CN104337807A - 共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体及其制备方法与应用，另外也涉及一种结构新颖的增敏剂3-(2-噻吩基)苯并[5,6]香豆素。本发明的制备过程简单快捷，原料易得，所制备的PTX/ThBC纳米脂质体粒径较均一，稳定性佳，包封率≥94%。该制剂相对于传统的PTX注射液，具有明显的缓释性能，毒副作用降低；相对于已有的PTX纳米脂质体，由于ThBC的增敏作用，对肿瘤细胞，如HeLa细胞增殖抑制活性更佳。

Description

共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药，具体涉及一种共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体及其制备方法与应用。另外也涉及一种结构新颖的增敏剂3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素。

背景技术

紫杉醇（Paclitaxel，或Taxol，缩写PTX），最初是由两位美国化学家Wani和Wall于1963年从生长在美国西部大森林中的一种被称为太平洋杉的树皮和木材中分离得到，并发现它具有广泛的抗恶性肿瘤作用（Wani MC, Taylor HL, Wall ME, et al. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc, 1971, 93(9): 2325- 2327.）。该活性成分在植物中含量极低，直到1971年，通过X-射线衍射分析才确定了其结构。1994年7月，美国FDA批准PTX作为一种新型抗微管、抗癌药物进入市场。现已作为治疗多种肿瘤，如乳腺癌、非小细胞肺癌和卵巢癌等的一线用药，对***、大肠癌、原发性肝癌、直肠癌也有比较显著的疗效。研究发现，PTX与β微管蛋白结合，影响α、β微管蛋白二聚体与微管间的动态平衡，促进微管蛋白组装成微管，并使已组装的微管凝结、聚集，阻滞其解聚成亚单位，使细胞周期停滞于G₂/M期（Rowinsky EK, Donehower RC. Paclitaxel (taxol). N Engl J Med, 1995, 332(15): 1004-1014.）。

然而，PTX难溶于水（< 0.3 μg/mL），制成注射剂有一定的困难(Kakinoki A, Kaneo Y, Tanaka T, et al. Synthesis and evaluation of water-soluble poly(vinyl alcohol)-paclitaxel conjugate as a macromolecular prodrug. Biol Pharm Bull, 2008, 31(5): 963-969.)。目前临床使用的PTX注射液有国产的紫素，泰素，进口的紫杉醇注射液 (美国BMS公司)，Anzatax (澳大利亚Fauliding公司) 等产品，这些产品均采用了表面活性剂增溶法，即以非离子表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL）与乙醇以1 : 1的比例组成的混合液来稳定和溶解制剂中的PTX，解决PTX不溶于水的缺点，达到静脉给药目的（Zhang JA, Anyarambhatla G, Ma L, et al. Development and characterization of a novel Cremophor EL free liposome-based paclitaxel (LEP-ETU) formulation. Eur J Pharm Biopharm, 2005, 59(1): 177-187.）。但是，该剂型伴随很多难以解决的临床问题：（1）由于聚氧乙烯蓖麻油会引起体内组胺释放，产生过敏反应、超过敏反应，如出现药物性皮疹，呼吸急促，支气管痉挛，低血压等。有超过2％的严重过敏反应发生而引起死亡。（2）PTX的聚氧乙烯蓖麻油溶液存在稳定性和相容性的问题，如药物一经稀释PTX就易发生沉淀。（3）制剂使用过程繁琐，病人顺应性差。（4）PTX利用率低，靶向性差，有一定的神经毒性。由于这类PTX制剂缺乏靶向性，易造成药物全身分布引起全身毒性；为了能够清除肿瘤细胞或病灶，不得不加大给药剂量，导致毒副作用增加。因此临床上迫切需要研制出不含聚氧乙烯蓖麻油的PTX新型给药***，以克服目前PTX剂型的缺陷。

香豆素类化合物广泛存在于天然产物及合成药物中，具有多种生理活性，例如：抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等作用（Riveiro ME, De Kimpe N, Moglioni A, et al. Coumarins: old compounds with novel promising therapeutic perspectives. Curr Med Chem. 2010, 17(13): 1325-1338.）。近几年，香豆素的抗肿瘤作用成为研究的热点，人们已经建立多种细胞模型，并逐步深入到分子机制上，如发现其主要是通过作用于细胞周期，诱导细胞凋亡以及阻断多种信号等途径抑制肿瘤细胞的增殖（Zhou Y, Zhao W, Xie G, et al. Induction of Nur77-dependent apoptotic pathway by a coumarin derivative through activation of JNK and p38 MAPK. Carcinogenesis, 2014, Epub ahead of print.）。然而，到目前为止，具有临床应用价值的实用性香豆素类抗肿瘤化合物鲜有报道（马龙, 张波, 陈耀等, 具有抗肿瘤活性的香豆素类化合物, CN 103172606 A.）。一方面，该类化合物中的绝大多数抗肿瘤作用弱，活性低，单独成药的可能不大。另一方面，同PTX一样，诸多香豆素类化合物水溶性差，制剂困难；此外，部分化合物结构中的内酯环对pH变化很敏感，易于水解，导致稳定性不佳。

脂质体（Liposomes）的迅猛发展为解决PTX等难溶性药物提供了良好的应用平台。脂质体是由磷脂和胆固醇组成的类似生物膜的双分子层结构。由于其结构类似生物膜，可包封水溶性和脂溶性药物，具有提高药物稳定性、减少药物用量、降低毒性；减轻***反应和免疫反应；延缓释放、降低体内消除速度；改变药物在体内的分布等优点而得到广泛的应用。脂质体常作为药物的储库，用于肿瘤、感染性疾病、心血管疾病等治疗中（Sempkowski M, Locke T, Stras S, et al. Liposome-based approaches for delivery of mainstream chemotherapeutics: preparation methods, liposome designs, therapeutic efficacy. Crit Rev Oncog, 2014, 19(3-4):177-221.）。但是，脂质体的稳定性差已成为其应用中的主要问题：脂质体进入体内后，由于受血液中的蛋白、抗体等各种因素作用，易发生破裂，包封药物快速渗漏，并很快被网状内皮***识别、吸收，限制了它在临床上的应用。

纳米脂质体（Nanoliposomes，或Nano-liposomes、Nano-lipo）是在常规脂质体基础上结合纳米技术发展起来的一种新型给药***。纳米脂质体的粒径小，包封率高，靶向作用强，同时具有辅料相容性好、体外释放可控性强等优点。研究表明：紫杉醇纳米脂质体制剂与传统的注射剂相比，疗效相似，但可避免聚氧乙烯蓖麻油复合溶媒带来的不良反应，稳定性显著提高，药物不易渗漏；同时纳米脂质体的天然生物膜结构在体内具有被动靶向性，可以改善PTX在动物体内的代谢动力学，降低毒副作用，患者顺应性佳。

将紫杉醇和增敏剂香豆素类化合物共同载入纳米脂质体中，则可以解决PTX临床使用中以下几个难题：（1）将PTX载于脂质体，免除了产生毒副作用的表面活性剂的使用。（2）将其制成纳米脂质体制剂，避免网状内皮***的吞噬，使PTX在体内产生一定的储库效应和靶向性，药物在纳米脂质体中停留时间明显延长，有利于肿瘤组织及病理部位的吸收。（3）纳米脂质体中引入增敏剂香豆素类化合物，可显著增强PTX对某些肿瘤细胞的增殖抑制作用；这样，临床使用时，可在保证疗效的前提下，减少PTX用药剂量，从而降低其毒副作用，达到“增敏减毒”PTX之目的。

发明内容

为了将紫杉醇和增敏剂香豆素类化合物共同载入纳米脂质体中，达到“增敏减毒”PTX之目的，本发明提供一种不含聚氧乙烯蓖麻油的新型给药***—共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体。本发明的另一目的在于提供该纳米脂质体的制备方法，本发明的第三个目的在于提供上述纳米脂质体作为制备抑制肿瘤药物的应用。

本发明的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体，以下述配比的原料制成：紫杉醇：10 mg；注射用大豆卵磷脂：n_{大豆卵磷脂}: n_紫杉醇= 33～70 : 1；胆固醇：n_胆固醇: n_{大豆卵磷脂}=0.05～0.15 : 1；增敏剂n_增敏剂: n_紫杉醇=1～3 : 1；冻干保护剂：用量为注射用大豆卵磷脂及胆固醇总质量的5%～10%；磷酸盐缓冲液：pH7.2～7.4，用量为40～80 mL；

其中n为摩尔数。

为了计算方便，将有关原料的信息在这里列出。紫杉醇分子式C₄₇H₅₁NO₁₄，分子量理论值为853.92，注射用大豆卵磷脂分子式为C₄₂H₈₀NO₈P，分子量理论值为758.06，胆固醇分子量理论值为386.6535。

进一步，增敏剂为ThBC，其化学结构如式（I）所示：

（I）

ThBC即为3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素（英文全称：3-(2-thiophenyl)-benzo[5, 6]coumarin），分子式为C₁₇H₁₀O₂S，分子量理论值为278.0402。

    进一步，所述的冻干保护剂可为蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇和/或海藻糖。更进一步，优选蔗糖。

为了实现第二个发明目的，所述的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的制备方法包括：

将注射用大豆卵磷脂、胆固醇、紫杉醇及增敏剂用有机溶剂溶解，并混匀。55 ℃下水浴蒸发成膜，除去溶剂，真空干燥。加入磷酸盐缓冲液及冻干保护剂，搅拌，充分溶胀至薄膜脱落，得到黄色混悬液；然后冰水浴下分散，得到黄色略带荧光的悬液，再经0.22 μm滤器过滤除菌整粒，即得纳米脂质体悬液；分装至西林瓶，冷冻干燥，得到共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体。

上述制备方法中，还包括一种增敏剂ThBC的合成，其步骤包括如下：

向反应器中依次加入噻吩-2-乙酸，乙酸酐和2-羟基-1-萘甲醛，室温下搅拌, 使固体溶解后，加入三乙胺，氮气保护下加热回流，反应结束后冷却至室温，加入冰水，搅拌，析出固体，抽滤，滤饼用冰水洗涤至中性，再加入CH₂Cl₂，过滤，去除不溶物，浓缩，硅胶柱层析分离，得黄色固体，即目标产物。

其中硅胶柱层析分离采用V _乙酸乙酯：V _石油醚= 1: 4的乙酸乙酯-石油醚混合流动相。

特别地，本发明的制备方法中，注射用大豆卵磷脂及胆固醇一起用5～8 mL的***或三氯甲烷溶解；紫杉醇用1～4 mL乙醇或三氯甲烷溶解；增敏剂用1～4 mL二氯甲烷或三氯甲烷溶解。

更进一步，上述制备方法中所述的分散的方法为超声波细胞破碎仪间歇超声法或高压乳匀法。

在第三个方面，本发明提供上述所述的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的在制备抗肿瘤药物方面的应用，其中所述肿瘤包括***、乳腺癌、卵巢癌。

进一步，药物剂型为静脉注射剂。

本发明将紫杉醇和增敏剂共同载入纳米脂质体中，构建了共载紫杉醇和增敏剂（如：3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素）的纳米脂质体，所得到的制剂具有粒径小，稳定性高，体外释放可控等优点，是一种新型的药物缓释制剂。该制剂解决了PTX临床使用中以下几个难题：（1）将PTX载于脂质体，免除了产生毒副作用的表面活性剂的使用。（2）将其制成纳米脂质体制剂，三次检测的包封率≥94%，载药量2.06%～2.39%，平均粒径均在171.4 nm左右，且分布较均匀。该纳米脂质体避免了网状内皮***的吞噬，使PTX在体内产生一定的储库效应和靶向性，药物在纳米脂质体中停留时间明显延长，有利于肿瘤组织及病理部位的吸收。（3）纳米脂质体中引入增敏剂（如：3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素），可显著增强PTX对某些肿瘤细胞的增殖抑制作用；临床使用时，可在保证疗效的前提下，减少PTX用药剂量，从而降低其毒副作用。综上，将增敏剂与PTX共载入纳米脂质体中，可达到“增敏减毒”PTX之目的。

本发明的整个制备过程简单快捷，原料易得，所制备的PTX/ThBC纳米脂质体粒径较均一，稳定性好；包封率高；该制剂相对于传统的PTX注射液，具有明显的缓释性能，毒副作用降低；相对于已有的PTX纳米脂质体，由于ThBC的增敏作用，对肿瘤细胞，如HeLa细胞增殖抑制活性更佳。

附图说明

图1为ThBC的¹H NMR图谱（a图）及高分辨率质谱图（b图）。

图2为ThBC的X射线单晶衍射图。

图3为共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的粒径分布图。

图4为共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的SEM图。

图5为三种紫杉醇制剂在含30%乙醇的PBS中药物释放曲线图。

图6为HeLa细胞对共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体胞内摄取的激光共聚焦显微照片。

图7为三种紫杉醇制剂及增敏剂对HeLa细胞增殖抑制活性图。

图8为三种紫杉醇制剂及增敏剂诱导HeLa细胞发生凋亡比较图。

图9为三种紫杉醇制剂及增敏剂对HeLa细胞周期的影响比较图。

图10为三种紫杉醇制剂及增敏剂对细胞HeLa胞内活性氧水平的影响比较图。

具体实施方式

本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

实施例1 

ThBC的合成

合成路线如Scheme 1所示：

Scheme 1 Synthesis of sensitizer 3-(2-thiophenyl)-benzo[5, 6]coumarin

制备过程：

向100 mL烧瓶中依次加入噻吩-2-乙酸（1.42 g , 0.01 mol），乙酸酐（5 mL）和2-羟基-1-萘甲醛（1.72 g , 0.01 mol），室温下搅拌10 min , 使固体溶解后，加入三乙胺（2 mL），氮气保护下加热回流12 h。反应结束后冷却至室温，加入20 mL冰水，剧烈搅拌15 min，析出大量固体，抽滤，滤饼用冰水洗涤至中性，再加入CH₂Cl₂，过滤，去除不溶物，浓缩，硅胶柱层析分离( V _乙酸乙酯：V _石油醚= 1: 4)，得黄色固体目标产物1.75 g。 产率：62.87%, mp：218 ～ 220 ℃。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 8.81 (s, 1H), 8.38 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 1.0 Hz, 1H), 7.76 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.52 (m, 2H), 7.29 (d, J = 0.5 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 159.6, 152.4, 136.6, 133.5, 132.6, 132.6, 131.4, 130.5, 129.2, 128.8, 128.2, 127.7, 127.1, 126.2, 121.5, 116.7, 113.6. ESI-HRMS (m/z): calcd. for C₁₇H₁₀O₂S [M + H]⁺: 279.04351; found: 279.04734。

参见图1和图2。

实施例2

（1）配方

紫杉醇：10 mg（0.0117mmol）；

注射用大豆卵磷脂：355 mg（0.4683 mmol，n_{大豆卵磷脂}: n_紫杉醇= 40.025）；

胆固醇：18 mg（0.0466 mmol，n_胆固醇: n_{大豆卵磷脂}=0.0995）； 

增敏剂ThBC：6.5 mg（0.0234 mmol，n_增敏剂: n_紫杉醇= 2.0）；

蔗糖：20 mg（占注射用大豆卵磷脂及胆固醇总质量的5.36%）；

磷酸盐缓冲液：50 mL。

（2）制备工艺

采用薄膜分散法：将上述处方量注射用大豆卵磷脂、胆固醇溶于6 mL***，PTX溶于1 mL乙醇，增敏剂ThBC溶于1 mL二氯甲烷中，待充分溶解后，转入100 mL茄形瓶中混匀。55 ℃下水浴旋转蒸发成膜，减压除去溶剂，薄膜置真空干燥器内干燥过夜。加入磷酸盐缓冲液及冻干保护剂蔗糖，搅拌，充分溶胀至薄膜脱落，得到黄色略带荧光的悬液。冰水浴下，经超声波细胞破碎仪间歇超声10 min，再经0.22 μm滤器过滤除菌整粒，即得纳米脂质体悬液。分装至西林瓶，低温冷冻干燥，得到PTX/ThBC Nano-lipo（即共载紫杉醇和增敏剂ThBC的纳米脂质体），置于4 ℃冰箱密封保存。

实施例3

共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体的表征

采用激光散射粒度分析仪测定纳米脂质体（包括仅载有紫杉醇的脂质体和共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体，以下分别称为PTX Nano-lipo，以及PTX/ThBC Nano-lipo）的粒径分布，PTX/ThBC Nano-lipo的粒径分布如图3所示。采用透射电镜观测纳米脂质体的形貌。透射电镜显示PTX/ThBC Nano-lipo呈圆球形，大小略不均一，如图4所示。粒径检测结果显示：三次检测的PTX/ThBC Nano-lipo平均粒径均在171.4 nm左右。

实施例4

共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体包封率及稳定性考察

采用超滤法测定PTX脂质体包封率：取出一定量PTX/ThBC Nano-lipo冻干粉，加入纯水稀释后离心超滤（5000 rpm，30 min），收集下清液，高效液相色谱（HPLC）检测下清液中PTX浓度，从而计算出游离的PTX的质量（m_Free），并测定超滤前脂质体悬液中PTX总浓度，从而计算出PTX的总质量（m_PTX），以及药物与辅料的总质量（m）。HPLC条件：流动相为乙腈：水（60：40），流速1 mL/min，检测波长227 nm，进样量20 μL。

分别根据以下公式计算包封率（Encapsulation efficiency，EE）和载药量(Drug loading，DL)，其中(EE, %) = (m_PTX- m_Free) / m_PTX × 100%；(DL, %) =(m_PTX- m_Free) / m × 100%，平行检测3次。测得包封率≥94%，载药量2.06%～2.39%。

稳定性考察：将PTX/ThBC Nano-lipo冻干粉存储于4 ℃下，分别于第2、7、14、21、30 d取出一定量的纳米脂质体，加入纯水复溶后，利用上述超滤法，检测脂质体中PTX的包封率。经检测，其包封率均在89%以上，药物泄漏量少，提示在上述储存条件下，所制备的PTX/ThBC Nano-lipo稳定性良好。

实施例5

纳米脂质体的体外释放行为考察

PTX/ThBC Nano-lipo悬液经稀释后，取2 mL 加入截留分子量7 KD透析袋内，两端夹紧后置于40 mL，含30%乙醇的PBS溶液中，置于37℃恒温摇床中，以100 rpm的速度持续震摇。分别于0.5、1、2、4、8、12、24、36、48、60 h取出透析液1 mL备用，同时透析袋外回加1 mL含乙醇的PBS溶液。取出的透析液加入丙酮后，高速离心（13000 rpm，30 min），取上清液行HPLC检测PTX含量。同时检测透析前PTX/ThBC Nano-lipo中PTX的浓度。计算PTX的累积释放度，累积释放度的计算公式为：F = A₁ / A₀ × 100%。其中F为累积释放度；A₁为累积释放PTX的质量（μg）；A₀为加入透析袋中PTX的总质量（μg）。并以市售PTX注射液（以下称为PTX injection）及PTX Nano-lipo为对照，按照上述相同的方法，比较各组PTX的释放能力。实验重复3次。

实验结果采用均值±标准差(`x ± s)表示；显著性检验采用单因素方差分析和配对t检验。所有数据采用SPSS 18. 0统计软件包进行统计分析，p < 0.05 为有统计学差异（以下实验同）。

由图5可见，在起始的4 h内，三种制剂均呈现突释，PTX injection在含乙醇的PBS溶液中突释最明显，12 h内累积释放度达80%以上，不足24 h即释放完毕；而PTX Nano-lipo和PTX/ThBC Nano-lipo在突释后即呈现缓慢释放，12 h内累积释放度仅约50%；而且，两种纳米脂质体均可持续释放达到60 h。故将紫杉醇/增敏剂共载于纳米脂质体后，PTX的释放速率明显降低，缓释作用显著。

实施例6

纳米脂质体的胞内摄取实验

人***细胞HeLa接种于含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液中，培养瓶置于37 ℃，含5％CO₂的细胞培养箱中，每2～3天换液一次，传代和收集细胞。将对数生长期5 × 10⁶个细胞接种于6 cm培养皿，置培养箱24 h使细胞贴壁，皿中分别加入PTX injection稀释液，PTX Nano-lipo，或PTX/ThBC Nano-lipo悬液，按PTX含量计均为1 μg，37 ℃下孵育2 h，冰PBS液洗涤2次，0.25%的胰酶消化，收集细胞，加100 μL裂解液裂解细胞，加100 μL甲醇沉淀蛋白，离心（13000 rpm，10 min），取上清行HPLC检测。实验重复3次。

在另一个实验中，接种有HeLa细胞的6 cm培养皿中加入PTX/ThBC Nano-lipo悬液，PTX浓度分别为0.5 μg/mL，2 μg/mL，孵育2 h，冰PBS液洗涤2次，以充分洗去未进入细胞的染料和脂质体，得到细胞的PBS悬液（50 μL）。取10 μL滴加至载玻片上，加入抗荧光淬灭封片液，封片后，置于激光共聚焦显微镜下，观测细胞对纳米脂质体的摄取。Compd. ThBC的激发波长Ex = 387 nm，发射波长Em = 455 nm。

实验结果：HeLa细胞对3种PTX制剂（PTX injection，PTX Nano-lipo，PTX/ThBC Nano-lipo）中PTX的摄取量如表1所示。相同孵化时间内，细胞对紫杉醇纳米脂质体中PTX的摄取量明显高于PTX injection，其中对PTX/ThBC Nano-lipo的摄取量最多，纳米脂质体组与PTX injection之间的差异显著（p < 0.05）。由此，将PTX和ThBC共载于纳米脂质体后，细胞对PTX的摄取量显著增加。由激光共聚焦显微镜检测结果可知，随着纳米脂质体浓度的增加，细胞对其摄取量增加。图6为PTX浓度2 μg/mL时，HeLa细胞对PTX/ThBC Nano-lipo胞内摄取的激光共聚焦显微照片。而且，ThBC激发后发出明亮的蓝色荧光，随着ThBC浓度的增加，蓝色荧光增强，因此，化合物3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素可作为一种荧光探针，用于考察细胞对给药***，如纳米粒、脂质体的摄取。上述研究也说明：脂质体中载入化合物3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素，能有效增强HeLa细胞对PTX脂质体的摄取。

表1 HeLa细胞对紫杉醇三种制剂的摄取

Group	PTX injection	PTX Nano-lipo	PTX/ThBC Nano-lipo
				Cellular uptake (μg)	0.167 ± 0.022	0.291 ± 0.049 *	0.383 ± 0.062 *

^*  p < 0.05 vs PTX injection group.

实施例7

细胞增殖抑制实验

采用溴化四氮唑蓝(MTT) 法，评价PTX/ThBC Nano-lipo对HeLa细胞的增殖抑制活性。MTT是一种黄色的染料。在活细胞线粒体中, 琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT, 使其tetrazolium环开裂, 生成蓝紫色的结晶甲瓒, 并沉积在细胞中。在一定细胞数范围内, 甲瓒结晶的生成量仅与活细胞的数目成正比（由于死细胞中不含有琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有甲瓒生成）。二甲基亚砜(DMSO) 能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处检测其光吸收值，可间接反映活细胞数量。因而，采用MTT法可测定PTX injection，PTX/ThBC Nano-lipo，以及PTX/ThBC Nano-lipo抑制细胞增殖的能力。

实验方法：将对数生长期HeLa细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成所需浓度的细胞悬液，按每孔5000细胞(180 μL)加入到96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后每孔加入20 μL增敏剂ThBC（ThBC预先配制成DMSO溶液）或PTX三种制剂的溶液（PTX injection，PTX Nano-lipo，PTX/ThBC Nano-lipo）。加有PTX三种制剂的孔中PTX的终浓度分别为1，2，5，10，15 μg/mL；仅加有增敏剂的孔中ThBC的终浓度分别为1，5，10，15，20 μg/mL，每个浓度设3个平行孔。培养48 h（或72 h）后，每孔加入10 μL，5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，终止培养，弃去培养液。每孔加入100 μL的DMSO，置于摇床上低速振荡8 min，使结晶充分地溶解。酶联免疫检测仪检测波长为570 nm下各孔的OD值。同时设置调零孔（只加入培养基、MTT、DMSO）。根据所得的OD值，计算抑制率。抑制率计算公式：抑制率 = （对照组OD值－给药组OD值）/对照组OD值 × 100%。同时根据各浓度的生长抑制率，采用SPSS v18.0软件计算IC₅₀值。

检测结果：

各实验组体外肿瘤细胞增殖抑制活性结果如图7所示。各组的IC₅₀值如表2所示。由图7和表2可知，Compd. ThBC的毒性较低，仅在72 h后，才显示出较弱的细胞毒性。随着PTX浓度的增加，HeLa细胞的成活率下降，抑制率升高，抑制率呈浓度依耐性。在PTX同浓度时，较PTX injection，PTX/ThBC Nano-lipo对HeLa细胞表现出更好的增殖抑制活性，PTX Nano-lipo的增殖抑制活性最弱；如共孵化48 h，PTX浓度为25 μg/mL时，上述PTX的三种制剂（PTX injection，PTX Nano-lipo和PTX/ThBC Nano-lipo）的抑制率分别为 (73.95 ± 4.34)%，(63.71 ± 3.79)% 和(75.12 ± 3.74)%，它们的IC₅₀值分别为12.28 ± 1.37 μg/mL，15.30 ± 1.41 μg/mL和9.74 ± 0.49 μg/mL。

表2 增敏剂及紫杉醇三种制剂对HeLa细胞的IC₅₀值（n = 3）

实施例8 

诱导细胞凋亡实验

将HeLa细胞以2 × 10⁶ /mL的密度接种于直径6 cm的培养皿，每皿3 mL。待细胞贴壁后分别加入增敏剂ThBC或PTX三种制剂的溶液（PTX injection，PTX Nano-lipo，PTX/ThBC Nano-lipo）。PTX（或ThBC）的终浓度分别为5，10，15 μg/mL，同时设置空白对照。共孵化48 h后，离心收集悬浮细胞和贴壁细胞，并调整细胞浓度为5 × 10⁵/mL，加入Annexin V-FITC试剂，室温避光孵育20 min，再加入PI染液，室温避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。各组的检测结果如图8和表3所示。

由检测结果可知，共孵化48 h后，Compd. ThBC，PTX injection，PTX Nano-lipo及PTX/ThBC Nano-lipo均能够诱导HeLa细胞发生凋亡；而且随着PTX或ThBC浓度的增加，活细胞数目显著下降，凋亡率增加。在相同条件下（PTX浓度均为10 μg/mL），由于PTX被深深包裹于脂质体中，PTX释放缓慢，因此，PTX Nano-lipo组的凋亡率低于阳性对照组PTX injection；但是在ThBC的作用下，PTX的诱导凋亡作用得以加强，导致PTX/ThBC Nano-lipo组的凋亡率最高，达到(44.2 ± 1.9)%。上述PTX injection组和PTX/ThBC Nano-lipo组的凋亡率均与阴性对照组间有着显著性差异（p ＜ 0.05）。因此凋亡机制是PTX/ThBC Nano-lipo产生增殖抑制活性的原因之一，其中化合物3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素不仅自身可诱导凋亡，还对PTX起着关键性的增敏作用，促进PTX诱导HeLa细胞发生凋亡。

表3 共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体诱导HeLa细胞发生凋亡（n = 3）

^* p < 0.05, compared with Control.

实施例9

阻滞细胞周期实验

将HeLa细胞接种于6 cm的培养皿，细胞密度、药物的浓度及共孵化时间同于上述诱导细胞凋亡实验。细胞消化后，用PBS洗涤2次，制成细胞悬液，加入-20℃预冷的70%乙醇溶液，-20 ℃下固定过夜。离心弃去固定液，用PBS洗涤2次，加入RNase A，室温避光染色30 min，再加入PI染液，流式细胞仪进行检测，每个样品进样1 ×10⁴个细胞。采用ModFit软件分析细胞周期分布。实验重复3次。实验的检测结果如图9和表4所示。

流式细胞术检测结果显示，当PTX浓度大于5 μg/mL时，即表现出明显的细胞周期阻滞作用；并且，随着PTX浓度增加，阻滞作用增强，呈浓度依赖性。ThBC阻滞周期的能力甚弱，即使在浓度达到15 μg/mL时，也只有很微弱的G₂/M期阻滞作用。但是，当其与PTX共载于纳米脂质体后， PTX的细胞周期阻滞能力显著增强。同阴性对照组相比，载PTX的脂质体同HeLa细胞共孵化48 h后，G₀/G₁期细胞比率下降，同时G₂/M期的比率升高：G₀/G₁期比率由(57.91 ± 3.49) %分别下降至(7.19 ± 0.44)%（PTX Nano-lipo组）和 (3.02 ± 0.37) %（PTX/ThBC Nano-lipo组）；相应地，G₂/M期比率则由(13.48 ± 1.36) %分别升高到(32.34 ± 1.98)%（PTX Nano-lipo组）和(68.34 ± 3.71) %（PTX/ThBC Nano-lipo组），PTX的三种制剂组同阴性对照组间有显著性差异 ( p ＜ 0.05)。因此，PTX injection，PTX Nano-lipo及PTX/ThBC Nano-lipo均可阻滞HeLa细胞周期于G₂/M期；而且，PTX浓度相同时，由于Compd. ThBC的增敏作用，PTX/ThBC Nano-lipo表现出最强的细胞周期阻滞能力。

表4 共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体对HeLa细胞周期的影响（n = 3）

^* p < 0.05, compared with Control.

实施例10

对胞内活性氧水平的影响

参照文献（Azad GK, Singh V, Mandal P, et al. Ebselen induces reactive oxygen species (ROS)-mediated cytotoxicity in Saccharomyces cerevisiae with inhibition of glutamate dehydrogenase being a target. FEBS Open Bio, 2014, 4: 77-89.）报道的方法, 利用荧光探针DCF-DA测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。DCF-DA进入细胞后, 经酯酶作用脱去二酯生成2′, 7′-二氯氢化荧光素(DCFH) , DCFH被超氧阴离子和过氧化氢等氧化, 生成发荧光的2′, 7′-二氯荧光素(DCF) , 通过DCF水平的变化即可反映ROS水平的变化。将HeLa细胞接种于培养皿。细胞密度、加入药物的浓度及共孵化时间同于上述的诱导细胞凋亡实验。细胞消化后，用PBS洗涤2次，加入10 μmol·L^-1 DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min。其后用PBS洗涤细胞2遍以充分去除残留的DCFH-DA试液，流式细胞仪检测荧光强度，激发波长Ex =488 nm，发射波长Em =525 nm。实验重复3次。检测结果如图10和表5所示。

表5 共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体对HeLa胞内活性氧水平的影响（n = 3）

Group	Concentration（μg/mL）	p1 (%, `x ± s）	p2 (%, `x ± s）
				Control	0	97.1 ± 3.7	2.80 ± 0.34
Compd. ThBC	10	73.1 ± 4.7	26.9 ± 1.6 *
				PTX injection	10	84.9 ± 3.1	15.0 ± 1.7 *
PTX Nano-lipo	10	76.4 ± 3.7	23.6 ± 2.1 *
				PTX/ThBC Nano-lipo	5	71.8 ± 4.1	28.1 ± 2.9 *
PTX/ThBC Nano-lipo	10	59.2 ± 2.3	40.7 ± 3.4 *
				PTX/ThBC Nano-lipo	15	31.7 ± 2.0	68.0 ± 4.0 *

^* p < 0.05, compared with Control.

从流式细胞仪检测结果可见, 细胞内DCF荧光强度呈浓度-效应关系，随着浓度的增加，p1区的比率下降，而p2区的比率上升。与阳性对照PTX injection相同，Compd. ThBC，PTX Nano-lipo和PTX/ThBC Nano-lipo均可诱导细胞内ROS的产生，升高胞内ROS的水平，而且，在相同浓度下（10 μg/mL），Compd. ThBC产生氧自由基的能力胜过PTX injection和PTX Nano-lipo，这说明Compd. ThBC能强烈地刺激细胞，产生氧自由基，破坏胞内氧自由基的生成与清除之间的动态平衡；而且，由于Compd. ThBC与PTX协同性地诱导氧自由基的产生，使得PTX/ThBC Nano-lipo组胞内氧自由基水平最高。因此，诱导氧自由基产生，促使胞内氧自由基水平显著升高是Compd. ThBC增敏PTX的又一途径。上述药理学检测结果表明，促凋亡及显著升高胞内氧自由基水平是化合物3-(2-噻吩基)苯并[5, 6]香豆素发挥增敏作用的两条重要途径。本发明为PTX/ThBC Nano-lipo用于***等恶性肿瘤的治疗提供了有力的实验依据。本发明所制备得到的PTX/ThBC Nano-lipo具有良好的工业应用前景。

Claims (10)

1.共载紫杉醇和增敏剂的纳米脂质体，其特征是以下述配比的原料制成：紫杉醇：10 mg；注射用大豆卵磷脂：n_{大豆卵磷脂}: n_紫杉醇 = 33～70 : 1；胆固醇：n_胆固醇 : n_{大豆卵磷脂} = 0.05～0.15 : 1；增敏剂n_增敏剂 : n_紫杉醇 =1～3 : 1；冻干保护剂：用量为注射用大豆卵磷脂及胆固醇总质量的5%～10%；磷酸盐缓冲液：pH7.2～7.4，用量为40～80 mL；

其中n为摩尔数。

2.根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于：增敏剂为ThBC，其化学结构如式（I）所示：

（I）。

3.根据权利要求1所述的纳米脂质体，其特征在于：所述的冻干保护剂可为蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇和/或海藻糖。

4.权利要求1所述的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的制备方法包括：

将注射用大豆卵磷脂、胆固醇、紫杉醇及增敏剂用有机溶剂溶解，并混匀；

55 ℃下水浴蒸发成膜，除去溶剂，真空干燥；

加入磷酸盐缓冲液及冻干保护剂，搅拌，充分溶胀至薄膜脱落，得到黄色混悬液；然后冰水浴下分散，得到黄色略带荧光的悬液，再经0.22 μm滤器过滤除菌整粒，即得纳米脂质体悬液；分装至西林瓶，冷冻干燥，得到共载紫杉醇/增敏剂纳米脂质体。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：还包括一种增敏剂ThBC的合成，其步骤包括如下：

向反应器中依次加入噻吩-2-乙酸，乙酸酐和2-羟基-1-萘甲醛，室温下搅拌, 使固体溶解后，加入三乙胺，氮气保护下加热回流，反应结束后冷却至室温，加入冰水，搅拌，析出固体，抽滤，滤饼用冰水洗涤至中性，再加入CH₂Cl₂，过滤，去除不溶物，浓缩，硅胶柱层析分离，得黄色固体，即目标产物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：硅胶柱层析分离采用V _乙酸乙酯：V _石油醚 = 1: 4的乙酸乙酯-石油醚混合流动相。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：注射用大豆卵磷脂及胆固醇一起用5～8 mL的***或三氯甲烷溶解；紫杉醇用1～4 mL乙醇或三氯甲烷溶解；增敏剂用1～4 mL二氯甲烷或三氯甲烷溶解。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：分散的方法为超声波细胞破碎仪间歇超声法或高压乳匀法。

9.权利要求1所述的共载紫杉醇和增敏剂纳米脂质体的在制备抗肿瘤药物方面的应用，其中所述肿瘤包括***、乳腺癌、卵巢癌。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：药物剂型为静脉注射剂。