CN108350476A - 调节重组蛋白生产状况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在细胞培养过程中调节由哺乳动物宿主细胞表达的重组蛋白的糖基化的方法和组合物。还公开了在渗透压保持恒定同时含二糖或三糖的细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法。

Description

调节重组蛋白生产状况的方法
发明领域
本发明涉及用于在细胞培养过程中调节由哺乳动物宿主细胞表达的重组蛋白的糖基化的方法和组合物。还公开了在渗透压保持恒定同时含二糖或三糖的细胞培养基中培养表达重组蛋白的宿主细胞的方法。
背景技术
蛋白质如治疗性蛋白质或抗体的糖基化状况是重要的特征，由于其对例如折叠、稳定性和抗体依赖性细胞毒性(ADCC，负责抗体治疗效果的机制之一)的影响而导致半衰期和亲和力变化，进而影响蛋白质的生物学活性。糖基化高度依赖于用来生产感兴趣蛋白质的细胞系以及细胞培养过程(pH，温度，细胞培养基组成，原料批次间区别，培养基过滤材料，空气等)。
ADCC活性受与Fc区的寡糖连接的岩藻糖和/或甘露糖的量影响，随着岩藻糖减少和/或甘露糖增加可观察到活性增强。事实上，例如，与岩藻糖化的IgG相比，非岩藻糖化形式表现出显着增强的ADCC，这是由于FcγRIIIa结合能力增强并且没有任何补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗原结合能力的可测的变化(Yamane-Ohnuki和Satoh，2009)。类似地，显示高水平甘露糖-5聚糖的抗体也呈现更高的ADCC(Yu等，2012)。因此，在ADCC反应是抗体活性的主要治疗机制的情况下，提供方法制备糖基化状况以岩藻糖化降低和/或甘露糖化升高为特征的重组治疗性蛋白质是有益的。非岩藻糖化和/或高甘露糖化抗体的优点还包括在低剂量下达到治疗效果。然而，目前市场上的许多治疗性抗体都是高度岩藻糖化的，因为它们由哺乳动物细胞系产生，这些细胞系具有负责产物的Fc N-聚糖的核心岩藻糖化的内在酶活性。
由于糖基化(例如甘露糖化和/或岩藻糖化)可影响治疗效用和安全性，蛋白质糖基化的调整对于市售治疗性蛋白质或抗体具有特殊意义。此外，在生物仿制药化合物框架内，重组蛋白糖基化状况的控制是至关重要的，因为所述重组蛋白的糖基化状况必须与参照产物的糖基化状况相当。
优化培养条件以获得最大可能生产力是重组蛋白生产的其他主要目标之一。从经济角度来看，即使生产力的稍稍提高也会具有重要意义。许多商业上相关的蛋白质在宿主细胞中重组生产。因此需要以有效且经济的方式生产这些蛋白质。不幸的是，重组蛋白生产的缺点之一是进行细胞培养的条件通常使细胞活力随着时间的推移而降低，从而降低了效率和整体生产力。
灌注培养、分批培养和分批补料培养是培养用于生产重组蛋白的动物细胞的基本方法。通常，特别是在分批补料培养和灌注方法中，将诱导剂添加到培养基中以增加细胞中蛋白质的产量。这些诱导剂诱导细胞产生更多的所需产物。此类试剂之一是丁酸钠。然而，在细胞培养中使用丁酸钠的缺点是它显著影响细胞活力。例如，Kim等(2004)报道，虽然丁酸钠能够在分批培养中增加重组CHO细胞中的蛋白质产量，但在生产运行结束时(培养8天后)，细胞活力小于45％。以灌注分批培养重复该实验，作者发现，接受处理6天内细胞活力低至15％。
尽管使用诱导剂可以增加蛋白质产量，但是关于细胞活力的缺点不容忽视。事实上，使用熟知的诱导剂如丁酸钠在培养约5天后就可能会适得其反，而在分批补料模式下典型的生产期为12至15天，并且在灌注模式可以高达40-45天。
由于许多蛋白质是由细胞培养生长6天以上重组产生的，需要方法来允许更有效的多轮生产运行，同时长期维持可接受细胞活力。
还需要这样的培养条件和生产方法，其不仅能够通过在生产期间保持高细胞密度、提高收获滴度或避免细胞活力显著降低来提高重组蛋白生产力，而且还能够控制重组蛋白的糖基化状况，例如岩藻糖化和/或甘露糖化状况。本发明通过提供用于增加重组蛋白产量和/或调整重组蛋白糖基化且对生产效率没有负面影响的方法和组合物来满足这些需要。
发明内容
一方面，本发明提供了以分批补料或分批模式生产重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
另一方面，本文公开以分批补料或分批模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养所述宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
另一方面，本发明提供了以分批补料或分批模式增加重组蛋白产量的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述蛋白的哺乳动物宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
另一方面，本文公开了生产具有经调整糖基化状况的重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，同时保持培养基的渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
在其他方面，本发明提供了生产具有经调整的糖基化状况的重组蛋白的方法，所述方法包括在补充至少一批含二糖或三糖的补料的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，同时维持培养基的渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
另一方面，本发明提供三糖作为诱导剂和/或改善效率或生产运行的用途。
根据本发明，二糖优选为蔗糖，三糖优选为棉子糖。
附图说明
图1是实验方法1的示意图，其中渗透压恒定，糖浓度升高(参见实施例1)。黑条＝氯化钠浓度，灰条＝糖浓度。
图2显示在恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度棉子糖对mAb1细胞的作用。在96孔深孔板中培养14天的表达mAb1的mAb1细胞表现出的：a.生长状况和b.活力。在第3、5、7、10、12和14工作日采集活细胞密度和活力(Guava)的样品。
图3显示在恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度棉子糖对mAb1/mAb1细胞的作用。表达mAb1的mAb1细胞所表现的：a.第14个工作日的绝对收获滴度，b.第14工作日的比生产力[pg/细胞/天]，c.相对于对照的糖基化的绝对变化；未知＝未知，Gal＝半乳糖化，Man＝高甘露糖，Sial＝唾液酸化，非Fuc＝非岩藻糖化，Fuc＝岩藻糖化糖型。
图4显示在恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度棉子糖对mAb2细胞的作用。在96孔深孔板中培养14天的表达mAb2的mAb2细胞表现的：a.生长状况和b.活力。在第3、5、7、10、12和14工作日采集活细胞密度和活力(Guava)的样品。
图5显示恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度棉子糖对mAb2/mAb2细胞的作用。表达mAb2的mAb2细胞所表现的：a.第14工作日的绝对收获滴度，b.比生产力[pg/细胞/天]，c.相对于对照的糖基化的绝对变化；未知＝未知，Gal＝半乳糖化，Man＝高甘露糖，Sial＝唾液酸化，非Fuc＝非岩藻糖化，Fuc＝岩藻糖化糖型。
图6显示在恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度蔗糖对mAb1细胞的作用。在96孔深孔板中培养14天的表达mAb1的mAb1细胞表现出的：a.生长状况和b.活力。在第3、5、7、10、12和14工作日采集活细胞密度和活力(Guava)的样品。
图7显示恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度蔗糖对mAb1/mAb1细胞的作用。表达mAb1的mAb1细胞所表现的：a.第14工作日的相对收获滴度，b.比生产力[pg/细胞/天]，c.相对于对照的糖基化的绝对变化；未知＝未知，Gal＝半乳糖化，Man＝高甘露糖，Sial＝唾液酸化，非Fuc＝非岩藻糖化，Fuc＝岩藻糖化糖型。
图8显示恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度蔗糖对mAb2细胞的作用。在96孔深孔板中培养14天的表达mAb2的mAb2细胞表现出的生长状况(a)和活力(b)。在第3、5、7、10、12和14工作日采集活细胞密度和活力(Guava)的样品。
图9显示恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度蔗糖对mAb2/mAb2细胞的作用。表达mAb2的mAb2细胞所表现的：a.第14工作日的绝对收获滴度，b.比生产力[pg/细胞/天]，c.相对于对照的糖基化的绝对变化；未知＝未知，Gal＝半乳糖化，Man＝高甘露糖，Sial＝唾液酸化，非Fuc＝非岩藻糖化，Fuc＝岩藻糖化糖型。
图10显示恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度棉子糖对mAb1细胞的作用。在旋管(Spin Tube)中培养14天的表达mAb1的mAb1细胞的a.生长状况，b.活力。在第3、5、7、10、12和14工作日采集活细胞密度和活力(ViCell)的样品。
图11显示恒定的渗透压(315mOsm/kg)下不同浓度棉子糖对mAb1细胞的作用。在Spin Tube中培养14天的表达mAb1的mAb1细胞的a.第14工作日(WD)的绝对收获滴度(Biacore)，b.每天的比细胞生产力[pg/细胞/天]。在工作日5、7、10、12和14取样，n＝2。
图12显示恒定渗透压下(315mOsm/kg)不同浓度棉子糖对mAb1糖基化的影响(表达mAb1的mAb1细胞表现出的相对于对照的糖基化绝对变化)。未知＝未知，Gal＝半乳糖化，Man＝高甘露糖，Sial＝唾液酸化，非Fuc＝非岩藻糖化，Fuc＝岩藻糖化糖型。
图13显示了不同渗透压下两种浓度(0或30mM)棉子糖对mAb2细胞的作用。在96孔深孔板中培养14天的表达mAb2的mAb2细胞表现出的：a.生长状况和b.活力。在第3、5、7、10、12和14工作日采集活细胞密度和活力(Guava)的样品。培养基中补充棉子糖的用“30mM棉子糖”(空心符号)标示。
图14显示了不同渗透压下两种浓度(0或30mM)棉子糖对mAb2/mAb2细胞的作用。表达mAb2的mAb2细胞所表现的：a.第14工作日的绝对收获滴度，b.比生产力[pg/细胞/天]，和c.相对于对照的糖基化的绝对变化；未知＝未知，Gal＝半乳糖化，Man＝高甘露糖，Sial＝唾液酸化，非Fuc＝非岩藻糖化，Fuc＝岩藻糖化糖型。培养基中补充棉子糖的用“30mM棉子糖”(有划线)标示。
发明详述
本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开或申请。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不意在构成限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。如本文所使用的，提供以下定义以便于理解本发明。
在说明书和权利要求中，表述中使用“和/或”，例如“A和/或B”，包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。
在整个说明和图中的缩写“WD”表示工作日。
说明书和权利要求书中，术语“细胞培养”或“培养”是指细胞在体外(即在生物体外或组织外)的生长和繁殖。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的，例如在《用于制药和细胞疗法的细胞培养技术》(Cell Culture Technology for Pharmaceutical andCell-Based Therapies)(2005)中教导的。哺乳动物细胞可以悬浮培养或与固体基质附连。
术语“细胞培养基”，“培养基”及其任何复数形式是指可培养各种类型细胞的各种培养基。“基础培养基”是指含有对细胞代谢有用的所有必需成分的细胞培养基。这包括例如氨基酸、脂质、碳源、维生素和矿物盐。DMEM(达氏修正依氏培养基)，RPMI(洛斯维公园纪念研究所培养基)或培养基F12(翰氏(Ham's)F12培养基)是市售基础培养基的示例。或者，所述基础培养基可以是完全内部开发的专有培养基，在此也称为“化学组成明确的培养基”，其中所有成分都可以用化学式来描述并且以已知浓度存在。培养基可以不含蛋白质和/或不含血清，并且可以补充有各种其他标准化合物(例如氨基酸，盐，糖，维生素，激素，生长因子)，这取决于所培养的细胞的需要。
术语“标准培养基”是指渗透压在300至330mOsm/kg之间、优选315mOsm/kg或约315mOsm/kg的细胞培养基。根据本发明，术语“标准培养基”用于不含二糖或三糖、除此之外成分与包含二糖或三糖的培养基完全相似的培养基。例如，如果使用标准培养基“A”，培养基“A'”的唯一差别将是存在二糖如蔗糖或存在三糖如棉子糖，此外可能盐浓度不同(例如，本发明通过改变盐浓度保持渗透压恒定)。
术语“补料培养基”(及其复数)是指在培养过程中用作补充物以补充所消耗的营养素的培养基。补料培养基可以是市售的补料培养基或专有补料培养基(此处可选地为化学组成明确的补料培养基)。
术语“生物反应器”或“培养***”是指可以培养细胞的任何***，优选以分批或分批补料方式培养。该术语包括但不限于烧瓶，静态烧瓶，旋转瓶，管，摇管，摇瓶，摇摆袋(wave bag)，生物反应器，纤维生物反应器，流化床生物反应器以及带或不带微载体的搅拌罐生物反应器。或者，术语“培养***”还包括微量滴定板，毛细管或多孔板。可以使用各种尺寸的生物反应器，例如0.1毫升(0.1mL，非常小规模)至20000升(20000L或20KL，大规模)，例如0.1mL，0.5mL，1mL，5mL，0.01L，0.1L，1L，2L，5L，10L，50L，100L，500L，1000L(或1KL)，2000L(或2K)，5000L(或5KL)，10000L(或10KL)，15000L(或15KL)或20000L(20KL)。
术语“分批补料培养”是指一种培养细胞的方法，其中包括团注(bolus)或连续补充补料培养基以补充消耗的营养素。根据培养基配方、细胞系和其他细胞生长条件，这种细胞培养技术能获得超过10x 106至30x 106个细胞/ml的高细胞密度。可采用各种补料策略和培养基配方来创建和维持双相培养条件。
或者可以使用灌注培养。灌注培养中，细胞培养物接受新鲜灌注补料培养基同时除去废培养基。灌注可以是连续的，分步的，间歇的，或以上若干或全部的任意组合。灌注速率可以为每天小于一工作体积至多个工作体积。优选地，细胞保留在培养物中，且被去除的废培养基基本不含细胞或所含细胞显著少于培养物。灌注可以通过许多细胞截留技术来完成，包括离心，沉淀或过滤(参见例如Voisard等，2003)。
使用本发明的方法和/或细胞培养技术时，蛋白一般直接分泌到培养基中。一旦所述蛋白质分泌到培养基中，就可以使用市售蛋白质浓缩滤器首先浓缩来自这种表达***的上清液。
根据例如活细胞密度提高、细胞活力降低的减小和/或较高的收获滴度来测定生产运行的效率。
本文中，“细胞密度”是指给定体积的培养基中细胞的数量。“活细胞密度”(VCD)是指通过标准活力测定法测定的给定体积培养基中的活细胞数。术语“较高细胞密度”或“较高活细胞密度”及其等同术语指细胞密度或活细胞密度与对照培养条件相比提高至少15％。如果细胞密度与对照培养条件相比在-15％至15％的范围内，则认为细胞密度保持不变。术语“较低细胞密度”或“较低活细胞密度”及其等同术语指细胞密度或活细胞密度与对照培养条件相比降低至少15％。
术语“活力”或“细胞活力”是指培养物中活细胞总数与细胞总数之间的比率。只要不低于培养起始时的50％，活力通常是可以接受的。活力通常用于确定收获时间。例如，在分批补料培养中，一旦活力达到50％或培养14天后，就可以进行收获。
术语“滴度”是指溶液中的物质(此处为感兴趣的蛋白质)的量或浓度。在本发明的范围内，它也被称为收获滴度(收获后的滴度)。其指示溶液可被稀释且仍含有可检测量的感兴趣分子的稀释倍数。其计算是常规的，例如通过连续稀释(1:2、1:4、1:8、1:16等)含有感兴趣蛋白质的样品，然后使用适当的检测方法(比色法，色谱法等)测定各稀释液是否存在可检测水平的感兴趣蛋白质。还可以采用诸如fortéBIO或Biacore等手段来测量滴度，如实施例中所示。
术语“比生产力”是指每个细胞每天产出的产物(本文为感兴趣蛋白质)的量。
术语“较高滴度”或“较高比生产力”及其等同术语指与对照培养条件相比，滴度或生产力提高至少10％。如果与对照培养条件相比的滴度或比生产力处于-10％至10％的范围内，则认为滴度或比生产力保持不变。术语“较低滴度”或“较低生产力”及其等同术语指，与对照培养条件相比，滴度或生产力降低至少10％。
术语“渗透压”是指溶液中溶解颗粒的总浓度，并以每千克溶剂中溶质的渗透压摩尔来表示。它通常表示为mOsm/kg。
说明书和权利要求书中，“经调整的糖基化状况”包括与标准培养基中培养的表达重组蛋白的重组细胞所产生的相同蛋白的糖基化状况相比发生了调整的重组蛋白(例如治疗性蛋白质或抗体)的糖基化状况，所述标准培养基未添加二糖如蔗糖或三糖如棉子糖。经调整的糖基化状况可以包括调整所述蛋白质中的岩藻糖化水平和/或甘露糖化水平。在一个实施方案中，经调整的糖基化状况可以包括蛋白质的岩藻糖化水平总体降低而甘露糖化水平总体升高。
本文中，术语“蛋白质”包括肽和多肽，并且指包含两个或更多氨基酸残基的化合物。本发明所述的蛋白质包括但不限于细胞因子，生长因子，激素，融合蛋白，抗体或其片段。治疗性蛋白质指用于或可以用于治疗的蛋白质。
术语“重组蛋白”是指通过重组技术产生的蛋白质。重组技术为本领域技术人员所熟知和掌握(参见例如Sambrook等，1989和更新版)。
说明书和权利要求书中，“抗体”及其复数形式包括但不限于多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段如F(ab')2、Fab蛋白酶水解片段以及单链可变区片段(scFv)。还包括遗传工程改造的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、scFv和Fab片段，以及合成的抗原结合肽和多肽。
术语“人源化”免疫球蛋白指包含人框架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”且提供构架区的人免疫球蛋白称为“受体”(通过将非人CDR移植到人构架和恒定区上，或通过将整个非人可变结构域整合在人恒定区上(嵌合化)来进行人源化)。恒定区无需存在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、优选至少约95％或更高程度相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同，可能为根据需要调整效应功能而改变的若干重链恒定区残基和CDR除外。通过将抗体人源化可提高生物半衰期，并降低了给予人后不良免疫反应的可能性。
说明书和权利要求书中，“全人”免疫球蛋白指包含人框架区和人CDR的免疫球蛋白。恒定区无需存在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、优选至少约95％或更高程度相同。因此，全人免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同，可能为根据需要调整效应功能或药代动力学特征而改变的若干重链恒定区残基除外。在一些情况下，可在CDR、框架区或恒定区内引入氨基酸突变以改进抗体的结合亲和力和/或降低抗体的免疫原性和/或改进抗体的生物化学/生物物理学特征。
术语“重组抗体”是指通过重组技术产生的抗体。由于抗体生成中涉及重组DNA技术，因此无需局限于天然抗体中发现的氨基酸的序列；可以重新设计抗体以获得所需的特性。可能的变化形式有很多，包括仅改变(例如可变结构域或恒定区的)一个或数个氨基酸到完全重新设计(例如可变结构域或恒定区)。通常，进行恒定区中的变化是为改进、降低或改变诸如补体固定(例如补体依赖的细胞毒性，CDC)、与Fc受体的相互作用，以及其他效应子功能(例如抗体依赖的细胞毒性，ADCC)、药代动力学特性(例如与新生儿Fc受体(FcRn)结合)等特征。进行可变结构域中的变化是为改进抗原结合特性。除抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括例如单链或Fv、Fab和(Fab')2以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。
本文所用术语“抗体部分”指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合区或可变区。所述部分或片段应保留完整链/抗体的至少一种活性，即其是“功能性部分”或“功能性片段”。如果其保留至少一种活性，则优选保留靶标结合特性。抗体部分(或抗体片段)的示例包括但不限于“单链Fv”、“单链抗体”、“Fv”或“scFv”。这些术语指在单个多肽链内包含来自重链和轻链的可变结构域但缺少恒定区的抗体片段。通常，单链抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其能够令单链抗体形成抗原结合所需的结构。在具体的实施方式中，单链抗体还可以是双特异性和/或人源化的。
“Fab片段”包含一条重链的可变结构域和CH1结构域和一条轻链。Fab分子的重链无法与另一重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链且含有更多恒定区(CH1和CH2结构域之间部分)从而在两条重链之间形成链间二硫键的“Fab’片段”称作F(ab')2分子。“F(ab')2”含有两条轻链和两条重链，其含有恒定区中CH1和CH2结构域之间的部分，使得两条重链之间形成链间二硫键。在定义了若干重要术语后，现在可以着重讨论本发明的具体实施方式了。
可根据本发明生产的已知抗体的示例包括但不限于阿达木单抗、阿仑单抗、贝利单抗、贝伐单抗、卡那单抗(canakinumab)、聚乙二醇化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、地诺单抗、依库珠单抗、戈利木单抗、英夫利昔单抗、那他珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕妥珠单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、希妥昔单抗、托珠单抗、曲妥珠单抗、优特克单抗(ustekinumab)或维多珠单抗(vedolizomab)。
大多数天然存在的蛋白质包含碳水化合物或糖部分，它们与主肽链上选定数目的氨基酸通过特异性连接从而连接至肽。因此，许多天然存在的肽被称为“糖肽”或“糖蛋白”或被称为“糖基化”的蛋白质或肽。在糖蛋白上主要的糖有：岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖，N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)、N-乙酰葡糖胺(“GlcNAc”)和唾液酸。连接到肽链上的寡糖结构被称为“聚糖”分子。聚糖的性质影响它们所连接的蛋白质的三维结构和稳定性。天然糖肽中发现的聚糖结构分为两大类：“N-连接聚糖”或“N-连接寡糖”(真核细胞中的主要形式)和“O-连接聚糖”或“O-连接寡糖”。在真核细胞中表达的肽通常包含N-聚糖。N-连接的糖蛋白的糖基团的加工发生在内质网(ER)的腔中，并在高尔基体中继续。这些N-连接的糖基化发生在肽一级结构中的天冬酰胺残基上，在含有氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸(X是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸残基)的位点上。
表1列出了CHO细胞分泌的抗体或其片段上可见的主要聚糖：
表1-主要聚糖结构(图例：灰色方块：GlcNAc；中灰色圆：甘露糖，浅灰色圆：半乳糖；灰色三角形：岩藻糖；灰色菱形：唾液酸)
“糖型”指蛋白质例如抗体或其片段的一种同种型，其区别仅在于连接的聚糖的数量和/或类型。通常，包含糖蛋白的组合物包含所述糖蛋白的多种不同糖型。
用于测定聚糖一级结构的技术在本领域中是公知的，详细描述可见例如Roth等(2012)或Song等(2014)。分离细胞产生的蛋白质并确定其N-聚糖的结构是常规的。N-聚糖在含糖分支(也称为“天线(antennae)”)的数目以及所述分支的性质上各不相同，这些分枝除了man3GlcNac2核心结构之外还可包括例如N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、岩藻糖和/或唾液酸。关于标准糖生物学命名法的综述，参见《糖生物学基础》，1999。
岩藻糖化蛋白质包含至少一个岩藻糖残基，例如包括如GOF，G1F和/或G2F之类聚糖(参见表1)。
蛋白质上的N-聚糖结构包含至少三个甘露糖残基。这些结构可以进一步被甘露糖化。甘露糖化的聚糖如Man5，Man6或Man7被称为高甘露糖聚糖(见表1)。
术语“对象”包括(但不限于)哺乳动物，例如人、狗、牛、马、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔或大鼠。更优选地，对象是人。
术语“诱导剂”，“诱导物”或“生产力增强剂”是指加入细胞培养物能令生产性能或蛋白质产量提高的化合物或组合物(如培养基)。例如，已知用于大肠杆菌生产的诱导物之一是IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)，用于CHO生产的诱导物包括丁酸钠、多西环素或***等。
本发明提供了用于提高生产运行效率和/或调整重组蛋白如治疗性蛋白质或抗体的糖基化状况的方法和组合物。本发明是基于对用于蛋白质制造(例如生产抗体或抗原结合片段)的细胞培养条件进行优化，由此实现更有效的生产和/或产生具有经调整的糖基化状况的重组蛋白，优选岩藻糖化降低和/或甘露糖化升高(即高甘露糖聚糖增加，例如Man5)，同时对生产效率没有不利影响。
出人意料地，在补充有二糖如蔗糖或三糖如棉子糖(它们不是培养基或补料培养基的标准组分)并控制培养基渗透压的细胞培养条件下，可以调整重组蛋白的高甘露糖化糖型含量和/或重组蛋白的岩藻糖化糖型。因此，在细胞培养的生产性运行中，如果需要调整重组蛋白的糖基化状况例如所生产的重组蛋白的岩藻糖化水平和/或甘露糖化水平，可向细胞培养物中添加补充有二糖如蔗糖或三糖如棉子糖的细胞培养基，同时控制渗透压，较好的是相比不含所述二糖或所述三糖的标准培养基保持渗透压恒定(即保持或维持其与不含所述二糖或所述三糖的标准培养基的渗透压近似)。或者，细胞培养基可以本身已经包含所述二糖或三糖，只要所述培养基的渗透压保持与不含所述二糖或所述三糖的标准培养基的渗透压近似。还显示，在补充有二糖或三糖、同时相比不含所述二糖或所述三糖的标准培养基保持渗透压恒定的条件下细胞培养可以实现更有效的运行(例如更高的VCD和/或细胞活力和/或总体滴度)。
D-(+)-棉子糖(本文亦称“棉子糖”)：(O-α-D-吡喃半乳糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖苷)
D-(+)-蔗糖(本文亦称“蔗糖”)：α-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-呋喃果糖苷
一方面，本发明提供了以分批补料或分批模式生产重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。在一些优选的实施方案中，二糖是蔗糖，三糖是棉子糖。
或者，本发明描述了以分批补料或分批模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养所述宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的一种标准培养基近似。在一些优选的实施方案中，二糖是蔗糖，三糖是棉子糖。
另一方面，本发明提供了以分批补料或分批模式提高重组蛋白产量的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述蛋白的哺乳动物宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。在一些优选的实施方案中，二糖是蔗糖，三糖是棉子糖。
本发明更还提供二糖或三糖在细胞培养基中作为诱导剂和/或提高至少一轮生产运行的效率的用途，同时保持所得培养基的渗透压与标准培养基的渗透压近似。
另一方面，本发明提供生产具有经调整的糖基化状况的重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，同时保持培养基的渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。在一些优选的实施方案中，二糖是蔗糖，三糖是棉子糖。
在其他方面，本文提供了生产具有经调整糖基化状况的重组蛋白的方法，所述方法包括在补充至少一批含二糖或三糖的补料的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，同时维持培养基的渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。在一些优选的实施方案中，二糖是蔗糖，三糖是棉子糖。
优选地，就本发明整体而言，蛋白质的经调整的糖基化状况包括调整所述蛋白质的岩藻糖化水平和/或甘露糖化水平。具体地说，岩藻糖化水平的调整是重组蛋白中总岩藻糖化水平降低和/或甘露糖化水平的调整是重组蛋白中总甘露糖化水平升高。更特定的情形中，岩藻糖化水平的降低至少是由于G0F和/或G1F形式的减少，更进一步的特定情形中，岩藻糖化水平的降低至少是由于G0F形式的减少。更的特定情形中，甘露糖化水平的升高至少是由于高甘露糖型如Man5的增加。优选地，总岩藻糖化水平降低约0.1％至约99％，如约0.1％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％。如果岩藻糖基残基完全消失，则该蛋白质将是非岩藻糖化的。在另一实施方式中，总甘露糖化含量或水平升高约0.1％至约100％，如约0.1％，1％，1.5％，2％，2.5％，3％，3.5％，4％，4.5％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或100％。或者两种修饰同时发生，即降低岩藻糖化和提高甘露糖化。
本文中，与在不含二糖或三糖的标准培养基中生长的细胞相比“细胞活力基本上不实质性或显著降低”指与对照培养物(即无二糖或三糖条件下生长的细胞)相比细胞活力不降低或降低不超过约15％。
本文中，“对生产效率没有负面影响”或其等同形式指生产效率与对照培养物(即无二糖或三糖条件下生长的细胞)相比不降低或降低不超过约15％。本发明中，由于生产运行的效率可以基于细胞活力、活细胞密度和/或收获滴度来测量，因此，举例来说，如果VCD与对照相比约-5％，或者如果收获滴度与对照相比-10％或约-10％，认为对生产效率没有负面影响。
就本发明整体而言，待生产的重组蛋白可以是治疗性蛋白质、抗体或其抗原结合片段，例如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分。优选地，它是抗体或其抗原结合片段。
本发明的方法可用于产生岩藻糖基残基的量或水平降低和/或甘露糖基残基的量或水平升高的蛋白质(例如抗体)。具有这种经修饰糖基化状况的抗体已被证明具有增强的ADCC。
就本发明整体而言，三糖化合物如棉子糖存在于培养基或补料培养基中或添加到培养基或补料培养基中(例如作为补充物)的浓度优选是或约为0.001至130mM，更优选是或约为0.01至100mM，例如是或约为0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或100mM(培养基中或补料培养基中曾经的、在进入培养***之前即接种之前的三糖浓度)。例如，但不作为限制，通过调节三糖的浓度并同时保持培养基的渗透压恒定，可以调整糖基化状况以及生产运行的效率。或者，可以将三糖作为补充补料加入。在这种情况下，它将以与以上所述相似的起始浓度加入。
就本发明整体而言，二糖化合物如蔗糖存在于培养基或补料培养基中或添加到培养基或补料培养基中(例如作为补充物)的浓度优选是或约为0.001至150mM，所述浓度优选是或约为0.01至150mM，例如是或约为0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、100或130mM(培养基中或补料培养基中曾经的、进入培养***之前即接种之前的二糖浓度)。例如，但不作为限制，通过调节二糖的浓度并同时保持培养基的渗透压恒定，可以调整糖基化状况以及生产的效率。或者，可以将二糖作为补充性补料加入。在这种情况下，它将以与以上所述相似的起始浓度加入。
就本发明而言，细胞培养基是适合动物细胞如哺乳动物细胞在体外细胞培养中生长的培养基。细胞培养基配方在本领域中是众所周知的。根据培养细胞的需要，细胞培养基可补充额外的标准组分，如氨基酸，盐，糖，维生素，激素和生长因子。优选地，细胞培养基不含动物性组分；它们可以不含血清和/或不含蛋白质。标准培养基具有300至330mOsm/kg之间的渗透压，例如315mOsm/kg或约315mOsm/kg。当待用培养基包含二糖或三糖并且应具有与标准培养基相似的渗透压时，所述培养基优选为除盐的培养基，例如除去NaCl、MgCl2和/或CaCl2，这取决于通常存在于所述培养基中的盐。一旦以所需浓度添加二糖或三糖，通过引入至少一种盐来控制渗透压。
在本发明的某些实施方式中，向细胞培养基补充二糖或三糖，例如在培养开始时，并且/或者以分批补料或连续的方式。二糖或三糖补充物的添加可以是基于测得的中间态糖基化状况或测得的至少一轮生产运行的中间效率。
就本发明整体而言，重组细胞(优选哺乳动物细胞)在培养***例如生物反应器中生长。向生物反应器中接种活细胞，其中的培养基含有或补充有二糖(如蔗糖)或三糖(如棉子糖)。培养基优选无血清和/或无蛋白质。一旦接种到生产性生物反应器中，重组细胞经历指数生长阶段。可以采用分批补料方法团注补以任选性补充有所述二糖或三糖的补料培养基来维持生长期。补料培养基优选无血清和/或无蛋白质。这些补充性团注补料通常开始于细胞接种到生物反应器后不久，在预计或确定细胞培养物需要补料的时候进行。例如，补充性补料可以从培养的第3天或第4天或者更早或更晚一天或两天开始。在培养阶段，培养物可能会接受两次，三次或更多的团注补料。这些团注补料中的任何一批可以任选地包含或补充有二糖或三糖。二糖或三糖的补料或补充可以在培养开始时进行，以分批补料和/或连续的方式进行。培养基可以包含或补充有葡萄糖。所述补充可以在培养开始时进行，以分批补料和/或连续的方式进行。
本发明的方法、组合物和用途可用于改善多步培养过程中重组蛋白的生产。在多阶段过程中，细胞培养包括两个或更多不同阶段。例如，细胞首先在一个或多个生长阶段(在改善细胞增殖和活力的条件下)中培养，然后转入生产阶段(在改善蛋白质生产的条件下)。在多步培养过程中，某些条件在一步(或一个阶段)和其他步(或其他阶段)之间可能会有所不同：培养基组成，pH变化，温度变化等。生长阶段可以在高于生产阶段的温度下进行。例如，生长阶段可以在约35℃至约38℃的第一温度下进行，然后为进入生产阶段而将温度变为约29℃至约37℃的第二温度。收获前，细胞培养物可以在生产阶段维持数天甚至数周。
在本发明的一个实施方式中，宿主细胞(优选哺乳动物宿主细胞，本文也称为哺乳动物细胞)包括但不限于HeLa、Cos、3T3、骨髓瘤细胞系(例如NS0、SP2/0)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
用于本发明的细胞系(也称为“重组细胞”)经遗传工程改造而表达具有商业或科研价值的蛋白质。用于表达感兴趣多肽的细胞和/或细胞系的基因工程方法和载体是本领域技术人员熟知的；例如，Ausubel等(1988年和更新版)或Sambrook等(1989年和更新版)阐述了各种技术。本发明的方法可用于培养表达感兴趣重组蛋白的细胞。通常令重组蛋白分泌到培养基中，然后由所得培养基中回收重组蛋白。然后可以使用可从供应商获得的产品和已知方法将回收的蛋白质纯化或者部分纯化。然后可以将纯化的蛋白质配制成药物组合物。用于药物组合物的合适制剂包括《雷明顿药物科学》(Remington's PharmaceuticalSciences，1995)中描述的那些。
通过本发明的方法产生的具有经调整糖基化状况、岩藻糖化水平或量降低和/或甘露糖化水平或量升高的重组蛋白(例如抗体或其抗原结合片段)可用于治疗对象各种适合用包含于组合物中的治疗性蛋白质(例如抗体或其抗原结合片段)来治疗的病症。
在另一方面，还公开了药物组合物，其包含通过本发明的方法产生的具有经调整糖基化状况的重组蛋白和药学上可接受的运载体。重组蛋白优选为治疗性蛋白，可以是抗体或其抗原结合片段，如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分。优选地，它是岩藻糖化水平或量降低和/或甘露糖化水平或量升高的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，包含具有经调整糖基化状况的重组蛋白的本发明药物组合物可以与药学上可接受的运载体一起配制成药物(治疗性)组合物，并且可以通过本领域已知的多种方法施用(参见例如《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，1995)。这样的药物组合物可以包含下述的任何一种：盐，缓冲剂，表面活性剂，增溶剂，多元醇，氨基酸，防腐剂，相容性载体，任选的其他治疗剂，以及它们的组合。包含具有经调整糖基化状况的重组蛋白的本发明药物组合物以本领域已知并且可用于治疗用途的形式存在，例如液体制剂或冻干制剂。本领域技术人员能够理解，在特定说明的情形以外对本文所述的发明进行变化和修改是容易的。应该理解的是，本发明包括所有这些符合本发明的精神或必要特征的变化和修改。本发明还包括说明书中单独或组合方式提到或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中任意两种或更多种的任意组合和全部组合。
因此，本公开在所有方面均为说明性而非限制性，本发明的范围如所附权利要求书所述，并且包含所有等同含义和范围内的所有改变。
通过参考以下实施例将更全面地理解前述公开。然而，这些实施例是实施本发明的方法的示例，无意于限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
I.细胞、细胞扩增和细胞生长
1)细胞
用两种CHO细胞系进行试验：
-表达IgG1mAb1的CHO-S细胞，在此称为“细胞mAb1”或“mAb1细胞”。“mAb1”是抗可溶性蛋白的完全人单克隆抗体。其等电点(pI)约为8.20-8.30。
-表达IgG1mAb2的CHO-K1细胞，在此称为“细胞mAb2”或“mAb2细胞”。“mAb2”是抗细胞膜上受体的人源化单克隆抗体。其等电点(pI)约为9.30。
2)细胞扩增
在管中在适合细胞扩增的培养基中进行细胞扩增。在扩增至少一周后开始分批补料试验。
3)接种
深孔板(DWP)：按0.2x 106个细胞/mL接种表达mAb2的细胞，按0.3x 106个细胞/mL接种表达mAb1的细胞。
旋管(Spintubes)：按0.3×106个细胞/mL接种表达mAb1和mAb2的细胞。
4)分批补料
所有试验均以分批补料培养进行。
使用无血清化学组成明确的培养基。原样使用(或适应性调整)，或者补充以不同浓度(0-45mM)的D-(+)-棉子糖五水合物(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，83400-25G)。定期向培养基中加入化学组成明确的补料培养基和葡萄糖，维持葡萄糖水平在>0至约8g/L的范围内。
进行培养：
-在工作体积为450μL的深孔板中。36.5℃、5％CO2、90％湿度下孵育并以320rpm振荡。各分批补料培养持续14天。
-在工作体积为30mL的Spin Tubes(ST)中(具有可透性盖子)。按0.3×106个细胞/mL细胞密度接种，36.5℃、320rpm、5％CO2和90％湿度下维持14天。
II.分析方法：
使用Guava流式细胞仪测量活细胞密度和活力。
使用fortéBIO测量抗体滴度。
通过联合激光诱导荧光的毛细管凝胶电泳(CGE-LIF)确定糖基化状况。聚糖组别如表2所示。
表2-鉴定的主要聚糖组(说明：灰色方块：GlcNAc；中灰色圆：甘露糖，浅灰色圆：半乳糖；灰色三角形：岩藻糖)
实施例1-保持渗透压恒定同时添加二糖或三糖的作用(在深孔板中；实验方法1)：
实验检测高渗透压或高糖浓度是否影响细胞活力、VCD以及高甘露糖(HM)类物质的量。采用相比标准培养基较低渗透压的化学组成明确的专有培养基(PM-200)来改变糖浓度从1-150mM(绿色)，同时通过补充NaCl(蓝色)维持标准培养基的渗透压(315mOsm/kg)，如图1所示。标准培养基和PM-200在组成上有所不同，因此添加了缺少的原料(NaCl除外)。选择棉子糖(三糖)和蔗糖(二糖)作为糖。制备储液(棉子糖22mM，棉子糖220mM，蔗糖50mM，蔗糖1M和NaCl 1M)，并在接种前加入培养基中。
表3汇总了实验方法1和2的不同条件。用培养基制备储液以免稀释。给定浓度等于接种前培养基中的浓度。表达mAb1的CHO-S细胞(＝mAb1细胞)扩增49天，表达mAb2的CHO-K1(＝mAb2细胞)扩增28天。
表3：实验方法1和2：1：渗透压恒定(315mOsm/kg)糖浓度升高(0-127.5mM)，2：糖浓度恒定(0或30mM)渗透压升高(300-375毫渗量/千克)；n＝5-6
结果-添加棉子糖对培养的mAb1细胞的作用：
图2显示了渗透压恒定(315mOsm/kg)棉子糖浓度升高对mAb1细胞生长的影响。随着糖浓度升高，细胞生长受到抑制。对照和1mM棉子糖浓度达到16.2±1.0×106个细胞/mL的最大细胞浓度，而100mM棉子糖仅达到2.3±2.1×106个细胞/mL。从第7个工作日开始，高棉子糖浓度下细胞活力较低。5mM棉子糖的活力最高(约57％)，而对照在第14个工作日达到约53％。
图3a显示渗透压恒定(315mOsm/kg)且培养基中补充棉子糖的CHO-S细胞的第14工作日绝对收获滴度。高浓度棉子糖(80-127.5mM)条件所得滴度为825-975mg/L，而对照约1850mg/L。10mM棉子糖条件获得最高滴度，约为2650mg/L。总体看来，1-65mM棉子糖条件所得产物滴度高于对照，未显示数据。图3b显示比生产力[pg/细胞/天]。随着棉子糖浓度升高，比生产力也同样升高。100mM棉子糖具有最高的比生产力(约45pg/细胞/天)。
添加50mM棉子糖的HM物质百分比增量最高(6.8％)(图3c)。随着糖浓度升高，观察到半乳糖化的、HM和非岩藻糖化物质增加而岩藻糖化物质减少。
总之，实施例1显示在恒定渗透压下提高棉子糖浓度影响生长速率、活力、抗体生产以及mAb1的糖基化状况。1-30mM棉子糖培养物的第14工作日VCD、活力和抗体浓度最高。50mM棉子糖的HM增量最高(6.8％)。这表明高糖浓度降低细胞生长、提高特异性抗体生产并令mAb1的糖基化状况显著改变。
结果-添加棉子糖对培养的mAb2细胞的作用：
图4突出显示了渗透压恒定棉子糖浓度升高对mAb2细胞生长和细胞活力的影响
图4a显示随着糖浓度升高，mAb2细胞生长减弱。在5mM棉子糖浓度，获得11.8±1.1×106个细胞/mL的最大细胞浓度，而对照达到11.3±1.4×106个细胞/mL的最大VCD。添加80mM棉子糖的VCD最低(6.4±1.7×106个细胞/mL)。从第7天开始，活力随糖浓度升高而下降(图4b)。高浓度棉子糖培养物的第14工作日活力显著低于对照。
图5a显示了在培养基中补充棉子糖的mAb2细胞的第14工作日相对收获滴度。随着棉子糖浓度升高，相对收获滴度降低，获得最高抗体浓度的50mM和100mM棉子糖条件除外。100mM棉子糖条件获得的滴度约2350mg/L，而对照的第14工作日产生约2150mg/L的mAb2。
图5b显示了比生产力。与对照相比，棉子糖升高时mAb2的生产力没有变化，除了100mM棉子糖条件。该条件下获得了最高的生产力(约30pg/细胞/天)，而对照约22pg/细胞/天。
随着糖浓度升高，观察到半乳糖化的、HM和非岩藻糖化的物质增加而岩藻糖化物质减少(图5c)。100mM棉子糖补充使HM物质增加了6.3％。
总之，与mAb1细胞一样，在恒定渗透压下提高棉子糖浓度影响第14工作日绝对滴度、生长速率和活力。显示糖基化绝对变化的图(图24c)显示与mAb1细胞实验方法类似的趋势。随着糖浓度升高，半乳糖化糖型增加，但mAb2细胞的增加更多。随着棉子糖浓度升高，非岩藻糖化糖型增加，岩藻糖化糖型减少。100mM(6.3％)获得了mAb2细胞培养物的最高HM物质增量。
结果：添加蔗糖对培养的mAb1细胞的作用
图6显示渗透压恒定蔗糖浓度升高的实验方法对mAb1细胞生长的效果。同样地，随着糖浓度升高，细胞生长受到抑制。在1mM蔗糖浓度达到18.2±1.7×106个细胞/mL的最大细胞浓度，而最高试验蔗糖浓度(127mM)条件达到9.6±3.2×106个细胞/mL。
第7个工作日后，除了1mM、80mM和127.5mM蔗糖条件外，高蔗糖浓度所得活力低于对照。在1mM和127.5mM蔗糖下获得最高活力(约635％和64％)，而对照约53％。
随着蔗糖浓度升高，绝对收获滴度降低，有1mM和80mM补充的条件除外。这些条件的第14工作日绝对收获滴度最高(约2800mg/L和2550mg/L)，而对照的滴度约为1850mg/L(图7a)。
随着蔗糖浓度升高，第14工作日比生产力没有变化(图7b)，含1mM和80mM蔗糖的条件除外。80mM蔗糖获得最高生产力(约26pg/细胞/天)。
补充100mM和127.5mM蔗糖使HM物质增加了14.2％和14.3％(图7c)。随着糖浓度升高，观察到半乳糖化的、HM和非岩藻糖化的物质增加而岩藻糖化物质减少。
概括来说，对照和以下条件的VCD最高：1mM，5mM，10mM，30mM和65mM蔗糖。含1mM、80mM和100mM蔗糖条件显示最高的第14工作日活力。对于蔗糖浓度较高的条件，较高的活力可能是由于培养期间细胞密度较低。含最高蔗糖浓度(100mM和127.5mM)条件的糖基化状况最好，HM增加14.2％和14.3％。
这证实了源于上述实验(DWP中的mAb1细胞-补充棉子糖)的假设，即高糖浓度降低细胞生长而提高比生产力。
结果-添加蔗糖对培养的mAb2细胞的作用：
图8显示渗透压恒定(315mOsm/kg)蔗糖浓度升高实验方法中mAb2细胞的VCD和活力。
对照获得的最大细胞浓度为11.3±1.4×106个细胞/mL，而10mM蔗糖条件达到11.1±1.6×106个细胞/mL VCD。含127.5mM蔗糖条件获得最低的VCD(6.9±1.1×106个细胞/mL)。从第7个工作日开始，观察到随着糖升高而活力降低。
图9a显示在培养基中补充棉子糖的mAb2细胞的第14工作日绝对收获滴度。补充蔗糖使得抗体产量相对于对照减少。对照和含50mM蔗糖条件的绝对滴度最高，分别为约2150mg/L和约2100mg/L，而5mM蔗糖的浓度最低(约700mg/L)。
第14工作日的比生产率低于对照(约22pg/细胞/天)，含50mM(约21pg/细胞/天)和127.5mM蔗糖(约24pg/细胞/天)的条件除外(图9b)。
图9c显示糖基化状况相对于对照的变化。补充127.5mM蔗糖使HM物质增加9.1％；100mM蔗糖使HM物质的量增加6.0％。随着糖浓度升高观察到半乳糖化的、HM和非岩藻糖化的物质增加而岩藻糖化物质减少。
总之，在培养过程中，补充蔗糖的培养物的活力低于对照的活力。第7个工作日后，VCD显著下降，因为很可能周末期间葡萄糖水平过低或其他培养基成分限制。第12工作日再次补加葡萄糖和主要补料后VCD升高证实了这一假设。补充蔗糖的培养物第14工作日的绝对收获滴度和比生产力显著低于对照的滴度。非岩藻糖化糖型和HM的增加低于mAbl细胞。同样地，岩藻糖化聚糖的减少也较低，但仅在mAb2细胞中获得半乳糖化增加。
实施例2：保持渗透压恒定同时添加二糖或三糖的效果(在Spin Tubes中；实验方 法1)：为了验证实施例1的结果，在50mL Spin Tubes中重复实验方法1，并用细胞mAb1(27天扩增)和表4所示条件。同样，给定的渗透压和浓度等于接种前的条件。
条件 渗透压[mOsm/kg] 棉子糖的浓度[mM]
1 315 0
2 315 10
3 315 50
4 315 100
表4：渗透压恒定(315mOsm/kg)棉子糖浓度升高(0-100mM)的四种实验条件；n＝2
结果-添加棉子糖对培养的mAb1细胞的作用：
在具有30mL工作体积、含mAb1细胞的离心管中进行渗透压恒定(315mOsm/kg)棉子糖浓度升高的第二个实验。图10a显示Spin Tubes中采用渗透压恒定、棉子糖浓度升高的实验方法所得mAb1细胞的VCD和活力。对照和10mM棉子糖获得最大细胞浓度，分别为对照的17.8±0.2×106个细胞/mL和10mM棉子糖的17.8±0.2×106个细胞/mL。如图10b所示，100mM棉子糖的VCD最低(10.2±0.2×106个细胞/mL)。但这一条件在培养结束时的活力最高(约86％)，对照的活力最差(约52％)。
如图11a所示，第14工作日抗体最高浓度由含10mM棉子糖的条件实现(约2200mg/L)，而对照约1840mg/L并且是最低滴度。补充棉子糖的条件生产力都优于对照，参见图11b。对照的比生产力约14pg/细胞/天，含100mM棉子糖条件的生产力/细胞/天(PCD)最高(峰值约23pg/细胞/天)，并且实现了生产力的提高(约64％)。含50mM和100mM棉子糖的培养物的PCD显示的斜率比含10mM棉子糖条件和对照的更陡。
补充棉子糖令Man5和非岩藻糖化的量增加而令岩藻糖化糖型减少(图12)。在100mM棉子糖，Man5增加7.7％而岩藻糖化聚糖减少15.9％。未知、半乳糖化和唾液酸化糖型的绝对变化不受影响。
随着棉子糖浓度升高，碱式同种型减少，而酸式同种型以及聚集体增加(未显示数据)。
补充棉子糖的培养物的绝对收获滴度高于对照(图11a)。与DWP中的相同实验方法相比，这些培养物表现出相似的行为，但是仅限于1-65mM的棉子糖。尽管100mM棉子糖条件的VCD是最低的，但其第14工作日抗体浓度仍保持在与对照相同的范围，因此生产力高于对照。一种可能的解释是，更大细胞直径能够产生甚至更多的抗体。
在恒定的渗透压下提高棉子糖浓度令HM和非岩藻糖化增加而令岩藻糖化糖型减少。唾液酸化和半乳糖化的糖型不受影响。
实施例3：改变渗透压的同时添加二糖或三糖的效果(在深孔板中；实验方法2)：第二种实验方法是在渗透压升高而糖浓度恒定的情况下进行的(见表3和实施例1中的方法)。
结果-添加棉子糖对培养的mAb2细胞的作用：
图13显示了培养物的VCD和活力。添加棉子糖的培养物用“30mM棉子糖”标示。对照获得11.7±2.7×106个细胞/mL的最高VCD。渗透压升高导致最大细胞密度降低。额外补充棉子糖未显示与VCD减少相关。425mOsm/kg和30mM棉子糖获得最低VCD(8.2±2.3×106个细胞/mL)，见图13a。在实验结束时，375mOsm/kg和30mM棉子糖和300mOsm/kg(的培养物显示出最高活力，分别为30mM棉子糖的约59％和300mOsm/kg的约58％(图13b)。除了375mOsm/kg和30mM棉子糖之外，活力随着渗透压升高而降低。
图14a显示第14工作日绝对收获滴度。对照产生最高浓度的抗体(约2050mg/L)，而425mOsm/kg和补充30mM棉子糖的条件仅为约1150mg/L。因此，随着渗透压升高，绝对收获滴度下降。比生产力(图14b)保持在约18pg/细胞/天至约24pg/细胞/天的范围。
图14c中可见糖基化状况相对于对照(315mOsm/kg)的变化。随着渗透压升高，岩藻糖化糖型减少，而非岩藻糖化和半乳糖化糖型增加。同样观察到HM物质增加。425mOsm/kg与30mM棉子糖条件实现最高增加8.5％。添加棉子糖时，每种糖型的增加/减少甚至更甚。
总之，高渗透压和添加棉子糖似乎抑制细胞生长，这可以由微管蛋白下调来解释。与实验方法1(见实施例2和3)相比，高渗透压条件的活力与高糖浓度条件的活力保持相同。与对照相比，第14工作日抗体浓度没有增加，但是第14工作日比生产力相似。随着渗透压升高，所有条件下HM物质的量增加。
总结：
实施例1和2提示在恒定渗透压下向细胞培养基中添加棉子糖或蔗糖会影响mAb1和mAb2的生长速率、活力以及糖基化状况。对于mAb1，添加棉子糖或蔗糖分别获得7％或14％的HM增加。对于mAb2，添加棉子糖或蔗糖分别获得6％或9％的HM增加。补糖不影响比生产力。因此，高二糖或三糖浓度降低细胞生长而提高比生产力。在DWP和Spin Tubes中都获得了类似的结果。
这里给出的结果表明，可以通过补充化合物例如二糖(例如蔗糖)或三糖(例如棉子糖)同时控制渗透压(优选相比标准培养基保持渗透压恒定)来控制生产运行的效率并控制HM物质的丰度。
基于实施例3中提供的结果推测，不仅高糖浓度而且高渗透压也降低细胞生长并提高比生产力。
本发明出人意料地证明，通过控制培养基的渗透压和二糖或三糖的浓度，可以调节至少一轮生产运行的效率和/或调整蛋白质如抗体的糖基化状况。因此，可以通过调整培养条件来适应具体的数量和/或质量目标。
技术人员由实施例1至3的结果可知，可以使用二糖(如蔗糖)或三糖(如棉子糖)并同时保持培养基的渗透压相比标准培养基保持恒定来调节至少一轮生产运行的效率和/或任意蛋白质和任意抗体的糖基化状况，无论使用何种细胞系进行生产。根据生产性能和/或技术人员希望获得的各个分子的糖基化状况，必须根据具体情况来确定给定渗透压下向细胞培养基中添加的二糖(如蔗糖)或三糖(如棉子糖)的确切浓度。基于本发明的教导能够完成所述确定而无需任何创造性技术。本领域技术人员还将理解，在生产蛋白质如抗体的任何方法中即使并不旨在获得特定的糖基化状况而仅为改善至少一轮生产运行的效率也可以在渗透压恒定的培养基中使用任意二糖或三糖而不限于棉子糖或蔗糖。
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Claims (16)

1.一种以分批补料或分批模式生产重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述重组蛋白的哺乳动物宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
2.一种以分批补料或分批模式培养表达重组蛋白的哺乳动物宿主细胞的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养所述宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
3.一种在分批补料或分批模式中提高重组蛋白产量的方法，所述方法包括在包含或者补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述蛋白的哺乳动物宿主细胞，同时保持渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法提高至少一轮生产运行的效率。
5.如权利要求4所述的方法，其中，通过活细胞密度的提高和/或细胞活力降低的减小来测定生产运行的效率。
6.一种生产具有经调整的糖基化状况的重组蛋白的方法，所述方法包括在包含或补充有二糖或三糖的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，同时保持所述培养基的渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
7.一种生产具有经调整的糖基化状况的重组蛋白的方法，所述方法包括在补充至少一批包含二糖或三糖的补料的细胞培养基中培养表达所述蛋白的宿主细胞，同时维持所述培养基的渗透压与不含所述二糖或三糖的标准培养基的渗透压近似。
8.如权利要求6或7所述的方法，还包括纯化所述具有经调整的糖基化状况的重组蛋白。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的经调整的糖基化状况包括所述蛋白质中岩藻糖化水平和/或甘露糖化水平的调整。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述岩藻糖化水平的调整是岩藻糖化水平降低，其中所述甘露糖化水平的调整是所述蛋白质中甘露糖化水平升高。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述二糖是蔗糖，所述三糖是棉子糖。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白选自：重组融合蛋白、生长因子、激素、细胞因子、抗体或其抗原结合片段，例如人抗体或其抗原结合部分、人源化抗体或其抗原结合部分、嵌合抗体或其抗原结合部分。
14.二糖或三糖在细胞培养基中作为诱导剂的用途。
15.二糖或三糖在细胞培养基中提高至少一轮生产运行的效率的用途。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法或如权利要求14或15所述的用途，其中所述细胞培养基中二糖或三糖的浓度为约0.1mM至100mM。
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