CN108350415A - 调节灌注模式中重组蛋白生产概况的方法 - Google Patents

调节灌注模式中重组蛋白生产概况的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养领域。特别地，本发明涉及使用浓缩细胞培养基以灌注模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法。

Description

调节灌注模式中重组蛋白生产概况的方法
发明领域
本发明涉及细胞培养领域。特别地，本发明涉及使用浓缩细胞培养基以灌注模式培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法。
背景技术
优化培养条件以获得最大可能的生产力是重组蛋白生产的主要目标之一。从经济角度来看，即使生产力的稍稍提高也会具有重要意义。许多商业上相关的蛋白质在宿主细胞中重组生产。这导致需要以有效且经济的方式生产这些蛋白质。不幸的是，重组蛋白生产的缺点之一是进行细胞培养的条件通常促使细胞活力随着时间的推移而降低，从而降低了效率和整体生产力。
灌注培养、分批培养和补料分批培养是培养用于生产重组蛋白的动物细胞的基本方法。使用灌注的细胞培养已经在生物技术工业中使用了数十年。实际上，灌注模式是达到重组生产蛋白质高产量的有效手段。与补料分批培养相比，这种培养模式还具有例如，可以使用较小尺寸生物反应器来获得至少相似产量的优点。
通常，特别是在灌注方法中，将诱导剂添加到培养基中以提高细胞中蛋白质的产量。这些诱导剂诱导细胞产生更多的所需产物。此类试剂之一是丁酸钠。然而，在细胞培养中使用丁酸钠的缺点是它显著影响细胞活力。例如，Kim等(2004)已经表明，虽然丁酸钠能够在分批培养中提高重组CHO细胞中的蛋白质产量，但在生产运行结束时(培养8天后)，细胞活力小于45％。在灌注分批培养中重复相同的实验，作者注意到在处理6天内，细胞活力低至15％，而在灌注模式下典型的生产期可以长达40至45天。
由于许多蛋白质是通过以灌注模式培养生长40至45天以上的细胞重组产生的，需要允许更有效生产运行的方法，该更有效的生产运行归因于给定灌注速率下的活细胞密度提高，和/或可接受细胞活力的长期维持(这使得滴度提高)。
因此，仍然需要允许更有效生产运行的培养条件和生产方法，该更有效生产运行归因于给定灌注速率下的活细胞密度提高，和/或可接受细胞活力的长期维持(这使得滴度提高)。本发明通过提供允许更有效的生产运行的组合物和方法来满足这种需要。
发明内容
一方面，本发明提供了以灌注模式生产重组蛋白的方法，所述方法包括在浓缩细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞。
另一方面，本发明提供以灌注模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在浓缩细胞培养基中培养所述宿主细胞。
另一方面，本发明提供提高灌注模式中重组蛋白产量的方法，所述方法包括在浓缩细胞培养基中培养表达所述蛋白质的哺乳动物宿主细胞。
另一方面，本发明提供浓缩细胞培养基，其中所述浓缩细胞培养基用于灌注方法。
在又一个方面，本文提供了生产浓缩细胞培养基的方法，其包括a)将主要组分以未浓缩标准培养基浓度的1.5至5倍的所需浓度混合在一起，以提供初级浓缩细胞培养基，b)任选向步骤a)的初级浓缩细胞培养基中加入不能在不改变培养基质量的情况下被浓缩的其余组分和/或加入调整培养基特定特征所需的组分，和c)加入盐以调节渗透压。
在本文所述的包括浓缩细胞培养基的任何方法中或任何浓缩细胞培养基中，所述浓缩细胞培养基可进一步补充有至少一种盐以调节所述培养基的渗透压。
附图说明
图1显示了不影响化合物平衡并保持渗透压恒定的示例性浓缩培养基。
图2显示了使用下列培养基进行的分批培养重复(duplicate)运行的细胞mAb1的VCD概况(profile)：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末(depleted powder)的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。A)从第0天到第6天，B)相同的经历一直持续到第10天。
图3显示了使用下列培养基进行的分批培养重复运行的细胞mAb1的活力概况：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。A)从第0天到第6天，B)相同的经历一直持续到第10天。
图4显示了使用下列培养基进行的分批培养重复运行的细胞mAb2的VCD概况：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。A)从第0天到第6天，B)相同的经历一直持续到第10天。
图5显示了使用下列培养基进行的分批培养重复运行的细胞mAb2的活力概况：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。A)从第0天到第6天，B)相同的经历一直持续到第10天。
图6显示了表达抗体mAb1的宿主细胞的滴度与时间(从第6天到第10天)的关系。使用下列培养基进行分批培养重复：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。
图7显示了表达抗体mAb2的宿主细胞的滴度与时间(从第6天到第10天)的关系。使用下列培养基进行分批培养重复：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。
图8显示了使用下列培养基进行的分批培养重复运行的细胞FP的VCD概况：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。
图9显示了使用下列培养基进行的分批培养重复运行的细胞FP的活力概况：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。
图10显示了表达融合蛋白FP的宿主细胞的滴度与时间(从第7天到第10天)的关系。使用下列培养基进行分批培养重复：01-02PM:补料分批生产培养基(对照)/03-04PM 1×:使用贫化粉末的补料分批平台培养基模拟物/05-06PM 1.5×：富集了1.5倍的培养基/07-08PM 2×：富集了2倍的培养基。
发明详述
在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以便于理解本发明。
如在说明书和权利要求中所使用的，在短语例如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”，“A或B”，“A”和“B”。
如说明书和权利要求书中所使用的，术语“细胞培养”或“培养”是指细胞在体外(即在生物体或组织外部)的生长和繁殖。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的，例如在《用于制药和细胞疗法的细胞培养技术》(Cell Culture Technology forPharmaceutical and Cell-Based Therapies)(2005)中教导的。哺乳动物细胞可以悬浮培养或与固体基质附连。
术语“细胞培养基”，“培养基”，“介质”及其任何复数形式是指可培养任何类型细胞的任何培养基。“基础培养基”是指含有对细胞代谢有用的所有必需成分的细胞培养基。这包括例如氨基酸、脂质、碳源、维生素和矿物盐。DMEM(达氏修正依氏培养基)，RPMI(洛斯维公园纪念研究所培养基)或培养基F12(翰氏(Ham's)F12培养基)是市售基础培养基的示例。或者，所述基础培养基可以是内部完全开发的专用培养基，在此也称为“化学限定培养基”或“化学成分确定的培养基”，其中所有成分都可以根据化学式来描述并且以已知浓度存在。培养基可以不含蛋白质和/或不含血清，并且可以补充有任何其他化合物(例如氨基酸，盐，糖，维生素，激素，生长因子)，这取决于培养细胞的需要。所述基础培养基在此可选地被称为生产性介质或生产性培养基。在本发明的上下文中，当关于灌注方法使用术语“细胞培养基”、“培养基”或“介质”时，所述培养基可替代地称为“灌注培养基”。“基础培养基”也可以被替代性地称为“灌注基础培养基”。
术语“生物反应器”或“培养***”是指可以培养细胞的任何***。该术语包括但不限于烧瓶，静态烧瓶，旋转瓶，管，摇管，摇瓶，摇摆袋(wave bag)，生物反应器，纤维生物反应器，流化床生物反应器以及带或不带微载体的搅拌罐生物反应器。或者，术语“培养***”还包括微量滴定板，毛细管或多孔板。可以使用任何尺寸的生物反应器，例如0.1毫升(0.1mL，非常小规模)至20000升(20000L或20KL，大规模)，例如0.1mL，0.5mL，1mL，5mL，0.01L，0.1L，1L，2L，5L，10L，50L，100L，500L，1000L(或1KL)，2000L(或2KL)，5000L(或5KL)，10000L(或10KL)，15000L(或15KL)或20000L(20KL)。在灌注模式下，通常使用1L至2KL的生物反应器。
术语“灌注”是指一种使细胞生长的方法，其中细胞培养物接受新鲜灌注培养基或新鲜灌注基础培养基，同时除去废培养基。灌注可以是连续的，逐步的，间歇的，或者这些中的任何或全部的组合。灌注速率可以为每天小于一工作体积至多个工作体积。优选地，细胞保留在培养物中，并且被去除的废培养基基本不含细胞或具有比培养物显著更少的细胞。灌注可以通过许多细胞保留技术来完成，包括离心，沉淀或过滤(参见例如Voisard等，2003)。当使用本发明的方法和/或细胞培养技术时，重组蛋白一般直接分泌到培养基中。一旦所述蛋白质分泌到培养基中，可以使用市售蛋白质浓缩滤器首先浓缩来自这种表达***的上清液。截至今天，不存在一种在实验室规模(以非常小的体积)执行灌注的方式。然而，似乎分批培养中观察到的主要趋势在灌注培养中通常保持相似(《连续生物过程：当前实践和未来潜力》(Continuous bioprocess：current practice and future potential)，2014)。通常，只需要进行微调。因此可以使用小型生物反应器筛选大量的培养基或条件，然后应用于灌注细胞培养。
如本文所用，“细胞密度”是指给定体积的培养基中细胞的数量。“活细胞密度”(或VCD)是指通过标准活力测定法测定的给定体积培养基中的活细胞数。术语“更高的细胞密度”或“更高的活细胞密度”及其等同术语意指，对于给定的灌注速率，细胞密度或活细胞密度与对照培养条件相比提高至少15％。对于给定的灌注速率，如果细胞密度与对照培养条件相比在-15％至15％的范围内，则认为细胞密度保持不变。术语“更低的细胞密度”或“更低的活细胞密度”及其等同术语意指，对于给定的灌注速率，细胞密度或活细胞密度与对照培养条件相比减少至少15％。
术语“活力”或“细胞活力”是指培养物中活细胞总数与细胞总数之间的比率。只要不低于60％，活力通常是可以接受的。活力通常用于确定收获时间。
术语“滴度”是指溶液中的物质(此处为感兴趣的蛋白质)的量或浓度。其指示溶液可被稀释且仍含有可检测量的感兴趣分子的次数。其经常规计算，例如通过连续稀释(1:2,1:4,1:8,1:16等)含有感兴趣蛋白质的样品，然后使用适当的检测方法(比色法，色谱法等)，测定各稀释液是否存在可检测水平的感兴趣蛋白质。如实施例部分中所用，还可以通过诸如fortéBIO或Biacore等手段来测量滴度。在灌注模式下，其通常称为收获滴度。还可以在生物反应器中于收获前测量滴度。
术语“比生产力”是指每个细胞每天产生的物质(本文为感兴趣蛋白质)的量。
术语“较高滴度”或“较高生产力”及其等同术语意指，当与对照培养条件相比时，滴度或生产力提高至少10％。如果与对照培养条件相比的滴度或比生产力处于-10％至10％的范围内，则认为滴度或比生产力保持不变。术语“较低滴度”或“较低生产力”及其等同术语意指，当与对照培养条件相比时，滴度或生产力降低至少10％。
如本文所用，术语“蛋白质”包括肽和多肽，并且指包含两个或更多氨基酸残基的化合物。根据本发明的蛋白质包括但不限于细胞因子，生长因子，激素，融合蛋白，抗体或其片段。治疗性蛋白质指用于或可以用于治疗的蛋白质。
术语“重组蛋白”是指通过重组技术产生的蛋白质。重组技术完全在本领域技术人员的知识范围内(参见例如Sambrook等，1989和更新版)。
说明书和权利要求书中所用术语“抗体”及其复数形式包括但不限于多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，如F(ab')2、Fab蛋白酶水解片段以及单链可变区片段(scFv)。还包括遗传工程改造的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、scFv和Fab片段，以及合成的抗原结合肽和多肽。
术语“人源化”免疫球蛋白指包含人框架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架区的人免疫球蛋白称为“受体”(通过将非人CDR接枝在人框架和恒定区上，或通过将整个非人可变结构域整合在人恒定区上(嵌合化)来进行人源化)。恒定区无需存在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同，可能除了CDR以及如果需要调节效应子功能则重链恒定区中的一些残基不同以外。通过人源化抗体，可提高生物半衰期，并降低了给予人后不良免疫反应的可能性。
说明书和权利要求书中所用术语“全人”免疫球蛋白指包含人框架区和人CDR的免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％或更高相同。因此，全人免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同，可能除了如果需要调节效应子功能或药代动力学特征则重链恒定区中的少数残基不同以外。在一些情况下，可将氨基酸突变导入CDR、框架区或恒定区内以改进抗体的结合亲和力和/或降低抗体的免疫原性和/或改进抗体的生物化学/生物物理学性质。
术语“重组抗体”是指通过重组技术产生的抗体。由于抗体生成中重组DNA技术的相关性，无需限制于天然抗体中发现的氨基酸的序列；可以重新设计抗体以获得所需的特性。可能的变化形式有很多且范围为从改变(例如)可变结构域或恒定区的仅一个或数个氨基酸到完全重新设计。通常进行恒定区中的变化以改进、降低或改变一些性质，诸如补体固定(例如补体依赖的细胞毒性，CDC)、与Fc受体的相互作用，以及其他效应子功能(例如抗体依赖的细胞毒性，ADCC)、药代动力学特性(例如与新生儿Fc受体(FcRn)结合)。进行可变结构域中的变化以改进抗原结合特性。除抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab')2以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。
本文所用术语“抗体部分”指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合区或可变区。所述部分或片段应维持完整链/抗体的至少一种活性，即其是“功能性部分”或“功能性片段”。如果其维持至少一种活性，其优选维持靶标结合特性。抗体部分(或抗体片段)的示例包括但不限于“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”。这些术语指在单个多肽链内包含来自重链和轻链的可变结构域但缺少恒定区的抗体片段。通常，单链抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其促使形成允许抗原结合的所需结构。在具体的实施方式中，单链抗体还可以是双特异性和/或人源化的。
“Fab片段”由一条重链的可变结构域和CH1结构域和一条轻链组成。Fab分子的重链无法与另一重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链且含有较多的恒定区(在CH1和CH2结构域之间)从而在两条重链之间形成链间二硫键的“Fab’片段”称作F(ab')2分子。“F(ab')2”含有两条轻链和两条重链，其含有CH1和CH2结构域之间的一部分恒定区，使得两条重链之间形成链间二硫键。在定义了一些重要术语后，现在可以关注于本发明的特定实施方式。
可根据本发明生产的已知抗体的示例包括但不限于阿达木单抗、阿仑单抗、贝利单抗、贝伐单抗、卡那单抗(canakinumab)、赛妥珠单抗,聚乙二醇连接(pegol)、西妥昔单抗、地诺单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、那他珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕妥珠单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、希妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizomab)。
术语“诱导剂”，“诱导物”或“生产力增强剂”是指当加入细胞培养物时允许提高生产性能或提高蛋白质产量的化合物或组合物(如培养基)。例如，已知用于大肠杆菌生产的诱导物之一是IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)，用于CHO生产的诱导物包括丁酸钠、多西环素或***等。
术语“对象”旨在包括(但不限于)哺乳动物，例如人、狗、牛、马、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔或大鼠。更优选地，对象是人。
灌注培养的关键方面是培养基组成和灌注速率。灌注速率将确定细胞可用的营养物的量，并且培养基组成决定这些不同化合物之间的比例。细胞培养基的适当平衡对细胞代谢至关重要。任何过量的化合物都可能导致可能损害培养活力的某种有毒化合物的积累和不需要的途径。一旦获得均衡的培养基，灌流速率可经改变以调整营养物质添加来适应细胞的需求。提高灌注速率将为细胞带来更多营养。副产品当然由细胞分泌，需要将其消除。再次，可以修变灌注速率以调整这种消除能力。当灌注速率提高时，废化合物去除速率也提高。
可以采取不同的方法来优化灌注培养。如果目标是最小化灌注速率以限制流速。为了在不改变化合物添加速率的情况下降低灌注速率，需要对培养基进行富集。本发明描述了富集已经存在的细胞培养基而不影响主化合物之间的比例并保持渗透压恒定的方法。
本发明提供了方法和培养基，其用于允许以灌注模式(灌注细胞培养)更有效的生产运行，这归因于给定灌注速率下的活细胞密度提高，和/或给定灌注速率下可接受细胞活力的长期维持，使得待生产的蛋白质的滴度提高并且培养基体积消耗减少。本发明基于用于蛋白质制造的细胞培养基的优化，例如抗体或抗原结合片段的生产，导致更有效的生产运行，对于给定的灌注速率提高活细胞密度，维持活力并使相同培养基体积消耗下的重组蛋白的总生产提高。
本发明人惊讶地发现，与在未浓缩的细胞培养基中以灌注模式(相同的灌注速率，主要组分之间相同的比例，相同的渗透压)培养的相同哺乳动物细胞相比，当在浓缩细胞培养基中以灌注模式培养哺乳动物细胞时，对于给定的灌注速率，活细胞密度提高，并且在生产期间避免了细胞活力的实质性或显著降低(即更有效的生产运行)。此外，重组蛋白的总产量可提高(即滴度可提高)。因此，当希望提高灌注模式下生产运行的效率时，可以使用浓缩的细胞培养基。
在一个方面，本发明提供浓缩细胞培养基，其中所述浓缩细胞培养基的组分(至少主要组分)的浓度(或存在的量)比未浓缩的相似培养基(即，以相同比例包含相同主要组分)高或约高1.5至5倍(1.5×至5×)。优选地，所述浓缩细胞培养基的所述组分的浓度比未浓缩的相似培养基的浓度高或高约1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍，4倍，4.5倍或5倍(1.5×至5×)。甚至更优选地，所述浓缩细胞培养基的所述组分的浓度比未浓缩的相似培养基的浓度高或高约1.5倍，2倍，2.5倍，3倍。例如，如果培养基未浓缩，半胱氨酸浓度为10mg/L，谷氨酰胺浓度为2mg/L(半胱氨酸/谷氨酰胺的比例为5:1)，则1.5倍浓缩培养基将含有15mg/L半胱氨酸和3mg/L谷氨酰胺，而5倍浓缩培养基将含有50mg/L半胱氨酸和10mg/L谷氨酰胺。在这两种情况下，半胱氨酸/谷氨酰胺的比例将保持在5:1。相同的原则将自动应用于浓缩培养基的所有主要组分。用作生产性培养基的浓缩培养基由两要素组成：初级浓缩培养基(通常配制成粉末)和至少一种补充物(见图1)。实际上，培养基的一些组分不能在不影响培养基质量(例如聚集，溶解性等)的情况下浓缩。一些组分也用于调整培养基的特定特征(例如渗透压，pH等)。因此，这些组分不会成为初级浓缩培养基的一部分，但会作为补充物添加。一旦初级浓缩培养基以液体形式配制后(例如如果初级浓缩培养基制成粉末)，将这种或这些其余的组分作为补充物添加到其中。例如，对于可以提供培养基的一半渗透压的盐的情况就是如此。所述盐可以是例如NaCl。在本发明的上下文中，初级浓缩细胞培养基首先配制而至少不含盐，无论是作为液体或是粉末。一旦初级浓缩培养基以液体形式配制后(例如如果初级浓缩培养基以粉末形式提供)，将所述盐稍后加入以调节渗透压。优选浓缩培养基的渗透压将与未浓缩的相当的细胞培养基的渗透压相同。或者，它可以作为补充物直接添加到细胞培养中。对于不能在不影响培养基质量的情况下进行浓缩的其他可能的组分和/或调整培养基特定特性所需的组分而言也是如此。一旦初级浓缩培养基以液体形式配制后(例如如果初级浓缩培养基以粉末形式提供)，它们可像盐一样稍后加入。或者，它们可以作为补充物直接添加到细胞培养中。
为了本发明的目的，细胞培养基(浓缩或不浓缩)是适合在灌注模式下在体外细胞培养中使哺乳动物细胞生长的培养基。所述培养基优选是化学成分确定的培养基。优选地，细胞培养基不含动物组分；它们可以不含血清和/或不含蛋白质。
而且，在本发明的内容中，重视液体培养基的最终性质(或特性)例如渗透压和pH是非常重要的。根据需要，可以使用从主要粉末制剂中去除的盐来调节渗透压并使用酸或碱来调节pH。可以使用正确量的缓冲盐调节pH值，当然也需要考虑其对渗透压的影响。
本文还描述了用于以灌注模式培养细胞的初级浓缩细胞培养基，其中所述初级浓缩细胞培养基在其配制时优选至少不用(depleted)盐。所述初级培养基可以配制成粉末或液体形式。
在另一方面，本发明提供生产浓缩细胞培养基的方法，其包括a)将主要组分以未浓缩的标准培养基的浓度的1.5至5倍的所需浓度混合在一起，提供初级浓缩细胞培养基，b)任选向步骤a)的初级浓缩细胞培养基中加入不能在不改变培养基质量的情况下浓缩的其余组分和/或加入调整培养基特定特征所需的组分，和c)加入盐以调节渗透压。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的浓缩细胞培养基在灌注培养中作为细胞培养物的诱导物的用途。
另一方面，本发明提供了以灌注模式生产重组蛋白的方法，所述方法包括在根据本发明的浓缩细胞培养基之一中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者，本发明提供一种以灌注模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在根据本发明的浓缩细胞培养基之一中培养所述宿主细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
又一方面，本发明提供了以灌注模式提高重组蛋白的产量的方法，所述方法包括在根据本发明的浓缩细胞培养基之一中培养表达所述蛋白的哺乳动物宿主细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
当根据本发明的浓缩细胞培养基作为整体使用时，对于相似的灌注速率，可以支持更高的细胞密度。相对于组分未浓缩的类似培养基生长的细胞，细胞活力没有实质性或显著降低，并且重组蛋白的总产量可以提高。
如本文所用，当与不用浓缩培养基生长的细胞相比时，短语“细胞活力没有实质性或显著降低”表示与对照培养物(即，不用浓缩培养基生长的细胞)相比细胞活力的降低不超过约15％。
在本发明的一个实施方式中，哺乳动物宿主细胞(本文也称为哺乳动物细胞)优选地选自但不限于HeLa、Cos、3T3、骨髓瘤细胞系(例如NS0、SP2/0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在本发明整体内容中，重组哺乳动物细胞在培养***例如生物反应器中生长。用培养基中的活细胞接种生物反应器。所述培养基优选是根据本发明的浓缩培养基。或者，用1倍浓度培养基中的活细胞接种生物反应器，在培养开始后的任何时间使用浓缩培养基代替该1×培养基。培养基优选无血清和/或无蛋白质。一旦接种到生产性生物反应器中，重组细胞经历指数生长阶段。灌注模式可以在需要支持细胞生长的任何时候被激活，并且应该在运行期间理想地保持恒定。一旦达到所需的细胞密度，可以激活排放以保持该细胞密度恒定。因此，培养基以与收获和排放的总和相对应的流速连续供给。例如，通过细胞保留装置(如ATFTM)收集收获物。
根据本发明的方法、培养基和用途可用于以一步或多步(或多阶段)培养过程在灌注模式中改进重组蛋白的总产量和/或生产运行。在多阶段过程中，细胞以两个或更多不同阶段进行培养。例如，细胞首先在一种或多种生长阶段(在改善细胞增殖和活力的条件下)中培养，然后转移至生产阶段(在改善蛋白质生产的条件下)。在多步培养过程中，某些条件可能会在一步(或一个阶段)和其他步(或其他阶段)之间存在变化：培养基组成，pH变化，温度变化等。生长阶段可以在高于生产阶段的温度下进行。例如，生长阶段可以在约35℃至约38℃的第一温度下进行，然后针对生产阶段将温度变为约29℃至约37℃的第二温度。只要过程支持良好的活力，细胞培养物可以在生产阶段维持数周。
用于本发明的哺乳动物细胞系(也称为“重组细胞”或“宿主细胞”)被遗传工程化以表达具有商业或科学价值的蛋白质。用于表达感兴趣多肽的细胞和/或细胞系的基因工程化的方法和载体是本领域技术人员熟知的；例如，Ausubel等(1988年和更新版)或Sambrook等(1989年和更新版)阐述了各种技术。本发明的方法或培养基可用于培养表达感兴趣的重组蛋白的细胞。通常将重组蛋白分泌到可从中将其回收的培养基中。然后可以使用可从商业供应商获得的产品和已知方法将回收的蛋白质纯化或者部分纯化。然后可以将纯化的蛋白质配制成药物组合物。用于药物组合物的合适制剂包括《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences，1995)中描述的那些。
在本发明整体内容中，重组蛋白选自抗体或其抗原结合片段，如人抗体或其抗原结合部分，人源化抗体或其抗原结合部分，嵌合抗体或其抗原结合部分，重组融合蛋白，生长因子，激素或细胞因子。
本领域技术人员能够理解，除了特定说明以外，本文所述的发明易进行变化和修改。应该理解的是，本发明包括所有这些变化和修改而不脱离本发明的精神或必要特征。本发明还包括说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意和全部组合。因此，本公开被认为是所示的所有方面并且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求书表明，并且在等同的含义和范围内的所有改变都包含在其中。
通过参考以下实施例将更全面地理解前述公开。然而，这些实施例是实施本发明的方法的示例，并不意图限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
I.细胞、细胞扩增和细胞生长
1)细胞
用两种CHO细胞系进行测定：
-表达IgG1 mAb1的CHO-S细胞，在本文中为“细胞mAb1”或“mAb1细胞”。“mAb1”是针对可溶性蛋白的完全人单克隆抗体。其等电点(pI)约为8.20-8.30。
-表达IgG1 mAb2的CHO-K1细胞，在本文中为“细胞mAb2”或“mAb2细胞”。“mAb2”是针对细胞膜上发现的受体的人源化单克隆抗体。其等电点(pI)约为9.30。
-表达融合蛋白FP的CHO-S细胞，在本文中为“细胞FP”或“FP细胞”。“FP”是IgG1融合蛋白，其包含针对膜蛋白的一部分(IgG部分)，其与靶向可溶性免疫蛋白的第二部分连接。其等电点(pI)约为6.3-7.0。
2)细胞扩增
在适合于细胞扩增的培养基中在管中进行细胞扩增。在扩增至少一周后开始灌注中的分析。
3)接种
表达mAb1、mAb2和FP的细胞以0.3×106个细胞/mL接种。
4)批次和灌注
所有分析均在分批培养中进行，用以模拟灌注过程。将宿主细胞在Spin(工作体积：30mL)中培养，并在试验过程中，在36.5℃、90％相对湿度、5％CO2和320rpm摇动下孵育。
II.分析方法
用Guava流式细胞仪或用ViCell测定活细胞密度(VCD)和活力。
根据分子，用Biacore或PA-HPLC测定抗体滴度。
通过采用激光诱导荧光的毛细管凝胶电泳(CGE-LIF)建立糖基化概况。聚集体和片段的剂量分别通过尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)和通过SDS-毛细管凝胶电泳进行。
结果和讨论
实施例1:培养基制备
培养基1(未浓缩的培养基；本文中的“PM”)使用下列物质制备：
-粉末1：含有主要营养物和盐(无血清和/或蛋白质)，浓度均为1×，给定的渗透压为“O”
-任选的蛋白质(应该使用含蛋白质的培养基时)
-用于pH控制(pH“P”)的缓冲盐
本文中的培养基“PM 1×”对应于不用盐的“PM”，除了pH控制外。
以与PM相似的方式制备培养基2，使粉末1的所有组分浓度加倍。然而，将组分浓度加倍会对溶液的渗透压有很大的影响。因此决定基于至少不用盐的粉末配制两种培养基(以下称PM 1.5×和PM 2×)。令人惊讶的是，这种技术可以浓缩主要营养物而不影响溶液渗透压。因此，PM 1.5×和PM 2×的制备如下：
-对于PM 1.5×：粉末3(初级培养基3)＝不用盐的粉末1(任选地不用其他化合物，例如化合物Y)，将组分浓缩1.5倍；对于PM 2×：粉末4(初级培养基4)＝不用盐的粉末1(任选地不用其他化合物，例如化合物Y)，将组分浓缩2倍
-任选的蛋白质(PM 1.5×和/或PM 2×应含蛋白质时)
-用于pH控制的缓冲盐(与PM相同的pH“P”)。
-调整渗透压的盐
-任选的化合物Y，如果化合物Y不包括在初级培养基3或4中。
在完成培养基制备之前将pH调节到所需的水平是很重要的。一旦已知所需的修正，缓冲盐量就可以相应地改变。
实施例2:培养基浓度对细胞mAb1和细胞mAb2的影响
为了评估本文定义的浓缩培养基对细胞生长和代谢的影响，以对照和不同富集水平进行分批和灌注培养。所有实验都重复两次。
例如，分批培养的结果显示：
-使用浓缩高至2倍的培养基，细胞能够从低细胞密度(接种密度＝0.3百万个细胞/mL)生长(图2、4和8)。
-浓缩1倍的培养基(PM和PM 1×)显示出相似的生长曲线和活力概况(图2、4和8)。
-使用1.5倍(PM 1.5×)和2倍(PM 2×)浓缩培养基，最大VCD显著提高(图2、4和8)。
-浓缩的培养基(PM 1.5×和PM 2×)延缓了活力下降(图3、5和9)。
结论：对于所有细胞(细胞mAb1、细胞mAb2和细胞FP)，使用本发明培养基浓缩策略是有前景的，因为在初步运行中在VCD和活力方面的性能得到改善。
实施例3:蛋白质总产量
还针对抗体mAb1和mAb2的滴度以及融合蛋白FP的滴度来评估浓缩培养基策略的功效。图6、7和10强调了由于浓缩培养基策略，抗体mAb1或mAb2以及融合蛋白PF的滴度得到极大改善。在所有情况下，使用PM 2×均可观察到最佳的改善(在每种情况下滴度都翻倍或几乎翻倍)。用PM 1.5×观察到的改善已经非常有趣(在每种情况下滴度提高约50％)。还预计这种策略不会改变蛋白质的糖基化概况：
总结：
浓缩培养基的使用是提高生产运行功效和提高产生的重组蛋白量的非常有前景的策略。因此所述浓缩培养基可以用作诱导物。
技术人员从上述实施例的结果可以理解，无论用于生产的是何种细胞系，都可以使用浓缩培养基来调节任何抗体和任何蛋白质的生产概况和生产运行功效。用于培养的培养基的最佳浓缩系数将需要根据具体情况确定。基于本发明的教导，可以完成该确定而无需任何创造性技术。
参考文献
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5)Sambrook等,1989和更新版,《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Laboratory Press)
6)《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，1995，第18版，宾夕法尼亚州伊斯顿，马克出版公司(Mack Publishing Company)编

Claims (14)

1.一种以灌注模式生产重组蛋白的方法，所述方法包括在浓缩细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞。
2.一种以灌注模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在浓缩细胞培养基中培养所述宿主细胞。
3.一种提高灌注模式中重组蛋白产量的方法，所述方法包括在浓缩细胞培养基中培养表达所述蛋白的哺乳动物宿主细胞。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法提高生产运行的效率。
5.如权利要求4所述的方法，其中，通过活细胞密度的提高和/或细胞活力降低减少来测定生产运行的效率。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自HeLa、Cos、3T3、NS0、SP2/0或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述浓缩细胞培养基的主要组分的存在量为未浓缩的相当的细胞培养基中存在量水平的1.5至5倍。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述浓缩细胞培养基的主要组分的存在量为未浓缩的相当的细胞培养基中存在量水平的1.5至3倍。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白选自：重组融合蛋白、生长因子、激素、细胞因子、抗体或其抗原结合片段，例如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分。
10.浓缩细胞培养基在灌注细胞培养中作为诱导物的用途。
11.一种浓缩细胞培养基，其中所述浓缩细胞培养基以灌注模式用于细胞培养。
12.一种用于以灌注模式培养细胞的初级浓缩细胞培养基，其中所述初级浓缩细胞培养基在其配制时优选至少不用盐。
13.如权利要求11所述的浓缩细胞培养基或如权利要求12所述的初级浓缩细胞培养物，其中在所述浓缩细胞培养基或所述初级浓缩细胞培养基配制后至少添加盐以调节所述培养基的渗透压。
14.一种生产浓缩细胞培养基的方法，其包括a)将主要组分以未浓缩的标准培养基浓度的1.5至5倍的所需浓度混合在一起，以提供初级浓缩细胞培养基，b)任选向步骤a)的初级浓缩细胞培养基中加入不能在不改变培养基质量的情况下浓缩的其余组分和/或加入调整培养基特定特征所需的组分，和c)加入盐以调节渗透压。
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