CN102093955A - 一株小球藻及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株小球藻及其应用。本发明提供的小球藻为小球藻(Chlorellasp.)YL-2，其保藏编号为CGMCC No.4305。小球藻YL-2在污水中生长良好，同时可以高效去除污水中的氮磷。小球藻YL-2自身富含油脂高，可以用于制备生物柴油。综上所述，小球藻YL-2在利用污水培养与生物柴油转化体系中具有广阔的应用前景。

Description

一株小球藻及其应用
技术领域
本发明涉及到一株小球藻及其应用，具体涉及该小球藻在生物能源和污水净化应用领域中的应用。
背景技术
能源危机与水资源危机是当前国际上面临的两大危机。据有关报道，全球矿物化石能源储量：石油1500亿吨，可使用年限为41年；煤炭5500亿吨，可使用年限为200年；天然气1100亿吨，可使用年限为60年。社会经济的迅速发展和人口的不断增加，有限的淡水资源已受到严重污染和破坏，全球正面临着水资源紧缺的严峻危机。因此，开发新型可再生的生物能源(生物柴油)和污水生物深度处理新技术是应对日益严重的能源危机和水资源危机的有力措施，也是人类可持续发展的必由之路。
利用微藻制备生物柴油已成为当前国内外的研究热点，尤其利用污水培养微藻，在净化污水的同时制备生物柴油是该研究领域的前沿课题。微藻具有生长快、收获期短、富含油脂、光合利用效率高等特点(每年固定的CO2大约占全球净光合产量的40％)，是目前可替代化石能源的主要原材料。微藻生长过程中会吸收利用大量氮磷元素，因此可利用污水处理厂的后处理单元培养微藻进行脱氮除磷深度净化污水。
目前，国内开展关于污水培养微藻制备生物柴油的相关技术研究报道较少，能否获得适宜污水培养并富含油脂较高，易于转化制备生物柴油的微藻藻株是关键。从已有的报道来看，所利用的藻株普遍存在培养条件要求高、生物产量和油脂产量低、生物柴油转化不稳定等问题难以实现应用。因此，筛选优良的藻种对于解决上述问题具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株小球藻及其应用。
本发明提供的小球藻(Chlorella sp.)，命名为YL-2，分离自北京清河的水样，已于2010年11月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.4305。小球藻YL-2在4℃-37℃(优选10℃-35℃，最优选28℃)的培养温度及pH6-9(优选pH7)的范围下均能生长。
小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305简称小球藻YL-2。
本发明还保护一种用于培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2的种子培养基，是将如下溶质用水定容至1升得到的：1ml A5+Co溶液、2g淀粉、1.5g蛋白胨、1.5g NaNO3、0.04gK2HPO4·3H2O、0.075gMgSO4·7H2O、0.036gCaCl2·2H2O、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁胺、0.001g Na2·EDTA和0.02g Na2CO3；所述A5+Co溶液是将如下溶质用水定容至1升得到的：2.86g/L H3BO3、1.81g/L MnCl 2·H2O、0.222g/L ZnSO4·7H2O、0.079g/LCuSO4·5H2O、0.390g/L Na2MoO4·2H2O、0.049g/L Co(NO3)2·6H2O。
本发明还保护一种制备小球藻(Chlorella sp.)YL-2种子液的方法，是在所述种子培养基中培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305，得到种子液。
培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305的温度条件具体可为4℃-37℃，优选10℃-35℃，最优选28℃。培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305的pH条件具体可为pH4-9，优选pH6-9，最优选pH7。
小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305可用于污水处理。所述污水处理具体可为污水除氮和/或污水除磷。
小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305可用于制备生物柴油(脂肪酸甲酯)。
本发明还保护一种制备生物柴油的方法，是以小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCCNo.4305中提取的油脂作为原料，制备生物柴油。小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCCNo.4305在进行所述提取前，可先在污水中进行培养。具体可将所述种子液接种入所述污水中进行培养。
小球藻YL-2在污水中生长良好，同时可以高效去除污水中的氮磷。小球藻YL-2自身富含油脂高，可以用于制备生物柴油。综上所述，小球藻YL-2在利用污水培养与生物柴油转化体系中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为基于18S rDNA部分序列构建的***发育树。
图2为小球藻YL-2在不同基础培养基上的生长情况。
图3为添加各种碳源对小球藻YL-2生长的影响。
图4为添加各种氮源对小球藻YL-2生长的影响。
图5为各种pH条件对小球藻YL-2生长的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、小球藻YL-2的分离鉴定
一、样品采集
2010年7月从北京清河采集含有绿藻的水样。
二、小球藻YL-2的分离和筛选
分离步骤：将采集的水样转接于经高压灭菌(121℃，高压蒸汽灭菌20分钟)的生活污水(取自某城市生活污水处理厂)，置于光照培养箱中富集培养。进行三轮富集培养之后，适当稀释藻液与污水琼脂半固体培养基混匀后光照培养，挑单藻落于小试管中扩大培养。
筛选步骤：首先将纯藻株接种于48孔酶标板(每孔含有无菌污水0.25mL)，放置光照培养箱中进行培养，以540nm检测生长情况，挑选生长较快的藻株，并测定其在污水培养条件下油脂含量。
在污水中液体培养的参数：28±1℃；1000～1200lux光照强度；光暗比14h∶10h；每天定时振荡(2次)，避免细胞沉淀；培养7天。
得到一株在污水中生长较快、富含油脂的纯藻株，命名为YL-2。
三、小球藻YL-2的鉴定
1、小球藻YL-2的形态鉴定
细胞形态呈圆形或椭球形，细胞直径3-6μm，单独存在，细胞中间有一个明显的载色体，淡绿色。
2、小球藻YL-2的分子鉴定
收集指数生长期的细胞，用植物基因组DNA提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)提取基因组DNA，以其为模板扩增18S rDNA基因片段。PCR扩增体系为25μL，其中含有12.5μL PCR 2×mix(TianGen)、正反向引物(10μmol/L)各1μL、模板DNA 1μL、双蒸灭菌水9.5μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。
用于扩增18S rDNA的引物为通用引物，序列如下：
正向引物(18SF)：5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′；
反向引物(18SR)：5′-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3′。
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序。PCR扩增产物为18s rDNA部分序列，共1742bp，测序结果如序列表的序列1所示。
测序结果经NCBI网站BLAST比对分析，YL-2与Chlorella vulgaris(FM205855)的Query coverage值达到100％，Max ident为99.9％。用MEGA 4.0软件进行多序列同源性分析，并构建***发育树(见图1，分枝上的数值为自举1000次的结果)。藻YL-2与Chlorella vulgaris很好地聚在一个分支。
基于形态鉴定和分子鉴定的结果，将YL-2鉴定为小球藻(Chlorella sp.)。将小球藻(Chlorella sp.)YL-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为No.4305。
实施例2、小球藻YL-2种子培养基的确定
一、基础培养基的选择
利用污水大规模培养微藻需要一定量的优良种子，因此考察培养小球藻通常采用的培养基(BG11培养基、SE培养基、水生6号培养基及f/2培养基)对藻株YL-2生长的影响。
1、培养基的制备
(1)BG11培养基
制备BG11培养基(pH7.0)。
BG11培养基(pH7.0)由NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、柠檬酸(citricacid)、柠檬酸铁胺(Ferric ammonium citrate)、Na2·EDTA、Na2CO3、A5+Co溶液和蒸馏水组成；每升培养基中，含有1ml A5+Co溶液、1.5g NaNO3、0.04g K2HPO4·3H2O、0.075g MgSO4·7H2O、0.036g CaCl2·2H2O、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁胺、0.001gNa2·EDTA和0.02g Na2CO3。
A5+Co溶液由溶质和水组成；溶质及其浓度为：2.86g/L H3BO3、1.81g/L MnCl2·H2O、0.222g/L ZnSO4·7H2O、0.079g/L CuSO4·5H2O、0.390g/L Na2MoO4·2H2O、0.049g/LCo(NO3)2·6H2O。
(2)SE培养基
制备SE培养基(pH7.0)。
SE培养基(pH7.0)由NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KH2PO4、NaCl、FeCl3·6H2O、Fe-EDTA、土壤提取液、A5溶液和蒸馏水组成；每升SE培养基中，含有1ml Fe-EDTA、40ml土壤提取液、1ml A5溶液、0.25g NaNO3、0.075g K2HPO4·3H2O、0.075g MgSO4·7H2O、0.025g CaCl2·2H2O、0.175g KH2PO4、0.025g NaCl、0.005gFeCl3·6H2O。
土壤提取液的制备方法：取0.5kg未施过肥的花园土，置于三角瓶(或烧杯)中，加入1000ml蒸馏水，用透气塞封瓶口，在水浴中沸水加热2小时，冷却数小时，在无菌条件下过滤，取上清液加入灭菌蒸馏水至总体积1000ml；4℃保存备用。
A5溶液由溶质和水组成；溶质及其浓度为：H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O 1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.009g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.004g/L。
Fe-EDTA的制备方法：将lg Na2·EDTA溶于50ml蒸馏水；将8lmg FeCl3·6H2O溶于50ml 0.1M的HCl水溶液；将以上两个溶液混合。
(3)水生6号培养基
制备水生6号培养基(pH7.0)。
SE培养基(pH7.0)由NH2CONH2、MgSO4·7H2O、NaHCO3、KCl、FeSO4、CaCl2、土壤提取液和蒸馏水组成；每升培养基中，含有0.5ml土壤提取液、0.133g/L NH2CONH2、0.1g/LMgSO4·7H2O、0.1g/L NaHCO3、0.033g/L KCl、0.2g/L FeSO4、0.03g/L CaCl2。
土壤提取液的制备方法同步骤2。
(4)f/2培养基
制备f/2培养基(pH7.0)。
f/2培养基(pH7.0)由NaHCO3、NaCl、KH2PO4、KNO3、NH2CONH2、MgSO4·7H2O、f/2微量元素溶液、f/2维生素溶液和蒸馏水组成；每升培养基中，含有1ml f/2微量元素溶液、1ml f/2维生素溶液、12g NaHCO3、1g NaCl、0.02g KH2PO4、0.1g KNO3、0.03gNH2CONH2、0.02g MgSO4·7H2O。
f/2微量元素溶液的制备方法：将ZnSO4·4H2O 0.023g、MnCl2·4H2O 0.078g、CuSO4·5H2O 0.010g、FeC6H5O7·5H2O 0.0039g、Na2MoO4·2H2O 0.0073g、CoCl2·6H2O0.012g、Na2·EDTA 0.00435g溶于去离子水，并用去离子水定容至1000ml。
f/2维生素溶液的制备方法：将维生素B120.0005g，维生素B10.1g溶于去离子水，并用去离子水定容至1000ml。
2、基础培养基的选择
将小球藻YL-2分别接种至BG11培养基、SE培养基、水生6号培养基或f/2培养基(将OD540nm值为0.5的小球藻YL-2以20％的体积比接种于各个培养基中，小球藻YL-2在培养基中的OD540nm值均为0.15左右)，28℃培养8天。
检测各个培养液的OD540nm值，结果见图2。小球藻YL-2在四种基础培养基中生长差异较大，采用BG11培养基培养时生长最快，培养8天时得到了较大的生物量(OD540nm达1.13)，而在f/2培养基中生长最差。因此，BG11培养基是较为适宜的基础培养基。
二、小球藻YL-2种子培养基的确定
为使小球藻YL-2更快更好的生长，在BG11培养基基础上进行氮源、碳源的优化。
在BG11培养基基础上添加不同碳源，各个碳源在培养基中的浓度均为2g。将小球藻YL-2分别接种至各培养基(将OD540nm值为0.5的小球藻YL-2以20％的体积比接种于各个培养基中，小球藻YL-2在培养基中的OD540nm值均为0.15左右)，28℃培养8天。检测各个培养液的OD540nm值，结果见图3。
在BG11培养基基础上添加不同氮源，各个氮源在培养基中的浓度均为1.5g。将小球藻YL-2分别接种至各培养基(将OD540nm值为0.5的小球藻YL-2以20％的体积比接种于各个培养基中，小球藻YL-2在培养基中的OD540nm值均为0.15左右)，28℃培养8天。检测各个培养液的OD540nm值，结果见图4。
将BG11培养基调节为不同的起始pH，将小球藻YL-2分别接种至各培养基(将OD540nm值为0.5的小球藻YL-2以20％的体积比接种于各个培养基中，小球藻YL-2在培养基中的OD540nm值均为0.15左右)，28℃培养8天。检测各个培养液的OD540nm值，结果见图5。
结果表明，最佳碳源为淀粉，最佳氮源为蛋白胨，最佳pH为7.0(pH6-9的范围下均能生长)。
根据氮源、碳源的优化结果，确定种子培养基的配方，制备种子培养基(pH7.0)。
种子培养基是将如下溶质用水定容至1升得到的：加入1ml A5+Co溶液、2g淀粉、1.5g蛋白胨、1.5g NaNO3、0.04g K2HPO4·3H2O、0.075g MgSO4·7H2O、0.036g CaCl2·2H2O、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁胺、0.001g Na2·EDTA和0.02g Na2CO3。
A5+Co溶液是将如下溶质用水定容至1升得到的：2.86g/L H3BO3、1.81g/LMnCl2·H2O、0.222g/L ZnSO4·7H2O、0.079g/L CuSO4·5H2O、0.390g/L Na2MoO4·2H2O、0.049g/L Co(NO3)2·6H2O。
实施例3、小球藻YL-2的生长情况
原污水取自某城市生活污水处理厂，经过沉淀，不灭菌，水质条件见表1。
表1原污水水质情况
  水质指标   指标值
  总氮(mg/L)   2091.63
  氨氮(mg/L)   349.09
  总磷(mg/L)   84.2
  CODcr(mg/L)   3502
  pH   6.9
1、小球藻YL-2的培养
在实施例2制备的种子培养基中28℃培养小球藻YL-2至对数生长期(OD540nm约为0.8)，以20％(体积比)转接至三角瓶中(每个1000ml三角瓶装500ml原污水)，28℃、光照强度1000～1200lux、光暗比14h∶10h条件下培养7天(生长进入停滞期)。
2、生物量和油脂含量测定
取培养液置于离心管中，5000r/min离心3min，弃去上清液，将离心管敞口置于烘箱中，80℃烘干至恒重。每升培养液得到0.57g干燥藻体(生物量为0.57g/L)。
将干燥藻体充分研磨为藻粉(重量为W0)，加入溶剂(石油醚∶***＝2∶1；体积比)，50℃浸提5小时，期间适当振荡混匀；提取结束后，加10％(质量百分含量)氢氧化钾水溶液沉淀细胞，摇匀静止后6000r/min离心10min，收集上清液于已经干燥并恒重的离心管中，于60℃水浴中迅速蒸去多余的溶剂，得到小球藻油脂(重量为W1)，计算小球藻的油脂含量(W1/W0*100％)。结果表明，小球藻YL-2在原污水中培养后油脂含量较高，约为39.2％。
实施例4、小球藻YL-2在二级污水中生长及氮磷去除情况
二级沉淀池出水(二级污水)取自某城市生活污水处理厂，不灭菌，水质条件见表2。
表2二级污水水质情况
  水质指标   指标值
  总氮(mg/L)   2326.21
  氨氮(mg/L)   1.73
  总磷(mg/L)   1.17
  CODcr(mg/L)   25.3
  悬浮物(mg/L)   9.6
  浊度   1.85
  pH   7.02
1、小球藻YL-2的培养
在实施例2制备的种子培养基中28℃培养小球藻YL-2至对数生长期(OD540nm约为0.8)，以20％(体积比)转接至三角瓶中(每个1000ml三角瓶装500ml二级污水)，28℃、光照强度1000～1200lux、光暗比14h∶10h条件下培养8天(生长进入稳定期)，每天定时振荡(2次)，避免细胞沉淀。
2、氮磷去除率的测定
取培养液进行总氮测定(GB11894-89，水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法)和总磷测定(GB/T 11893-1989，水质总磷的测定钼酸铵分光光度法)，结果见表3(3瓶的平均值)。
表3培养小球藻YL-2后二级污水中的总氮和总磷含量
3、生物量和油脂含量测定
测定方法同实施例3的步骤2
每升培养液得到0.45g干燥的藻体(生物量为0.45g/L)。
小球藻的油脂含量为42.2％。
结果表明，小球藻YL-2油脂含量较高，且在二级污水中生长良好，对氮(磷源不足导致总氮去除率较低)、磷有较强的去除效果，是一株在污水处理耦合生物油生产应用中很有潜力的微藻。
实施例5、应用小球藻YL-2制备生物柴油
1、小球藻YL-2的培养
同实施例4的步骤1。
2、制备小球藻油脂
取培养液置于离心管中，5000r/min离心3min，弃去上清液，将离心管敞口置于烘箱中，80℃烘干至恒重。
将干燥藻体充分研磨为藻粉，加入溶剂(石油醚∶***＝2∶1；体积比)，50℃浸提5小时，期间适当振荡混匀；提取结束后，加10％(质量百分含量)氢氧化钾沉淀细胞，摇匀静止后6000r/min离心10min，收集上清液于已经干燥并恒重的离心管中，于60℃水浴中迅速蒸去多余的溶剂，得到小球藻油脂。
3、制备生物柴油
将小球藻油脂和甲醇进行转酯化反应，得到脂肪酸甲酯，即生物柴油。工艺条件：醇油比30∶1(物质的量比)；催化剂为KOH，用量为小球藻油脂质量的1％，反应温度为50℃，反应时间1h。反应结束后离心分离，上层减压蒸馏过量甲醇后得到脂肪酸甲酯，下层为副产品甘油。
设置三次重复实验，结果取平均值。脂肪酸甲酯(生物柴油)的得率＝脂肪酸甲酯的质量/小球藻油脂的质量*100％。脂肪酸甲酯(生物柴油)的得率为69.6％。
Figure ISA00000372995300011
Figure ISA00000372995300021

Claims (10)

1.小球藻(Chlorella sp.)YL-2，其保藏编号为CGMCC No.4305。
2.用于培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2的种子培养基，是将如下溶质用水定容至1升得到的：1ml A5+Co溶液、2g淀粉、1.5g蛋白胨、1.5g NaNO3、O.04g K2HPO4·3H2O、0.075g MgSO4·7H2O、0.036g CaCl2·2H2O、0.006g柠檬酸、0.006g柠檬酸铁胺、0.001gNa2·EDTA和0.02g Na2CO3；
所述A5+Co溶液是将如下溶质用水定容至1升得到的：2.86g/L H3BO3、1.81g/LMnCl2·H2O、0.222g/L ZnSO4·7H2O、0.079g/L CuSO4·5H2O、0.390g/L Na2MoO4·2H2O、0.049g/L Co(NO3)2·6H2O。
3.一种制备小球藻(Chlorella sp.)YL-2种子液的方法，是在权利要求2所述种子培养基中培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305，得到种子液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305的温度条件为4℃-37℃，优选10℃-35℃，最优选28℃；所述培养小球藻(Chlorella sp)YL-2CGMCC No.4305的pH条件为pH4-9，优选pH6-9，最优选pH7。
5.小球藻(Chlorella sp)YL-2CGMCC No.4305在污水处理中的应用。
6.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述污水处理为污水除氮和/或污水除磷。
7.小球藻(Chlorella sp)YL-2CGMCC No.4305在制备生物柴油中的应用。
8.一种制备生物柴油的方法，是以小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCC No.4305中提取的油脂作为原料，制备生物柴油。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：小球藻(Chlorella sp.)YL-2CGMCCNo.4305在进行所述提取前，先在污水中进行培养。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述培养为将权利要求3或4所述种子液接种入所述污水中进行培养。
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