CN108348548A - 抗衰老药物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供通过注射入皮肤应用的药物制剂，其中所述药物制剂可以通过包括下述步骤的制备方法配制：提供从有机体收集的液体，该液体包含血液的细胞组分，提供容器或容纳装置，所述容器或容纳装置具有内表面，和将所述液体与所述容器或容纳装置接触，其中(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述液体的细胞组分，(b)所述液体包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述液体的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或(c)所述制备方法还包括避免温育所述液体的步骤，和除去与所述容器或容纳装置接触的所述液体的细胞组分的步骤。
Description
本发明涉及衰老领域，尤其是涉及药物制剂，用于治疗衰老和/或年龄相关性障碍或用作抗衰老药。
治理人类群体的衰老和衰老相关的障碍是全球性挑战。许多工业化国家具有越来越多的衰老人群，并且发展中国家的老年人群比例将陡峭上升。在生物学水平，衰老可以定义为有机体及其个体细胞、组织和器官随时间的进行性劣化。所述劣化可以导致某些年龄相关性障碍。据估计，于2050年全世界60岁及其以上的人群数将大约是目前(约11％)的两倍。
已提出衰老和有关虚弱的数种理论。一种理论关注损伤的进行性蓄积。在高龄的寿命和健康显得受到下述因素的影响：在对生物分子(尤其是DNA)造成的损伤与维持和修复***之间的平衡等。因此衰老被认为相关于DNA损伤，并且某些衰老相关性障碍可能是由于过多的DNA损伤或受损的DNA修复。因此，已开发出衰老的相应动物模型，和广泛应用的模型包括与野生型小鼠相比具有核苷酸切除修复(NER)缺陷和显示过早衰老表型的小鼠。据信在所述小鼠中的变化和所伴随的障碍反映小鼠、以及其它有机体比如人类中的正常衰老。对细胞和细胞组分的氧化损伤也已牵涉于衰老和某些障碍中，并且缺少足够的修复，比如损伤的抗氧化物酶表达或活性。细胞衰老也已关联于端粒缩短，其可以充当分子时钟和从而可能是与衰老关联的某些障碍的原因。在细胞变得不能保持足够的细胞***速度的情况下，缺少组织更新可能促进年龄相关性障碍。过度的细胞死亡比如细胞凋亡还可以促进老化、衰老和有关的障碍。又一衰老理论关注过度的(即使细微的)炎症，其在高龄发挥有害效果。免疫***也会衰老，一个特征是与降低的接种敏感性有关的"免疫衰老"。
尽管原先衰老已被视为不可避免的自然过程，最近在科学人群中该观点有所变化。根据最近的概念，可以将衰老描述为疾病。还常常强调的是，衰老是许多疾病最常见的危险因素。因而，治疗(包括预防)衰老或其原因之一是治疗性的。这不仅是因为现今可以将衰老本身定为一种疾病，还是因为治疗疾病的风险因素本身就是治疗目的。
Niccoli和Partridge(2012)指出年龄是主要致衰弱的和威胁生命的病症包括癌症、心血管疾病和神经变性的主要风险因素(Current Biology22,R741)，并且"目前的疗法靶向分开的单独疾病；而靶向衰老过程本身的疗法则旨在同时覆盖许多疾病"。Kelland在2010年的文章(http://www.reuters.com/article/us-ageing-disease-idUSTRE64I6HV20100520)则引用了专家看法认为，衰老是全部年龄相关性疾病共同的最大风险因素并且未能研究"其全部的共同机制"而是仅研究特定疾病是一种失败。
Kelland(2010)还报告称衰老专家认为对衰老的认识需要更新，也即将其视为能够操纵、治疗和延缓的病症。确实，例如Bulterijs等人的文章(2015)名为"It is time toclassify biological aging as a disease"(Frontiers in Genetics,6,205)。作者认为，衰老是由疾病引起的，所述疾病受随后在生命中带来有害效果的对等位基因的选择影响，从而衰老是进化忽视而非有意的结果，而如果衰老并非有意图，则其是自然过程的概念可能有误。作者作出的结论是衰老应视为疾病，尽管作为疾病其是一般和多***的过程。Insilico Medicine的首席执行官Dr.Zhavoronkov相信，衰老应视为疾病并且认为将衰老描述为疾病会激励疗法的开发。在此情况文中有必要指出，在2014年已建立"Palo AltoLongevity Prize"，其宣称的目标正是"破解生命代码并且治愈衰老"。根据该奖的顾问之一Prof.Kim，衰老仅仅是能够找到解决方式的医学问题。衰老可治愈概念的一位重要提议者是老年病学家和作家Dr.de Grey，SENS研究基金的CSO，其观点是科学家目前过于关注与衰老有关的疾病而非衰老本身。Musa在The Scientist期刊2016年11月1日的文章包括的陈述是，衰老"仅仅是又一种疾病"，不应再视为不可避免并且应按照慢性病症进行治疗。
紫外(UV)辐射尤其存在于日光当中。其具有在可见光之下的波长。生物学上，UV-A波段(ISO-21348定义为315至400nm)即UV光谱的最长波部分，和邻近的UV-B波段(280至315nm)是最为重要的，而具有更短波长(UV-C)的UV辐射实际上被臭氧层和地球大气吸收。UV辐射能够触发化学反应。虽然其对人体具有某些有益作用但也是危险的，原因是其导致损伤、尤其是皮肤和眼睛的损伤。UV辐射(全部波段)已知损伤胶原和弹性蛋白纤维，其带来皮肤老化(光老化)，其征兆可以包括松弛的皮肤、干燥和/或起皱。
在DNA中，UV-B辐射导致嘧啶二聚体(尤其是胸腺嘧啶二聚体)的形成，该过程也称为直接DNA损伤。所形成的损伤改变DNA结构并且可以通过称为核苷酸切除修复的机理修复。如果未修复，则损伤致遗传改变。UV辐射也导致反应性氧类/自由基的产生，其带来氧化损伤，该过程称为间接DNA损伤。直接和间接DNA损伤均促进癌的形成。因此可理解的是，宽-光谱UV辐射被世界卫生组织识别为致癌物。
免疫***的特征之一是在T细胞与巨噬细胞之间的互相作用。在这方面，免疫过程的两种主要类型一般是不同的1类和2类。在1类过程中，牵涉1类T辅助细胞(Th1细胞)和1类巨噬细胞(M1)，并且这些过程在细胞免疫应答中发挥主要作用和在炎性过程的病理生理学中发挥主要作用。2类过程牵涉2类T辅助细胞(Th2细胞)和2类巨噬细胞(M2)，并且在抗炎性和/或再生过程比如伤口愈合和组织修复中发挥作用，并且在体液免疫应答中发挥作用。与1类过程有关的典型细胞因子是IFN-γ和IL-2。1类免疫应答最大化细胞杀灭能力。在存在(慢性)1类免疫过程优势的情况下，例如在涉及自身抗原I型糖尿病的情况下，可以发生有机体损伤，并且更一般地，衰老可以由于过度和/或慢性炎症而加速。1类免疫过程优势可以例如是1类对2类免疫过程的优势。免疫过程的这种失衡可能通过促进其它免疫过程(例如2类)或抑制1类免疫过程来对抗，这促进炎症的消除。
在神经变性中，比如阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化中，巨噬细胞(比如小神经胶质)的作用已有描述。
将平衡从1类免疫应答移动至2类免疫应答在神经***或皮肤障碍中可能是特别有意义的。
细胞衰老是这样的现象，其导致单独细胞无法持续***，使其在数次***之后停滞。为了检测细胞衰老，一般使用细胞染色测试，其检测衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(参见例如Dimri et al.(1995)PNAS 92，9363至9367)。展示衰老表型的细胞可以干扰整个有机体的重要功能和从而导致某些障碍。整个有机体的衰老伴随着某些障碍(比如疾病、并发症和条件)增加的风险。已发现，某些障碍的发生率随年龄以大于线性的方式例如指数地增加。如上文所提及，衰老是许多主要疾病的主要风险因素。
与年龄相关的一般特定障碍是动脉粥样硬化，心血管疾病，癌症，听力缺失，视觉缺失，白内障，视网膜变性例如黄斑变性，骨质疏松症，II型糖尿病，高血压，肝衰竭，恶病质，脊柱后凸，步态障碍，颤抖，共济失调，张力失常，降低的握力，肌萎缩和头发斑白。年龄也促进神经变性和相似障碍，比如轻微认知减退，阿尔茨海默病，脑血管病，帕金森病和肌萎缩性侧索硬化。
广泛希望的是延长寿命和/或健康期，也即人在此期间一般健康和未患严重疾病的生命时间段。虽然数种化合物或组合物已被建议用于该意图或用于治疗现有技术中的上述障碍，它们的效力和/或耐受性并不总是清楚的。从而需要备择的治疗。
本发明的问题是提供新的抗衰老手段，或用于治疗、预防、抑制或缓和衰老或上述障碍中的一种或多种的手段，或用于干扰衰老或所述障碍的生物学诱因中的一种或多种的手段。优选地，所述抗衰老涉及皮肤，所述衰老是皮肤衰老或上述障碍是皮肤障碍，比如能够通过抽吸弹性测量(例如用)评价的障碍。有利地，上述手段快速且便利地产生并且是成本有效的。也有利地，上述手段应具有良好的身体相容性。
上述描述和本文举例说明的实施方式的任意描述并不构成对某些实施方式或特征的任何放弃。
该问题解决如下：通过注射入皮肤应用的药物制剂，其中药物制剂可以通过包括下述步骤的制备方法配制：提供从有机体收集的液体，该液体包含血液的细胞组分，提供容器或容纳装置，所述容器或容纳装置具有内表面，和将所述液体与所述容器或容纳装置接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述液体的细胞组分，
(b)所述液体包含外来体(exosome)，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述液体的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述液体的步骤，和除去与所述容器或容纳装置接触的所述液体的细胞组分的步骤。
所述制备方法具有三种备择方式(a)、(b)和(c)并且在下文称为"本说明书的调整的制备方法"。
本发明还可以描述为通过将药物制剂注射入皮肤治疗需要所述治疗的患者的方法，其中所述药物制剂可以通过包括下述步骤的制备方法配制：提供从有机体收集的液体，该液体包含血液的细胞组分，提供容器或容纳装置，所述容器或容纳装置具有内表面，和将所述液体与所述容器或容纳装置接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述液体的细胞组分，
(b)所述液体包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述液体的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述液体的步骤，和除去与所述容器或容纳装置接触的所述液体的细胞组分的步骤。
额外地，本发明还可以描述为制备通过注射入皮肤应用的药物制剂的方法，其中所述方法包括下述步骤：提供从有机体收集的液体，该液体包含血液的细胞组分，提供容器或容纳装置，所述容器或容纳装置具有内表面，和将所述液体与所述容器或容纳装置接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述液体的细胞组分，
(b)所述液体包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述液体的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述液体的步骤，和除去与所述容器或容纳装置接触的所述液体的细胞组分的步骤。
下述描述的适用不受本发明描述为通过注射入皮肤应用的药物制剂、治疗患者的方法或制备通过注射入皮肤应用的药物制剂的方法所限。
在下文在，"本说明书的制备方法"是指包括下述步骤的制备方法：提供从有机体收集的血液样品和容器或容纳器(container)，将所述血液样品与所述容器或容纳器接触，和在所述容器或容纳器中温育所述血液样品，其中所述血液样品是(1)全血样品或(2)红细胞已耗尽的全血样品。
"衰老"优选是指有机体中的变化随时间的蓄积，特别优选的是物理变化和生物学衰老。
术语"抗衰老"优选是指延缓，阻滞，减少，停止和/或逆转衰老效果(特别皮肤上的衰老效果)。该术语还可以是指延缓，阻滞，减少，停止和/或逆转生物学衰老(特别是皮肤的衰老)。
"注射"包括任何给予，其使用一种或多种尖锐物体(比如针)来使得药物制剂跨越皮肤表面。优选，皮肤表面被中空的针穿透，药物制剂通过该针给予。
"血液的细胞组分"意指是全血的任何细胞组分，无论大量或少量存在。
优选，"液体"是血液样品。在甚至更优选的实施方式中，液体是血液样品，其是(1)全血样品或(2)其中细胞已耗尽的全血样品。在该上下文中，已耗尽的细胞优选选自红细胞，白细胞(尤其是中性白细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞，B细胞，T细胞，NK细胞和/或单核细胞)和血小板。更优选已耗尽的细胞是红细胞。
"容纳装置"是指一种或多种容纳装置。容器或容纳装置可以相同或不同于其中已收集所述液体的那个/那些。"容器或容纳装置"的优选含义是"容纳器(container)"。
容器或容纳装置的"内表面"是指容器或容纳装置本身的内表面。尤其是，不考虑可能包含于容器或容纳装置中的任何宏观颗粒、微观颗粒或纳米粒子的表面。
"温育"或"温育的"优选是指(i)温育，其持续时间至少2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、7分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时或6小时，和/或(ii)温育，其后某些参数，相对该参数在温育之前的值和/或正常值(比如细胞因子的浓度、细胞因子拮抗剂尤其是IL-1Ra的浓度，外来体的浓度和/或生长因子的浓度)，已发生可测量的变化。
在本发明实施方式描述为"含有"或"包含"某些主题例如方法步骤、组分或其它特征的情况下，应理解该优选实施方式由所述主题组成，除非上下文另有指明。
应理解"治疗"也包括预防。
根据优选实施方式，本发明因此提供通过注射入皮肤应用的药物制剂，其中所述药物制剂可以通过包括下述步骤的制备方法配制：提供从有机体收集的血液样品，其血液样品是(1)全血样品或(2)红细胞已耗尽的全血样品，提供容器或容纳器，所述容器或容纳器具有内表面，和将所述血液样品与所述容器或容纳器接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳器中温育所述血液样品一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述血液样品的细胞组分，
(b)所述血液样品包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述血液样品的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述血液样品的步骤，和除去与所述容器或容纳器接触的所述血液样品的细胞组分的步骤。
该实施方式还可以描述为通过将药物制剂注射入皮肤来治疗需要所述治疗的患者的方法，其中所述药物制剂可以通过包括下述步骤的制备方法配制：提供从有机体收集的血液样品，其血液样品是(1)全血样品或(2)红细胞已耗尽的全血样品，提供容器或容纳器，所述容器或容纳器具有内表面，和将所述血液样品与所述容器或容纳器接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳器中温育所述血液样品一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述血液样品的细胞组分，
(b)所述血液样品包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述血液样品的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述血液样品的步骤，和除去与所述容器或容纳器接触的所述血液样品的细胞组分的步骤。
额外地，该实施方式还可以描述为制备通过注射入皮肤应用的药物制剂的方法，其中所述方法包括下述步骤：提供从有机体收集的血液样品，其血液样品是(1)全血样品或(2)红细胞已耗尽的全血样品，提供容器或容纳器，所述容器或容纳器具有内表面，和将所述血液样品与所述容器或容纳器接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳器中温育所述血液样品一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述血液样品的细胞组分，
(b)所述血液样品包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述血液样品的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述血液样品的步骤，和除去与所述容器或容纳器接触的所述血液样品的细胞组分的步骤。
本发明也提供药物制剂，其如上文描述(1)用于治疗衰老或(2)用作抗衰老药。
还提供药物制剂，其如上文描述用于治疗：
(a)由下述引起的障碍：氧化损伤，DNA损伤，受损的DNA修复，受损的细胞***，过度的炎症，免疫过程的致病性分化，或过度的细胞死亡，或
(b)通过转基因小鼠的障碍模拟的障碍，所述小鼠在编码核苷酸切除修复途径的蛋白质的基因中具有至少一个突变，与缺少所述突变的小鼠相比所述突变导致过早衰老表型，或
(c)年龄相关性障碍或发生率随年龄增加超过线性方式的障碍，或
(d)对皮肤力学参数具有效果的障碍或由胶原损伤和/或弹性蛋白损伤、衰老、端粒缩短、损伤的抗氧化物酶表达或损伤的抗氧化物酶活性引起的障碍
(其优选用于治疗衰老或用作抗衰老药)。
本发明还提供药物制剂，其如上文所述用于治疗选自下述的障碍：硬化萎缩苔癣(LSA)，Ehlers-Danklos综合征，光化性弹力纤维病，结节性弹力组织变性和匐行穿通性弹力纤维病。在这些障碍中，皮肤和/或***的弹性受到损伤。
"障碍"如本文所用是指正常功能或外观的紊乱并且包括疾病，并发症和病况。
通过注射入皮肤应用或在上述治疗中的应用在下文中有时称为"根据本发明的用途"。相应地，通过注射入皮肤应用的药物制剂或在上述治疗中的用途有时称为"根据本发明的用途的药物制剂"
有关上述项(a)，优选所述氧化损伤是反应性氧类引起的损伤。所述由DNA损伤引起的障碍优选是由UV依赖性DNA损伤引起的障碍。优选地，所述由UV依赖性DNA损伤引起的障碍选自由嘧啶二聚体、基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤引起的障碍。优选的是，所述由受损的DNA修复引起的障碍是由缺乏核苷酸切除修复引起的障碍。优选地，所述由受损的细胞***引起的障碍是与损伤的髓核细胞***有关的(更优选通过其导致的和/或模拟的)障碍。在又一优选的实施方式中，所述由过度的炎症引起的障碍是非整形外科的障碍，不牵涉神经***的障碍和/或不牵涉眼的障碍。优选的是，所述由过度的炎症引起的障碍不同于下述障碍中的一种、多于一种或全部：风湿病，关节炎，类风湿性关节炎，幼年型类风湿关节炎，牛皮癣性关节炎，Bechterew关节炎，骨关节炎，背部症状，神经整形外科的障碍，关节障碍，椎间盘病，脊椎障碍，神经根障碍，肌腱障碍，软骨损失，神经性皮炎和脱发。优选地，所述免疫过程的致病性分化是1类免疫过程优势。优选地，所述1类免疫过程是Th1和/或M1过程，更优选它们是Th1和M1过程。"1类免疫过程优势"包括的含义是"1类相对2类免疫过程有优势"，其中所述2类免疫过程优选是Th2和/或M2过程和更优选Th2和M2过程。"1类免疫过程优势"也包括的含义是"过度的1类免疫过程"和"损伤的其它免疫过程"，例如"损伤的2类免疫过程"(其优选实施方式如上文所述)。所述细胞死亡优选是细胞凋亡。
有关上述项(b)，在所述转基因小鼠中的所述突变优选是在Ercc1基因中。更优选，其是Ercc1-/-或Ercc1-/Δ。
有关上述项(c)，优选所述发生率随年龄指数增加。
有关上述项(d)，优选所述由胶原损伤和/或弹性蛋白损伤引起的障碍选自松弛的皮肤、干燥和起皱。由胶原损伤和/或弹性蛋白损伤引起的障碍还可以一般地描述为皮肤老化。
目前发现，在注射入皮肤的情况下，根据本说明书的调整的制备方法制备的制剂能够令人惊讶地改善皮肤参数，所述参数能够通过抽吸弹性测量用评价，尤其是弹性。
通过(比如Dual MPA580)测量的参数如下：
R-参数
R0：代表皮肤受力的被动行为(坚固性)，参见最大幅度。
R1：皮肤返回其最初状态的能力。
R2：总弹性，该值越高则皮肤越弹性。
R3：在重复抽吸之后末次抽吸曲线的最大幅度。皮肤的"致疲劳效果"(疲劳)是可视的，其是随每次新抽吸增加的幅度。
R4：与首次曲线相比的末次最小幅度。皮肤的"致疲劳效果"是可视的，其是随每次新抽吸减少的再变形能力。
R5：净弹性，该值越高皮肤越弹性。
R6：曲线弹性部分上的粘弹性部分。该值越小，则弹性蛋白纤维的膨胀性越高。
R7：与完整曲线相比的弹性部分，该值越高，皮肤越弹性。
R8：皮肤恢复，该值越接近R0，则皮肤返回其最初状态的能力越强。
R9：代表在重复抽吸和释放皮肤之后皮肤的致疲劳效果。R9越小，则致疲劳效果越小。
F-参数
F0，F1：这些面积从总面积扣除。完全弹性物质将不显示任何面积，该值越接近0，则物质越弹性。
F2：上包络曲线以上的面积，显示在重复抽吸之后的致疲劳效果。
F3：包络曲线内的面积，代表皮肤疲劳。
F4：上包络曲线以下的面积。F4越小，则皮肤越耐抽吸(皮肤坚固性)。
Q-参数
Q0：最大恢复面积，将随增加的皮肤坚固性减小。
Q1：弹性恢复，将随增加的皮肤弹性增加。
Q2：粘性恢复
Q3：粘弹性恢复(总弹性)，将随增加的皮肤弹性增加。
在本文中，R0视为是最重要的参数(该值越低，则弹性越高)。R5视为是第二重要的参数。
此外已令人惊讶地发现，根据本说明书的制备方法制备的制剂，除了皮肤参数改善之外，还具有与(生物学)衰老过程的各个方面有关的许多其它效果。由于全部这些效果涉及延缓、阻滞、减少、停止和/或逆转在有机体中随时间蓄积的变化，能够得出的结论是上述制剂影响衰老本身并因此有效地治疗衰老或用作抗衰老药。更特别地，上述制剂抵消UV辐射对细胞的有害效果，与在更年轻的患者中相比在更老的患者中具有更强的抗炎性效果，与在更年轻的患者中相比在更老的患者中含有甚至更有利的抗炎性组分:炎性组分比率，诱导免疫***功能从炎性转化为再生和抗炎性，刺激抗凋亡途径和增加细胞***，其充当本发明的基础。根据本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法制备的制剂从而是药物制剂，并且其可以用作用于治疗、预防、抑制或缓和衰老或者干扰其生物学诱因的新手段。
根据本发明的用途的药物制剂可以通过包括下述的制备方法配制：提供从有机体收集的液体，该液体包含血液的细胞组分，提供容器或容纳装置，所述容器或容纳装置具有内表面，和将所述液体与所述容器或容纳装置接触，其中(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述液体的细胞组分，(b)所述液体包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选地在所述浓缩之后除去所述液体的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或(c)所述制备方法还包括避免温育所述液体的步骤，和除去与所述容器或容纳装置接触的所述液体的细胞组分的步骤。优选地，所述制备方法包括：提供从有机体收集的血液样品，提供容器或容纳器，所述容器或容纳器具有内表面，和将所述血液样品与所述容器或容纳器接触，其中(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳器中温育所述血液样品一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述血液样品的细胞组分，(b)所述血液样品包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选地在所述浓缩之后除去所述血液样品的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或(c)所述制备方法还包括避免温育所述血液样品的步骤，和除去与所述容器或容纳器接触的所述血液样品的细胞组分的步骤。在进行这些方法步骤之后获得药物制剂，并且其效力来自于进行这些方法步骤。根据其备择(a)，方法获得经调理的血液样品。效力尤其是有利的，条件是在所述温育时间与所述内表面之间的关系符合下述公式：t＝f*A，其中t指定温育时间，A指定内表面而f小于或等于0.5小时/cm2。然而效力并不取决于温育，如下文进一步解释。因此，根据备择(b)可以进行或避免温育，并且根据备择(c)避免温育。
例如，在温育步骤期间，在液体(优选血液样品)中诱导有效组分，原因尤其是其中细胞的活性。因此优选所述液体是血液样品，其是全血样品。然而，血液样品还可以是全血的级分。例如红细胞，作为缺少细胞核和从而缺少基因表达能力的细胞，可以不存在于血液样品。因此所述血液样品另选来自已耗尽红细胞的全血样品(优选完全或基本上完全耗尽，但另选预期仅一部分红细胞已耗尽)，例如血沉棕黄层或PRP(富血小板的血浆)。不必要的且不优选的是，添加任何外部刺激物或活化剂。在提供步骤之前，本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法优选额外地包括从所述有机体收集所述液体(优选血液样品，更优选全血样品)的步骤。
所述有机体可以或可以不罹患任何上述障碍，而该有机体中的细胞可以或可以不展示上述表型。
根据本说明书的制备方法制备的药物制剂已被发现抵消UV辐射对细胞的有害效果。用UV-A和UV-B辐射的组合辐射的细胞中的细胞计数已被发现在根据本说明书的制备方法制备的药物制剂存在下与其不存在相比更高。该效果的大小取决于温育步骤。因此液体(优选血液样品，更优选全血样品)的温育导致组分的形成，所述组分有效促进UV-辐射的细胞的生存和/或增殖，这涉及衰老的一个方面。
在这方面，根据本说明书的制备方法制备的药物制剂的效果，亦即援救由UV引起的DNA损伤，与有功能的核苷酸切除修复***的效果相同。因此，不受理论所限的结论可以是根据本发明的用途的药物制剂刺激核苷酸切除修复。更一般地，可以得出的结论是根据本发明的用途的药物制剂对由下述引起的障碍具有效果：受损的DNA修复或DNA损伤的蓄积，这涉及衰老的又一方面。
相应地，可以假定的是根据本发明的用途的药物制剂用于治疗由不足的核苷酸切除修复引起的障碍。存在核苷酸切除修复缺乏的数种模型，例如Ercc1-/-小鼠。该模型显示过早衰老表型并且被视为反映在小鼠中和在其它有机体比如人类中的正常衰老。其显示在表皮病况，脊柱后凸，步态，颤抖，共济失调，张力失常和握力中年龄相关的病理学状况。脊柱后凸还牵涉骨质疏松症。共济失调，张力失常和颤抖是神经变性疾病并且对神经变性和有关的障碍比如阿尔茨海默病，轻微认知减退，脑血管病，帕金森病和肌萎缩性侧索硬化具有影响。步态和握力对肌萎缩具有影响。此外，神经变性和有关的障碍通常与神经炎症有关联。能够得出的结论是，根据本发明的用途的药物制剂的抗炎性作用也用于治疗神经炎症、神经变性和有关的障碍，该效果涉及衰老的又一方面。
此外，根据本说明书的制备方法制备的药物制剂刺激NF-κB途径，其已知具有抗凋亡效果、尤其是通过诱导许多基因的表达，其产物能够抑制细胞凋亡(参见例如Karin&Lin(2002)Nat Immunol 3,221)。因此，可以得出的结论是，其能够用于治疗由过度的细胞死亡引起的障碍，其涉及衰老的额外方面。
根据本说明书的制备方法制备的药物制剂也已被发现增加细胞***。相应地，可以得出的结论是其对由受损的细胞***引起的障碍具有效果。由于衰老和衰老可以由受损的细胞***引起，该发现可以有助于解释药物制剂在衰老或年龄相关性障碍中或作为抗衰老药的普遍效果。例如，在年龄相关性椎间盘退行性变中总的来说，椎间盘细胞的退化是有关的。增加的椎间盘细胞(髓核)***可以再生椎间盘并且可以有助于预防椎间盘障碍比如滑脱的椎间盘，其中缺少足够的细胞***且更新可以发挥作用。
根据本发明的用途的药物制剂可以提供例如简单、有效和/或快速的制备。通过在制备中进行一系列的简单步骤和不需要特殊或复杂的设备和物质，以最少的步骤和在数小时内获得即用的药物制剂，而不需要在制备期间向身体添加任何外来物质或者必须在制备中随后再次分离的其它物质。以该方式，通过排它地使用身体自身的物质，制得特别身体相容的试剂。
有关本说明书的调整的制备方法的备择(a)，优选的是在所述温育时间与所述内表面之间的关系符合下述公式：t＝f*A，其中t指定温育时间，A指定内表面而f小于或等于0.5小时/cm2。优选地，f小于或等于0.45小时/cm2，小于或等于0.4小时/cm2，小于或等于0.35小时/cm2，小于或等于0.3小时/cm2，小于或等于0.25小时/cm2，小于或等于0.24小时/cm2，小于或等于0.23小时/cm2，和尤其是小于或等于0.22小时/cm2。这可用于确保药物制剂不具有不希望的炎性潜力。特别优选地，f值的范围是0.04至0.25小时/cm2，0.05至0.24小时/cm2，0.06至0.23小时/cm2和尤其是0.07至0.22小时/cm2，而在某些情况下还可以使用的范围是0.1至0.22小时/cm2，0.12至0.22小时/cm2或0.14至0.22小时/cm2。
已知的是，全血和经调理的全血含有外来体。外来体是从细胞分泌入其环境的小囊泡。外来体例如包含于生物液体中，比如血清，尿，唾液，腹膜液，脑脊髓液和滑膜液。绝大多数类型的细胞据观察能够分泌外来体。分泌经过释放通过细胞质膜/从细胞质膜释放而发生。取决于它们在其中产生的细胞类型，外来体尤其含有可变的蛋白质组合。在下文中，术语"外来体"优选额外地包含其它细胞外囊泡(EV)。
如上文所述，调理导致外来体和其它应用物质的额外形成。然而，并不总是必需调理液体(优选血液样品)。由于发明人已令人惊讶地发现外来体展示许多有关效果(比如培养物中的细胞增殖，全身CRP水平的降低)，外来体可以在调理之后浓缩或分离，但另选的是血液中存在的外来体可以浓缩或分离而无需调理，以便实现有益效果。
相应地，有关本说明书的调整的制备方法的备择(b)，优选的是所述制备方法，在浓缩或分离所述外来体的步骤之前，还包括在所述容器或容纳装置中温育所述液体(优选血液样品)一段温育时间的步骤，或者避免温育所述液体的步骤(血液样品)。浓缩或分离可用于进一步增加效力。
由于发明人已令人惊讶地发现根据本说明书的调整的制备方法制备的药物制剂在不温育的情况下也展示许多有关效果(比如在UV辐射之后促进细胞存活)，在某些实施方式中可以避免温育，按照本说明书的调整的制备方法的备择(c)进行。在该备择方式中，总是进行除去液体(优选血液样品)细胞组分的步骤。上述除去细胞组分的步骤常常在本说明书的调整的制备方法的全部备择方式中都是有益的。
有关本说明书的调整的制备方法的全部备择方式，除去细胞组分的步骤优选是除去下述的步骤：红细胞(尤其是在包含血液的细胞组分的所述液体是全血的情况下)，血小板(尤其是在包含血液的细胞组分的所述液体是全血或已耗尽红细胞的全血的情况下)或全部细胞组分(尤其是在包含血液的细胞组分的所述液体是全血或已耗尽红细胞的全血的情况下)。最优选的是，除去细胞组分的步骤是除去全部细胞组分的步骤(在包含血液的细胞组分的所述液体是全血的情况下)。上述分离可以通过离心比如在低相对离心力短暂离心(例如于1000g约10分钟)或通过过滤实现。
在本说明书的调整的制备方法的备择方式(a)和(b)中，除去所述液体的细胞组分的步骤是任选的，并且另选还预期包括不进行除去所述液体的细胞组分(或不进行除去具有特定希望功能的那些细胞组分)的步骤。尤其是，预期不进行除去红细胞、血小板或全部细胞组分。
优选地，本说明书的调整的制备方法还包括减少所述液体的体积的步骤和/或根据本说明书的调整的制备方法制备的药物制剂呈无水状态(尤其是粉末形式)。
内表面的优选范围是10至300cm2，15至200cm2，20至150cm2，25至140cm2，30至130cm2，35至120cm2和尤其是40至110cm2。
优选的是，根据本说明书的调整的制备方法的实施方式(1)，所述血液样品是全血样品。
优选地，注射在小于3mm，2.5mm或更少，2mm或更少，1.5mm或更少或者1mm或更少的深度进行。优选的深度范围是0.1mm至小于3mm，0.5mm至小于3mm，1mm至小于3mm，1至2.5mm，1至2mm或1至1.5mm。
优选的是，注射入皮肤是注射入真皮(也即真皮内注射)或皮下组织(也即皮下注射)。
优选地，上述用途/治疗牵涉一次或多次后续注射，其中相邻注射之间的时间间隔是1天至52周，2天至42周，3天至30周，4天至24周，5天至18周，6天至12周，1至8周，尤其是1至6周，1至4周，1至3周，1至2周，2至3周或2周。尤其是，总共至少3次注射是优选的，最优选在第一次与第二次注射之间和在第二次与第三次注射之间的时间间隔为2周，或优选在任何两次相邻注射之间的时间间隔为2周。
为了实现最大效果，优选的是在使用可以根据本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法配制的药物制剂之前避免贮藏。
优选地，在根据本发明的用途的药物制剂的上下文中提及的所述有机体是人。优选地，所述人是至少30、35、40、45、48、50、55、60或65岁，或30至65、35至60或40至55岁。
在根据本发明的用途的优选药物制剂中，(a)IL-6的水平是2000pg/ml或更低(优选1500pg/ml或更低，1000pg/ml或更低，800pg/ml或更低，700pg/ml或更低，600pg/ml或更低和尤其是500pg/ml或更低)(b)各自按pg/ml度量的IL-1Ra水平和IL-6水平的比率是3或更多，5或更多，7或更多，10或更多，15或更多，20或更多，25或更多，30或更多，40或更多和尤其是50或更多，(c)IL-1Ra水平是200pg/ml或更高，300pg/ml或更高，400pg/ml或更高，500pg/ml或更高，600pg/ml或更高，800pg/ml或更高，1000pg/ml或更高，1200pg/ml或更高，1400pg/ml或更高，1600pg/ml或更高，1800pg/ml或更高和尤其是2000pg/ml或更高，(d)各自以pg/ml度量的IL-1Ra水平和IL-1水平的比率是10或更多，20或更多，30或更多，40或更多，50或更多，60或更多，70或更多，80或更多，90或更多，100或更多，150或更多，200或更多，300或更多，500或更多，700或更多和尤其是1000或更多，或(e)所述药物制剂不含添加的透明质酸。IL-6是皮肤以及肝的重要因子。
优选根据本发明的用途的药物制剂包含外来体。
优选地，包含于根据本发明的用途的药物制剂中的外来体已在容器或容纳装置中在上述(如果存在的)从有机体收集的液体(优选血液样品、更优选全血样品)的温育期间产生。
在根据本发明的用途的含外来体药物制剂中，外来体的平均直径，如通过透射电子显微镜所测，优选是30至200nm，尤其是50至190nm，70至180nm，90至160nm或100至150nm。这种尺度的外来体是特别高的效力的基础，更大的囊泡尺寸可以指示含有受损的外来体和聚集体的混合体。然而，更大的外来体也可以是有功能的，尤其是关于将1类免疫应答转变为2类免疫应答。这适用于直径范围200至5000nm或100至800nm的外来体。这些更大的外来体可以通过差异离心获得。
本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法优选还包括在温育之后浓缩或分离外来体的步骤(如果存在)以便进一步增加其效力。
上述浓缩或分离步骤可以导致根据本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法制备的两种或更多种药物制剂。这些两种或更多种药物制剂相应于在进行上述浓缩或分离步骤之后获得的级分。
浓缩或分离外来体可以例如通过于2,000至1,000,000g，10,000至800,000g，20,000至600,000g，50,000至400,000g，80,000至200,000g和尤其是100,000g离心实现，原因是这种加速特别适宜于浓缩或分离外来体，其取决于它们的尺寸。上述离心优选进行至少10分钟，至少30分钟，特别是至少60分钟。离心形成的丸粒然后含有外来体。优选地，然后将浓缩的或分离的外来体分散在流体(优选缓冲溶液比如PBS，或另选例如血浆或血清)中。任选地，然后将它们过滤，例如通过0.2μm滤器。
本发明也构思根据本发明的用途的药物制剂，其不含有外来体。然而，根据本发明的用途的优选药物制剂确实包含外来体，和尤其是其可以由外来体组成。
在所含的根据本发明的用途的药物制剂(其在某些情况下是优选的)包含血清或血浆的情况下，所述血清或血浆优选含有细胞因子和/或生长因子类。
优选地，根据本发明的用途的药物制剂不包含皮质类固醇，原因是其可以损伤药物制剂的效力，尤其是由于抑制其衰老-援救效果和/或抗凋亡效果。
液体(优选血液样品，更优选全血样品)的温育优选进行5分钟至22小时，10分钟至20小时，15分钟至18小时，30分钟至16小时，45分钟至15小时，1至14小时，2至13小时，3至12小时，4至11小时，5至10小时或6至9小时的温育时间。
温育优选在0℃至45℃的温度，尤其是10℃至43℃，20℃至41℃，30℃至40℃，35℃至39℃，36℃至38℃或37℃的温度进行。这些温度确保最佳效力。
优选地，温育在不存在添加的肝素的情况下进行。更优选，其在不存在任何添加的抗凝剂的情况下进行。
用于进行本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法的适宜容器或容纳装置(优选容纳器)是例如皮下注射针，注射器，管比如真空管或试验管，微量滴定板，注射器和输注袋。容器或容纳装置可以例如具有0.4至5cm、0.9至4cm或1.4至3.5cm的直径，和/或3至30cm、5至20cm、7至15cm或8至12cm的长度。优选，容器或容纳装置呈圆柱形。优选的容器或容纳装置具有1ml至1000ml、3ml至750ml、5ml至500ml、7ml至300ml、8ml至200ml、9ml至150ml、10ml至100ml、11ml至80ml和尤其是12ml至70ml的体积，然而其还可以具有15ml至65ml、20ml至60ml、25ml至50ml或30至40ml的体积。优选，内表面和体积的比率是0.01至10cm2/ml。优选的液体(优选血液样品)体积是0.5ml至900ml、1ml至700ml、2ml至400ml、3ml至300ml、6ml至200ml、7ml至150ml、8ml至100ml、9ml至80ml和尤其是10ml至60ml的体积，然而其还可以具有11ml至55ml、12ml至50ml、15ml至40ml或20至30ml的体积。
容器或容纳装置优选包括接触液体(优选血液样品，更优选全血样品)的表面，其包含玻璃，塑料，刚玉或石英或其组合。优选的塑料选自聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚乙烯和聚丙烯。优选地，容器或容纳装置接触液体的表面构成完全密闭的空间。优选的容器或容纳装置具有下述特征中的一种或多种：平面对称，轴对称和圆柱形。
根据优选实施方式，容器或容纳装置含有宏观颗粒、微观颗粒或纳米颗粒，并且在温育期间液体(优选血液样品)接触所述颗粒。出于本申请的意图，宏观颗粒定义为肉眼观察时可视的颗粒，微观颗粒(微粒)定义为太小以致肉眼观察时不可视的、但用显微镜观察时可视的颗粒，而纳米颗粒定义为太小以致用显微镜观察时不可视的颗粒(优选大于1nm)。所述颗粒能够将接触液体(血液样品)的表面扩大(例如扩大0.3至90cm2，2至80cm2，5至70cm2，10至60cm2，20至50cm2或30至40cm2)并且能够具有球、粒、粉末、凝胶或绒毛状。优选的物质是玻璃，塑料，刚玉，石英，金和粘土矿物(例如高岭土)。特别优选的是玻璃球。颗粒表面能够任选修饰，例如与腐蚀剂比如50％v/v铬硫酸温育并随后重复冲洗。如上文所述，在计算容器或容纳装置的"内表面"的情况下并不考虑所述颗粒的表面。
优选地，根据本发明的用途的药物制剂用于注射至已从其收集所述液体(优选血液样品，更优选全血样品)的相同有机体。在该情况下，其优选是罹患一种或多种上述障碍的有机体。从而，根据本发明的用途的药物制剂优选是自体的药物制剂而并非同种异体的药物制剂，特别是出于安全考虑。在将本发明描述为上述治疗患者的方法的情况下，其意味着有机体与患者相同。
在优选的实施方式中，根据本发明的用途的药物制剂用于与一种或多种其它有效试剂联合治疗。优选的其它有效试剂是有效治疗衰老或用作抗衰老药(特别是治疗一种或多种上文提及的障碍)的试剂，透明质酸或肉毒杆菌毒素，或其组合。特别优选的是根据本发明的用途的药物制剂、透明质酸和肉毒杆菌毒素的组合。
实施例
实施例1：髓核来源的细胞的增殖
髓核细胞的增殖在各种添加物存在下测试：人调理血清("ACS")，其是根据本说明书的制备方法制备的药物制剂，含和不含外来体；胎牛血清("FBS")，含和不含外来体；和从ACS分离的外来体和从FBS分离的外来体(参见图1)。
将髓核来源的细胞铺板于96孔板(8000细胞/孔)，其中具有DMEM/F12培养基和PenStrep 1％。细胞培养基补充有含外来体的完全ACS("ACS+Ex")，不含外来体的ACS("ACS-Ex")，来自ACS的外来体("ExA")，含外来体的完全FBS("FBS+Ex")，不含外来体的FBS("FBS-Ex")和来自FBS的外来体("ExF")。在24小时之后用XTT测试在ELISA读数器中光度评价细胞***。从ACS和FBS分离外来体：分别于100,000g将30ml ACS和30ml FBS离心2小时，将丸粒各自再悬浮于3ml PBS中。
发现的是，ACS和FBS均促进细胞***。在更低的ACS浓度(1％至2％)下细胞***最佳。在更高的ACS浓度(5％，10％)，在存在和不存在外来体的情况下，观察到细胞数的明显减少，但是这可以对应于在洗去细胞培养基然后用XTT染色培养基替换的情况下脱落的细胞或细胞混合体。这可以引起错误读数，原因是因为仅贴壁细胞能够对在该XTT测试中观察到的信号有贡献。在含外来体的ACS存在下观察到最高增殖。FBS在更高的浓度比如5％和10％并未显示可比拟的明显细胞数减少，但是促进细胞***的总体效果更差。在用FBS进行的实验中，外来体对细胞增殖不具有主要效果。FBS来源的分离的外来体和ACS来源的分离的外来体剂量依赖性地促进细胞***。
因此，可以根据本说明书的制备方法配制的药物制剂增加细胞***。
实施例2：抗凋亡途径的刺激
刺激具有抗凋亡效果的NF-κB途径用GFP/萤光素酶报告子***来测试，使用下述样品：根据本说明书的制备方法制备的药物制剂，所述方法不包括分离或浓缩在温育期间产生的外来体，其中所述药物制剂是血清，温育时间是6h("ACS")，并且对照使用并未进行本说明书的制备方法的对照血清("对照")。NF-κB途径用各种浓度的IL-1β来刺激。在该实验中，软骨细胞来源的细胞是用由下述组成的DNA构造转基因的：驱动萤光素酶基因的基础CMV启动子和前导的NF-κB蛋白质的4倍结合基序(TRE)。在这些细胞中NF-κB途径的任何诱导因此都可视为增强的萤光素酶活性(相对轻单元(RLU))，其是能够定量的。
结果示于下表和图2中。
在图2中，各组中的左侧柱代表对照和右侧柱代表ACS。
| IL-1β(ng/ml) | 0.001 | 0.01 | 0.1 | 1 | 10 |
| 增加倍数，对照中 | 1.7 | 2.0 | 2.7 | 3.7 | 4.2 |
| 增加倍数，ACS中 | 3.0 | 3.3 | 4.8 | 5.3 | 6.5 |
明显的是，NF-κB途径被IL-1β以剂量依赖性方式刺激。根据本说明书的制备方法制备的药物制剂("ACS")在所测试的IL-1β浓度的整个范围内增强该刺激。
从而能够得出的结论是，可以根据本说明书的制备方法配制的药物制剂刺激抗凋亡途径。
实施例3：细胞的UV辐射
在第一系列的实验中，将髓核细胞铺板于24孔板中，其中不存在血清而存在根据本说明书的制备方法制备的药物制剂，所述药物制剂呈血清形式("EOT")。EOT浓度是0.05％，0.1％，0.2％，0.5％和1％。EOT样品的一部分不加温育而是立即处理("EOT0")。EOT样品的其它部分温育6小时("EOT6")。
在铺板细胞6小时之后，用紫外光辐射细胞(Herolab透照器FT-28/312，6管，cat.nr.29 84 100，15W，312nm)。发射最大值是312nm。辐射持续时间是80s。细胞在37℃、5％CO2再生长2天。
用500μl的1％胰蛋白酶使细胞脱落，在Casy计数器中计数。每ml细胞数如下：
数据图示于图3A。
发现的是，在不存在血清的情况下UV辐射强烈地减少细胞计数。EOT0的存在并不具有大的效果。与之相对，EOT6的存在以约10倍的因子增加细胞计数，例外是最低浓度0.05％。
可以得出的结论是根据本说明书的制备方法制备的药物制剂抵消UV辐射的有害效果。该效果取决于温育，也即在温育时间段期间有效组分的形成。
第二系列的实验确认这些结果。在该系列中，省略了未辐射的对照。结果(细胞/ml)示于下表和图3B中。
再次观察到的是，根据本说明书的制备方法制备的药物制剂抵消UV辐射的有害效果，并且该效果取决于温育步骤。
实施例4：全身CRP水平的降低
不同年龄组(20至45岁，48至58岁，60至83岁)的人类受试者接受肌内或关节内注射的根据本说明书的制备方法制备的药物制剂，其包含分离的外来体。通过于100,000g离心2小时从经调理血液样品分离外来体，将丸粒再悬浮于PBS中。PBS的体积是血清体积的1/10。在各情况下向受试者经肌肉内给予1ml。受试者总数是22。受试者各自接受单次注射，在注射之前和在注射之后约2周测量CRP水平。
在各情况下，C-反应性蛋白质(CRP)的水平通过高敏感性CRPELISA("hsCRP")确定，并与治疗前的水平比较。为了能够比较结果，在各情况下计算CRP水平的相对降低。发现的是，平均相对降低在20至45岁组中最不显著，在48至58岁组中更显著和在60至83岁组中最显著。
结果示于图4。
能够得出的结论是根据本说明书的制备方法制备的药物制剂如CRP水平所示降低炎症，从而抵消衰老的可能诱因。与在更年轻的患者中相比在更老的患者中其甚至更明显。
实施例5：抗炎性组分:炎性组分比率的年龄依赖性
检查的是，人的年龄是否对根据本说明书的制备方法制备的药物制剂的组成具有影响。
为此，在一系列的体外实验中从人类受试者收集血液样品并进行本说明书的制备方法。IL-1β和IL-1Ra的浓度在温育步骤之后确定。
发现的是，在温育之后IL-1β(炎性组分)的浓度关于年龄并非统计学显著。结果示于图5A(受试者总数：165)。
与之相对，在温育之后IL-1Ra(抗炎性组分)的浓度与在更年轻的患者中相比在更老的患者中更高。结果示于图5B(受试者总数：368)。
结论是，根据本说明书的制备方法制备的药物制剂具有抗炎性效果，从而抵消衰老的可能诱因。与在更年轻的患者中相比在更老的患者中该效果甚至更强烈，如下述事实显示：在温育之后IL-1Ra的浓度随年龄增加，但IL-1β浓度却并非如此。
实施例6：免疫***功能的转变
4位人类志愿者各自接受4次肌内注射4ml根据本说明书的制备方法制备的药物制剂，其呈自体的调理血清形式(1x每周)。
在第0周、第2周和第4周从受试者取得全血并进行体外测试：在用5.7μg/ml PHA刺激24小时的情况下体外测试全血中IL-2和IFN-γ的产生。血液CRP水平额外地通过高敏感性C-反应性蛋白质ELISA确定("hsCRP")。
发现的是，注射导致全血产生IL-2和IFN-γ的能力的强烈降低，如下表所示。hsCRP降低。
1类细胞因子(IL-2和IFN-γ)的减少意味着注射已诱导免疫***从炎性转变为再生性/抗炎性。因此，由于1类免疫过程优势导致的免疫过程失衡可以得以治疗。
由其能够得出的结论是根据本说明书的制备方法或本说明书的调整的制备方法制备的药物制剂抵消衰老的可能诱因。
实施例7：在注射入面部皮肤之后的弹性测量
通过注射入面部皮肤治疗21位面部皮肤和弹性损失的患者(年龄35至55岁)。向患者注射根据本说明书的调整的制备方法制备的药物制剂，其中在温育之后已除去血液样品的细胞组分，呈血清形式("ACS")。温育时间t是6h而内表面积A是41cm2。因为定义为t/A，f是0.146。
总研究持续时间是24周。各次访问如下：筛选访问(第-2周，即在录用之前2周)，录用访问(第0周)，第2周，第4周，第8周，第12周和第24周。下表显示访问情况总结。进行的活动用"x"标记：
排除标准是严重慢性皮肤疾病例如牛皮癣，特应性湿疹(神经性皮炎)或其它自身免疫皮肤疾病，皮肤癌既往症，有皮肤牵涉的全身性疾病(SLE)，用激光、肉毒杆菌毒素或透明质酸预处理，怀孕，在过去3个月严重节食或在24周的研究持续时间期间补充营养剂，急性感染，痤疮。
在第0周、第2周和第4周对患者进行一系列的3次注射ACS。在第12周对多数患者提供第4次注射。
每一次总共皮内注射约2ml的ACS(深度1至小于3mm)。在两个颧骨区域手工完成注射(≤1ml每区域)，在邻近注射位置之间距离1cm的网格中进行。在每个脸颊，约4cm x 5cm的面积通过20次注射处理。
为了主要效力评价，将抽吸原理用于皮肤中。采用MPA 580(Courage&Khazaka，Cologne，德国)，在24周内评价描述皮肤粘弹性特性的12种参数7次(第-2周，第0周和第2周，第4周，第8周，第12周和第24周)。在第12周测量无效力的情况，进行额外的ACS给药。
在皮肤弹性测量中用获得主要效力变量。额外变量是角质层含水度(水化的度量)，全球审美改善量表(Global Aesthetic Improvement Scale)(GAIS)等级(改善/无变化/更劣的程度)，吸引力自评和问卷。
结果如下：
SD：标准偏差
差异：访问5减去基线
p值：成对T检验
应注意，在标准偏差小的情况下，即使是小差异也能导致统计学上显著结果。
比较第12周和基线，R0值大大地降低约30％，从0.34降低至0.24(显著)。这能够视为是代表20岁年龄差异的差异。R5值大大地增加约25％(显著)。
不受理论所限，弹性的显著增加可能是由于成纤维细胞的活化。
从而能够得出的结论是效果持续至少12周。
实施例8：髓核来源的细胞的增殖
药物制剂根据本说明书的调整的制备方法制备，呈血清形式("ACS")。温育时间t是6h而内表面积A是41cm2。因为定义为t/A，f是0.146。
已建立的是ACS能够促进细胞体外增殖。在此，评价不同组成的ACS对髓核(NP)细胞体外增殖的促进。
将髓核细胞铺板在96孔细胞培养板中，密度约4500细胞/孔。然后向细胞输送各种组成的ACS：ACS经由尺寸排阻柱分馏(IZON qEV，参见用于EV分离和纯化的qEV尺寸排阻柱http://www.izon.com/assets/SideColumnPDFs/qEV-Brochure-April-15.pdf)。该柱能够从蛋白和其它组分分离外来体(EV)。最大颗粒(EV)首先洗脱，随后是越来越小的颗粒。精确级分数可以取决于因素比如缓冲剂，温度和所用流体的种类(例如血清、血浆或其它流体)。然而，将存在至少2个分开的具有促增殖活性的峰。
简言之，qEV柱用细胞培养基(DMEM，Gibco)平衡；将500μl ACS施用至柱，如下分馏。弃去首个1.5ml，后续液体以350μl级分收集。级分用来培养细胞，细胞数通过CCK-8("Cell Counting Kit-8")测试确定。
CCK-8提供敏感的比色测试，用于确定细胞存活率。高度水可溶的四唑鎓盐WST-8被细胞中的脱氢酶活动还原，产生可溶于组织培养基中的橙颜色甲染料。于450nm的吸收与细胞中的活性线粒体成比例，参见http://www.dojindo.eu.com/store/p/456-Cell-Counting-Kit-8.aspx。细胞中的脱氢酶活动产生的甲染料的量直接与活细胞数成比例。
结果展示的是，外来体能够促进NP细胞增殖。基线是仅用DMEM的细胞增殖。
在第一个CCK-8测试(图6A)中，外来体洗脱于级分8和9。从级分10开始，蛋白质(包括来自ACS的生长因子类)开始洗脱并形成又一个导致细胞增殖的峰。来自16的级分含有不刺激细胞生长的组分。
在第二个CCK-8测试(图6B)中，外来体洗脱于级分5至8，和蛋白质洗脱于级分9至11。来自12的级分含有不刺激细胞生长的组分。汇集的级分5至14将外来体(EVs)和蛋白质组合。
结论是，来自ACS的EV促进细胞增殖。来自ACS的蛋白质也促进细胞增殖。ACS含有独立促进细胞增殖的两类组分：EV(外来体)和蛋白质，比如生长因子类。ACS中的第三类组分减少细胞增殖并随小组分洗脱。注：组分的精确级分数取决于因素比如：柱尺寸，缓冲剂和温度。组分的顺序在非变性条件下不变。将含有EV的级分和含有蛋白质比如生长因子类的级分汇合可以增效地发挥作用。
因此，能够得出的结论是ACS含有2类组分，其独立地促进细胞体外增殖。
实施例9：在UV辐射之后的体外细胞存活
药物制剂根据本说明书的调整的制备方法制备，呈血清形式("ACS")。温育时间t是6h而内表面积A是41cm2。由于定义为t/A，从而f是0.146。
ACS能够促进细胞体外增殖。该实验评价ACS和其它血液制剂在UV辐射之后对髓核细胞体外生存的促进。
简言之，将髓核细胞铺板于96孔细胞培养板中，密度约3000细胞/孔，保持在37℃、5％CO2。向细胞供给10％，5％，2.5％，1.25％和0.63％的各自的胎牛血清(FBS)，ACS，富血小板血浆(PRP)，血浆(等同ACS但不温育)和血小板裂解液(PL)。
用高强度UV辐射将所述孔中的一半辐射30分钟。各孔中的细胞经由IMAGER计数。
图7显示在补充物添加和UV辐射之后24小时的活细胞百分比，与未补充的对照比较。数据基于三个96孔板的平均。
不存在UV辐射(左侧五柱)的情况下，各种浓度的补充物导致约50％至150％的细胞数，与未补充对照的那些相比。
在UV辐射之后，多数未补充的细胞死亡。与不存在UV辐射的情况相比，细胞死亡发生的程度更高。
补充物以各种程度保护细胞免于UV辐射诱导的细胞死亡，这取决于它们的浓度。这显示为：与未补充对照相比的活细胞百分比(右侧五柱)清楚地高于100％。最大保护用2.5％和1.25％的FCS和1.25％的ACS实现。PRP和血浆的效果是更不显著的。在血浆与ACS之间的比较显示，在某些浓度下，温育具有清楚的效果，但不存在温育也能够实现某些效果。血小板裂解液在该实验中没有效果。
结论：UV辐射导致净细胞体外死亡。与未补充的细胞相比，用血液衍生制剂补充明显地增加存活率。
Claims (24)
1.通过注射入皮肤的用途的药物制剂，其中所述药物制剂可以通过包括下述步骤的制备方法配制：提供从有机体收集的液体，该液体包含血液的细胞组分，提供容器或容纳装置，所述容器或容纳装置具有内表面，和将所述液体与所述容器或容纳装置接触，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，和任选地在所述温育之后除去所述液体的细胞组分，
(b)所述液体包含外来体，和所述制备方法还包括浓缩所述外来体和任选在所述浓缩之后除去所述液体的细胞组分的步骤，或分离所述外来体的步骤，或
(c)所述制备方法还包括避免温育所述液体的步骤，和除去与所述容器或容纳装置接触的所述液体的细胞组分的步骤。
2.根据权利要求1第(a)项的用途的药物制剂，其中在所述温育时间与所述内表面之间的关系符合下述公式：t＝f*A，其中t指定温育时间，A指定内表面且f小于或等于0.5小时/cm2。
3.根据权利要求1第(b)项的用途的药物制剂，其中所述制备方法，在浓缩或分离所述外来体的步骤之前，还包括下述步骤：在所述容器或容纳装置中温育所述液体一段温育时间，或避免温育所述液体的步骤。
4.根据权利要求1、2或3的用途的药物制剂，其中所述液体是血液样品。
5.根据权利要求4的用途的药物制剂，其是(1)全血样品或(2)细胞已耗尽的全血样品。
6.根据权利要求5的用途的药物制剂，其中已耗尽的所述细胞是红细胞。
7.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中除去细胞组分的步骤是除去红细胞、血小板或全部细胞组分的步骤。
8.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中
(a)所述制备方法还包括下述步骤：减少所述液体的体积，和/或
(b)所述药物制剂呈干燥形式。
9.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述注射在小于3mm的深度进行。
10.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述注射入皮肤是注射入真皮或皮下组织。
11.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述用途牵涉一次或多次后续注射，并且相邻注射之间的时间间隔是1天至52周。
12.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其(1)用于治疗衰老或(2)用作抗衰老药。
13.根据权利要求12的用途的药物制剂，其用于治疗：
(a)由下述引起的障碍：氧化损伤，DNA损伤，受损的DNA修复，受损的细胞***，过度的炎症，免疫过程的致病性分化，或过度的细胞死亡，或
(b)通过转基因小鼠的障碍模拟的障碍，所述小鼠在编码核苷酸切除修复途径的蛋白质的基因中具有至少一个突变，与缺少所述突变的小鼠相比所述突变导致过早衰老表型，或
(c)年龄相关性障碍或发生率随年龄增加超过线性方式的障碍，或
(d)对皮肤力学参数具有效果的障碍或由胶原损伤和/或弹性蛋白损伤、衰老、端粒缩短、损伤的抗氧化物酶表达或损伤的抗氧化物酶活性引起的障碍。
14.根据权利要求13的用途的药物制剂，其中
(a)所述氧化损伤是反应性氧类引起的损伤，所述由DNA损伤引起的障碍是由UV依赖性DNA损伤引起的障碍，所述由受损的DNA修复引起的障碍是由缺乏核苷酸切除修复引起的障碍，所述由受损的细胞***引起的障碍是与损伤的髓核细胞***有关的障碍，所述由过度的炎症引起的障碍是非整形外科的障碍、不牵涉神经***的障碍和/或不牵涉眼的障碍，所述免疫过程的致病性分化是1类免疫过程的优势，或所述细胞死亡是细胞凋亡，或
(b)在所述转基因小鼠中的所述突变是在Ercc1基因中，或
(c)所述发生率随年龄指数增加，或
(d)所述由胶原损伤和/或弹性蛋白损伤引起的障碍选自松弛的皮肤、干燥和起皱。
15.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述有机体是人。
16.根据权利要求15的用途的药物制剂，其中所述人至少30岁。
17.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中
(a)IL-6水平是2000pg/ml或更低，
(b)各自以pg/ml度量的IL-1Ra水平和IL-6水平的比率是3或更多，
(c)IL-1Ra水平是200pg/ml或更高，
(d)各自以pg/ml度量的IL-1Ra水平和IL-1水平的比率是10或更多，
(e)所述药物制剂不含添加的透明质酸。
18.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述药物制剂包含外来体。
19.根据权利要求18的用途的药物制剂，其中外来体已在所述温育期间产生。
20.根据权利要求18至19中任一项的用途的药物制剂，其中所述制备方法还包括下述步骤：在所述温育之后浓缩或分离所述外来体，和任选将浓缩的或分离的外来体分散在流体中。
21.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其包含血清或血浆。
22.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述温育进行如下：
(a)温育时间5分钟至22小时，
(b)温度0℃至45℃，和/或
(c)不存在添加的抗凝剂。
23.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述容器或容纳装置
(a)具有1ml至1000ml的体积，
(b)包括接触液体、优选血液样品的表面，其包含玻璃、塑料、刚玉或石英或其组合和/或
(c)含有选自宏观颗粒、微观颗粒和纳米颗粒的颗粒，和其中在所述温育期间液体(优选血液样品)接触所述颗粒。
24.根据上述权利要求中任一项的用途的药物制剂，其中所述用途是
(a)通过注射至已从其收集所述液体(优选血液样品)的相同有机体进行和/或
(b)与一种或多种其它有效试剂联合治疗。
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| JOYDEEP BASU等: "Exosomes for Repair, Regeneration and Rejuvenation", 《EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112955159A (zh) * | 2018-08-23 | 2021-06-11 | 奥索根股份公司 | 用于基于血液成分制备药物制剂的方法 |
| CN113316472A (zh) * | 2018-12-27 | 2021-08-27 | 三得利控股株式会社 | 变性弹性蛋白的分解降低的抑制剂、正常的弹性蛋白纤维的维持剂、弹性蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白复合体形成抑制剂及具有弹性蛋白-抑弹性蛋白酶蛋白复合体形成抑制作用的物质的筛选方法 |
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