CN108349959B - 4位取代的香豆素衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种4位取代的香豆素衍生物，其结构式如式Ⅰ所示，还提供了上述4位取代的香豆素衍生物的制备方法和用途。所述化合物具有较强的抗肿瘤活性，还具有较好的抑制微管聚合的效果，可用来制备抗敏感和耐药肿瘤细胞药物。

Description

4位取代的香豆素衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于化学医药领域，具体涉及4位取代的香豆素衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

微管是构成细胞骨架的主要成分，微管有聚合和解聚的动力学特性，在保持细胞形态、细胞的***增殖、细胞器的组成与运输及信号物质的传导方面发挥重要作用。以微管为靶点的抗肿瘤药物就是利用其动力学特性，或促进其聚合或抑制其聚合，从而达到直接影响细胞的有丝***，使细胞***停止于G2/M期。研究表明微管至少存在3个不同的药物结合位点：紫杉醇位点、长春新碱位点和秋水仙碱位点。紫杉醇能够抑制微管蛋白的解聚，使微管结构稳定；而长春碱和秋水仙碱则通过各自的作用位点，抑制微管蛋白的聚合。

抑制微管解聚的药物，以紫杉醇(Taxol)为代表，现已广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌和非小细胞肺癌等的治疗。抑制微管聚合的药物，有两个不同的结合位点：秋水仙碱(colchicine)位点和长春碱(vinblastine)位点。作用长春碱位点的药物，以长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristin)等为代表，目前在临床上用于治疗白血病，淋巴癌，非小细胞肺癌等的治疗。作用于秋水仙碱的药物，以秋水仙碱，鬼臼毒素，康普瑞丁(CA-4)为代表，秋水仙碱位点空腔体积较小且相应抑制剂的结构较为简单，因而近年来关于其抑制剂的研究也备受关注，其中有部分衍生物***已经进入临床研究，如E7010

ZD6126

等，展现了较好的应用前景。在炎性疾病的治疗中，秋水仙碱已在临床上用于急性痛风和痛风性关节炎的治疗。由于紫杉醇类和长春碱类化合物，在肿瘤治疗取得的成功，使得科学家们对开发出靶向秋水酰碱位点的微管抑制剂充满了信心。

相对于紫杉醇位点和长春碱位点，以秋水酰碱位点为靶点开发肿瘤药物，主要具备两个重要的优点。其一，但凡靶向秋水酰碱位点的化疗药物，不仅可以抑制微管蛋白的聚合，还普遍具有抑制肿瘤新生血管生成的活性。因此，这类药物可以抑制实体肿瘤的血管生成，造成肿瘤组织的供血不足，能对肿瘤的抑制起到明显的治疗作用，近年来，也是越来越得到各学者的认可。更为重要的是，抗血管作用不受多重耐药性的影响，能有效且长期起到抗肿瘤活性。

另一个优点，就是靶向秋水酰碱位点的化疗药物能有效地抵抗耐药性。尽管以微管为靶点的抗肿瘤药物在单独给药和联合给药中，均显示出了强大的活性，但在***的化疗中其多药耐药限制了其疗效的发挥。目前，紫杉醇耐药机制涉及过度表达MDR-1基因，α、β微管基因的点突变，β-III微管蛋白单体表达三方面。美国FDA最近批准埃坡霉素上市，被证实需要克服β-III微管蛋白单体耐药机制。临床用药证实，紫杉醇类和长春碱类药物因耐药造成治疗失败的主要耐药机制就是P-糖蛋白过度表达和β-III微管蛋白单体表达改变。

香豆素(Coumarin)类化合物在结构上可以看成是顺式邻羟基桂皮酸脱水而形成的内酯类化合物，是一类具有苯骈--吡喃酮母核天然产物的总称。自1812年Vauquelin从植物Daphnealpina中首次得到香豆素类化合物瑞香苷(daphnin)，至今已研究数百种香豆素类化合物。此类化合物广泛存在于植物界，特别是在伞形科、芸香科、菊科、豆科、茄科等植物中分布广泛。如蛇床子、独活、白芷、枳壳、前胡、秦皮、茵陈、补骨脂、续随子等中药均含有这类成分。香豆素类化合物具有显著地抗病毒、抗肿瘤、抗微生物、抗癌、抗炎等多方面的生物活性，为国内外学者研究一直所重视。根据其母核上取代基及其位置的差异，分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他香豆素四类。香豆素气味芳香，代表性化合物主要有：当归内酯、白芷内酯、美花椒内酯、亮菌甲素等。

在众多被报道的化疗药物中，香豆素被实验证实具有较小或者没有毒性。因此，众多药学工作者对香豆素的作用机制产生了浓厚兴趣。目前，香豆素在抗肿瘤中已经被报道了具有酶抑制活性，细胞周期阻滞，抗血管生成活性，热休克蛋白(HSP90)抑制活性，端粒酶抑制活性，抗有丝***活性，碳酸酐酶抑制活性，转运蛋白抑制活性，芳香酶抑制活性以及硫酸酯酶抑制活性。进一步地，学者们对香豆素类衍生物的构效关系，深入地进行了探索。

Tsyganov等人研究了香豆素类化合物抗有丝***活性。他们半合成出了多烷氧基取代的3-(4-甲氧基苯基)香豆素，通过表型海胆胚胎试验证明了这些化合物具有抗有丝***活性。其中，报道了化合物A，他们在研究中指出，化合物A的抗有丝***活性来源与香豆素母核的5，6，7位碳上的甲氧基有关。三甲氧基的结构确实在很多微管抑制剂中出现，比如，秋水酰碱和CA4。同时，他们的研究认为，香豆素3位有取代的芳香基团，是香豆素抗有丝***药物的特征。

文献Biochemical Pharmacology，2009，77，1773-1779中，报道了香豆素化合物B。文献中发现，化合物B具有微管解聚作用，并明显地引起细胞在G2/M期阻滞，这个现象是符合秋水仙碱位点的化疗药物的。同时，对肿瘤细胞抑制的IC50在44.8-475.2nM之间，对正常细胞的抑制大于5微摩尔。对耐药肿瘤细胞株，化合物B仍然显示明显的抑制作用。化合物B的结构，在7位碳上有一个二乙氨基，替代了甲氧基。此外，同化合物A一样，化合物B的3位碳上也是有一个芳香取代结构。在3位碳上的取代衍生物，被认为是微管抑制类药物的特征。

文献J.Med.Chem.2011，54，3153-3162中，报道了香豆素衍生化合物C。文献中发现，化合物C具有较强的抗肿瘤活性，IC50值在几十个纳摩尔范围。同时发现，化合物C具有微管解聚作用，类似于秋水仙碱和CA4。更重要的是，对于P-糖蛋白过表达的耐药株，化合物C仍然显示明显的抑制作用。化合物C的报道引起了大家对香豆素4位碳芳香取代的重视，扩展了香豆素衍生物可修饰的范围。

文献J.Med.Chem.2009，52，2341～2351中报道了化合物D(MPC-6827，Azixa)，对多种肿瘤细胞其IC50值在1～10nM之间，目前化合物D在治疗多元神经胶质瘤做到了临床二期，治疗黑色素瘤做到了临床一期。文献Cancer Res.2007，Jun 15，67(12)：5865～71中，报道化合物D作用机制是通过靶向秋水酰碱位点，抑制微管蛋白的聚合，从而阻断有丝***过程，诱导细胞凋亡。文献中通过计算机模拟结果显示化合物D的2位取代的官能团，占据了秋水仙碱位点一个重要的口袋，且2位取代的基团越大，抗微管活性越低，其中以甲基或卤素原子如氯原子取代对维持化合物D的抗微管活性具有重要贡献。化合物D的2位无取代，将会导致抗微管活性完全失去。此外，喹唑啉的1位芳香氮原子和3位芳香氮原子在维持微管活性种扮演不同的角色，其中，1位芳香氮原子与微管蛋白中的氢键供体形成氢键，有利于抑制微管蛋白的活性，而3位芳香氮原子无此功能。同时，喹唑啉的4位上氮原子上的取代基甲基对发挥抑制微管活性也具有重要作用，如甲基被其它集团如氢取代也将失去抗微管活性。尽管化合物D显示良好的抗肿瘤活性，但I期和II期临床试验结果表明其毒性大，限制其药效的发挥。

上述化合物A、B、C、D的结构式如下所示：

目前，开发出能够有效地抵抗耐药性，且安全、低毒的化合物是非常迫切的。

发明内容

本发明为了解决上述问题，提供了一种4位取代的香豆素衍生物，其结构式如式I所示：

其中，R₁为取代的饱和或不饱和5～12元杂环或

所述杂环的杂原子为N、O或S；所述杂环上的取代基为

C1～C8烷氧基、C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；

R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；

R₃～R₅独立地为-H、C1～C8烷氧基、C1～C8烷基、卤素、C3～C8环烷基、

C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、-NH₂或

且不同时为-H；

R₆～R₉独立地为-H、C1～C8烷氧基、卤素、C1～C8烷基、

或C1～C8卤素取代的烷基；

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；

R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；

R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C8烷基、C1～C8烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；

R₁₄～R₁₆独立地为C1～C8烷基、卤素、-H、C1～C8烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；

R₁₇为C1～C8烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C8烷基、卤素或-H；

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基、卤素或-H。

作为本发明优选的方案，R₁为取代的饱和或不饱和5～12元杂环或

所述杂环的杂原子为N、O或S；所述杂环上的取代基为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H、

C1～C4烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、C1～C4烷基、卤素、C3～C8环烷基、

C2～C4烯基、C1～C4卤素取代的烷基、-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；

R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H、

C1～C4烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、C1～C4烷基、卤素、C3～C8环烷基、

C2～C4烯基、C1～C4卤素取代的烷基、-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

进一步优选的，R₁为

R₂₁、R₂₂独立地为

R₂₃为C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H、

C1～C4烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、C1～C4烷基、卤素、C3～C8环烷基、

C2～C4烯基、C1～C4卤素取代的烷基、-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H、

或C1～C4烷基；R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、C1～C4烷基、卤素、C3～C8环烷基、

C2～C4烯基、C1～C4卤素取代的烷基、-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

进一步优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、C1～C4烷基、卤素、C3～C8环烷基、

C2～C4烯基、C1～C4卤素取代的烷基、-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、C1～C4烷基、卤素、C3～C8环烷基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

进一步优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

优选的，R₁为

R₂₁～R₂₃独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

x＝1～2，y＝1～2；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

R₁₈为C1～C4烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

最优的，R₁为

R₂₁、R₂₂独立地为

R₂₃为C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

R₁₈为C1～C4烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

当R₁为取代的不饱和5元杂环时，上述4位取代的香豆素衍生物的结构式如式II所示：

其中，A为O或S；

R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；

R₆～R₉独立地为-H、C1～C8烷氧基、卤素、C1～C8烷基、

或C1～C8卤素取代的烷基；

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基、卤素或-H。

作为本发明优选的方案，A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基、-H、

C1～C4烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

优选的，A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基、-H、

或C1～C4烷基；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

进一步优选的，A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基或-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

或C1～C4卤素取代的烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

更进一步优选的，A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基或-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基、卤素或-H。

最优的，A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基或-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

当R1为

R3为-H，R4为甲氧基，R5为

时，上述4位取代的香豆素衍生物的结构式如式III所示：

其中，R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；

R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C8烷基、C1～C8烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；

R₁₄～R₁₆独立地为C1～C8烷基、卤素、-H、C1～C8烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；

R₁₇为C1～C8烷基、卤素、-H或

作为本发明优选的方案，R₂为C1～C4烷氧基、-H、

C1～C4烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

优选的，R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H、C1～C4烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、卤素、-H或

进一步优选的，R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₁₀为

x＝1～2，y＝1～2；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

最优的，R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₁₀为

R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

当R1为

R3为-H，R4为甲氧基，R5为

时，上述4位取代的香豆素衍生物的结构式如式IV所示：

其中，R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；

R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H。

作为本发明优选的方案，R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H；

优选的，R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₈为C1～C4烷基或-H。

上述4位取代的香豆素衍生物，其结构式为：

本发明还提供了上述4位取代的香豆素衍生物的制备方法。

反应路线一：

其中，A为O或S；R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₆～R₉独立地为-H、C1～C8烷氧基、卤素、C1～C8烷基、

或C1～C8卤素取代的烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基、卤素或-H。

上述反应路线一的具体步骤为：

1)先将10～20个当量的三氯氧磷和1当量的原料1(丙二酸)在80～100℃反应2小时，除去未反应的三氯氧磷后，在有机溶剂中，与2～3当量的原料2(苯酚)在25～50℃反应6～8小时，得到中间体3；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种。

2)1当量的中间体3、1～2当量的

和3～5当量的碱在有机溶剂中回流反应6～12小时，得到中间体4；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；

3)1当量的中间体4和2～4当量的三氟甲磺酸酐，溶于有机溶剂中，在0℃～50℃反应2～8小时，得到中间体5；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；

4)将1当量的中间体5和1当量的

溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱和0.3％～0.8％当量的催化剂，回流反应得到中间体6；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的催化剂为醋酸钯、二氯化钯、10％钯碳、四(三苯基)磷钯中的任意一种；

5)将1当量的中间体6溶于有机溶剂中与1～2当量的NBS(N-溴代丁二酰亚胺)反应，得到中间体7；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述反应的温度为0℃～50℃；所述反应的时间为2～8小时；

6)将1当量的中间体7和1当量的

溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱碱和0.3％～0.8％的催化剂，回流反应得到式II化合物；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的催化剂为醋酸钯、二氯化钯、10％钯碳、四(三苯基)磷钯中的任意一种；所述反应的时间为2～24小时。

反应路线二：

其中，R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基、卤素或-H；R₂₃为C1～C4烷氧基。

上述反应路线二的具体步骤为：

1)1当量的中间体4在有机溶剂中与2～3当量的四叔丁基溴化胺回流反应，得到中间体10；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述反应的时间为2～8小时；

2)将1当量的中间体10溶于有机溶剂中，2～5当量加入碱，与1当量的

回流反应得到式V化合物；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述反应的时间为2～24小时。

反应路线三：

其中，R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C8烷基、C1～C8烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C8烷基、卤素、-H、C1～C8烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C8烷基、卤素、-H或

上述反应路线三的具体步骤为：

1)将1当量的原料4溶于有机溶剂中，滴加3～5当量的氯甲基甲醚(MOMCl)，反应得到中间体11；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～80℃；所述的反应时间是2～12小时；

2)将1当量的中间体11溶于有机溶剂中，加入1％～2％当量的钯碳催化剂，通入5～20个当量的氢气还原，反应得到中间体12；所述的钯催化剂是10％含量的钯碳；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～40℃；所述的反应时间是2～12小时；

3)将1个当量的中间体12溶于有机溶剂中，加入3～5当量的甲醇钠，加入1～3当量的多聚甲醛，搅拌反应过夜后，在反应底物中加入1～2当量的硼氢化钠，回流反应得到化合物13；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的回流反应温度是0℃～80℃；所述的回流反应时间是2～12小时；

4)将1个当量的13和1个当量的中间体10溶于有机溶剂中，加入2～3当量的碱，回流反应得到中间体14；所述的碱选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠的任意一种；所述的有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳的任意一种；所述的反应时间是2～24小时；

5)将1个当量的中间体14溶于有机溶剂中，加入2～3当量的酸，反应得到中间体15；所述的酸为浓盐酸、氯化氢乙酸乙酯溶液、三氟乙酸、甲磺酸或硫酸中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是40℃～100℃；所述的反应时间是2～24小时；

6)将1个当量的中间体15溶于有机溶剂中，加入2～3当量的碱，加入1～3当量的卤素-R₁₀，反应得到式III化合物；所述反应中用的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～60℃；所述的反应时间是1～12小时。

反应路线四：

其中，Q为卤素；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H。

上述反应路线四的具体步骤为：

1)将1当量的原料5溶于有机溶剂中，加入2～3当量的碱，滴加2～3当量的碘甲烷，反应得到中间体16；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～60℃；所述的反应时间是1～12小时；

2)将1当量的中间体16溶于有机溶剂中，加入3～5当量的甲醇钠，回流下反应得到中间体17；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应时间是2～24小时；

3)将1当量的中间体17溶于有机溶剂中，加入1％～2％当量的钯碳，通入5～20个当量的氢气还原，反应得到中间体18；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度可以是20℃～100℃；所述的反应时间是2～24小时；

4)将1当量的中间体18和1当量的中间体10溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱，回流下反应得到中间体19；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应时间是2～24小时；

5)将中间体19溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱，加入1～3当量的

反应得到式IV化合物；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；反应温度可以是0℃～60℃；反应时间是1～12小时。

本发明还提供了上述4位取代的香豆素衍生物在药学上可接受的盐。

药物组合物，是以式I～IV所示的4位取代的香豆素衍生物及其盐为活性成分，添加药学上可接受的载体组成。

本发明还提供了上述4位取代的香豆素衍生物及其盐在制备抗肿瘤药物中的用途。

优选的，所述抗肿瘤药物为拮抗肺癌，结肠癌，***癌，卵巢癌，乳腺癌的药物。

所述抗肿瘤药物的靶点为人肺癌大细胞癌NCI-H460，人小细胞肺癌细胞NCI-H446，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCT116、人***癌PC-3、人黑色素瘤A375。

本发明还提供了上述4位取代的香豆素衍生物及其盐在制备抗敏感和耐药肿瘤细胞药物中的用途。

本发明还提供了上述4位取代的香豆素衍生物及其盐在制备治疗炎症药物中的用途。

本发明还提供了上述4位取代的香豆素衍生物及其盐，以药学上可接受的制剂形式存在，包括：片剂、口服剂、栓剂、滴丸剂、大输液、小针、冻干粉针、胶囊剂、气雾剂、分散片、软膏，包括各种缓释、控释剂型或纳米制剂。上述4位取代的香豆素衍生物及其盐以单位剂量形式给药，注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和腹腔注射。

上述片剂、胶囊剂中可以包含：粘合剂(如***胶、玉米淀粉或明胶)、赋形剂(如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等)、润滑剂(如硬脂酸镁)、甜味剂(如蔗糖、果糖、乳糖等)或调味剂(如薄荷等)。当剂型是胶囊时，还可以包含液体载体(如植物油或聚乙二醇)。

此外，以本发明提供的4位取代的香豆素衍生物及其盐为主的活性化合物可以掺入缓释制剂和缓释装置中。

以本发明提供的4位取代的香豆素衍生物及其盐为主的活性化合物也可以通过输注或注射来静脉内或腹膜内给药。

以本发明提供的4位取代的香豆素衍生物及其盐为主的活性化合物，可以制备其水溶液，或混合无毒的表面活性剂，也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三酯中至少一种的分散剂。上述制剂还包含防腐剂以阻止微生物生长。

用于注射或输注的药物剂型，可以包含以本发明提供的4位取代的香豆素衍生物及其盐为主的活性成分的无菌水溶液、分散剂或无菌粉末。所述分散剂的液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油或无毒甘油酯中的至少一种。

此外，还包括各种药物新剂型如脂质体、脂肪乳、微球和纳米球的应用，如使用微粒分散体系包括聚合物胶束(polymericmicelles)、纳米乳(nanoemulsion)、亚微乳(submicroemuls)、微囊(microcapsule)、微球(microsphere)、脂质体(liposome)和类脂囊泡(niosomes)等制备的药剂。

本发明提供的化合物具有较强的抗肿瘤活性，在多种肿瘤细胞株的IC50值在0.01～5nM之间，还具有较好的抑制微管聚合的效果，且具有多样的生物活性和较小的毒性，为制备抗敏感和耐药肿瘤细胞药物提供了新的选择。

附图说明

图1部分化合物对微管的解聚作用。

图2部分化合物对微管的解聚作用。

图3各化合物在结肠癌C26模型上肿瘤生长曲线图。

图4各化合物在肺癌H460模型上肿瘤生长曲线图。

图5体外微管聚合曲线。通过用酶标仪监测37℃ 340nm波长吸光值反映微管聚合程度。

图6划痕和成管实验。利用HUVEC细胞进行的划痕和成管实验，证明本发明化合物具有抗血管活性。

具体实施方式

4位取代的香豆素衍生物的制备方法。

反应路线一：

其中，A为O或S；R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₆～R₉独立地为-H、C1～C8烷氧基、卤素、C1～C8烷基、

或C1～C8卤素取代的烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基、卤素或-H。

上述反应路线一的具体步骤为：

1)先将10～20个当量的三氯氧磷和1当量的原料1(丙二酸)在80～100℃反应2小时，除去未反应的三氯氧磷后，在有机溶剂中，与2～3当量的原料2(苯酚)在25～50℃反应6～8小时，得到中间体3；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种。

2)1当量的中间体3、1～2当量的

和3～5当量的碱在有机溶剂中回流反应6～12小时，得到中间体4；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；

3)1当量的中间体4和2～4当量的三氟甲磺酸酐，溶于有机溶剂中，在0℃～50℃反应2～8小时，得到中间体5；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；

4)将1当量的中间体5和1当量的

溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱和0.3％～0.8％当量的催化剂，回流反应得到中间体6；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的催化剂为醋酸钯、二氯化钯、10％钯碳、四(三苯基)磷钯中的任意一种；

5)将1当量的中间体6溶于有机溶剂中与1～2当量的NBS(N-溴代丁二酰亚胺)反应，得到中间体7；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述反应的温度为0℃～50℃；所述反应的时间为2～8小时；

6)将1当量的中间体7和1当量的

溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱碱和0.3％～0.8％的催化剂，回流反应得到式II化合物；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的催化剂为醋酸钯、二氯化钯、10％钯碳、四(三苯基)磷钯中的任意一种；所述反应的时间为2～24小时。

反应路线二：

其中，R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基、卤素或-H；R₂₃为C1～C4烷氧基。

上述反应路线二的具体步骤为：

1)1当量的中间体4在有机溶剂中与2～3当量的四叔丁基溴化胺回流反应，得到中间体10；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述反应的时间为2～8小时；

2)将1当量的中间体10溶于有机溶剂中，2～5当量加入碱，与1当量的

回流反应得到式V化合物；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述反应的时间为2～24小时。

反应路线三：

其中，R₂为C1～C8烷氧基、-H、

C1～C8烷基、卤素或C3～C8环烷基；R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₂为C1～C10烷基、

卤素、C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C8烷基、C1～C8烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C8烷基、卤素、-H、C1～C8烷氧基或-NH₂，且不同时为-H；R₁₇为C1～C8烷基、卤素、-H或

上述反应路线三的具体步骤为：

1)将1当量的原料4溶于有机溶剂中，滴加3～5当量的氯甲基甲醚(MOMCl)，反应得到中间体11；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～80℃；所述的反应时间是2～12小时；

2)将1当量的中间体11溶于有机溶剂中，加入1％～2％当量的钯碳催化剂，通入5～20个当量的氢气还原，反应得到中间体12；所述的钯催化剂是10％含量的钯碳；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～40℃；所述的反应时间是2～12小时；

3)将1个当量的中间体12溶于有机溶剂中，加入3～5当量的甲醇钠，加入1～3当量的多聚甲醛，搅拌反应过夜后，在反应底物中加入1～2当量的硼氢化钠，回流反应得到化合物13；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷或四氯化碳中的任意一种；所述的回流反应温度是0℃～80℃；所述的回流反应时间是2～12小时；

4)将1个当量的13和1个当量的中间体10溶于有机溶剂中，加入2～3当量的碱，回流反应得到中间体14；所述的碱选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠的任意一种；所述的有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳的任意一种；所述的反应时间是2～24小时；

5)将1个当量的中间体14溶于有机溶剂中，加入2～3当量的酸，反应得到中间体15；所述的酸为浓盐酸、氯化氢乙酸乙酯溶液、三氟乙酸、甲磺酸或硫酸中的任意一种；有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是40℃～100℃；所述的反应时间是2～24小时；

6)将1个当量的中间体15溶于有机溶剂中，加入2～3当量的碱，加入1～3当量的卤素-R₁₀，反应得到式III化合物；所述反应中用的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～60℃；所述的反应时间是1～12小时。

反应路线四：

其中，Q为卤素；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

或-NH₂；z＝1～10；R₁₈为C1～C4烷基、卤素或-H。

上述反应路线四的具体步骤为：

1)将1当量的原料5溶于有机溶剂中，加入2～3当量的碱，滴加2～3当量的碘甲烷，反应得到中间体16；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度是0℃～60℃；所述的反应时间是1～12小时；

2)将1当量的中间体16溶于有机溶剂中，加入3～5当量的甲醇钠，回流下反应得到中间体17；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应时间是2～24小时；

3)将1当量的中间体17溶于有机溶剂中，加入1％～2％当量的钯碳，通入5～20个当量的氢气还原，反应得到中间体18；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应温度可以是20℃～100℃；所述的反应时间是2～24小时；

4)将1当量的中间体18和1当量的中间体10溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱，回流下反应得到中间体19；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；所述的反应时间是2～24小时；

5)将中间体19溶于有机溶剂中，加入2～5当量的碱，加入1～3当量的

反应得到式IV化合物；所述的碱为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢化钠中的任意一种；所述的有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、吡啶、四氢呋喃、二氯甲烷、四氯化碳中的任意一种；反应温度可以是0℃～60℃；反应时间是1～12小时。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。

实施实例1：4-(5-(4-甲氧基苯基)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-1)

在氮气保护下，将相应的中间体7a(4-(5-溴噻吩-2-基)-香豆素)、4-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶和无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品，收率58％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.65(dd，J＝11.0，3.9Hz，2H)，7.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7.36(dt，J＝14.3，6.8Hz，2H)，7.18～7.08(m，4H)，6.81(d，J＝8.7Hz，2H)，3.72(s，3H)。MS(ESI，m/z)：357.1[M+Na]⁺。

实施实例2：4-(5-(4-甲磺酰基苯基)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-2)

在氮气保护下，将相应的中间体7a(4-(5-溴噻吩-2-基)-香豆素)、4-甲磺酰基苯硼酸、四(三苯基)磷靶和无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品，收率56％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.84(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(t，J＝7.8Hz，1H)，7.59～7.54(m，1H)，7.50～7.39(m，4H)，7.29(t，J＝7.7Hz，1H)，7.03(dd，J＝5.0，3.7Hz，1H)，6.99～6.95(m，1H)，3.04(s，3H)。MS(ESI，m/z)：405.0[M+Na]⁺。

实施实例3：4-(5-(4-甲基苯基)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-3)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、4-甲基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品，收率59％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.58～7.50(m，2H)，7.42(d，J＝8.2Hz，1H)，7.37(dd，J＝5.0，1.0Hz，1H)，7.23(d，J＝7.1Hz，1H)，7.08(q，J＝8.3Hz，4H)，7.05～7.01(m，1H)，7.01～6.97(m，1H)，2.30(s，3H)。MS(ESI，m/z)：341.1[M+Na]⁺。

实施实例4：4-(5-(2-甲氧基苯基)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-4)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、2-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.73～7.65(m，1H)，7.63(dd，J＝4.9，1.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.3Hz，1H)，7.44～7.33(m，2H)，7.29～7.23(m，1H)，7.11～7.01(m，3H)，6.96(d，J＝8.3Hz，1H)，6.83(t，J＝7.4Hz，1H)，3.68(s，3H)。MS(ESI，m/z)：357.1[M+Na]⁺。

实施实例5：4-(5-苯基噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-5)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率62％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.68(d，J＝7.0Hz，1H)，7.65(dd，J＝5.0，1.0Hz，1H)，7.52(d，J＝8.2Hz，1H)，7.43～7.39(m，1H)，7.35(t，J＝7.5Hz，1H)，7.29～7.19(m，5H)，7.15～7.12(m，1H)，7.08(dd，J＝4.9，3.6Hz，1H)。MS(ESI，m/z)：327.1[M+Na]⁺。

实施实例6：4-(5-(3，4，5-三甲氧基苯基)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-6)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、3，4，5-三甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率48％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.70(d，J＝4.9Hz，1H)，7.68～7.64(m，1H)，7.52(d，J＝7.9Hz，1H)，7.42(d，J＝6.8Hz，1H)，7.36(t，J＝7.3Hz，1H)，7.17(d，J＝2.4Hz，1H)，7.15～7.11(m，1H)，6.55(s，2H)，6.05(s，1H)，3.64(s，3H)，3.61(s，5H)。MS(ESI，m/z)：417.1[M+Na]⁺。

实施实例7：4-(5-(4-氯苯)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-7)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、4-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37～7.30(m，3H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：361.1[M+Na]⁺。

实施实例8：4-(5-(3-氯苯)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-8)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、3-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率53％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.64(m，2H)，7.56～7.50(m，1H)，7.45～7.39(m，1H)，7.37(d，J＝7.8Hz，1H)，7.36～7.26(m，3H)，7.18(dd，J＝12.5，5.1Hz，2H)，7.12(dd，J＝4.9，3.6Hz，1H)。MS(ESI，m/z)：361.1[M+Na]⁺。

实施实例9：4-(5-(3，4，5-三甲氧基苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-9)

在氮气保护下，将相应的中间体7b(4-(5-溴噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素)、3，4，5-三甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率51％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.71～7.66(m，1H)，7.32(d，J＝8.9Hz，1H)，7.17～7.09(m，3H)，6.96(dd，J＝8.9，2.4Hz，1H)，6.51(s，2H)，3.89(s，3H)，3.63(s，3H)，3.60(s，5H)。MS(ESI，m/z)：447.1[M+Na]⁺。

实施实例10：4-(5-(4-甲基苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-10)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、4-甲基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率59％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.64(d，J＝4.4Hz，1H)，7.28(d，J＝8.9Hz，1H)，7.15～7.01(m，7H)，6.95(dd，J＝8.9，2.0Hz，1H)，3.88(s，3H)，2.50(s，2H)。MS(ESI，m/z)：371.1[M+Na]⁺。

实施实例11：4-(5-(3，4-(亚甲二氧基)苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-11)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、3，4-(亚甲二氧基)苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率50％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.65(m，1H)，7.29(d，J＝8.9Hz，1H)，7.17～7.13(m，1H)，7.11(d，J＝4.8Hz，2H)，6.95(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，6.81～6.74(m，2H)，6.62(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，5.99(s，2H)，3.88(s，3H)。MS(ESI，m/z)：401.1[M+Na]⁺。

实施实例12：4-(5-(2-甲氧基苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-12)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、2-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.61(dd，J＝3.7，2.3Hz，1H)，7.31(d，J＝8.9Hz，1H)，7.25(t，J＝7.8Hz，1H)，7.12(d，J＝2.1Hz，1H)，7.05(d，J＝2.3Hz，2H)，7.01(d，J＝7.4Hz，1H)，6.95(dd，J＝8.3，3.3Hz，2H)，6.81(t，J＝7.4Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.67(s，3H)。MS(ESI，m/z)：387.1[M+Na]⁺。

实施实例13：4-(5-(3-乙氧羰基苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-13)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、3-乙氧羰基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.82(d，J＝7.1Hz，2H)，7.65(d，J＝4.5Hz，1H)，7.45(d，J＝7.7Hz，1H)，7.40(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(d，J＝9.0Hz，1H)，7.13(dd，J＝6.4，2.5Hz，2H)，7.10～7.05(m，1H)，6.97(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，4.28(q，J＝7.1Hz，2H)，3.90(s，3H)，1.30(t，J＝7.1Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：429.1[M+Na]⁺。

实施实例14：4-(5-(4-氯苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-14)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、4-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ3.93(s，3H)，7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37～7.30(m，2H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：391.1[M+Na]⁺。

实施实例15：4-(5-(4-甲氧基苯基)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-15)

在氮气保护下，将相应的中间体7c(4-(5-溴呋喃-2-基)-香豆素)、4-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率58％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.65(dd，J＝11.0，3.9Hz，2H)，7.51(d，J＝8.0Hz，1H)，7.36(dt，J＝14.3，6.8Hz，2H)，7.18～7.08(m，4H)，6.81(d，J＝8.7Hz，2H)，3.72(s，3H)。MS(ESI，m/z)：341.1[M+Na]⁺。

实施实例16：4-(5-(4-甲磺酰基苯基)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-16)

在氮气保护下，将相应的中间体7c、4-甲磺酰基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率56％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.84(d，J＝8.4Hz，2H)，7.61(t，J＝7.8Hz，1H)，7.59～7.54(m，1H)，7.50～7.39(m，4H)，7.29(t，J＝7.7Hz，1H)，7.03(dd，J＝5.0，3.7Hz，1H)，6.99～6.95(m，1H)，3.04(s，3H)。MS(ESI，m/z)：489.0[M+Na]⁺。

实施实例17：4-(5-(4-甲基苯基)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-17)

在氮气保护下，将相应的中间体7c、4-甲基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率59％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.58～7.50(m，2H)，7.42(d，J＝8.2Hz，1H)，7.37(dd，J＝5.0，1.0Hz，1H)，7.23(d，J＝7.1Hz，1H)，7.08(q，J＝8.3Hz，4H)，7.05～7.01(m，1H)，7.01～6.97(m，1H)，2.30(s，3H)。MS(ESI，m/z)：325.1[M+Na]⁺。

实施实例18：4-(5-(2-甲氧基苯基)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-18)

在氮气保护下，将相应的中间体7c、2-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.73～7.65(m，1H)，7.63(dd，J＝4.9，1.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.3Hz，1H)，7.44～7.33(m，2H)，7.29～7.23(m，1H)，7.11～7.01(m，3H)，6.96(d，J＝8.3Hz，1H)，6.83(t，J＝7.4Hz，1H)，3.68(s，3H)。MS(ESI，m/z)：341.1[M+Na]⁺。

实施实例19：4-(5-苯基呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-19)

在氮气保护下，将相应的中间体7c、苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率62％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.68(d，J＝7.0Hz，1H)，7.65(dd，J＝5.0，1.0Hz，1H)，7.52(d，J＝8.2Hz，1H)，7.43～7.39(m，1H)，7.35(t，J＝7.5Hz，1H)，7.29～7.19(m，5H)，7.15～7.12(m，1H)，7.08(dd，J＝4.9，3.6Hz，1H)。MS(ESI，m/z)：311.1[M+Na]⁺。

实施实例20：4-(5-(3，4，5-三甲氧基苯基)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-20)

在氮气保护下，将相应的中间体7c、3，4，5-三甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率48％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.70(d，J＝4.9Hz，1H)，7.68～7.64(m，1H)，7.52(d，J＝7.9Hz，1H)，7.42(d，J＝6.8Hz，1H)，7.36(t，J＝7.3Hz，1H)，7.17(d，J＝2.4Hz，1H)，7.15～7.11(m，1H)，6.55(s，2H)，6.05(s，1H)，3.64(s，3H)，3.61(s，5H)。MS(ESI，m/z)：401.1[M+Na]⁺。

实施实例21：4-(5-(4-氯苯)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-21)

在氮气保护下，将中间体7c、4-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37-7.30(m，3H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：345.1[M+Na]⁺。

实施实例22：4-(5-(3-氯苯)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-22)

在氮气保护下，将中间体7c、3-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率53％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.64(m，2H)，7.56～7.50(m，1H)，7.45～7.39(m，1H)，7.37(d，J＝7.8Hz，1H)，7.36～7.26(m，3H)，7.18(dd，J＝12.5，5.1Hz，2H)，7.12(dd，J＝4.9，3.6Hz，1H)。MS(ESI，m/z)：345.1[M+Na]⁺。

实施实例23：4-(5-(3，4，5-三甲氧基苯)呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-23)

在氮气保护下，将中间体7d(4-(5-溴呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素)、3，4，5-三甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率51％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.71～7.66(m，1H)，7.32(d，J＝8.9Hz，1H)，7.17～7.09(m，3H)，6.96(dd，J＝8.9，2.4Hz，1H)，6.51(s，2H)，3.89(s，3H)，3.63(s，3H)，3.60(s，5H)。MS(ESI，m/z)：431.1[M+Na]⁺。

实施实例24：4-(5-(4-甲基苯)呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-24)

在氮气保护下，将中间体7d、4-甲基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率59％。

H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.64(d，J＝4.4Hz，1H)，7.28(d，J＝8.9Hz，1H)，7.15～7.01(m，7H)，6.95(dd，J＝8.9，2.0Hz，1H)，3.88(s，3H)，2.50(s，2H)。MS(ESI，m/z)：355.1[M+Na]⁺。

实施实例25：4-(5-(3，4-(亚甲二氧基)苯)呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-25)

在氮气保护下，将中间体7d、3，4-(亚甲二氧基)苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率50％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.65(m，1H)，7.29(d，J＝8.9Hz，1H)，7.17～7.13(m，1H)，7.11(d，J＝4.8Hz，2H)，6.95(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，6.81～6.74(m，2H)，6.62(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，5.99(s，2H)，3.88(s，3H)。MS(ESI，m/z)：485.1[M+Na]⁺。

实施实例26：4-(5-(2-甲氧基苯)呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-26)

在氮气保护下，将中间体7d、2-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.61(dd，J＝3.7，2.3Hz，1H)，7.31(d，J＝8.9Hz，1H)，7.25(t，J＝7.8Hz，1H)，7.12(d，J＝2.1Hz，1H)，7.05(d，J＝2.3Hz，2H)，7.01(d，J＝7.4Hz，1H)，6.95(dd，J＝8.3，3.3Hz，2H)，6.81(t，J＝7.4Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.67(s，3H)。MS(ESI，m/z)：371.1[M+Na]⁺。

实施实例27：4-(5-(3-乙氧羰基苯)呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-27)

在氮气保护下，将中间体7d、3-乙氧羰基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.82(d，J＝7.1Hz，2H)，7.65(d，J＝4.5Hz，1H)，7.45(d，J＝7.7Hz，1H)，7.40(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(d，J＝9.0Hz，1H)，7.13(dd，J＝6.4，2.5Hz，2H)，7.10～7.05(m，1H)，6.97(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，4.28(q，J＝7.1Hz，2H)，3.90(s，3H)，1.30(t，J＝7.1Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：413.1[M+Na]⁺。

实施实例28：4-(5-(4-氯苯)呋喃-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-28)

在氮气保护下，将中间体7d、4-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ3.93(s，3H)，7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37-7.30(m，2H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：375.1[M+Na]⁺。

实施实例29：4-(5-(3-甲氧基苯基)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-29)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、3-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.73～7.65(m，1H)，7.63(dd，J＝4.9，1.2Hz，1H)，7.52(d，J＝8.3Hz，1H)，7.44～7.33(m，2H)，7.29-7.23(m，1H)，7.11～7.01(m，3H)，6.96(d，J＝8.3Hz，1H)，6.83(t，J＝7.4Hz，1H)，3.68(s，3H)。MS(ESI，m/z)：357.1[M+Na]⁺。

实施实例30：4-(5-(2-氯苯)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-30)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、2-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37～7.30(m，3H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：361.1[M+Na]⁺。

实施实例31：4-(5-(3，4-(亚甲二氧基)苯)噻吩-2-基)-香豆素的制备(COUM-31)

在氮气保护下，将相应的中间体7a、3，4-(亚甲二氧基)苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率50％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.72-7.65(m，1H)，7.29(d，J＝8.9Hz，1H)，7.17～7.13(m，1H)，7.11(d，J＝4.8Hz，2H)，6.95(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，6.81～6.74(m，2H)，6.62(dd，J＝8.0，1.3Hz，1H)，5.99(s，2H)。MS(ESI，m/z)：371.1[M+Na]⁺。

实施实例32：4-(5-(3-乙氧羰基苯)呋喃-2-基)-香豆素的制备(COUM-32)

在氮气保护下，将中间体7a、3-乙氧羰基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率52％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.82(d，J＝7.1Hz，2H)，7.65(d，J＝4.5Hz，1H)，7.45(d，J＝7.7Hz，1H)，7.40(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(d，J＝9.0Hz，1H)，7.13(dd，J＝6.4，2.5Hz，2H)，7.10～7.05(m，1H)，6.97(dd，J＝8.9，2.3Hz，1H)，4.28(q，J＝7.1Hz，2H)，1.30(t，J＝7.1Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：399.1[M+Na]⁺。

实施实例33：4-(5-(3-甲氧基苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-33)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、3-甲氧基苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.61(dd，J＝3.7，2.3Hz，1H)，7.31(d，J＝8.9Hz，1H)，7.25(t，J＝7.8Hz，1H)，7.12(d，J＝2.1Hz，1H)，7.05(d，J＝2.3Hz，2H)，7.01(d，J＝7.4Hz，1H)，6.95(dd，J＝8.3，3.3Hz，2H)，6.81(t，J＝7.4Hz，1H)，3.89(s，3H)，3.67(s，3H)。MS(ESI，m/z)：387.1[M+Na]⁺。

实施实例34：4-(5-(2-氯苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-34)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、2-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ3.93(s，3H)，7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37～7.30(m，2H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：391.1[M+Na]⁺。

实施实例35：4-(5-(3-氯苯)噻吩-2-基)-7-甲氧基-香豆素的制备(COUM-35)

在氮气保护下，将相应的中间体7b、3-氯苯硼酸、四(三苯基)磷靶、无水碳酸铯溶于除水的DMF溶液中。在无水无氧条件下，回流12小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，加入乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，先后用水，饱和食盐水洗涤。无水硫酸钠干燥30min，除去有机溶剂得到粗品。用乙酸乙酯∶石油醚＝1∶10快速柱层析分离，得到淡黄色固体产品。收率55％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ3.93(s，3H)，7.72～7.64(m，2H)，7.53(d，J＝8.2Hz，1H)，7.40(dd，J＝8.7，7.4Hz，2H)，7.37-7.30(m，2H)，7.25(d，J＝8.5Hz，2H)，7.17～7.14(m，1H)，7.13～7.09(m，1H)。MS(ESI，m/z)：391.1[M+Na]⁺。

实施实例36：4-(6-甲氧基-3，4-二氢喹啉-1(2H)-基)香豆素的制备(COUM-36)

在氮气保护下，将中间体10a(4-溴-香豆素)、6-甲氧基-1，2，3，4-四氢喹啉、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率70％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，7.57(d，J＝7.2Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.28(d，J＝7.8Hz，1H)，7.15(d，J＝8.2Hz，1H)，6.81(d，J＝2.3Hz，1H)，6.77(dd，J＝8.2，2.5Hz，1H)，5.59(s，1H)，4.03(q，J＝7.1Hz，2H)，3.75(s，3H)，3.70(t，J＝5.6Hz，2H)，2.99～2.85(m，2H)，1.99(s，4H)，1.17(t，J＝7.1Hz，3H)。

实施实例37：4-(8-甲氧基-1，3，4，5-四氢-2H-苯并氮杂卓-2-基)香豆素的制备(COUM-37)

在氮气保护下，将中间体10a、中间体15、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率70％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，7.57(d，J＝7.2Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.28(d，J＝7.8Hz，1H)，7.15(d，J＝8.2Hz，1H)，6.81(d，J＝2.3Hz，1H)，6.77(dd，J＝8.2，2.5Hz，1H)，5.59(s，1H)，4.55(s，2H)，4.03(q，J＝7.1Hz，2H)，3.75(s，3H)，3.70(t，J＝5.6Hz，2H)，2.99～2.85(m，2H)，1.99(s，4H)，1.17(t，J＝7.1Hz，3H)。

实施实例38：4-(6-甲氧基-3，4-二氢喹啉-1(2H)-基)-7甲氧基香豆素的制备(COUM-38)

在氮气保护下，将中间体10b(4-溴-7-甲氧基香豆素)，6-甲氧基-1，2，3，4-四氢喹啉，N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃8取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率70％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，7.57(d，J＝7.2Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.28(d，J＝7.8Hz，1H)，7.15(d，J＝8.2Hz，1H)，6.81(d，J＝2.3Hz，1H)，6.77(dd，J＝8.2，2.5Hz，1H)，5.59(s，1H)，4.03(q，J＝7.1Hz，2H)，3.85(s，3H)，3.75(s，3H)，3.70(t，J＝5.6Hz，2H)，2.99～2.85(m，2H)，1.99(s，4H)，1.17(t，J＝7.1Hz，3H)。

实施实例39：4-(8-甲氧基-1，3，4，5-四氢-2H-苯并氮杂卓-2-基)-7-甲氧基香豆素的制备(COUM-39)

在氮气保护下，将中间体10b、中间体15、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率70％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.73(d，J＝7.5Hz，1H)，7.57(d，J＝7.2Hz，1H)，7.35(d，J＝7.8Hz，1H)，7.28(d，J＝7.8Hz，1H)，7.15(d，J＝8.2Hz，1H)，6.81(d，J＝2.3Hz，1H)，6.77(dd，J＝8.2，2.5Hz，1H)，5.59(s，1H)，4.55(s，2H)，4.03(q，J＝7.1Hz，2H)，3.85(s，3H)，3.75(s，3H)，3.70(t，J＝5.6Hz，2H)，2.99～2.85(m，2H)，1.99(s，4H)，1.17(t，J＝7.1Hz，3H)。

实施实例40：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基苯)-氨基)-7-甲氧基香豆素的制备(COUM-40)

在氮气保护下，将中间体10b、N-甲基-4-甲氧基苯胺、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率72％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.42(dd，J＝10.5，4.1Hz，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.94(t，J＝10.4Hz，4H)，5.83(s，1H)，3.85(s，3H)，3.75(s，3H)，3.32(s，3H)。

实施实例41：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基苯)-氨基)-7-二乙胺基香豆素的制备(COUM-41)

在氮气保护下，将中间体10c(4-溴-7-二乙胺基香豆素)、N-甲基-4-甲氧基苯胺、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率72％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.42(dd，J＝10.5，4.1Hz，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.94(t，J＝10.4Hz，4H)，5.83(s，1H)，3.75(s，3H)，3.38(m，4H)，3.32(s，3H)，1.20(m，6H)。

实施实例42：4-(N-甲基-N-(3，4，5-三甲氧基苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-42)

在氮气保护下，将中间体10a、N-甲基-3，4，5-甲氧基苯胺、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率72％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.42(dd，J＝10.5，4.1Hz，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.94(t，J＝10.4Hz，4H)，5.83(s，1H)，3.75(s，3H)，3.72(s，6H)，3.32(s，3H)。

实施实例43：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基苯)-氨基)香豆素的制备(COUM--43)

在氮气保护下，将中间体10a、N-甲基-4-甲氧基苯胺、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率72％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.42(dd，J＝10.5，4.1Hz，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.94(t，J＝10.4Hz，4H)，5.83(s，1H)，3.75(s，3H)，3.32(s，3H)。MS(ESI，m/z)：304.1[M+Na]⁺。

实施实例44：4-(N-甲基-N-(3，4，5-三甲氧基苯)-氨基)香豆素的制备(COUM--44)

在氮气保护下，将中间体10b、N-甲基-3，4，5-甲氧基苯胺、N，N-二异丙基乙胺溶于除水的DMF中，回流24小时。反应完全后，冷却至室温，加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率72％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.42(dd，J＝10.5，4.1Hz，1H)，7.32(d，J＝8.1Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.94(t，J＝10.4Hz，4H)，5.83(s，1H)，3.85(s，3H)，3.75(s，3H)，3.72(s，6H)，3.32(s，3H)。

实施实例45：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-乙氧基-2-羰基乙氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-45)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加溴乙酸乙酯。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率76％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.39～7.32(m，1H)，7.29(s，1H)，6.96(dd，J＝8.2，1.1Hz，1H)，6.90～6.85(m，1H)，6.83(d，J＝8.6Hz，1H)，6.70(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，6.65(d，J＝2.5Hz，1H)，5.83(s，1H)，4.63(s，2H)，4.17(q，J＝7.1Hz，2H)，3.89(s，3H)，3.34(s，3H)，1.25(t，J＝7.1Hz，3H)。

实施实例46：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3羟基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-46)

在氮气保护下，将中间体14a(4-(N-甲基-N-(3-甲氧甲氧基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)，溶于除水的乙酸乙酯中，通入氯化氢气体，室温搅拌24小时。反应完全后，加入大量饱和碳酸氢钠溶液中和，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到黄色固体。收率82％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.34(m，1H)，7.29(m，1H)，7.05(d，J＝8.2Hz，1H)，6.88(t，J＝7.6Hz，1H)，6.81(d，J＝2.5Hz，1H)，6.75(d，J＝8.5Hz，1H)，6.51(dd，J＝8.5，2.5Hz，1H)，5.83(s，1H)，3.90(s，3H)，3.34(s，3H)。MS(ESI，m/z)：298.3[M+H]⁺。

实施实例47：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-羟基苯)-氨基)-7-甲氧基香豆素的制备(COUM-47)

在氮气保护下，将中间体14b(4-(N-甲基-N-(3-甲氧甲氧基-4-甲氧基苯)-氨基)-7-甲氧基香豆素)，溶于除水的乙酸乙酯中，通入氯化氢气体，室温搅拌24小时。反应完全后，加入大量饱和碳酸氢钠溶液中和，用乙酸乙酯萃取，萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥。除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到黄色固体。收率85％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.91(d，J＝9.1Hz，1H)，6.77(d，J＝18.8Hz，3H)，6.52(d，J＝7.3Hz，1H)，6.45(d，J＝8.2Hz，1H)，5.71(s，1H)，3.90(s，3H)，3.79(s，3H)，3.32(s，3H)。MS(ESI，m/z)：328.1156[M+H]⁺。

实施实例48：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-乙酰氧基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-48)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加乙酰氯。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率83％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，7.28(d，J＝8.5Hz，1H)，7.01(d，J＝8.2Hz，1H)，6.95-6.86(m，4H)，5.86(s，1H)，3.84(s，3H)，3.36(s，3H)，2.30(s，3H)。MS(ESI，m/z)：340.1156[M+H]⁺。

实施实例49：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-吗啉乙氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-49)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，分批加入氯乙基吗啉盐酸盐。加入完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率53％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.35(t，J＝7.6Hz，1H)，7.29(m，1H)，6.98(d，J＝8.2Hz，1H)，6.87(t，J＝7.7Hz，1H)，6.81(d，J＝8.5Hz，1H)，6.74-6.64(m，2H)，5.83(s，1H)，4.11(m，2H)，3.86(s，3H)，3.76(m，4H)，3.35(s，3H)，2.73(m，6H)。MS(ESI，m/z)：411.1912[M+H]⁺。

实施实例50：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-硫代吗啉乙氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-50)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，分批加入氯乙基硫代吗啉盐酸盐。加入完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率53％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.35(t，J＝7.6Hz，1H)，7.29(m，1H)，6.98(d，J＝8.2Hz，1H)，6.87(t，J＝7.7Hz，1H)，6.81(d，J＝8.5Hz，1H)，6.74～6.64(m，2H)，5.83(s，1H)，4.11(m，2H)，3.86(s，3H)，3.76(m，4H)，3.35(s，3H)，2.73(m，6H)。

实施实例51：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-哌啶乙氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-51)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，分批加入氯乙基哌啶盐酸盐。加入完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率53％。

实施实例52：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-吡咯乙氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-52)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，分批加入氯乙基吡咯盐酸盐。加入完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率53％。

实施实例53：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-((4-乙基苯)甲羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-53)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-乙基苯甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率80％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.10(d，J＝7.9Hz，2H)，7.34(ddd，J＝23.4，15.4，8.0Hz，4H)，7.08(d，J＝8.2Hz，1H)，7.03(s，1H)，6.99-6.90(m，3H)，5.87(s，1H)，3.81(s，3H)，3.38(s，3H)，2.74(q，J＝7.6Hz，2H)，1.28(t，J＝7.6Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：430.2367[M+H]⁺。

实施实例54：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-甲磺酸酯基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-54)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加甲磺酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率86％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.37(t，J＝7.3Hz，1H)，7.30(d，J＝8.2Hz，1H)，7.16(d，J＝2.1Hz，1H)，7.02-6.88(m，4H)，5.90(s，1H)，3.90(s，3H)，3.37(s，3H)，3.19(s，3H)。MS(ESI，m/z)：376.1383[M+H]⁺。

实施实例55：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(4-甲基苯)甲磺酸酯基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-55)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-甲基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率82％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.79(dd，J＝8.7，5.0Hz，2H)，7.41(t，J＝7.4Hz，1H)，7.33(d，J＝8.2Hz，1H)，7.16(t，J＝8.4Hz，2H)，7.01～6.90(m，4H)，6.81(d，J＝8.6Hz，1H)，5.87(s，1H)，3.62(s，3H)，3.34(s，3H)，2.65(s，3H)。

实施实例56：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(4-氟苯)甲磺酸酯基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-56)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-氟苯磺酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率82％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.79(dd，J＝8.7，5.0Hz，2H)，7.41(t，J＝7.4Hz，1H)，7.33(d，J＝8.2Hz，1H)，7.16(t，J＝8.4Hz，2H)，7.01～6.90(m，4H)，6.81(d，J＝8.6Hz，1H)，5.87(s，1H)，3.62(s，3H)，3.34(s，3H)。MS(ESI，m/z)：456.1704[M+H]⁺。

实施实例57：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-烯丙酸酯基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-57)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，7.29(d，J＝8.2Hz，1H)，7.02(t，J＝8.8Hz，1H)，6.93(d，J＝10.8Hz，4H)，6.61(d，J＝17.3Hz，1H)，6.32(dd，J＝17.3，10.5Hz，1H)，6.03(d，J＝10.5Hz，1H)，5.86(s，1H)，3.83(s，3H)，3.37(s，3H)。MS(ESI，m/z)：352.1173[M+H]⁺。

实施实例58：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-乙氧基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-58)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加碘乙烷的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，7.29(d，J＝8.7Hz，1H)，7.03(d，J＝8.0Hz，1H)，6.95～6.88(m，2H)，6.85(s，2H)，5.85(s，1H)，4.13(m，2H)，3.81(s，3H)，3.35(s，3H)，1.41(m，3H)。MS(ESI，m/z)：326.4[M+H]⁺。

实施实例59：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-特戊酸酯基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-59)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加叔丁基酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，7.29(d，J＝8.7Hz，1H)，7.03(d，J＝8.0Hz，1H)，6.95～6.88(m，2H)，6.85(s，2H)，5.85(s，1H)，3.81(s，3H)，3.35(s，3H)，1.36(s，9H)。MS(ESI，m/z)：382.4[M+H]⁺。

实施实例60：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-氯乙羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-60)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加氯乙酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(d，J＝8.0Hz，1H)，7.29(d，J＝8.2Hz，1H)，7.03～6.88(m，5H)，5.88(s，1H)，4.32(s，2H)，3.84(s，3H)，3.36(s，3H)。MS(ESI，m/z)：396.6[M+Na]⁺。

实施实例61：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(呋喃-2-基-甲羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-61)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加呋喃-2-酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.68(m，1H)，7.38(m，2H)，7.29(d，J＝8.4Hz，1H)，7.07～7.01(m，2H)，6.93(m，3H)，6.60(d，J＝1.7Hz，1H)，5.87(s，1H)，3.83(s，3H)，3.38(s，3H)。MS(ESI，m/z)：414.2[M+Na]⁺。

实施实例62：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(3-氯苯基-甲羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-62)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加3-氯苯甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率83％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.17(s，1H)，8.07(d，J＝7.6Hz，1H)，7.61(d，J＝8.2Hz，1H)，7.46(t，J＝7.9Hz，1H)，7.38(t，J＝7.5Hz，1H)，7.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.07(d，J＝8.2Hz，1H)，7.01(s，1H)，6.99～6.92(m，3H)，5.88(s，1H)，3.83(s，3H)，3.39(s，3H)。MS(ESI，m/z)：458.5[M+Na]⁺。

实施实例63：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-甲基苯基-甲羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-63)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加2-甲基苯甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.14(d，J＝7.8Hz，1H)，7.48(t，J＝7.5Hz，1H)，7.37(t，J＝7.7Hz，1H)，7.30(t，J＝8.1Hz，3H)，7.08(d，J＝8.1Hz，1H)，7.02(s，1H)，6.98-6.91(m，3H)，5.88(s，1H)，3.84(s，3H)，3.39(s，3H)，2.66(s，3H)。

实施实例64：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(噻吩-2基-甲羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-64)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加噻吩-2-甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.68(d，J＝4.9Hz，1H)，7.47～7.37(m，2H)，7.32(d，J＝8.2Hz，1H)，7.08～7.01(m，1H)，6.97(m，3H)，6.85(m，2H)，5.85(s，1H)，3.70(s，3H)，3.32(s，3H)。

实施实例65：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(4-(甲氧基苯基)-甲羰氧基)-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-65)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-甲氧基苯甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.14(d，J＝8.8Hz，2H)，7.37(t，J＝7.6Hz，1H)，7.29(d，J＝8.2Hz，1H)，7.11～6.89(m，8H)，5.87(s，1H)，3.90(s，3H)，3.82(s，3H)，3.38(s，3H)。MS(ESI，m/z)：454.4[M+Na]⁺。

实施实例66：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-戊羰基氧基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-66)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加正戊酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率87％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，7.28(d，J＝9.3Hz，1H)，7.01(d，J＝8.2Hz，1H)，6.94～6.86(m，4H)，5.85(s，1H)，3.83(d，J＝7.2Hz，3H)，3.36(s，3H)，2.56(t，J＝7.5Hz，2H)，1.78～1.70(m，2H)，1.45(dd，J＝15.0，7.4Hz，2H)，0.96(t，J＝7.3Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：404.6[M+Na]⁺。

实施实例67：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-丙羰基氧基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-67)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加丙酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率87％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.48～7.42(m，1H)，7.33(d，J＝8.2Hz，1H)，7.12～7.04(m，3H)，7.02～6.94(m，2H)，5.87(s，1H)，3.76(s，3H)，3.32(s，3H)，2.54(dd，J＝14.1，6.6Hz，2H)，1.10(t，J＝7.5Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：376.2[M+Na]⁺。

实施实例68：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-溴乙基羰基氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-68)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加溴乙酰溴二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率86％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.50～7.42(m，1H)，7.33(d，J＝8.3Hz，1H)，7.08(s，1H)，6.98(d，J＝8.4Hz，2H)，5.89(s，1H)，4.41(s，2H)，3.78(s，3H)。MS(ESI，m/z)：440.3，442.3[M+Na]⁺。

实施实例69：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(2-甲基-烯丙羰基氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-69)

在氮气保护下，将中间体15a(4-(N-甲基-N-(3-羟基-4-甲氧基苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加2甲基丙烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率85％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.7Hz，1H)，7.28(d，J＝10.5Hz，1H)，7.09～6.85(m，5H)，6.35(s，1H)，5.86(s，1H)，5.77(s，1H)，3.81(d，J＝9.2Hz，3H)，3.36(s，3H)，2.06(s，3H)。MS(ESI，m/z)：388.5[M+Na]⁺，753.3[2M+Na]⁺。

实施实例70：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(3-甲基丁-2-烯)羰基氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-70)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加3-甲基丁-2-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.35(t，J＝7.7Hz，1H)，7.28(d，J＝8.0Hz，1H)，7.02(t，J＝8.9Hz，1H)，6.90(d，J＝14.3Hz，4H)，5.93(s，1H)，5.85(s，1H)，3.83(s，3H)，3.36(s，3H)，2.22(s，3H)，1.99(s，3H)。MS(ESI，m/z)：402.8[M+Na]⁺。

实施实例71：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(丁-2-烯-羰基氧基-)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-71)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加丁-2-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率91％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.2Hz，1H)，7.28(d，J＝9.3Hz，1H)，7.19(dq，J＝13.9，6.9Hz，1H)，7.03(d，J＝8.2Hz，1H)，6.92(dd，J＝7.2，6.1Hz，4H)，6.05(dd，J＝15.5，1.4Hz，1H)，5.85(s，1H)，3.82(s，3H)，3.36(s，3H)，1.97(dd，J＝6.9，1.2Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：388.5[M+Na]⁺。

实施实例72：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(环丙基-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-72)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加环丙基甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率89％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.38～7.27(m，2H)，7.01(d，J＝8.1Hz，1H)，6.89(d，J＝12.3Hz，4H)，5.85(s，1H)，3.83(s，3H)，3.35(s，3H)，1.90～1.78(m，1H)，1.22-1.14(m，2H)，1.09～0.98(m，2H)。MS(ESI，m/z)：388.5[M+Na]⁺。

实施实例73：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(环戊基-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-73)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加环丙基甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率89％。

实施实例74：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(3-乙氧羰基-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-74)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加3-乙氧羰基丙酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率85％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.44(dd，J＝10.4，4.2Hz，1H)，7.33(d，J＝8.3Hz，1H)，7.16～7.05(m，2H)，6.98(dd，J＝14.1，7.7Hz，3H)，5.87(s，1H)，4.13～3.96(m，3H)，3.75(s，3H)，3.33(s，3H)，2.79(t，J＝6.5Hz，2H)，2.61(t，J＝6.5Hz，2H)，1.17(q，J＝7.2Hz，2H)。MS(ESI，m/z)：448.5[M+Na]⁺。

实施实例75：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(己烷羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-75)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加正己酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.38～7.33(m，1H)，7.28(d，J＝9.3Hz，1H)，7.04～6.99(m，1H)，6.95～6.85(m，4H)，5.85(s，1H)，3.82(s，3H)，3.36(s，3H)，2.55(t，J＝7.5Hz，2H)，1.80～1.70(m，2H)，1.44～1.33(m，4H)，0.92(t，J＝7.0Hz，3H)。

实施实例76：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(癸烷羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-76)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加正癸酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率64％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.35(t，J＝7.4Hz，1H)，7.28(d，J＝7.8Hz，1H)，7.01(d，J＝8.1Hz，1H)，6.95～6.85(m，4H)，5.85(s，1H)，3.82(s，3H)，3.36(s，3H)，2.55(t，J＝7.4Hz，2H)，1.80～1.68(m，2H)，1.25(dd，J＝15.7，8.4Hz，12H)，0.88(t，J＝6.5Hz，3H)。

实施实例77：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-((4-甲氧羰基)-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-77)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-甲氧羰基丁酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率82％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，7.28(d，J＝8.8Hz，1H)，7.01(d，J＝8.1Hz，1H)，6.96～6.85(m，4H)，5.86(s，1H)，3.82(s，3H)，3.69(s，3H)，3.36(s，3H)，2.64(t，J＝7.2Hz，2H)，2.47(q，J＝7.2Hz，2H)，2.11～2.03(m，2H)。MS(ESI，m/z)：448.7[M+Na]⁺。

实施实例78：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(5-氯-正戊烷羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-78)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加5-氯戊酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.39～7.33(m，1H)，7.28(dd，J＝8.3，1.1Hz，1H)，7.01(dd，J＝8.2，1.3Hz，1H)，6.95～6.85(m，4H)，5.86(s，1H)，3.83(s，3H)，3.64～3.53(m，2H)，3.36(s，3H)，2.61(dd，J＝8.5，5.1Hz，2H)，1.98～1.84(m，4H)。MS(ESI，m/z)：438.3[M+Na]⁺。

实施实例79：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(3，3-二甲基-丁羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-79)

在氮气保护下，将中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加特戊酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.40～7.32(m，1H)，7.28(dd，J＝9.1，1.8Hz，1H)，7.02(dd，J＝8.3，1.3Hz，1H)，6.95～6.85(m，4H)，5.85(s，1H)，3.82(s，3H)，3.36(s，3H)，2.44(s，2H)，1.13(s，9H)。

实施实例80：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(戊-1-烯-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-80)

在氮气保护下，中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加戊-1-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率76％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.41～7.32(m，1H)，7.28(d，J＝7.9Hz，1H)，7.01(d，J＝8.2Hz，1H)，6.90(dd，J＝12.9，7.2Hz，3H)，5.90(ddd，J＝17.4，8.7，4.5Hz，1H)，5.85(d，J＝3.9Hz，1H)，5.19～5.08(m，1H)，5.06(d，J＝10.2Hz，1H)，3.82(s，3H)，3.35(s，3H)，2.67(t，J＝7.4Hz，2H)，2.50(dd，J＝13.8，6.7Hz，2H)。MS(ESI，m/z)：380.2[M+H]⁺。

实施实例81：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(4-甲基--戊-3-烯-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-81)

在氮气保护下，中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-甲基--戊-3-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率76％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.39～7.33(m，1H)，7.30～7.27(m，1H)，7.05(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)，7.00(dd，J＝8.0，6.7Hz，1H)，6.96～6.86(m，4H)，5.85(s，1H)，3.82(s，3H)，3.36(s，3H)，2.27(p，J＝7.4Hz，2H)，1.94(s，3H)，1.10(t，J＝7.6Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：394.2[M+H]⁺。

实施实例82：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(反-己-4-烯-羰氧基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-82)

在氮气保护下，中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加反-己-4-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝6∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率79％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.39～7.32(m，1H)，7.28(dd，J＝8.3，0.9Hz，1H)，7.18(dt，J＝15.6，6.9Hz，1H)，7.03(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)，6.91(dd，J＝9.7，4.1Hz，4H)，6.02(dt，J＝15.6，1.5Hz，1H)，5.85(s，1H)，3.83(s，3H)，3.36(s，3H)，2.33～2.19(m，2H)，1.53(dt，J＝14.7，7.4Hz，2H)，0.97(t，J＝7.4Hz，3H)。

实施实例83：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(Boc-甘氨酸酯)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-83)

在氮气保护下，将中间体15a、EDCi(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶于无水的二氯甲烷中，冰浴下滴加Boc-甘氨酸的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，升至室温反应，过夜。次日，旋去二氯甲烷溶液，加入大量水稀释，再加入乙酸乙酯萃取。萃取三次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂。残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率59％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.40～7.33(m，1H)，7.29(dd，J＝8.3，1.1Hz，1H)，7.01(dd，J＝8.3，1.4Hz，1H)，6.95-6.86(m，4H)，5.85(d，J＝14.1Hz，1H)，5.19(s，1H)，3.97(d，J＝3.9Hz，2H)，3.87(d，J＝6.2Hz，3H)，3.35(d，J＝6.6Hz，3H)，1.51(d，J＝11.0Hz，9H)。

实施实例84：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(Boc-亮氨酸)苯)氨基)香豆素的制备(COUM-84)

在氮气保护下，中间体15a、EDCi，DMAP溶于无水的二氯甲烷中，冰浴下滴加Boc-亮氨酸的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，升至室温反应，过夜。次日，旋去二氯甲烷溶液，加入大量水稀释，再加入乙酸乙酯萃取。萃取三次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂。残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率58％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.39～7.32(m，1H)，7.31～7.27(m，1H)，7.01(dd，J＝8.3，1.3Hz，1H)，6.97～6.83(m，4H)，5.86(s，1H)，4.92(d，J＝8.6Hz，1H)，4.54(s，1H)，3.80(s，3H)，3.35(s，3H)，1.90～1.76(m，1H)，1.71～1.56(m，2H)，1.44(s，9H)，1.00(d，J＝6.3Hz，6H)。

实施实例85：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(Boc-α-丙氨酸)苯)氨基)香豆素的制备(COUM-85)

在氮气保护下，中间体15a、EDCi，DMAP溶于无水的二氯甲烷中，冰浴下滴加Boc-α-丙氨酸的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，升至室温反应，过夜。次日，旋去二氯甲烷溶液，加入大量水稀释，再加入乙酸乙酯萃取。萃取三次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂。残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率59％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.40～7.33(m，1H)，7.29(dd，J＝8.3，1.1Hz，1H)，7.01(dd，J＝8.3，1.4Hz，1H)，6.95～6.86(m，4H)，5.85(d，J＝14.1Hz，1H)，5.19(d，J＝27.0Hz，1H)，3.87(d，J＝9.8Hz，3H)，3.53(d，J＝5.5Hz，1H)，3.35(d，J＝11.0Hz，3H)，1.58(s，3H)，1.45(s，9H)。

实施实例86：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(Boc-蛋氨基酸)苯)氨基)香豆素的制备(COUM-86)

在氮气保护下，中间体15a、EDCi，DMAP溶于无水的二氯甲烷中，冰浴下滴加Boc-α-丙氨酸的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，升至室温反应，过夜。次日，旋去二氯甲烷溶液，加入大量水稀释，再加入乙酸乙酯萃取。萃取三次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂。残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率59％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.40～7.33(m，1H)，7.29(dd，J＝8.3，1.1Hz，1H)，7.01(dd，J＝8.3，1.4Hz，1H)，6.95～6.86(m，4H)，5.85(d，J＝14.1Hz，1H)，5.19(d，J＝27.0Hz，1H)，3.87(d，J＝9.8Hz，3H)，3.53(d，J＝5.5Hz，1H)，3.35(d，J＝11.0Hz，3H)，2.60(m，2H)，2.18(m，2H)，2.07(s，3H)，1.45(s，9H)。

实施实例87：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-氨基-苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-87)

在氮气保护下，将中间体18(4-甲氧基-N¹-甲基-1，3-二胺苯)和中间体10(4-溴香豆素)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，滴加2个当量的二异丙基乙胺，100摄氏度下反应过夜。反应底物加入大量水稀释，用乙酸乙酯萃取。旋去有机溶剂后，底物过快速柱(流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)。得到浅黄色固体，收率78％。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ7.47～7.39(m，1H)，7.30(dd，J＝8.2，0.8Hz，1H)，7.10(dd，J＝8.2，1.3Hz，1H)，7.01～6.95(m，1H)，6.77(d，J＝8.5Hz，1H)，6.45(d，J＝2.6Hz，1H)，6.37(dd，J＝8.4，2.6Hz，1H)，5.75(s，1H)，4.90(s，2H)，3.76(s，3H)，3.28(s，3H)。MS(ESI，m/z)：297.2[M+H]⁺。

实施实例88：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(3-乙氧羰基-羰氨基)苯)-氨基)香豆素的制备(COUM-88)

在氮气保护下，中间体19a(4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-氨基-苯)-氨基)香豆素)、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加3-乙氧羰基丙酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.46(d，J＝2.3Hz，1H)，8.02(s，1H)，7.36～7.30(m，1H)，7.27(d，J＝2.3Hz，1H)，7.03(dd，J＝8.2，1.1Hz，1H)，6.92-6.82(m，1H)，6.71(d，J＝8.6Hz，1H)，6.56(dd，J＝8.6，2.6Hz，1H)，5.83(s，1H)，4.17(p，J＝7.3Hz，2H)，3.88(s，3H)，3.35(s，3H)，2.74(s，4H)，1.28(t，J＝7.1Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：447.1[M+Na]⁺。

实施实例89：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-((4-甲氧羰基)-羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-89)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加4-甲氧羰基丁酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率82％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.48(s，1H)，7.87(s，1H)，7.38～7.29(m，1H)，7.27(d，J＝4.3Hz，1H)，7.03(t，J＝10.1Hz，1H)，6.86(t，J＝7.5Hz，1H)，6.71(d，J＝8.7Hz，1H)，6.56(dd，J＝8.6，2.6Hz，1H)，5.83(s，1H)，3.88(s，3H)，3.70(s，3H)，3.36(s，3H)，2.49(dt，J＝14.5，7.2Hz，4H)，2.11～2.03(m，2H)。MS(ESI，m/z)：447.1[M+Na]⁺。

实施实例90：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(己烷羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-90)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加己酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率86％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.51(d，J＝2.3Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.27(d，J＝4.9Hz，1H)，7.05(d，J＝7.4Hz，1H)，6.86(t，J＝7.1Hz，1H)，6.71(d，J＝8.6Hz，1H)，6.55(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，5.83(s，1H)，3.88(s，3H)，3.38(m，2H)，2.40(m，2H)，1.80～1.69(m，2H)，1.42～1.33(m，4H)，0.93(t，J＝6.9Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：417.1[M+Na]⁺。

实施实例91：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(癸烷羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-91)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加癸酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率84％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.51(d，J＝2.5Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.36～7.30(m，1H)，7.29～7.27(m，1H)，7.05(dd，J＝8.2，1.1Hz，1H)，6.91～6.81(m，1H)，6.71(d，J＝8.6Hz，1H)，6.55(dd，J＝8.6，2.6Hz，1H)，5.83(s，1H)，3.88(s，3H)，3.36(s，3H)，2.42(t，J＝7.6Hz，2H)，1.75(dd，J＝14.6，7.4Hz，2H)，1.64～1.00(m，24H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：473.4[M+Na]⁺。

实施实例92：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(5-氯-正戊烷羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-92)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加5-氯戊酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率83％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.48(d，J＝2.5Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.33(dd，J＝11.1，4.1Hz，1H)，7.28(s，1H)，7.07～7.01(m，1H)，6.91～6.81(m，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.57(dd，J＝8.6，2.6Hz，1H)，5.83(s，1H)，3.88(s，3H)，3.64～3.55(m，2H)，3.36(s，3H)，2.46(d，J＝6.6Hz，2H)，1.95～1.83(m，4H)。MS(ESI，m/z)：437.5[M+Na]⁺。

实施实例93：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(丁-2-烯-羰氨基-)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-93)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加丁-2-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率78％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.58(s，1H)，7.83(s，1H)，7.36～7.29(m，1H)，7.27(d，J＝2.7Hz，1H)，7.08～6.95(m，2H)，6.85(t，J＝7.0Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.57(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，6.01(d，J＝14.9Hz，1H)，5.84(s，1H)，3.88(s，3H)，3.37(s，3H)，1.94(d，J＝6.8Hz，3H)。MS(ESI，m/z)：387.5[M+Na]⁺。

实施实例94：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(1-甲酯-葵烷-氧基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-94)

在氮气保护下，中间体15a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加11-溴-十一酸加酯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率83％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.33(dd，J＝11.2，4.1Hz，1H)，7.28(d，J＝5.2Hz，1H)，6.98(d，J＝8.3Hz，1H)，6.85(dd，J＝11.2，4.2Hz，1H)，6.79(d，J＝8.4Hz，1H)，6.66～6.60(m，2H)，5.82(s，1H)，3.89(dd，J＝12.2，5.3Hz，2H)，3.86(s，3H)，3.67(s，3H)，3.36(s，3H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，1.82～1.69(m，2H)，1.60(d，J＝7.2Hz，2H)，1.40(m，2H)，1.28(s，10H)。

实施实例95：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(戊-1-烯-羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-95)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加戊-1-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率83％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.50(d，J＝2.1Hz，1H)，7.86(s，1H)，7.32(dd，J＝14.2，7.2Hz，1H)，7.27(d，J＝5.1Hz，1H)，7.05(d，J＝8.3Hz，1H)，6.86(t，J＝7.6Hz，1H)，6.71(d，J＝8.6Hz，1H)，6.56(dd，J＝8.6，2.4Hz，1H)，5.91(ddd，J＝16.9，10.4，6.1Hz，1H)，5.84(s，1H)，5.14(d，J＝16.6Hz，1H)，5.07(d，J＝10.3Hz，1H)，3.88(s，3H)，3.36(s，3H)，2.53(d，J＝10.9Hz，4H)。

实施实例96：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(4-甲基-戊-2-烯-羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-96)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加戊-1-烯酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.51(d，J＝2.3Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.27(d，J＝4.9Hz，1H)，7.05(d，J＝7.4Hz，1H)，6.86(t，J＝7.1Hz，1H)，6.71(d，J＝8.6Hz，1H)，6.55(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，6.34(m，1H)，5.83(s，1H)，3.88(s，3H)，2.34(s，3H)，2.02(m，2H)，1.01(m，3H)。

实施实例97：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(环戊基羰氨基)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-97)

在氮气保护下，中间体19a、N，N-二异丙基乙胺溶于无水的二氯甲烷中，冰浴搅拌下，缓慢滴加环戊基甲酰氯的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，可升至室温，搅拌过夜。次日，除去有机溶剂，残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到淡黄色固体，收率81％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.51(d，J＝2.3Hz，1H)，7.83(s，1H)，7.33(t，J＝7.6Hz，1H)，7.27(d，J＝4.9Hz，1H)，7.05(d，J＝7.4Hz，1H)，6.86(t，J＝7.1Hz，1H)，6.71(d，J＝8.6Hz，1H)，6.55(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，5.83(s，1H)，3.88(s，3H)，2.61(m，1H)，1.76～1.68(m，8H)。

实施实例98：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(1-羧酸-丙烷羰氨基-)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-98)

在氮气保护下，中间体化合物19a、EDCi，DMAP溶于无水的二氯甲烷中，冰浴下滴加丁二酸酐的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，升至室温反应，过夜。次日，旋去二氯甲烷溶液，加入大量水稀释，再加入乙酸乙酯萃取。萃取三次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂。残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率58％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.43(s，1H)，8.02(s，1H)，7.36～7.30(m，1H)，7.27(d，J＝4.1Hz，1H)，7.03(d，J＝8.1Hz，1H)，6.86(t，J＝7.6Hz，1H)，6.72(d，J＝8.6Hz，1H)，6.58(d，J＝8.3Hz，1H)，5.85(s，1H)，3.88(s，3H)，3.35(s，3H)，2.81(d，J＝5.3Hz，2H)，2.77(d，J＝5.2Hz，2H)。

实施实例99：4-(N-甲基-N-(4-甲氧基-3-(Boc-β-丙氨酸酰胺)苯基)-氨基)香豆素的制备(COUM-99)

在氮气保护下，中间体化合物19a、EDCi、DMAP溶于无水的二氯甲烷中，冰浴下滴加Boc-β-丙氨酸的二氯甲烷溶液。滴加完毕后，升至室温反应，过夜。次日，旋去二氯甲烷溶液，加入大量水稀释，再加入乙酸乙酯萃取。萃取三次，合并有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂。残留底物用石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1快速柱层析分离。得到白色固体。收率58％。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.43(d，J＝2.3Hz，1H)，7.86(s，1H)，7.33(dd，J＝11.1，4.1Hz，1H)，7.30～7.27(m，1H)，7.03(t，J＝11.6Hz，1H)，6.87(dd，J＝11.1，4.1Hz，1H)，6.73(d，J＝8.7Hz，1H)，6.59(dd，J＝8.6，2.5Hz，1H)，5.84(s，1H)，5.13(s，1H)，3.87(s，3H)，3.53～3.46(m，2H)，3.36(s，3H)，2.65(t，J＝5.8Hz，2H)，1.45(s，9H)。

药效学试验部分

实施例100体外肿瘤细胞增值抑制活性测试试验

本发明所述的香豆素衍生物具有显著的药理活性，如抗肿瘤、抗血管疾病，为证实上述特点，对本发明实施例中的化合物进行了体外肿瘤细胞增值抑制活性测试。

1)细胞系和细胞培养

人大细胞肺癌细胞株NCI-H460，人小细胞肺癌细胞株NCI-H446，人肝癌细胞株HepG2，人结肠癌细胞株HCT116、人***癌PC-3、人黑色素瘤A375、结肠癌细胞HCT-8、乳腺癌细胞MCF-7、卵巢癌细胞A2780s、卵巢癌耐药细胞A2780/T、结肠癌耐药的细胞HCT-8/T、阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR来自美国典型培养物中心(American Type CultureCollection，ATCC)，由四川大学生物治疗国家重点实验室细胞库培养保种。以上肿瘤细胞常规培养于含10％胎牛血清、100U.mL-1青霉素和100mg.L-1链霉素的DMEM培养液中，置饱和湿度、37℃的5％CO2孵箱中培养。

2)仪器设备

CO₂培养箱：新加坡ESCO CCL-170B-8。数码倒置显微镜：Olympus CKX31。正置研究级显微镜：Olympus BX51TRF。酶标仪：美国Molecular Device公司M5。常温离心机：Thermosicentific公司产品，thermo SOROALLST16。纯水仪：美国Millipore产品，FTPNO9748。立式高压灭菌锅：日本SANYO产品，MLS-3780。恒温水浴箱：巩义市予华仪器有限责任公司DF-101S。超净工作台：新加坡ESCO产品，ESCO Bilogical safety Cabinet，AC2-L1S1 Class II。旋涡混匀器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司cel-866。pH计：METTLERTOLEDO公司产品DELTA320。体重秤：龙腾电子有限公司，LD5102。温湿度计：河北衡水市武强温湿表制造中心，GJWS-A5。液氮罐：美国Thermo公司产品，CY50985-70。

3)细胞计数

体外培养的细胞经0.25％胰蛋白酶消化，轻轻吹落，收集，离心，1200g*3min，用新鲜培养基重悬，将细胞稀释到合适的密度。混匀后吸取少量悬液滴加到血球计数板上，在倒置显微镜下计数。记下4个大格的细胞总数，取平均数后乘以10⁴，再乘以稀释倍数得到细胞密度，乘以总体积即得到细胞总数。

4)体外培养细胞接种96孔板

细胞用0.25％的胰酶消化后离心，加完全培养基悬浮，用血球计数板对细胞进行计数。96孔板按每孔1000-10000个细胞加入稀释好的细胞悬液。置于CO₂孵箱中培养过夜。

5)MTT试验

选用对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％的胰酶消化后，用完全培养基调整细胞悬液浓度，以每孔1000～10000个细胞接种到96孔板，每孔200μL，37℃的5％CO2孵箱中培养24h，实验组更换新的含有不同浓度的待测化合物的培养基，对照组则换成含有等体积的新鲜培养基，每组设置5个平行孔，37℃的5％CO2孵箱中培养。

在药物作用72小时后弃去上清，每孔加入200uL新鲜配制的含有0.2mg/mL的MTT的无血清的培养基，37℃继续培养1～4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，并加入200uL DMSO(二甲基亚砜)，用微型超声振荡器振荡15～20分钟，使结晶物充分溶解混匀后，在酶标仪上检测570nm，参比波长为450nm，测定光密度值。

6)数据处理

按公式计算药物浓度梯度下对肿瘤细胞的生长抑制率：肿瘤细胞生长相对抑制率％＝(1-OD实验组/OD对照组)×100％。

以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度IC₅₀。每个实验均重复3次，测出每个化合物在不同肿瘤细胞中的半数致死浓度微摩尔(μM)(IC₅₀)或纳摩尔浓度(nM)。

7)实验结果

表1中列出各化合物对肝癌细胞HEPG2和结肠癌细胞HCT116的半数致死浓度μM(IC₅₀)范围，其中″+″表示IC₅₀＞5uM以上，″++″表示100nM＜IC₅₀＜5μM，″+++″表示10nM＜IC₅₀＜100nM，″++++″表示0.01＜IC₅₀＜10nM。

表1中MPC-6827的结构式为

表1各化合物对肿瘤细胞的半数抑制活性(IC50)

由表1可见，表1中多个化合物展示良好的抗肿瘤细胞增殖活性。其中化合物COUM-46、COUM-48、COUM-57、COUM-68、COUM-69、COUM-70、COUM-71、COUM-72、COUM-73、COUM-74、COUM-75、COUM-76、COUM-77、COUM-78、COUM-79、COUM-80、COUM-81、COUM-87、COUM-88、COUM-89、COUM-90、COUM-91、COUM-92、COUM-93、COUM-96等，是抗肿瘤活性最好的，它们的IC50值在0.01～10nM之间。本发明提供的部分化合物，其活性已经超过了MPC6827、紫杉醇、长春新碱和秋水仙碱等阳性药物。

表2各化合物对敏感和耐药肿瘤细胞的半数抑制活性(IC50，nM)

由表2可见，多个化合物不但对肿瘤细胞卵巢癌A2780S、结肠癌细胞HCT-8以及乳腺癌细胞MCF-7抗增活性强，且对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞A2780/T、紫杉醇耐药的结肠癌细胞HCT-8/T以及阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR也具有良好的抗增值活性。其中化合物COUM-71、COUM-80、COUM-87、COUM-81均显示比紫杉醇、长春新碱以及秋水仙碱更强的活性。

实施例101免疫荧光显示部分化合物对微管的解聚作用

1)实验方法

往6孔板中放置细胞爬片，将肝癌细胞HepG2细胞铺板于6孔板中，使细胞贴壁在爬片上。用200nM秋水仙碱，300nM紫杉醇作阳性对照药物，待测化合物MPC-6827、COUM-87、COUM-92、COUM-95、COUM-71、COUM-76、COUM-79、COUM-81、COUM-83分别设定三个浓度或等体积DMSO处理细胞16h；吸掉细胞培养液，PBS(磷酸盐缓冲液)洗一次后4％多聚甲醛室温固定15min；冷PBS洗一次；用含0.5％tritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的PBS室温打孔10min；用封闭液室温封闭30min；在保湿条件下孵育抗β-tubulin一抗，室温孵育1h，PBS洗3次；在保湿、避光条件下孵育488标记山羊抗小鼠二抗(购自于北京中杉金桥生物公司)45min；DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)工作液室温染色5min，避光；PBS洗3次；将爬片置于载玻片上，用抗淬灭剂封片后，采用Zeiss公司Axiovert200倒置荧光显微镜观察化合物对微管的抑制作用。

2)实验结果

由图1、图2可看到，DMSO对照组中，微管结构自然有序，而阳性药物MPC-6827组中，微管因为聚合受到抑制，无法装配成有序的丝状结构，表观上呈现为零散而均匀地分布在细胞轮廓内，而本专利所述的化合物COUM-79、COUM-81、COUM-87、COUM-92、COUM-95均表现出了随浓度增大而抑制微管聚合的能力。尤其是COUM-79、COUM-81、COUM-87，在1nM浓度下，仅能部分观察到丝状结构，浓度增大至3nM后，微管结构全部被破坏，表现出比MPC-6827更强的解聚作用，说明以上这些化合物具有抑制微管聚合的能力。

实施例102体内荷瘤小鼠肿瘤模型上的药效学

1)化合物：9种化合物COUM-87、COUM-89、COUM-92、COUM-95、COUM-71、COUM-76、COUM-77、COUM-80、COUM-83。

2)实验动物、培养基

SPF级BALB/c裸鼠(Balb/C nu/nu)和小白鼠，雌性，4-6周龄，18-22克，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2009-0004和SCXX(京)2014-0004，侍养于SPF级动物实验室。

改良型RPMI 1640培养基为HyClone公司提供，批号NWE 0416，规格：500mL，有效期至2012年5月31日。批号NYG0920，规格：500mL，有效期至2014年7月31日。批号NZG1176，规格：500mL，有效期至2015年7月31日。批号NZG1177，规格：500mL，有效期至2015年7月31日，2-8℃保存。

DMEM培养基为HyClone公司提供，批号NZB1077，规格：500mL，有效期至2015年2月28日，2～8℃保存。

3)细胞培养

人肺癌H460和鼠源结肠癌C26细胞在RPMI 1640培养基(HyClone)中培养，培养基中含有10％胎牛血清(呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司)和100U/mL的青霉素和链霉素。取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶消化、计数，将单细胞悬液用不含胎牛血清的培养基稀释至1×10⁷或6×10⁷个细胞/mL备用。

4)接种、分组和治疗

无菌条件下收集肿瘤细胞，用灭菌生理盐水调整细胞密度至5×10⁷个/mL，取0.2mL接种于裸鼠腋背部皮下，待肿瘤生长至直径1cm大小，无菌条件下取出，切成1mm×1mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋背部皮下进行传代。传代2次后，待肿瘤生长至直径1cm大小，无菌条件下取出，切成1mm×1mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋背部皮下。7日后待肿瘤生长至100～300mm³后，将动物随机分组，开始尾静脉注射(i.v.)，2日1次，剂量及给药方式见表3和表4。

表3对结肠癌C26治疗的实验分组表

表4对肺癌H460治疗的实验分组表

对应化合物	剂量(mg/kg)	给药途径	给药频率
				生理盐水组	-	-	-
MPC6827	2.5	i.v..	2天一次
				COUM-87	10	i.v.	2天一次
COUM-92	10	i.v.	2天一次
				COUM-95	10	i.v.	2天一次
COUM-87盐酸盐	10	i.v.	2天一次
				COUM-71	10	i.v.	2天一次
COUM-76	10	i.v.	2天一次
				COUM-79	10	i.v.	2天一次
COUM-81	10	i.v.	2天一次
				COUM-83	10	i.v.	2天一次

5)观察指标和有效判定标准

(1)肿瘤体积(TV)、相对肿瘤体积(RTV)和相对肿瘤增殖率：每2天用1/50mm精度游标卡尺或标尺测肿瘤的长径和短径，动态观察受试药抗肿瘤的效应。

肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV(mm3)＝a×b²×π/6；其中a、b分别表示长径和短径。

根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0，其中V0为每一组在分笼给药时(即d0)测量所得TV，Vt为该组每一次测量时的TV。

抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增值率T/C(％)，计算公式如下：

TRTV：治疗组相对肿瘤体积；CRTV：阴性对照组相对肿瘤体积。

疗效评价标准：T/C(％)＞60为无效；T/C(％)≤60，并经统计学处理P＜0.05为有效。

(2)肿瘤重量测定及抑瘤率(％)的计算：

于治疗终点时处死动物，解剖剥离瘤块，称瘤重，并照相。按下式计算抑瘤率(％)：

有效判定标准：抑瘤率(即肿瘤生长抑制率)＜40％为无效；抑瘤率≥40％并经统计学处理P＜0.05为有效。

6)实验结果

表5化合物对小鼠结肠癌C26皮下移植瘤肿瘤瘤重的影响及抑瘤率

	肿瘤重量平均值(g)	抑瘤率(％)	P值	t检验
					生理盐水组	2.46			0.83
MPC-6827	0.525	78.66	＜0.001	0.27
					COUM-87	0.45	81.70	＜0.001	0.15
COUM-89	1.99	19.12	0.05	0.84
					COUM-92	0.98	60.26	＜0.001	0.35
COUM-95	0.68	72.26	＜0.001	0.26
					COUM-71	1.58	35.77	ns	0.68
COUM-76	1.64	33.18	ns	0.40
					COUM-77	1.82	26.12	ns	0.91
COUM-80	2.00	18.60	ns	0.56
					COUM-83	1.74	29.12	ns	0.95

由图3和表5可见，代表性化合物如COUM-87，COUM-92，COUM-95及阳性药物MPC-6827在鼠源结肠癌模型上显示良好的抗肿瘤活性。其对结肠癌C26模型上，抑制率分别达到81.70％、60.26％、72.66％，且在治疗过程中老鼠体重无明显变化，而阳性药物MPC-6827尽管抑制率达到78.66％，但治疗过程中老鼠体重显著下降，且出现老鼠死亡，表明专利所述化合物毒性较阳性药物MPC-6827低，且抗肿瘤效果强。

表6化合物对人肺癌H460细胞裸鼠皮下肿瘤瘤重的影响及抑瘤率

图4和表6为在人源肺癌H460模型上考察多个代表性化合物的抗肿瘤活性。由图4和表6可知，实验结果表明，与空白对照组相比，化合物COUM-87、COUM-92、COUM-95、COUM-71、COUM-76、COUM-79、COUM-81、COUM-83以及COUM-87盐酸盐在静脉给于10mg/kg剂量，对人肺癌H460细胞肿瘤模型的抑瘤率均大于40％，显示良好的治疗效果，其中，COUM-87、COUM-92、COUM-95三个化合物对肿瘤抑制率分别为69.88％、79.12％、76.64％，抗肿瘤效果较好。与空白对照组相比，以上各化合物治疗过程中体重均无明显变化，表明其毒性也较小。

实施例103人卵巢癌细胞A2780S和紫杉醇耐药的细胞A2780/Taxol荷瘤裸鼠模型上的药效学

1)化合物：化合物COUM-87柠檬酸盐，化合物COUM-92

2)实验动物、培养基

SPF级BALB/c裸鼠(Balb/C nu/nu)和小白鼠，雌性，4-6周龄，18-22克，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2014-0012。实验条件：SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2015-0023

改良型RPMI 1640培养基为HyClone公司提供，批号NWE 0416，规格：500mL，有效期至2012年5月31日。批号NYG0920，规格：500mL，有效期至2014年7月31日。批号NZG1176，规格：500mL，有效期至2015年7月31日。批号NZG1177，规格：500mL，有效期至2015年7月31日，2-8℃保存。

DMEM培养基为HyClone公司提供，批号NZB1077，规格：500mL，有效期至2015年2月28日，2～8℃保存。

3)细胞培养

人卵巢癌细胞A2780S和紫杉醇耐药的卵巢癌A2780/Taxol细胞，在RPMI 1640培养基(HyClone)中培养，培养基中含有10％胎牛血清(呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司)和100U/mL的青霉素和链霉素。取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶消化、计数，将单细胞悬液用不含胎牛血清的培养基稀释至1×10⁷或6×10⁷个细胞/mL备用。

4)接种、分组和治疗：无菌条件下收集人卵巢癌细胞A2780S和紫杉醇耐药的卵巢癌A2780/Taxol肿瘤细胞，用灭菌生理盐水调整细胞密度至5×10⁷个/mL，取0.1mL接种于裸鼠腋背部皮下，待肿瘤生长至直径1cm大小，无菌条件下取出，切成1mm×1mm大小的瘤块，均匀接种于裸鼠腋背部皮下进行传代。12日后待肿瘤生长至100～300mm³后，将动物随机分组，开始给药。空白对照组生理盐水，0.2mL/鼠，尾静脉注射，2日1次；MPC6827组5mg/kg，尾静脉注射，7日1次；紫杉醇组10mg/kg，腹腔给药，2日1次、30mg/kg腹腔给药，7日1次；COUM-87柠檬酸盐、COUM-92分别为2.5、5、10mg/kg，尾静脉注射，2日一次、20mg/kg，尾静脉注射，7日1次。每2天称量体重并用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，给药20天后将裸鼠脱臼处死，剥离肿瘤组织，称重并拍照。最后计算肿瘤抑制率(％)，以肿瘤抑制率评价抗肿瘤作用强度。表7列出了各化合物对卵巢癌A2780s和A2780T治疗效果。

表7对卵巢癌A2780s和A2780T治疗效果总结表

由表7可见，化合物COUM-87柠檬酸盐、化合物COUM-92能剂量依赖地抑制肿瘤的生长，抗肿瘤活性优于紫杉醇，且治疗过程中体重无明显变化，而紫杉醇体重平均下降2克左右，表明化合物COUM-87柠檬酸盐和化合物COUM-92的毒性比紫杉醇低。

实施例104化合物抑制微管蛋白聚合活性

实验方法：

实验当天用灭菌水配制100×GTP液(100mM浓度，GTP粉末购自大连美仑生物技术有限公司)。

微管蛋白购买自cytoskeleton公司，-80℃保存，使用时置于冰上，用预冷的微管聚合缓冲液(Genaral Tubulin Buffer，成分为80mM哌嗪-1，4-二乙磺酸、2mM氯化镁、0.5mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，pH值为6.9)溶解微管蛋白，冰上混匀，放置30min-1h，使微管蛋白充分解聚；同时将实验用的96孔板放酶标仪中预热，调温至全程37℃，并调好酶标仪设置：动态读数(kinetic模式)，测340nm波长吸光值，测试时间设定为30-60min，每1min读值一次；再取部分General Tubulin Buffer平衡至室温。

将微管蛋白转移至预冷的EP管中，13000rpm，4℃离心20min，取上清放冰上。用Bradford法进行蛋白定量，按定量结果加微管聚合缓冲液将微管蛋白浓度调至2mg/mL。

将待测化合物按实验浓度的10倍配至100μL预热至室温的general tubulinbuffer中，即为待测化合物10×液。对照组配制等体积比例的DMSO。观察化合物溶解良好，未发生析出后，从酶标仪中取出预热的96孔板，尽快按每个实验组加10μL相应10×液加入化合物，然后再将96孔板放回酶标仪中37℃孵育。

往微管蛋白液中加100×GTP液至终浓度1mM，快速混匀。

从酶标仪中取出96孔板，快速往每个孔中加入90μL微管蛋白(加样过程中防止气泡产生)。

快速将96孔板放入酶标仪，开始读值。

由图5可以看出，化合物COUM-87、COUM-92与阳性药物一样，可剂量依存性地在体外抑制微管蛋白的聚合，在同样5μM浓度下，其抑制效果与MPC6827相当，说明化合物COUM-87、COUM-92具有较强的抑制微管聚合活性。

实施例105各化合物体外的抗血管活性

具有秋水仙碱结合位点的微管抑制剂往往具有破坏肿瘤相关血管的能力。因为这类化合物被视为具有杀伤肿瘤细胞和肿瘤相关血管内皮细胞的双重机制。化合物对微管体系的影响会造成内皮细胞的形态变化。我们利用培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)考察8a体外的抗血管活性。

HUVEC细胞分离培养方法：

经相关部门审核批准后，从临床获取新生儿脐带，放入无菌的PBS溶液中储存，外加冰袋保持低温，回到无菌操作台进行操作。用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗数次次，直到将污血冲洗干净为止。用手术钳夹紧脐带下端，加入1mg/mL浓度的胶原酶(购自Roche公司)室温下消化15～20分钟，并不时上下摇动脐带。消化完后，将下端手术钳松开，让消化液流入一个50mL无菌离心管中，再用无菌的PBS溶液冲洗脐带2～3次。将收集液1500rpm离心3分钟。弃上清，用含各类生长因子的EBM-2培养基(购自lonza公司)重悬细胞，置5％CO₂的培养箱中37℃恒温培养。

(1)实验方法：HUVEC细胞划痕试验

收集传代至第三至七代之间的HUVEC细胞，铺板于6孔板中。待细胞长至接近单层长满时，换成无血清培养基饥饿细胞6h。用一根灭菌的中号移液器吸头对细胞进行划痕。灭菌PBS洗两次，换回含有各类生长因子的EBM-2培养基继续培养，同时按不同浓度加入化合物。此时立即置于显微镜下拍照，作为0h组。细胞迁移时间为24h。处理时间到后，4％多聚甲醛固定后显微镜下拍照。每组随机选取3个不同视野，数迁移细胞数。

(2)HUVEC细胞成管实验

将Matrigel(基质胶，购自Becton Dickinson(BD)公司)放在4℃，令其呈液态；实验所用枪尖、96孔板、EP管也提前预冷。

按50μL/孔的量往96孔板中加入Matrigel，置于CO₂培养箱中37℃孵育45min让其凝固。收集传代至第三至七代之间的HUVEC细胞，计数后，按照10000个细胞/孔的数量铺板至预铺Matrigel的96孔板中，同时以不同浓度加入化合物。8h后，4％多聚甲醛固定，显微镜下照相。每组随机选取3个不同视野，对形成的腔状结构计数。

利用HUVEC细胞进行了划痕和成管实验。结果如图6所示，在划痕实验中，让划痕后的HUVEC细胞迁移24h后，溶剂对照组相比初始划痕时，表现出了很强的迁移活性。而化合物COUM-92、COUM-95、COUM-87、COUM-79与MPC-6827一样剂量依存地抑制了HUVEC细胞的迁移。COUM-92、COUM-95、COU-M87在最高的实验浓度10nM完全抑制了HUVEC的迁移。在成管实验中，经过8h的处理，溶剂对照组细胞很好地组装成了管状结构。而COUM-92、COUM-95、COUM-87、COUM-79与MPC-6827一样可剂量依存性地阻碍了HUVEC细胞的成管。在较高浓度，HUVEC细胞呈现接近完全零散的形态。这一系列血管方面实验说明，以上化合物具有抗血管活性。

本发明除了具有较强的抗肿瘤活性，在多种肿瘤细胞株的IC50值在0.01～5nM之间，还具有较好的抑制微管聚合的效果，且具有多样的生物活性和较小的毒性，同时也可能具有良好的溶解性。

Claims (22)

1.4位取代的香豆素衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：

其中，R₁为

R₂₁～R₂₂独立地为

或C1～C4烷氧基；

R₂为C1～C8烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C8烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；

R₆～R₉独立地为-H、C1～C8烷氧基、卤素、C1～C8烷基、

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；

R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；

R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C8烷基、C1～C8烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；

R₁₄～R₁₆独立地为C1～C8烷基、卤素、-H或C1～C8烷氧基，且不同时为-H；

R₁₇为C1～C8烷基、-H或

R₁₈为C1～C8烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基或-H。

2.根据权利要求1所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：R₁为

R₂₁～R₂₂独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

R₁₈为C1～C4烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

3.根据权利要求2所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：R₁为

R₂₁、R₂₂独立地为

R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

R₁₈为C1～C4烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

4.根据权利要求2所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：R₁为

R₂₁～R₂₂独立地为

或C1～C4烷氧基；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

x＝1～2，y＝1～2；R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

R₁₈为C1～C4烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

5.根据权利要求4所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：R₁为

R₂₁、R₂₂独立地为

R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₃～R₅独立地为-H、C1～C4烷氧基、

-NH₂或

且不同时为-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₀为

R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

R₁₈为C1～C4烷基或-H；R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

6.根据权利要求1所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：当R₁为取代的不饱和5元杂环时，其结构式如式Ⅱ所示：

其中，A为O或S；R₂为C1～C8烷氧基、-H或

R₆～R₉独立地为-H、C1～C8烷氧基、卤素、C1～C8烷基、

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C8烷基或-H。

7.根据权利要求6所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

8.根据权利要求7所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：A为O或S；R₂为C1～C4烷氧基或-H；R₆～R₉独立地为-H、C1～C4烷氧基、卤素、C1～C4烷基、

R₁₉、R₂₀独立地为C1～C4烷基或-H。

9.根据权利要求1所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：当R₁为

R₃为-H，R₄为甲氧基，R₅为

时，其结构式如式Ⅲ所示：

其中，R₂为C1～C8烷氧基、-H或

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C8卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C8烷基、C1～C8烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C8烷基、卤素、-H或C1～C8烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C8烷基、-H或

10.根据权利要求9所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₁₀为

x＝1～4，y＝1～4；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

11.根据权利要求10所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：R₂为C1～C4烷氧基、-H或

R₁₀为

x＝1～2，y＝1～2；R₁₂为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基、

R₁₃为C1～C4烷基、C1～C4烷基取代的苯基或卤素取代的苯基；R₁₄～R₁₆独立地为C1～C4烷基、卤素、-H或C1～C4烷氧基，且不同时为-H；R₁₇为C1～C4烷基、-H或

12.根据权利要求1所述的4位取代的香豆素衍生物，其特征在于：当R₁为

R₃为-H，R₄为甲氧基，R₅为

时，其结构式如式Ⅳ所示：

其中，R₁₁为C1～C10烷基、

C2～C8烯基、C1～C4卤素取代的烷基、C3～C8环烷基或

z＝1～10；R₁₈为C1～C4烷基或-H。

13.根据权利要求1所述的4位取代的香豆素衍生物，其结构式为：

14.4位取代的香豆素衍生物，其结构式为：

15.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物在药学上可接受的盐。

16.药物组合物，是以权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐为活性成分，添加药学上可接受的载体组成。

17.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐，以药学上可接受的制剂形式存在，为口服剂、栓剂、滴丸剂、大输液、小针、冻干粉针、气雾剂或软膏。

18.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐，以药学上可接受的制剂形式存在，为缓释剂型或控释剂型。

19.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐，以药学上可接受的制剂形式存在，为纳米制剂。

20.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐在制备***药物中的用途；所述肿瘤为血液癌、卵巢癌、***癌、睾丸癌、黑色素瘤、胰腺癌、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、脑癌、肺癌、肝癌或结肠癌中的任意一种。

21.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐在制备治疗敏感和耐药肿瘤细胞药物中的用途。

22.权利要求1～14任一项所述的4位取代的香豆素衍生物或权利要求15所述的盐在制备治疗炎症药物中的用途。

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