CN108330147A - 一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立。本发明首先提供一种重组腺相关病毒载体制备方法,包括如下步骤:(1)将含有重组腺相关病毒载体基因组序列的质粒转染入培养细胞;(2)在合适的条件下培养步骤(1)所得细胞,收集细胞培养上清液,所述细胞培养上清液是指含有重组腺相关病毒载体的细胞和培养上清液的混合物;(3)将步骤(2)所得的细胞培养上清液,进行纯化和浓缩,即得重组腺相关病毒载体。所述制备方法基本适用于大多数rAAV血清型和突变体,生产获得的重组腺相关病毒载体具有高滴度和高纯度,免疫原性低,安全高效的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立。
背景技术
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是一种复制缺陷型的细小病毒,其复制增殖需要腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒的协助,而在缺少辅助病毒时,AAV只能进行有限的复制,其感染细胞后便进入潜伏状态,整合到染色体中或以附加体的形式存在。因此,AAV归属于细小病毒科依赖病毒属。
AAV的核心为一条具有互补性的单链DNA,其衣壳蛋白呈20面体立体对称,病毒颗粒的直径在20~26nm之间,是人类感染的已知病毒里最小的病毒之一。AAV基因组的两末端为145bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat sequences,ITRs),ITR是DNA的复制起始和包装重组的AAV基因组成为感染性的病毒颗粒所需的顺式作用元件,具有转录启动子的活性,其序列之间为病毒编码区,含有两个开放阅读框架(ORF)。其中,左侧ORF编码四个Rep蛋白(Rep78,Rep68,Rep52,Rep40),这些非结构蛋白对于AAV病毒的整合、复制、拯救和包装是关键性的;右侧的ORF编码VP1、VP2和VP3三个病毒衣壳蛋白(分子量依次为87KDa,72KDa和62KDa)及包装激活蛋白AAP。成熟的AAV病毒颗粒中的VP1、VP2和VP3的比例约为1:1:10。根据衣壳的差异,目前AAV可分为12种血清型(AAV1~AAV12)和100多种变异体。其中,AAV2是最早得到感染性克隆的血清型,也是到目前为止研究得最清楚的一种血清型。
AAV作为唯一一种通过欧盟FDA认证的基因治疗载体,因其具有宿主范围广(能够感染***细胞和非***细胞)、安全性好(无致病性)、低免疫原性、体内长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点,已被广泛地应用于基因治疗的基础研究和临床试验中。而且,越来越多的临床试验证明了AAV载体的有效性和良好的安全性,使之成为基因治疗研究的热点,并被认为是一种最有前景的基因转移工具。
在基于病毒载体的基因递送***中,有一个很大的顾虑就是辅助质粒和载体质粒发生重组而恢复出野生型病毒。经典的生产重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)的实验方案是需要共转染一个载体质粒和一个表达病毒复制和结构基因的包装质粒到腺病毒感染的培养细胞中。这无疑增加了野生型AAV产生的可能性,且这种方法操作复杂、影响因素多,难以高效分离纯化rAAV,也不适于大规模生产。传统的纯化rAAV的工艺是采用两轮氯化铯密度梯度离心法,然而这种方法耗时耗力,所制备的AAV载体中含有较多的蛋白质和DNA杂质,且体内外转导效率较低。此外,虽然AAV载体本身具有低免疫原性的特点,但已有多项研究表明较高的AAV载体剂量注射也会引起显著增强的宿主免疫反应。虽然现有纯化技术不能完全消除AAV载体的免疫原性,但制备具有高滴度、高纯度和免疫原性最小化的AAV产品以用于基因治疗领域的研究是必要的。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题,本发明的目的在于提供一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立。
为了实现上述目的以及其他相关目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供一种重组腺相关病毒载体制备方法,包括如下步骤:
(1)将含有重组腺相关病毒载体基因组序列的质粒转染入培养细胞;
(2)在合适的条件下培养步骤(1)所得细胞,收集细胞培养上清液,所述细胞培养上清液是指含有重组腺相关病毒载体的细胞和培养上清液的混合物;
(3)将步骤(2)所得的细胞培养上清液,进行纯化和浓缩,即得重组腺相关病毒载体。
优选地,所述步骤(1)中,重组腺相关病毒载体基因组序列分别位于三个不同的载体质粒上,三个载体质粒分别为pHelper、prAAV-RC、prAAV-GFP。
所述pHelper提供生产具感染性的重组腺相关病毒载体所需的腺病毒基因产物(例如:E2A,E4和VA RNA基因);prAAV-RC包含复制蛋白rep编码序列和病毒衣壳蛋白cap编码序列;prAAV-GFP提供了真核启动子和当外源序列克隆入多克隆位点(MCS)时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件及指导病毒复制和包装的AAV反向末端重复序列(ITRs),其余的腺病毒基因产物则由稳定表达腺病毒E1基因的宿主细胞提供。将三个质粒pHelper、prAAV-RC、prAAV-GFP共转染入宿主细胞,即可产生非复制型的重组腺相关病毒载体。pHelper、prAAV-RC、prAAV-GFP均为市售质粒,可购自上海吉凯基因化学技术有限公司。
优选地,所述步骤(1)中,所述培养细胞(亦即宿主细胞)选自HEK293T。
所述步骤(2)中,本领域技术人员可根据培养细胞的种类,选择合适的培养条件对细胞进行培养,并在合适的时机收集细胞培养上清液,以最大程度降低初始污染物【包括核酸污染物(主要指DNA污染物)和蛋白污染物等】,并保证病毒粗提液(又称为细胞培养上清液)中有活性的病毒颗粒的水平。例如,可根据实际情况选择是否用无血清进行包装,可在有或没有氯喹或丁酸钠等诱导的情况下进行生产,且细胞培养上清液可以在转染后的多个时间点进行收集,如可在转染后48h/72h一次性收获或者分别于48h和72h各收获一次等。不同生产批次获得的重组腺相关病毒粗提液和最终产物的质量可通过测量纯度、滴度及安全性进行控制。
在本发明的一些实施方式中,培养的具体条件为:采用含8%~20%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基培养于37℃恒温培养,转染前,细胞培养液换成低血清含量的DMEM培养基【含2%~10%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基】,转染5~7h后将细胞培养液换成含2%~10%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基,并将细胞置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境中继续进行培养,并收集细胞培养上清液。优选的细胞培养上清液收集方案为,于转染72h后,收集细胞培养上清液。所述细胞培养上清液可立即进行后续的重组腺相关病毒载体的纯化和浓缩步骤,也可短暂放于4℃冰箱以备后用。
优选地,所述步骤(3)中,将步骤(2)所得的细胞培养上清液中的细胞和培养上清液进行分离,然后向分离后的培养上清液中加入PEG,离心沉淀重组腺相关病毒载体,重悬得PEG沉淀重悬液;分离后的细胞通过反复冻融法进行裂解,细胞裂解液通过微孔过滤器(属于滤膜过滤器)过滤,得过滤液;将所述过滤液与PEG沉淀重悬液合并,获得病毒粗提液。
优选地,所述PEG为PEG8000。
优选地,PEG在上清中的终浓度为8%~12%(w/v)。
优选地,采用PEG浓缩时,处理方法为4℃放置2~12h。
优选地,所述微孔过滤器的孔径为0.22或0.45μm。在本发明一实施例中,所述微孔过滤器的孔径为0.22μm。
优选地,所述微孔过滤器为PES过滤器。
进一步地,所述病毒粗提液通过全能核酸酶进行处理,离心并澄清,然后通过氯仿处理并澄清,回收病毒液。
优选地,所述全能酶的加入量为5~300U/ml。
进一步地,回收的病毒液再通过碘克沙醇密度梯度离心进行纯化,回收纯化后的病毒液。
本发明的一些实施例中列举了碘克沙醇密度梯度离心纯化步骤包含四个碘克沙醇密度梯度溶液(9ml 15%,6ml 25%,5ml 40%和5ml 60%,%均为质量体积百分浓度)。
再进一步地,将回收的纯化后的病毒液采用超滤浓缩柱进行超滤浓缩,获得超滤浓缩后的病毒液。
优选地,所述超滤浓缩柱的截留分子量(Molecular Weight CutOff,MWCO)为30~150KDa。
所述超滤步骤可以实现重组腺相关病毒载体的深度浓缩和纯化。
在本发明一实施例中,所述超滤浓缩柱的截留分子量(Molecular WeightCutOff,MWCO)为100KDa。
再进一步地,将超滤浓缩后的病毒液采用微孔过滤器(属于滤膜过滤器)过滤,进行终产物的收集。
优选地,所述微孔过滤器为PVDF过滤器。
优选地,所述微孔过滤器的孔径为0.22或0.45μm。在本发明一实施例中,所述微孔过滤器的孔径为0.22μm。
本发明的第二方面,提供前述重组腺相关病毒载体制备方法在重组腺相关病毒载体制备领域的用途。
本发明所述生产工艺可制备出高度浓缩和纯化的重组腺相关病毒载体产品以用于基因转移和基因治疗。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明利用无辅助病毒包装***(AAV Helper-Free System)作为rAAV载体的生产制备***,利用完整的AAV病毒颗粒可耐受有机溶剂的特性和单次碘克沙醇密度梯度离心法分离纯化rAAV,探索建立一种可扩缩的重组腺相关病毒载体的生产工艺。所述生产工艺基本适用于大多数rAAV血清型和突变体。本发明还提供了所述rAAV载体颗粒用于动物体内实验和立体定点注射实验的应用。由于具有高滴度和高纯度,本发明提供的rAAV载体颗粒免疫原性低,安全高效,能够实现外源基因稳定而持久的表达。
附图说明
图1A:辅助质粒pHelper和prAAV-RC图谱。
图1B:穿梭质粒prAAV-GFP图谱。
图2:本发明的rAAV载体生产图解,使用辅助质粒pHelper、prAAV-RC和穿梭质粒prAAV-GFP共转染HEK293T生产细胞,以使其产生非复制型的重组rAAV载体颗粒。
图3:显示本发明的rAAV病毒载体生产工艺各步骤的流程图。
图4:纯度检测结果图,将rAAV载体颗粒产品进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,电泳结束后用eStainTM L1蛋白染色仪对凝胶进行染色,并用凝胶成像***拍照,其中,M泳道代表蛋白质分子量标准,泳道1-4分别代表采用本发明提供的工艺生产的AAV8、AAV9、AAV2和AAV5四种血清型载体颗粒产品的纯度检测结果,电泳结果可见三条特征性的蛋白条带,其大小分别与AAV的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的大小是一致的,其余杂带不明显;同时,对凝胶成像结果图进行定量分析,检测结果显示VP1、VP2和VP3的总量约占总蛋白量的99%以上,表明用本发明提供的工艺生产的rAAV载体颗粒产品的纯度都很高。
图5:动物体内实验结果图,采用尾静脉注射法将经本发明提供的工艺生产的AAV5、AAV8、AAV9血清型载体颗粒(rAAV-Luciferase)分别以1×1011vg/只的剂量注射6周龄的C57BL/6小鼠,注射三周后,用IVIS Lumina System进行活体成像,并分析luciferase(荧光素酶)的表达水平,由动物体内实验结果可知,用本发明提供的工艺生产的AAV5、AAV8和AAV9三种血清型均具有较好的体内感染性且感染具有特异性。
图6:立体定点注射实验结果图,采用立体定点注射法将用本发明提供的工艺生产的AAV9光遗传载体(rAAV9-mCherry)注射Cre小鼠的海马体,注射体积为1.5μl,注射14天后,取脑组织切片观察表达信号;图6B是图6A中灰色方框所圈区域在更高放大倍数下的拍摄图像。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;theseries METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.),Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1 rAAV载体颗粒的制备
如图3所示,本实施中的一种rAAV载体颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(1)HEK293T细胞的培养:
rAAV载体颗粒的生产是在HEK293T中进行的。将HEK293T细胞以每皿1.4×106个细胞的量接种在含15%(体积百分浓度)FBS DMEM培养基的10cm培养皿中,并置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境下进行培养。接种2天后实施转染。
(2)HEK293T细胞的转染:
转染前,将细胞培养液换成5ml含5%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基。使用标准的PEI转染方法,通过瞬时三重转染将两个辅助载体质粒pHelper(图1A)、prAAV-RC(图1A)和一个穿梭载体质粒prAAV-GFP(图1B)按照每皿7:7:7质量比共转染进HEK293T细胞。转染混合物配好后,将其按照1ml/皿的量逐滴加入到细胞培养基中。转染6h后,将细胞培养液换成12ml含8%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基,并将细胞置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境中继续进行培养。
(3)细胞培养上清液的收集:
HEK293T细胞转染72h后,收集含有rAAV载体颗粒的细胞和培养上清液的混合物,用于后续的纯化和浓缩步骤。
(4)rAAV载体颗粒的纯化:
首先将收集的细胞和培养上清液的混合物在4℃,3000g条件下离心5min,以分离细胞和上清。然后,向分离后的上清中加入40%(w/v)PEG8000/NaCl(PEG/NaCl是预配置的,其中PEG8000的质量体积百分浓度为40%(w/v),NaCl的浓度为2.5M)至PEG8000的终浓度为10%(w/v),混匀后置于4℃放置2h;接着,4℃,10000g离心30min,以沉淀rAAV载体颗粒。同时采用液氮/37℃反复冻融法裂解分离后的细胞(共进行四个循环)。细胞裂解液通过直径为0.22μm的PES滤膜过滤,将此过滤液与上清的PEG沉淀重悬液合并。合并所得的病毒粗提液依次经全能核酸酶(加入量50U/ml,亦即,每1ml病毒粗提液中加入50U全能酶,37℃水浴1h)和氯仿处理(氯仿:病毒样品=1:1,室温剧烈振摇30min)得到进一步的纯化,并回收纯化和浓缩后的病毒液。
回收的病毒液可再通过碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本发明中的碘克沙醇密度梯度离心纯化步骤包含四个碘克沙醇密度梯度溶液(9ml 15%,6ml 25%,5ml 40%和5ml 60%,%均为质量体积百分浓度),其中,15%、25%和60%的梯度溶液中含0.5%(w/v)的酚红。将碘克沙醇线性梯度溶液在18℃,63000rpm条件下离心2h,并采用常规的5ml注射器收集40%层组分。经此步骤回收的rAAV病毒样品可通过超滤而得到进一步的浓缩和分离纯化。超滤过程是在MWCO=100KDa的超滤浓缩柱中完成的。本发明所述超滤步骤包含每超滤到1ml,即加入150mM NaCl 20mM Tris-HCl溶液反复超滤的程序(共进行三个循环)。最后采用0.22μm PVDF滤膜进行无菌过滤,进行终产物的收集,至此即得到了纯化和浓缩的rAAV载体颗粒产品。
为了尽量减少可复制的野生型rAAV的产生,本发明中将rAAV的基因组序列分别克隆到了三个不同的载体质粒上面。第一个载体质粒是辅助质粒pHelper,提供了生产具感染性的rAAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(例如:E2A,E4和VA RNA基因)。第二个载体质粒是辅助质粒prAAV-RC,包含了编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因。第三个载体质粒是穿梭质粒prAAV-GFP,提供了真核启动子和当外源序列克隆入多克隆位点(MCS)时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件,载体同时包含了指导病毒复制和包装的AAV反向末端重复序列(ITRs)。将这样的三个质粒共转染HEK293T生产细胞以产生非复制型的rAAV载体颗粒,图解如图2所示。
实施例2 rAAV载体颗粒的制备
如图3所示,本实施中的一种rAAV载体颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(5)HEK293T细胞的培养:
rAAV载体颗粒的生产是在HEK293T中进行的。将HEK293T细胞以每皿1.4×106个细胞的量接种在含8%(体积百分浓度)FBS DMEM培养基的10cm培养皿中,并置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境下进行培养。接种2天后实施转染。
(6)HEK293T细胞的转染:
转染前,将细胞培养液换成5ml含2%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基。使用标准的PEI转染方法,通过瞬时三重转染将两个辅助载体质粒pHelper(图1A)、prAAV-RC(图1A)和一个穿梭载体质粒prAAV-GFP(图1B)按照每皿7:7:7质量比共转染进HEK293T细胞。转染混合物配好后,将其按照1ml/皿的量逐滴加入到细胞培养基中。转染5h后,将细胞培养液换成12ml含10%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基,并将细胞置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境中继续进行培养。
(7)细胞培养上清液的收集:
HEK293T细胞转染72h后,收集含有rAAV载体颗粒的细胞和培养上清液的混合物,用于后续的纯化和浓缩步骤。
(8)rAAV载体颗粒的纯化:
首先将收集的细胞和培养上清液的混合物在4℃,3000g条件下离心5min,以分离细胞和上清。然后,向分离后的上清中加入40%(w/v)PEG8000/NaCl(PEG/NaCl是预配置的,其中PEG8000的质量体积百分浓度为40%(w/v),NaCl的浓度为2.5M)至PEG8000的终浓度为8%(w/v),混匀后置于4℃放置12h;接着,4℃,10000g离心30min,以沉淀rAAV载体颗粒。同时采用液氮/37℃反复冻融法裂解分离后的细胞(共进行四个循环)。细胞裂解液通过直径为0.45μm的PES滤膜过滤,将此过滤液与上清的PEG沉淀重悬液合并。合并所得的病毒粗提液依次经全能核酸酶(加入量300U/ml,亦即,每1ml病毒粗提液中加入300U全能酶37℃水浴1h)和氯仿处理(氯仿:病毒样品=1:1,室温剧烈振摇30min)得到进一步的纯化,并回收纯化和浓缩后的病毒液。
回收的病毒液可再通过碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本发明中的碘克沙醇密度梯度离心纯化步骤包含四个碘克沙醇密度梯度溶液(9ml 15%,6ml 25%,5ml 40%和5ml 60%,%均为质量体积百分浓度),其中,15%、25%和60%的梯度溶液中含0.5%(w/v)的酚红。将碘克沙醇线性梯度溶液在18℃,63000rpm条件下离心2h,并采用常规的5ml注射器收集40%层组分。经此步骤回收的rAAV病毒样品可通过超滤而得到进一步的浓缩和分离纯化。超滤过程是在MWCO=150KDa的超滤浓缩柱中完成的。本发明所述超滤步骤包含每超滤到1ml,即加入150mM NaCl 20mM Tris-HCl溶液反复超滤的程序(共进行三个循环)。最后采用0.22μm PVDF滤膜进行无菌过滤,进行终产物的收集,至此即得到了纯化和浓缩的rAAV载体颗粒产品。
为了尽量减少可复制的野生型rAAV的产生,本发明中将rAAV的基因组序列分别克隆到了三个不同的载体质粒上面。第一个载体质粒是辅助质粒pHelper,提供了生产具感染性的rAAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(例如:E2A,E4和VA RNA基因)。第二个载体质粒是辅助质粒prAAV-RC,包含了编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因。第三个载体质粒是穿梭质粒prAAV-GFP,提供了真核启动子和当外源序列克隆入多克隆位点(MCS)时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件,载体同时包含了指导病毒复制和包装的AAV反向末端重复序列(ITRs)。将这样的三个质粒共转染HEK293T生产细胞以产生非复制型的rAAV载体颗粒,图解如图2所示。
实施例3 rAAV载体颗粒的制备
如图3所示,本实施中的一种rAAV载体颗粒的制备方法,包括以下步骤:
(9)HEK293T细胞的培养:
rAAV载体颗粒的生产是在HEK293T中进行的。将HEK293T细胞以每皿1.4×106个细胞的量接种在含20%(体积百分浓度)FBS DMEM培养基的10cm培养皿中,并置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境下进行培养。接种2天后实施转染。
(10)HEK293T细胞的转染:
转染前,将细胞培养液换成5ml含10%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基。使用标准的PEI转染方法,通过瞬时三重转染将两个辅助载体质粒pHelper(图1A)、prAAV-RC(图1A)和一个穿梭载体质粒prAAV-GFP(图1B)按照每皿7:7:7质量比共转染进HEK293T细胞。转染混合物配好后,将其按照1ml/皿的量逐滴加入到细胞培养基中。转染7h后,将细胞培养液换成12ml含2%(体积百分浓度)FBS的DMEM培养基,并将细胞置于37℃,5%CO2和饱和湿度的环境中继续进行培养。
(11)细胞培养上清液的收集:
HEK293T细胞转染72h后,收集含有rAAV载体颗粒的细胞和培养上清液的混合物,用于后续的纯化和浓缩步骤。
(12)rAAV载体颗粒的纯化:
首先将收集的细胞和培养上清液的混合物在4℃,3000g条件下离心5min,以分离细胞和上清。然后,向分离后的上清中加入40%(w/v)PEG8000/NaCl(PEG/NaCl是预配置的,其中PEG8000的质量体积百分浓度为40%(w/v),NaCl的浓度为2.5M)至PEG8000的终浓度为12%(w/v),混匀后置于4℃放置8h;接着,4℃,10000g离心30min,以沉淀rAAV载体颗粒。同时采用液氮/37℃反复冻融法裂解分离后的细胞(共进行四个循环)。细胞裂解液通过直径为0.22μm的PES滤膜过滤,将此过滤液与上清的PEG沉淀重悬液合并。合并所得的病毒粗提液依次经全能核酸酶(加入量5U/ml,亦即,每1ml病毒粗提液中加入5U全能酶,37℃水浴1h)和氯仿处理(氯仿:病毒样品=1:1,室温剧烈振摇30min)得到进一步的纯化,并回收纯化和浓缩后的病毒液。
回收的病毒液可再通过碘克沙醇密度梯度离心进行纯化。本发明中的碘克沙醇密度梯度离心纯化步骤包含四个碘克沙醇密度梯度溶液(9ml 15%,6ml 25%,5ml 40%和5ml 60%,%均为质量体积百分浓度),其中,15%、25%和60%的梯度溶液中含0.5%(w/v)的酚红。将碘克沙醇线性梯度溶液在18℃,63000rpm条件下离心2h,并采用常规的5ml注射器收集40%层组分。经此步骤回收的rAAV病毒样品可通过超滤而得到进一步的浓缩和分离纯化。超滤过程是在MWCO=30KDa的超滤浓缩柱中完成的。本发明所述超滤步骤包含每超滤到1ml,即加入150mM NaCl 20mM Tris-HCl溶液反复超滤的程序(共进行三个循环)。最后采用0.22μm PVDF滤膜进行无菌过滤,进行终产物的收集,至此即得到了纯化和浓缩的rAAV载体颗粒产品。
为了尽量减少可复制的野生型rAAV的产生,本发明中将rAAV的基因组序列分别克隆到了三个不同的载体质粒上面。第一个载体质粒是辅助质粒pHelper,提供了生产具感染性的rAAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(例如:E2A,E4和VA RNA基因)。第二个载体质粒是辅助质粒prAAV-RC,包含了编码复制蛋白和病毒衣壳蛋白的rep和cap基因。第三个载体质粒是穿梭质粒prAAV-GFP,提供了真核启动子和当外源序列克隆入多克隆位点(MCS)时哺乳动物细胞高水平基因表达所需的其它元件,载体同时包含了指导病毒复制和包装的AAV反向末端重复序列(ITRs)。将这样的三个质粒共转染HEK293T生产细胞以产生非复制型的rAAV载体颗粒,图解如图2所示。
实施例4 rAAV载体颗粒的质量控制
在实施例1、实施例2、实施例3的基础之上,通过以下检测项对实施例1、实施例2、实施例3制备的rAAV载体颗粒进行质量控制。这些检测项包括滴度检测和纯度检测。
检测项1滴度检测:本发明采用QPCR绝对定量法确定rAAV载体颗粒产品的滴度。该方法可在扩增的每时每刻连续检测样本的荧光值变化,并可在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因进行准确定量、检测,且重复性好。本发明所用QPCR检测引物为EGFP引物,其上游引物序列为:5’-TGCTTCAGCCGCTACCC-3’(SEQ ID NO.1),下游引物序列为:5’-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3’(SEQ ID NO.2)。首先,将20μl rAAV载体颗粒产品用1μl全能核酸酶于37℃水浴30min;4℃,12000rpm,离心10min后,取10μl上清加90μl稀释缓冲液(1.5MTris-HCl pH8.0,0.1M EDTA,1M NaCl),于37℃水浴30min;自然冷却后再加入1μl蛋白酶K,65℃水浴1h;最后,置于95℃水浴中孵育20min,以灭活蛋白酶K。以经上述处理获得的病毒样品为模板配制QPCR反应体系(20μl)。本发明所用QPCR检测试剂为2×SYBR GreenMix。QPCR反应程序为:95℃10min;95℃15s,55℃20s,72℃20s,共40个循环;95℃1min,55℃30s,95℃30s。最后,根据标准曲线计算待测病毒样品中的rAAV基因组拷贝数(vg/ml)。结果,实施例1制备的病毒滴度可达到1E+12vg/ml~2E+13vg/ml。实施例2制备的病毒滴度可达到1E+12vg/ml~2E+13vg/ml。实施例3制备的病毒滴度可达到1E+12vg/ml~2E+13vg/ml。
检测项2纯度检测:eStainTM L1蛋白染色仪用来对经本发明所述生产工艺获得的rAAV载体颗粒产品进行纯度检测。eStainTM L1快速电染色法整合了传统的固定、染色和脱色三步反应,可在短时间内对SDS-PAGE凝胶上的蛋白进行考马斯亮蓝染色,具有高染色效率和高灵敏度。首先,将rAAV载体颗粒产品进行10%SDS-PAGE凝胶电泳,电泳结束后用eStainTM L1蛋白染色仪对凝胶进行染色,采用凝胶成像***对SDS-PAGE凝胶进行拍照并作定量分析,以确定rAAV载体制备物中三种衣壳蛋白的百分含量。
实施例1制备的rAAV载体颗粒检测结果见图4,M泳道代表蛋白质分子量标准,泳道1-4分别代表采用本发明提供的工艺生产的AAV8、AAV9、AAV2和AAV5四种血清型载体颗粒产品的纯度检测结果,电泳结果可见三条特征性的蛋白条带,其大小分别与AAV的三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的大小是一致的,其余杂带不明显;同时,对凝胶成像结果图进行定量分析,检测结果显示VP1、VP2和VP3的总量约占总蛋白量的99%以上,表明用本发明提供的工艺生产的rAAV载体颗粒产品的纯度都很高。同样地,实施例2制备的rAAV载体颗粒中VP1、VP2和VP3的总量约占总蛋白量的99%以上。实施例3制备的rAAV载体颗粒中VP1、VP2和VP3的总量约占总蛋白量的99%以上。
用经上述各检测项检测合格的rAAV载体颗粒产品做动物体内实验和立体定点注射实验,具体地,采用尾静脉注射法将经本发明实施例1提供的工艺生产的AAV5、AAV8、AAV9血清型载体颗粒(rAAV-Luciferase)分别以1×1011vg/只的剂量注射6周龄的C57BL/6小鼠。注射三周后,用IVIS Lumina System进行活体成像,并分析luciferase(荧光素酶)的表达水平。由如图5所示的动物体内实验结果可知,用本发明实施例1提供的工艺生产的AAV5、AAV8和AAV9三种血清型均具有较好的体内感染性且感染具有特异性。采用立体定点注射法将用本发明实施例1提供的工艺生产的AAV9光遗传载体(rAAV9-mCherry)注射Cre小鼠的海马体,注射体积为1.5μl,注射14天后,取脑组织切片观察表达信号,图6B是图6A中灰色方框所圈区域在更高放大倍数下的拍摄图像。同样地,用本发明实施例2和3提供的工艺生产的AAV5、AAV8和AAV9三种血清型也均具有较好的体内感染性且感染具有特异性。
综上所述,本发明结合氯仿处理、碘克沙醇和超滤等工艺从HEK293T细胞培养物中逐步提取、纯化并浓缩重组腺相关病毒载体。本发明提供了基于上述纯化方法而获得的rAAV载体颗粒产品,病毒滴度可达到1E+12vg/ml~2E+13vg/ml,纯度>99%。
本发明提供的生产工艺获得的rAAV载体颗粒能够用于动物体内实验,免疫原性低,可实现外源基因稳定而持久的表达。实际上,生产过程中的每个环节,包括细胞质量、转染实验参数、细胞培养物的收集时间以及细胞维持液的血清含量等,均可以影响所述生产细胞的产毒能力以及后续的浓缩和纯化步骤。因此,严格控制这些实验参数对最终获得的rAAV制剂的质量至关重要。本发明生产的rAAV载体颗粒产品具有高滴度、高纯度和高稳定性的特点,在体外转导和动物体内实验等方面均具有优势用途。本发明所述生产工艺可制备出高度浓缩和纯化的重组腺相关病毒载体产品以用于基因转移和基因治疗。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海吉凯基因化学技术有限公司
<120> 一种重组腺相关病毒载体生产工艺的建立
<130> 170859
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
tgcttcagcc gctaccc 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
agttcacctt gatgccgttc 20
Claims (11)
1.一种重组腺相关病毒载体制备方法,包括如下步骤:
(1)将含有重组腺相关病毒载体基因组序列的质粒转染入培养细胞;
(2)在合适的条件下培养步骤(1)所得细胞,收集细胞培养上清液,所述细胞培养上清液是指含有重组腺相关病毒载体的细胞和培养上清液的混合物;
(3)将步骤(2)所得的细胞培养上清液,进行纯化和浓缩,即得重组腺相关病毒载体。
2.根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于,所述步骤(1)中,重组腺相关病毒载体基因组序列分别位于三个不同的载体质粒上,三个载体质粒分别为pHelper、prAAV-RC、prAAV-GFP。
3.根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于,所述步骤(1)中,所述培养细胞选自HEK293T。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中,将步骤(2)所得的细胞培养上清液中的细胞和培养上清液进行分离,然后向分离后的培养上清液中加入PEG,离心沉淀重组腺相关病毒载体,重悬得PEG沉淀重悬液;分离后的细胞通过反复冻融法进行裂解,细胞裂解液通过微孔过滤器过滤,得过滤液;将所述过滤液与PEG沉淀重悬液合并,获得病毒粗提液。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述PEG为PEG8000。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述微孔过滤器为PES过滤器。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述病毒粗提液通过全能核酸酶进行处理,离心并澄清,然后通过氯仿处理并澄清,回收病毒液。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,回收的病毒液再通过碘克沙醇密度梯度离心进行纯化,回收纯化后的病毒液。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,将回收的纯化后的病毒液采用超滤浓缩柱进行超滤浓缩,获得超滤浓缩后的病毒液。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,将超滤浓缩后的病毒液采用微孔过滤器过滤,进行终产物的收集。
11.如权利要求1~10任一项重组腺相关病毒载体制备方法在重组腺相关病毒载体制备领域的用途。
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