg gtcctgtgac 1680
cctggtgagg cgggacaaac ttgtcttcct cacacccatc ttacttcctc ttatgaggaa 1740
acccagagag atgaggggtc ttgcccaagg aaggggtgtc catagtcagc tctgccttct 1800
gctcacccag aataaagacc tggggacccc gcgagggtca tggccaagtg gaatggactc 1860
ctggcatttg agggcttccc gactgcagcc ctcaggcagc catggctgtc ccaagtccag 1920
cgggcctttg ctcgggtcat ggctgggatg tctggccctt cctgacagga ggctgctggg 1980
ctcctgtcta cttggggacg cctcatgcag gagctggtgt gggggtgggc aggggggcgg 2040
tggcttcttc ctttctcttt ccctttcctc taccttttcc cctctcccca gaggaaatgg 2100
tagcaggatt tcttttaaga ggatgctgct gtattttgcc agcgggtgga aggtggcggt 2160
attagctccc gtgagctgca cgtggacccc tgtgtgaagc gtagcagggc acagagcagg 2220
cgagacgttt gcatctcaca gcgggagggc cggcgacatc acatgaagtg acaggcaggc 2280
ccttggaagc cggtgcttag atccttaatt agttcacacg tcgactgaat tttcaagtga 2340
atgaatttta attacatctc aggttaaaaa aaaaaaaagg cgccagtgat cgaggactcg 2400
tcactgggct ctgttgctcc tgaagtttcc tagcccacaa cacaccaaca ctgccaaggg 2460
ctcttctgga ttcaaggtga aacacatgtg ccataaatct tggagctctg aatgtttgga 2520
aagggcccga ctgtgagaag aagtaacaca ccgtcccgtg cagatggctg gctctgagga 2580
ggagttcatg ggagcttggg gacactcttg cctctagttc taggaagctg ggccacttct 2640
gaagtaatgg caatatcaat aaagtaatgg tctttatcat agaataacgt gataaaatat 2700
atagagaagt aaaaaagtat aaataaaagt aaaatcatca taaaacatag tagctaggca 2760
cttctgaagc tgtgtgtgca ctgattcatt cacccagtga ctcacagcct tatagcctag 2820
gtgctggcac ccctactttc attcgaggaa gtgaactcag gttcaggaat ttacccagca 2880
tcccccagat ggggtggcag gagccacatc ttccctgaaa actttcttgc ccagggtgtc 2940
tgctgggatt taggaatggt ctatgcctgc atttttatcc tggtcaggct gaccctgaac 3000
cctgagagat actctttttt atattcccat ctggaatatg cactgccggg gtcagtgggg 3060
tgtctggagg gccctctcga ggccagcttg gatgtgacac gtgtcgtggg tcccaacggg 3120
gcccagtaga gtgtgcagcg ttagaaaaat gaacatgctc ggctgggcgc ggtggctcac 3180
gcctgtgatc ctagcacttt gggaggccaa gatgggtgga tcatgaggtc aggagatcaa 3240
gaccatcctg gctaacatga gaccatcctg gtgaaacccc atctctacta aaaatacaaa 3300
aaattagctg ggcgtggtgg caggtgccta tggtcccagc tactcaggag gctgaggtag 3360
gagaatggtg tgaacctggg agggggagct tgcagtaagc ggagattgca ccactgcact 3420
ccagcctggg tgacagagtg cgactctgtc tcaaaaaaaa aaaaaag 3467
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctttccctt tcctctacc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatacagcag catcctct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtccgttgag tcatattc 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cacaacctca tcatacac 18
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ucaaaaaaua uaaaaaugga c 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccauuuuuau auuuuuugaa a 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acguuauucu augauaaaga c 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cuuuaucaua gaauaacgug a 21

Claims (10)

1.检测AACS基因和/或调控其表达的非编码RNA制剂在制备诊断骨肉瘤转移试剂中的应用，所述非编码RNA为ENSG00000279233。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，诊断骨肉瘤转移试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测样本中AACS或ENSG00000279233转录或基于免疫检测方法检测样本中AACS蛋白的表达情况。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用northern杂交方法、表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中AACS或ENSG00000279233的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸条检测样本中AACS蛋白的表达情况。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基于定量PCR方法包括特异性扩增AACS或ENSG00000279233的引物；基于探针杂交方法包括与AACS或ENSG00000279233的核酸序列杂交的探针；所述免疫检测方法包括与AACS蛋白特异性结合的抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，特异性扩增AACS引物序列见序列表SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5；特异性扩增ENSG00000279233引物序列见序列表SEQ ID NO.2和SEQID NO.3。
6.一种防治骨肉瘤转移试剂，包括下调AACS或ENSG00000279233的转录和/或抑制AACS或ENSG00000279233的活性的试剂。
7.根据权利要求6所述的防治骨肉瘤转移试剂，其特征在于，通过激活AACS基因的抑制基因、激活抑制AACS基因表达的蛋白、导入抑制AACS基因表达的siRNA、激活促进AACS mRNA降解的microRNA、导入促进AACS蛋白降解的分子、抑制促进AACS基因表达的因子及蛋白的表达，优选的，抑制AACS基因表达的siRNA序列见序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
8.根据权利要求5所述的防治骨肉瘤转移试剂，其特征在于，激活ENSG00000279233基因的抑制基因、激活抑制ENSG00000279233基因表达的蛋白、导入抑制ENSG00000279233表达的siRNA、激活促进ENSG00000279233降解的microRNA、抑制促进ENSG00000279233基因表达的因子及蛋白的表达,优选的，抑制ENSG00000279233表达的siRNA序列见序列表SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的防治骨肉瘤转移试剂，其特征在于，还包含药剂学上能接受的载体。
10.权利要求6-9任意一项所述的防治骨肉瘤转移试剂在制备治疗骨肉瘤转移药物或制剂中的应用。
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