ES2609860T3 - Línea celular para la producción de virus adenoasociado - Google Patents

Abstract

Una célula HEK293 aislada depositada como ATCC n.º PTA-13274.

Description

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DESCRIPCION

Lmea celular para la produccion de virus adenoasociado Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una lmea celular HEK293 que crece en condiciones de suspension libre de componentes animales. La lmea celular es ideal para la produccion rapida y que pueda cambiarse de escala de virus adenoasociados (VAA) y da sustento a la produccion de todos los serotipos y quimeras del VAA.

Antecedentes de la invencion

Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (VAAr) han demostrado una transduccion y expresion genica prolongada con poca a ninguna toxicidad e inflamacion in vivo. Estas caractensticas exclusivas del VAA han conducido a su reconocimiento como un vector importante, candidato para aplicaciones en terapia genica. Se han realizado a nivel mundial diversos ensayos clmicos de Fase I y Fase II utilizando el VAA (Aucoin et al., Biotechnol. Adv. 26:73 (2008); Mueller et al., Gene Ther. 15:858 (2008)). Sin embargo, muchos estudios preclmicos y ensayos clmicos satisfactorios han evidenciado diversos retos que necesitaran abordarse para sostener el uso de los VAAr en terapia genica humana (Mueller et al., Gene Ther. 15:858 (2008)). Un reto importante es el establecimiento de tecnologfas de fabricacion a gran escala en conformidad con las buenas practicas de fabricacion actuales (cGMP, sigla del ingles: current good manufacturing practices) para producir las cantidades del vector purificado necesarias para la creciente necesidad clmica. El exito en la generacion de una tecnologfa de produccion que pueda cambiarse de escala depende en gran medida de la comprension de la biologfa basica del VAA con respecto a la generacion de reactivos tales como lmeas celulares, plasmidos o vectores vmicos recombinantes, etc. que, cuando se utilicen juntos, imiten de forma precisa la produccion del VAA del tipo silvestre.

El VAA se ha clasificado como un dependovirus en la familia de los Parvovirus debido a que requiere la coinfeccion con virus auxiliares tales como el adenovirus (Ad) o los virus del herpes simple (VHS) para la infeccion productiva en cultivo celular (Atchison et al., Science 149:754 (1965); Buller et al., J. Virol. 40:241 (1981)). Los parvovirus estan entre los virus animales de ADN mas pequenos, con un virion de aproximadamente 25 nm de diametro compuesto en su totalidad de protema y ADN. El genoma del VAA es una molecula de ADN monocatenaria lineal que contiene 4679 bases (Srivastava et al., J. Virol. 45:555 (1983)). El genoma del VAA de tipo silvestre (ts) esta compuesto de dos genes que codifican cuatro protemas de replicacion y tres protemas de la capside, respectivamente, y esta flanqueado en cualquiera de los extremos por repeticiones terminales inversas (las ITR) (Lusby et al., J. Virol. 4:402 (1980); Srivastava et al., J. Virol. 45:555 (1983)). Las ITR son los unicos elementos que actuan en cis que son necesarios para la replicacion del genoma y para el empaquetamiento en la capside. Las cuatro protemas de replicacion (Rep 78, 68, 52 y 40) son multifuncionales y desempenan un papel en la transcripcion, en la replicacion del ADN vmico y en el empaquetamiento del ADN en la capside vmca preformada, dentro del nucleo de la celula infectada (Chejanovsky et al., Virology 173:120 (1989); King et al., EMBO J. 20:3282 (2001)). La capside vmca esta compuesta de las tres protemas Vp1, Vp2 y Vp3 en una proporcion de 1:1:8, respectivamente. Las protemas de la capside se producen de la misma fase de lectura abierta (ORF) pero utilizan distintos sitios de inicio de la transduccion.

Debido a que las ITR son los unicos elementos que actuan en cis, que son necesarios para la replicacion y para el empaquetamiento del genoma, los genes rep y cap pueden retirarse y clonarse en un plasmido distinto sin una perdida de la funcion. Despues, pueden clonarse entre las ITR un promotor y un gen de interes inducido por el promotor. Por lo tanto, cualquier gen que este flanqueado por las ITR puede empaquetarse de forma eficaz en una capside de VAA siempre y cuando el genoma tenga un tamano mas pequeno que 5,0 kb (Dong et al., Mol. Ther. 18:87 (2010); Grieger et al., J. Virol. 79:9933 (2005); Wu et al., Mol. Ther. 18:80 (2010)). Sin embargo, el VAA carece aun de la capacidad de replicarse. Una de las caractensticas distintivas del VAA es la necesidad de coinfeccion con un virus auxiliar tal como Ad y VHS. La generacion de VAAr solfa requerir la transfeccion del vector y de las construcciones de empaquetamiento en celulas infectadas con Ad (Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:97 (1992)). Durante de la coinfeccion con Ad o VHS, el VAA utiliza varios genes tempranos del virus auxiliar para facilitar su propia replicacion. La infeccion del Ad en celulas productoras para generar VAAr fue eficaz en la produccion de VAAr, pero una consecuencia era que tambien produda una sobreabundancia de partmulas de Ad. La eliminacion completa del Ad dependfa de tecnicas ffsicas tales como gradientes de CsCl, cromatograffa en columna y una etapa de desneutralizacion por calor para inactivar cualquier partmula de Ad residual que pudiera estar presente todavfa. Aunque la mayona de estos procedimientos ha tenido diversos grados de exito, el potencial de contaminacion con Ad es un riesgo no deseado y la presencia de protemas del Ad desnaturalizadas es inaceptable para el uso clmico. Una mejora significativa en la evolucion en la produccion de VAAr fue la introduccion de la transfeccion plasmfdica triple (Xiao et al., J. Virol. 72:2224 (1998)). Este metodo utilizaba una variacion del plasmido de rep y cap asf como del plasmido de las ITR, pero elimino el uso de la infeccion con Ad. Las protemas del Ad del ARN E1A, E1B, E4 y E2A y VA se clonaron en un unico plasmido llamado XX680. El suministro de los genes del Ad auxiliar en el plasmido XX680 elimino la produccion de Ad en las celulas transfectadas, produciendo solo vector de VAAr. El metodo de triple transfeccion continua como metodo de produccion convencional en la mayona de los laboratorios que experimentan con VAAr. Sin embargo, este metodo se ha limitado al uso de celulas adherentes.

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En los ultimos diez anos se han realizado avances en la produccion de VAAr que han permitido que varios laboratorios abandonen la produccion utilizando celulas HEK293 adherentes y se aproximen a las tecnolog^as que puedan cambiarse de escala, tales como las tecnolog^as basadas en infeccion a traves del uso de adenovirus recombinante (Gao et al., Mol. Ther. 5:644 (2002); Gao et al., Hum. Gene Ther. 9:2353 (1998); Liu et al., Mol. Ther. 2:394 (2000); Liu et al., Gene Ther. 6:293 (1999); Tessier et al., J. Virol. 75:375 (2001)), virus herpes simple (Booth et al., Gene Ther. 11:829 (2004); Conway et al., Gene Ther. 6:986 (1999); Hwang et al., Mol. Ther. 7:s14 (2003); Kang et al., Gene Ther. 16:229 (2009); Thomas et al., Hum. Gene Ther. 20:861 (2009)), el sistema de vector de expresion de baculovirus (SVEB) (Aslanidi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:5059 (2009); Cecchini et al., Gene Ther. 15:823 (2008); Kohlbrenner et al., Mol. Ther. 12:1217 (2005); Negrete et al., Meth. Mol. Biol. 433:79 (2008); Negrete et al., J. Gene Med. 9:938 (2007); Urabe et al., Hum. Gene Ther. 13:1935 (2002); Urabe et al., J. Virol. 80:1874 (2006)) y la transfeccion transitoria de celulas HEK293 en suspension (Durocher et al., J. Virol. Meth. 144:32 (2007); Hildinger et al., Biotechnol. Lett. 29:1713 (2007); Park et al., Biotechnol. Bioeng. 94:416 (2006)). Park et al. y Durocher et al. demostraron que utilizando sus sistemas optimizados de produccion en celulas HEK293 en suspension sin suero se generaban aproximadamente 1,4x104 y 3x104 gv/celula, respectivamente. En estos estudios es comun el hecho de que el rendimiento de vector continua siendo el impedimento y significativamente por debajo de los gv/celula generados a traves de la transfeccion de celulas HEK293 adherentes y del sistema de produccion por VHSr.

La purificacion por cloruro de cesio (CsCl) es todavfa la forma mas ampliamente utilizada de purificacion de VAA (Grieger et al., Nat. Protoc. 1:1412 (2006); Grieger et al., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 99:119 (2005)). Los beneficios del uso de la purificacion por CsCl son su relativo bajo costo, la compatibilidad para cualquier serotipo de VAA y la separacion de partmulas vadas de las que contienen genoma. Sin embargo, varias desventajas han devaluado este metodo para aplicaciones clmicas, incluyendo: (1) el tiempo y esfuerzo necesarios para identificar las fracciones que contienen virus dentro de multiples realizaciones de purificaciones por gradientes de CsCl; (2) que el virus resultante contiene muchas impurezas ademas del cesio; (3) los impedimentos para el cambio de escala; y (4) numerosas etapas abiertas durante la purificacion (Brument et al., Mol. Ther. 6:678 (2002); Chahal et al., J. Virol. Meth. 139:61 (2007); Hermens et al., Hum. Gene Ther. 10:1885 (1999); Kaludov et al., Hum. Gene Ther. 13:1235 (2002); Smith et al., J. Virol. Meth. 114:115 (2003); Zolotukhin, Hum. Gene Ther. 16:551 (2005)). Los experimentos realizados por Hermens et al. y Zolotukin et al. mostraron que un medio para gradiente de densidad llamado iodixanol era muy eficaz en el aislamiento del VAA2, despues de una etapa adicional de purificacion utilizando cromatograffa de afinidad con heparina (Hermens et al., Hum. Gene Ther. 10:1885 (1999); Zolotukhin et al., Gene Ther. 6:973 (1999); Zolotukhin et al., Methods 28:158 (2002)). La advertencia acerca de este sistema era la incapacidad para purificar otros serotipos de VAA y que las capsides quimericas carecen de afinidad por el sulfato de heparina, regresando asf la purificacion del VAAr por CsCl. Ha habido varios otros intentos de purificacion sin el uso de CsCl, incluyendo la manipulacion de capsides vmcas con epftopos (Koerber et al., Hum. Gene Ther. 18:367 (2007)) y diversas formas de cromatograffa (Brument et al., Mol. Ther. 6:678 (2002); Chahal et al., J. Virol. Meth. 139:61 (2007); Davidoff et al., J. Virol. Meth. 121:209 (2004); Gao et al., Hum. Gene Ther. 11:2079 (2000); Hermens et al., Hum. Gene Ther. 10:1885 (1999); Kaludov et al., Hum. Gene Ther. 13:1235 (2002); Smith et al., J. Virol. Meth. 114:115 (2003); Zolotukhin et al., Gene Ther. 6:973 (1999); Zolotukhin et al., Methods 28:158 (2002)). El uso de la cromatograffa de intercambio ionico ha mostrado purificar de forma satisfactoria varios serotipos del VAA. Brument et al. y Davidoff et al. utilizaron un sistema de dos columnas para purificar los serotipos de vAa 2, 5 y 8 (Brument et al., Mol. Ther. 6:678 (2002); Davidoff et al., J. Virol. Meth. 121:209 (2004)). Zolotukhin et al. demostro que el uso de iodixanol, ademas del intercambio ionico utilizando una columna de Q-Sefarosa, tema la capacidad de purificar los serotipos 1, 2 y 5 (Zolotukhin et al., Methods 28:158 (2002)). Estos metodos se mostraron como muy promisorios en la purificacion del VAA pero eran solo eficaces con los serotipos especificados. Todavfa tiene que identificarse un metodo universal que pueda purificar todos los serotipos del VAA.

La presente invencion proporciona una lmea celular HEK293 que crece en condiciones de suspension libre de componentes animales y que puede utilizarse en un sistema de produccion de VAA que es rapido, puede cambiarse de escala, produce tftulos elevados y funciona con todos los serotipos y quimeras de VAA.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere al desarrollo de un procedimiento de fabricacion que puede cambiarse de escala para vectores de VAA, que genera de forma eficaz vectores de VAA con elevado tftulo, elevadamente puros y en grandes cantidades. El desarrollo del procedimiento incluyo la generacion de una lmea celular HEK293 que crece en condiciones de suspension libre de componentes animales

Un aspecto de la invencion se refiere a una celula HEK293 aislada depositada como ATCC No. PTA-13274.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo de produccion de partmulas de VAA, que comprende: (a) proporcionar a las celulas HEK293 de la invencion un sistema de expresion de VAA; (b) cultivar las celulas en condiciones en las que las partmulas de VAA se produzcan y (c) de forma opcional aislar las partmulas de VAA.

Estos y otros aspectos de la invencion se exponen con mas detalle en la descripcion de la invencion a continuacion.

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Breve descripcion de los dibujos.

Las figuras 1A-1B muestran la optimizacion de las proporciones de plasmidos de la transfeccion triple y los volumenes del coctel de transfeccion. (A) Para determinar la proporcion de plasmido optima para la produccion de vector de VAAr se exploraron proporciones variables de los plasmidos XX680, auxiliar de rep/cap de VAA y TR. (B) Para determinar las condiciones de transfeccion optimas se probaron volumenes variables de coctel de transfeccion con una proporcion de reactivo de transfeccion (qmmico o lipfdico) con respecto a ADN de 2:1 y un tiempo de incubacion. El volumen porcentual de coctel de transfeccion es en referencia al porcentaje del volumen final del cultivo celular.

Las figuras 2A-2B muestran los experimentos de optimizacion de la densidad celular para la transfeccion y el impacto de la antiguedad del cultivo celular sobre la produccion de vector. (A) Se transfectaron 1 x 106 y 2x 106 celulas viables/ml con de 1 a 2 |jg de ADN plasmfdico (plasmido XX680: auxiliar de rep/cap de VAA:TR 2:1,5:1). (B) Se transfectaron celulas de pase bajo, medio y alto utilizando parametros optimizados, para determinar si la antiguedad del cultivo celular inflrna en la eficacia de transfeccion y la produccion de VAAr.

Las figuras 3A-3B ilustran la pureza de las fracciones del pico de elucion de VAA despues de la cromatograffa en columna a traves de tincion de plata y la microscopfa electronica de transmision (MET) de tincion negativa.

Las figuras 4A-4B evidencian la produccion y purificacion de los serotipos de VAAr 1-6, 8 y 9 monocatenarios y autocomplementarios utilizando las condiciones de produccion y purificacion optimizadas. Para cada serotipo se transfecto un litro de cultivo celular en un matraz agitador. Se calcularon para cada serotipo los tftulos de los lisados celulares y pospurificacion, ademas de la proporcion gv:UT, utilizando celulas HeLaRC32 (veanse los metodos). (A) Imagen de la tincion de plata de los serotipos 1-6, 8 y 9 monocatenarios pospurificacion. (B) Transferencia de Southern de los VAAr1-6, 8 y 9 autocomplementarios. Se aislaron genomas de vector a partir de cada capside de serotipo y se corrieron en un gel de agarosa alcalina.

La figura 5 muestra la tincion negativa de las imagenes por MET de los serotipos de VAAr 1-6, 8 y 9 monocatenarios y autocomplementarios. Se determinaron para cada serotipo las proporciones de las capsides vacfas con respecto a las llenas a base de las imagenes por MET de tincion negativa.

La figura 6 muestra las imagenes in vivo de ratones inyectados con 1x1011 gv de los vectores CBA-Luc de VAA6, 8, y 9. Los vectores CBA-Luciferasa (promotor de la beta actina de pollo-luciferasa) se administraron a cada raton a traves de inyeccion en la vena de la cola. Los vectores CBA-Luc generados a partir de celulas HEK293 en suspension se purificaron a traves de gradiente de densidad discontinuo/cromatograffa en columna y los generados a partir de celulas HEK293 adherentes se purificaron a traves de gradientes de densidad de CsCl. Se tomaron imagenes de los ratones (A) la semana y (B) al mes. Los ratones de control se inyectaron con PBS. El intervalo de fotones de VAA8 y 9 se establecio de 5x10° a 1x108. Para VAA6 se establecio en de 5x104 a 1x106. El tiempo de exposicion fue de 1 minuto para VAA8 y 9, y 5 de minutos para VAA 6.

Las figuras 7A-7B muestran la concentracion de los vectores VAAr monocatenarios y autocomplementarios por purificacion. (A) Tincion negativa de imagenes de MET de vector VAAr preconcentrado y (B) vector VAAr posconcentrado.

La figura 8 muestra una lmea de tiempo de la produccion de vector VAAr utilizando celulas HEK293 en suspension, cultivadas y transfectadas en matraces agitadores y en biorreactores por ondas.

La figura 9 muestra la produccion y recogida continua de VAAr8 y VAAr9 a partir del medio del cultivo de HEK293 en suspension. El rendimiento total representa los rendimientos de sedimento celular de todos los puntos de tiempo medios y a las 120 horas juntos. El control de sedimento celular de 48 horas representa el rendimiento a partir de una recogida convencional a las 48 horas postransfeccion, como se describe en el presente documento.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se describira ahora con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales se muestran las realizaciones preferentes de la invencion. Sin embargo, esta invencion puede realizarse de distintas formas y no debe considerarse como limitada a las realizaciones expuestas en el presente documento. Mas bien, estas realizaciones se proporcionan de forma que la presente divulgacion sea exhaustiva y completa, y transmita completamente el ambito de la invencion a los expertos en la materia.

A menos que se definan de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tiene el mismo significado como lo entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la invencion. La terminologfa utilizada en la descripcion de la invencion en el presente documento tiene solo el objetivo de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa de la invencion. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad.

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Las secuencias de nucleotidos se presentan en el presente documento solo de forma monocatenaria, en direccion 5' a 3', de izquierda a derecha, a menos que se indique otra cosa de forma espedfica. Los nucleotidos y aminoacidos se representan en el presente documento de la forma que recomienda la Comision de Nomenclature Bioqmmica IUPAC-IUB, o (para los aminoacidos) mediante ya sea el codigo de una letra o el codigo de tres letras, ambos en conformidad con 37 CFR §1.822 y el uso establecido. Vease, por ejemplo, el Manual del Usuario de PatentIn, 99-102 (Nov. de 1990) (Oficina de patentes y marcas de EE.UU.).

Salvo que se indique otra cosa, pueden utilizarse metodos convencionales conocidos para los expertos en la materia para la construccion de las construcciones VAAr, de los vectores de empaquetamiento que expresan las secuencias Rep y/o Cap del VAA y para transfectar de forma transitoria y estable las celulas de empaquetamiento. Tales tecnicas son conocidas para los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, SAMBROOK et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2a Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989); AUSUBEL et al. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).

Ademas, la presente invencion tambien contempla que, en algunas realizaciones de la invencion, pueda excluirse u omitirse cualquier caractenstica o combinacion de caractensticas expuestas en el presente documento.

Definiciones

En la descripcion del presente documento y las reivindicaciones adjuntas se utilizan los siguientes terminos:

Las formas singulares “un” y “una” se pretende que incluyan tambien las formas plurales, a menos que el contexto indique de forma clara otra cosa.

Ademas, el termino “aproximadamente”, como se utiliza en el presente documento cuando se hace referencia a un valor medible, tal como una cantidad de la longitud de la secuencia de un polinucleotido o polipeptido, la dosis, el tiempo, la temperatura y similares, se entiende que abarca variaciones del 20 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, o incluso el 0,1 % de la cantidad especificada.

Tambien, como se utiliza en el presente documento, “y/o” se refiere a y abarca cualquiera y todas las posibles combinaciones de uno o mas de los puntos enumerados asociados, asf como la falta de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa (“o”).

Como se utiliza en el presente documento, la frase de transicion “que consiste esencialmente en” se interpretara como que abarca los materiales o etapas mencionados “y aquellos que no afectan de forma material la caractenstica (o caractensticas) basica y nueva” de la invencion reivindicada (por ejemplo, la replicacion de VAAr). Vease, En re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (enfasis en el original); vease tambien MPEP § 2111.03. Por lo tanto, la expresion “que consiste esencialmente en”, como se utiliza en el presente documento, no debe interpretarse como equivalente de “que comprende”.

El termino “parvovirus” como se utiliza en el presente documento abarca la familia Parvoviridae, incluyendo a los parvovirus y dependovirus que replican de forma autonoma. Los parvovirus autonomos incluyen miembros del genero Parvovirus, Erythrovirus, Densovirus, Iteravirus y Contravirus. Los parvovirus autonomos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, el virus diminuto del raton, el parvovirus bovino, el parvovirus canino, el parvovirus del pollo, panleucopenia felina, el parvovirus felino, el parvovirus del ganso, el parvovirus H1, el parvovirus del pato de Berbena, el parvovirus de serpiente y el virus B19. Los expertos en la materia conocen otros parvovirus autonomos. Vease, por ejemplo, FIELDS et al. VIROLOGY, volumen 2, capftulo 69 (4a edicion, Lippincott-Raven Publishers).

El genero Dependovirus contiene a los virus adenoasociados (VAA), que incluyen, pero sin limitacion, el VAA tipo 1, VAA tipo 2, VAA tipo 3 (incluyendo los tipos 3A y 3B), VAA tipo 4, vAa tipo 5, VAA tipo 6, VAA tipo 7, VAA tipo 8, VAA tipo 9, VAA tipo 10, VAA tipo 11, vAA tipo 12, vAa tipo 13, el VAA aviar, el VAA bovino, el VAA canino, el VAA de cabra, el VAA de serpiente, el VAA equino y el VAA ovino. Vease, por ejemplo, FIELDS et al. VIROLOGY, volumen 2, capftulo 69 (4a edicion, Lippincott-Raven Publishers); y la Tabla 1.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “virus adenoasociado” (VAA) incluye, pero sin limitacion, VAA tipo 1, VAA tipo 2, VAA tipo 3 (incluyendo los tipos 3A y 3B), VAA tipo 4, vAa tipo 5, VAA tipo 6, VAA tipo 7, VAA tipo 8, VAA tipo 9, VAA tipo 10, VAA tipo 11, VaA tipo 12, VAA tipo 13, VAA de serpiente, VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino, VAA ovino, VAA de cabra, VAA de camaron y cualquier VAA conocido o descubierto mas tarde. Vease, por ejemplo, FIELDS et al. VIROLOGY, volumen 2, capftulo 69 (4a edicion, Lippincott- Raven Publishers). Se han identificado varios serotipos y clados de VAA relativamente nuevos (vease, por ejemplo, Gao et al., J. Virol. 78:6381 (2004); Moris et al., Virol. 33:375 (2004); y la Tabla 1).

Tabla 1

Genomas completos

Numero de referencia GenBank N.° de ref. GenBank N.° de ref. GenBank

Hu T88 AY695375 Hu42 AY530605

Virus adenoasociado 1

NC_002077, AF063497 Hu T71 AY695374 Hu67 AY530627

Virus adenoasociado 2

NC 001401 Hu T70 AY695373 Hu40 AY530603

Virus adenoasociado 3

NC 001729 Hu T40 AY695372 Hu41 AY530604

Virus adenoasociado 3B

NC-001863 Hu T32 AY695371 Hu37 AY530600

Virus adenoasociado 4

NC 001829 Hu T17 AY695370 Rh40 AY530559

Virus adenoasociado 5

Y18065, AF085716 Hu LG15 AY695377 Rh2 AY243007

Virus adenoasociado 6

NC_001862 o o Q) Q_ O Bb1 AY243023

VAA aviar ATCC VR- 865

AY186198, AY629583, NC 004828 Hu9 AY530629 Bb2 AY243022

VAA aviar cepa de DA-1

NC_006263, AY629583 Hu10 AY530576 Rh10 AY243015

VAA bovino

NC 005889, AY388617 Hu11 AY530577 Hu17 AY530582

Clado A

Hu53 AY530615 Hu6 AY530621

VAA1

NC 002077, AF063497 Hu55 AY530617 Rh25 AY530557

VAA6

NC 001862 Hu54 AY530616 Pi2 AY530554

Hu.48

AY530611 Hu7 AY530628 Pi1 AY530553

Hu 43

AY530606 Hu18 AY530583 Pi3 AY530555

Hu 44

AY530607 Hu15 AY530580 Rh57 AY530569

Hu 46

AY530609 Hu16 AY530581 Rh50 AY530563

Clado B

Hu25 AY530591 Rh49 AY530562

Hu. 19

AY530584 Hu60 AY530622 Hu39 AY530601

Hu. 20

AY530586 Ch5 AY243021 Rh58 AY530570

Hu 23

AY530589 Hu3 AY530595 Rh61 AY530572

Hu22

AY530588 Hu1 AY530575 Rh52 AY530565

Hu24

AY530590 Hu4 AY530602 Rh53 AY530566

Hu21

AY530587 Hu2 AY530585 Rh51 AY530564

Hu27

AY530592 Hu61 AY530623 Rh64 AY530574

Hu28

AY530593 Clado D Rh43 AY530560

Hu 29

AY530594 Rh62 AY530573 VAA8 AF513852

Hu63

AY530624 Rh48 AY530561 Rh8 AY242997

Hu64

AY530625 Rh54 AY530567 Rh1 AY530556

Hu13

AY530578 Rh55 A530568 Clado F

Hu56

AY530618 Cy2 AY243020 Hu14 (VAA9) AY530579

Hu57

AY530619 VAA7 AF513851 Hu31 AY530596

Hu49

AY530612 Rh35 AY243000 Hu32 AY530597

Hu58

AY530620 Rh37 AY242998 Aislado clonal

Hu34

AY530598 Rh36 AY242999 VAA5 Y18065, AF085716

Hu35

AY530599 Cy6 AY243016 VAA3 NC 00172 9

VAA2

NC 001401 Cy4 AY243018 VAA3B NC 00186 3

Hu45

AY530608 Cy3 AY243019 VAA4 NC 00182 9

Hu47

AY530610 Cy5 AY243017 Rh34 AY243001

Hu51

AY530613 Rh13 AY243013 Rh33 AY243002

Hu52

AY530614 m o Q) Q_ O Rh32 AY243003

Hu T41

AY695378 Rh38 AY530558

Hu S17

AY695376 Hu66 AY530626

En la tecnica se conocen las secuencias genomicas de diversos serotipos del VAA, asf como las secuencias de las ITR nativas, las protemas Rep y las unidades de capside. Tales secuencias pueden encontrarse en la bibliograffa o 5 en bases de datos publicas tales como GenBank. Veanse, por ejemplo, los numeros de referencia GenBank NC_002077, C_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001862, NC_000883, NC_001701,

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NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, AY631966, AX753250, EU285562, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852 y AY530579; las divulgaciones de los cuales se incorporan como referencia en el presente documento para la ensenanza de las secuencias de acido nucleico y de aminoacidos del VAA. Vease tambien, por ejemplo, Bantel-Schaal et al., J. Virol. 73:939 (1999); Chiorini et al., J. Virol. 71:6823 (1997); Chiorini et al., J. Virol. 73:1309 (1999); Gao et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854 (2002); Moris et al., Virology, 33:375 (2004); Mori et al., Virology, 330:375 (2004); Muramatsu et al., Virology, 221:208 (1996); Ruffing et al., J. Gen. Virol. 75:3385 (1994); Rutledge et al., J. Virol. 72:309 (1998); Schmidt et al., J. Virol. 82:8911 (2008); Shade et al., J. Virol. 58:921 (1986); Srivastava et al., J. Virol. 45:555 (1983); Xiao et al., J. Virol. 73:3994 (1999); publicaciones de patente internacional WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244 y la patente de Estados Unidos N.° 6.156.303; las divulgaciones de las cuales se incorporan como referencia en el presente documento para la ensenanza de las secuencias de acido nucleico y de aminoacidos del VAA. Vease tambien la Tabla 1. Se proporciona una descripcion anterior de las secuencias de la ITR del VAA1, VAA2, y VAA3 en Xiao, X., (1996), "Characterization of Adeno- associated virus (VAA) DNA replication and integration", lectura de tesis doctoral, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA (incorporado en el presente documento en su totalidad).

El termino “tropismo”, como se usa en el presente documento, se refiere a la entrada del virus en la celula, de forma opcional y preferente seguido por la expresion (por ejemplo, transcripcion y, de forma opcional, traduccion) en la celula de secuencias que transporta el genoma vmco, por ejemplo, para un virus recombinante, expresion de la secuencia (o secuencias) de nucleotidos heterologa. Los expertos en la materia apreciaran que la transcripcion de una secuencia de acido nucleico heterologa a partir del genoma vmco puede no iniciarse en ausencia de factores que actuan en trans, por ejemplo, para un promotor inducible o una secuencia de acido nucleico regulada de otra forma. En el caso del VAA, la expresion genica a partir del genoma vmco puede ser a partir de un provirus integrado de forma estable, a partir de un episoma no integrado, asf como cualquier otra forma que puede tomar al virus dentro de la celula.

Como se utiliza en el presente documento, “transduccion” o “infeccion” de una celula por un VAA significa que el VAA entra en la celula para establecer una infeccion activa (es decir, lttica). Como se utiliza en el presente documento, “transduccion” de una celula por VAA significa que el VAA entra en la celula para establecer una infeccion latente. Vease, por ejemplo, FIELDS et al. VIROLOGY, volumen 2, capftulo 69 (4a ed., Lippincott-Raven Publishers).

Las expresiones “porcion 5'” y “porcion 3'” son terminos relativos para definir una relacion espacial entre dos o mas elementos. Por lo tanto, por ejemplo, una “porcion 3'” de un polinucleotido indica un segmento del polinucleotido que esta cadena abajo de otro segmento. No se pretende que el termino “porcion 3'” indique que el segmento necesariamente esta en el extremo 3' del polinucleotido, o incluso que este necesariamente en la mitad 3' del polinucleotido, aunque podna ser el caso. Asimismo, una “porcion 5” de un polinucleotido indica un segmento del polinucleotido que esta cadena arriba de otro segmento. No se pretende que la expresion “porcion 5'” indique que el segmento esta necesariamente en el extremo 5' del polinucleotido, o incluso que esta necesariamente en la mitad 5' del polinucleotido, aunque podna ser el caso.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “polipeptido” abarca tanto a peptidos como protemas, a menos que se indique otra cosa.

Un "polinucleotido" es una secuencia de bases nucleotidicas, y pueden ser secuencias de ARN, ADN o hnbridas ADN-ARN (que incluyen tanto nucleotidos de origen natural como no natural), y que pueden ser ya sea secuencias de ADN monocatenario o bicatenario.

Como se utiliza en el presente documento, un polinucleotido “aislado” (por ejemplo, un “ADN aislado” o un “ARN aislado” significa un polinucleotido separado o sustancialmente libre de al menos alguno de los otros componentes del organismo o virus de origen natural, por ejemplo, los componentes estructurales celulares o vmcos (por ejemplo, la pared celular o la membrana celular) u otros polipeptidos o acidos nucleicos hallados comunmente asociados con el polinucleotido. En algunas realizaciones, un polinucleotido aislado es uno que esta al menos aproximadamente el 20 % puro, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % puro.

Asimismo, un polipeptido “aislado” significa un polipeptido que esta separado o sustancialmente libre de al menos alguno de los otros componentes del organismo o virus de origen natural, por ejemplo, los componentes estructurales, celulares o vmcos (por ejemplo, la pared celular o la membrana celular) u otros polipeptidos o acidos nucleicos hallados comunmente asociados con el polipeptido. En algunas realizaciones, un polipeptido aislado es uno que esta al menos aproximadamente al 20 % puro, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 % puro.

Un “polipeptido terapeutico” es un polipeptido que puede aliviar o reducir los smtomas que resultan de una ausencia de, o el defecto de, una protema en una celula o sujeto. Como alternativa, un “polipeptido terapeutico” es uno que confiere de otra forma un beneficio a un sujeto, por ejemplo, efectos anticancerosos o una mejora en la supervivencia al trasplante.

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Como se utiliza en el presente documento, el termino “modificado” como se aplica a una secuencia de polinucleotido o polipeptido, se refiere a una secuencia que difiere de una secuencia de tipo silvestre debido a una o mas deleciones, adiciones, sustituciones o cualquier combinacion de las mismas.

Como se utiliza en el presente documento, por “aislar” o “purificar” (o equivalentes gramaticales) un vector de virus, se entiende que el vector de virus esta separado al menos de forma parcial de al menos alguno de los otros componentes en el material inicial.

Por los terminos “tratar”, “que trata” o “tratamiento de" (y las variaciones gramaticales de los mismos) se entiende que la gravedad de la afeccion del sujeto se reduce, al menos se mejora o estabiliza de forma parcial y/o se consigue algo de alivio, mitigacion, disminucion o estabilizacion en al menos un smtoma clmico, y/o existe un retardo en la evolucion de la enfermedad o trastorno.

Los terminos “prevenir”, “que previene” y “prevencion” (y las variaciones gramaticales de los mismos) se refieren a la prevencion y/o retardo del inicio de una enfermedad, trastorno y/o un smtoma (o smtomas) clmico en un sujeto y/o una reduccion en la gravedad del inicio de la enfermedad, trastorno y/o smtoma (o smtomas) clmico con respecto a lo que se producina en ausencia de los metodos de la invencion. La prevencion puede ser completa, por ejemplo, la ausencia total de enfermedad, trastorno y/o smtoma (o smtomas) clmico. La prevencion tambien puede ser parcial, de forma que la aparicion de la enfermedad, trastorno y/o smtoma (o smtomas) clmico en el sujeto y/o la gravedad del inicio es menor que lo que se producina en ausencia de la presente invencion.

Una cantidad de “tratamiento eficaz” como se utiliza en el presente documento, es una cantidad que es suficiente para proporcionar alguna mejora o beneficio al sujeto. Como se indica alternativamente, una cantidad de “tratamiento eficaz” es una cantidad que proporcionara algo de alivio, mitigacion, disminucion o estabilizacion de al menos un smtoma clmico en el sujeto. Los expertos en la materia apreciaran que los efectos terapeuticos no necesitan ser completos o curativos, siempre y cuando se proporcione al sujeto algo de beneficio.

Una cantidad de “prevencion eficaz” como se utiliza en el presente documento, es una cantidad que es suficiente para prevenir y/o retardar el inicio de una enfermedad, trastorno y/o smtomas clmicos en un sujeto, y/o para reducir y/o retardar la gravedad del inicio de una enfermedad, trastorno y/o smtomas clmicos en un sujeto con respecto a lo que se producina en ausencia de los metodos de la invencion. Los expertos en la materia apreciaran que el nivel de prevencion no necesita ser completo, siempre y cuando se proporcione al sujeto algo de beneficio.

Las expresiones “secuencia de nucleotidos heterologa” y “acido nucleico heterologo” se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una secuencia que no es de origen natural en el virus. En general, el acido nucleico heterologo comprende una fase de lectura abierta que codifica un polipeptido o ARN no traducido de interes (por ejemplo, para el suministro a una celula o sujeto).

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “vector de virus”, “vector”, o “vector de suministro genico” se refiere a una partmula de virus (por ejemplo, VAA) que funciona como un vehmulo de suministro de acido nucleico y que comprende el genoma del vector (por ejemplo, ADN vmco [ADNv]) empaquetado dentro de un virion. Como alternativa, en algunos contextos, el termino “vector” puede utilizarse para referirse al genoma del vector/ADNv solo.

Los vectores de virus de la invencion pueden adicionalmente ser partmulas de VAA en duplex, como se describe en la publicacion de patente internacional WO 01/92551 (la divulgacion de la cual se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad). Por lo tanto, en algunas realizaciones, pueden empaquetarse en las capsides de virus genomas bicatenarios (duplex).

Un “genoma de vector de VAAr” o “genoma de VAAr” es un genoma de VAA (es decir, ADNv) que comprende una o mas secuencias de acido nucleico heterologas. Los vectores de VAAr en general necesitan solo la ITR de 145 bases en cis para generar virus. Todas las otras secuencias vmcas son prescindibles y pueden suministrarse en trans (Muzyczka, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97 (1992)). Normalmente, el genoma de vector de VAAr solo conservara una o mas secuencias de ITR, de forma que se maximice el tamano del transgen que el vector puede empaquetar de forma eficaz. Las secuencias que codifican las protemas estructurales y no estructurales pueden proporcionarse en trans (por ejemplo, a partir de un vector, tal como un plasmido o integrando de forma estable las secuencias en una celula empaquetadora). En realizaciones de la invencion el genoma de vector de VAAr comprende al menos una secuencia ITR (por ejemplo, la secuencia ITR de VAA), de forma opcional dos ITR (por ejemplo, dos ITR de VAA), las cuales normalmente estaran en los extremos 5' y 3' del genoma de vector y flanquearan el acido nucleico heterologo, pero no necesitan estar contiguas al mismo. Las ITR pueden ser la misma o distintas entre sf.

Un “sistema de expresion de VAA” es un sistema de uno o mas polinucleotidos que son suficientes, cuando se introducen en una celula hospedadora adecuada, para sustentar la produccion de VAAr. Un sistema de expresion de VAA normalmente incluye polinucleotidos que codifican rep y cap del VAA, los genes auxiliares y un genoma de VAAr. Un ejemplo de un sistema de expresion de VAA es el metodo de transfeccion triple.

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La expresion “repeticion terminal” o “TR” incluyen cualquier repeticion terminal vmca o sintetica que forma una estructura en horquilla y funciona como una repeticion terminal inversa (es dedr, media funciones deseadas tales como la replicacion, el empaquetamiento de virus, la integracion y/o el rescate de provirus, y similares). La ITR puede ser una ITR de VAA o una ITR que no es de VAA. Por ejemplo, puede utilizarse como un ITR una secuencia de ITR que no es de VAA tal como las de otros parvovirus (por ejemplo, parvovirus canino, parvovirus bovino, parvovirus de raton, parvovirus porcino, parvovirus humano B-19) o la horquilla del SV40, que sirve como el origen de replicacion del SV40, las cuales pueden modificarse adicionalmente mediante truncamiento, sustitucion, delecion, insercion y/o adicion. Adicionalmente, la ITR puede ser parcialmente o completamente sintetica, tal como la “secuencia doble D” como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.478.745 para el beneficio de Samulski et al.

Los genomas de VAA tienen secuencias palindromicas tanto en sus extremos 5' como 3'. La naturaleza palindromicas de las secuencias conduce a la formacion de una estructura en horquilla que se estabiliza mediante la formacion de enlaces de hidrogeno entre los pares de bases complementarias. Se cree que la estructura en horquilla adopta una forma de “Y” o una de “T”. Vease, por ejemplo, FIELDS et al. VIROLOGY, volumen 2, capttulos 69 y 70 (4a edicion, Lippincott-Raven Publishers).

Una “repeticion terminal invertida de VAA” o “ITR de VAA” puede proceder de cualquier VAA, incluyendo, pero sin limitacion los serotipos 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 13, VAA de serpiente, VAA aviar, VAA bovino, VAA canino, VAA equino, VAA ovino, VAA de cabra, VAA de camaron o cualquier otro VAA conocido o descubierto mas tarde (vease, por ejemplo, la Tabla 1). Una ITR de VAA no necesita tener la secuencia de repeticion terminal nativa (por ejemplo, una secuencia de ITR de VAA nativa puede alterarse mediante insercion, delecion, truncamiento y/o mutaciones sin sentido), siempre y cuando la repeticion terminal medie las funciones deseadas, por ejemplo, la replicacion, el empaquetamiento de virus, la integracion y/o el rescate de provirus, y similares.

Los vectores de virus de la invencion pueden adicionalmente ser vectores de virus “direccionados” (por ejemplo, que tengan un tropismo dirigido) y/o un VAA “hforido” (es decir, en el cual las ITR vmcas y la capside vmca sean de distintos VAA u otros parvovirus), como se describe en la publicacion de patente internacional WO 00/28004 y Chao et al., Mol. Therapy 2:619 (2000). En otras realizaciones, los vectores de virus son VAA “quimericos” (es decir, en los cuales las protemas de la capside son de mas de un serotipo y/o las protemas de la capside estan modificadas para contener secuencias de mas de un serotipo).

Adicionalmente, la capside o elementos genomicos vmcos pueden contener otras modificaciones, que incluyen inserciones, deleciones y/o sustituciones.

El termino “molde” o “sustrato” se utiliza en el presente documento para referirse a una secuencia de polinucleotido que puede replicarse para producir el ADN vmco de VAA. Para el fin de la produccion de vector, el molde normalmente se incluira dentro de una secuencia de nucleotidos o construccion mas grande, incluyendo, pero sin limitacion un plasmido, vector de ADN desnudo, cromosoma artificial bacteriano (por el acronimo en ingles, BAC), cromosoma artificial de levadura (por el acronimo en ingles, YAC) o un vector vmco (por ejemplo, vectores de adenovirus, herpesvirus, virus de Epstein-Barr, VAA, baculovmcos, retrovmcos y similares). Como alternativa, el molde puede incorporarse de forma estable en el cromosoma de una celula empaquetadora.

Como se utiliza en el presente documento, “secuencias que codifican Rep” de VAA indica las secuencias de acido nucleico que codifican las protemas no estructurales del VAA que median la replicacion vmca y la produccion de nuevas partfculas de virus. Los genes y protemas de replicacion de VAA se han descrito en, por ejemplo, FIELDS et al. VIROLOGY, volumen 2, capttulos 69 y 70 (4a edicion, Lippincott-Raven Publishers).

Las “secuencias que codifican Rep” no necesitan codificar todas las protemas Rep del VAA. Por ejemplo, con respecto al VAA, las secuencias que codifican Rep no necesitan codificar las cuatro protemas Rep del VAA (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40), de hecho, se cree que el VAA5 solo expresa las protemas Rep68 y Rep40 cortadas y empalmadas. En realizaciones representativas, las secuencias que codifican Rep codifican al menos las protemas de replicacion que son necesarias para la replicacion y el empaquetamiento del genoma vmco en los viriones nuevos. En general, las secuencias que codifican Rep codificaran al menos una protema Rep grande (es decir, Rep78/68) y una protema Rep pequena (es decir, Rep52/40). En realizaciones particulares, las secuencias que codifican Rep codifican la protema Rep78 de VAA y las protemas Rep 52 y/o Rep40 de VAA. En otras realizaciones, las secuencias que codifican Rep codifican las protemas Rep68 y la Rep52 y/o Rep40. En aun otra realizacion adicional, las secuencias que codifican Rep codifican las protemas Rep68 y Rep 52, las protemas Rep68 y Rep40, las protemas Rep78 y Rep52, o las protemas Rep78 y Rep40.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “protema Rep grande” se refiere a Rep68 y/o Rep78. Las protemas Rep grandes pueden ser ya sea de tipo silvestre o sinteticas. Una protema Rep grande de tipo silvestre puede proceder de cualquier VAA, incluyendo, pero sin limitacion los serotipos 1, 2, 3a, 3b, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 13, o cualquier otro VAA conocido ahora o descubierto mas tarde (vease, por ejemplo, la Tabla 1). Una protema Rep grande sintetica puede estar modificada mediante insercion, delecion, truncamiento y/o mutaciones sin sentido.

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Los expertos en la materia apreciaran adicionalmente que no es necesario que las protemas de replicacion esten codificadas en el mismo polinucleotido. Por ejemplo, el promotor p19 del VAA puede estar inactivo y la protema (o protemas) Rep grande expresarse a partir de un polinucleotido y la protema (o protemas) Rep pequena expresarse a partir de un polinucleotido distinto. Normalmente, sin embargo, sera mas conveniente expresar las protemas de replicacion a partir de una unica construccion. En algunos sistemas, los promotores vmcos (por ejemplo, promotor p19 del VAA) pueden no ser reconocidos por la celula y, por lo tanto, es necesario expresar las protemas Rep grande y pequena a partir de casetes de expresion distintos. En otros casos, puede ser conveniente expresar las protemas Rep grande y Rep pequena de forma separada, es decir, bajo el control de elementos de control transcripcional y/o traduccional separados. Por ejemplo, puede ser conveniente controlar la expresion de las protemas Rep grandes, de forma que se disminuya la proporcion de grande con respecto a la pequena.

Protemas Rep. En el caso de celulas de insecto, puede ser ventajosos regular de forma negativa la expresion de las protemas Rep grandes (por ejemplo, Rep78/68) para evitar la toxicidad para las celulas (vease, por ejemplo, Urabe et al., Hum. Gene Ther. 13:1935 (2002)).

Como se utiliza en el presente documento, las “secuencias que codifican cap” del VAA codifican las protemas estructurales que forman una capside de VAA funcional (es decir, pueden empaquetar ADN y pueden infectar celulas diana). Normalmente, las secuencias que codifican cap codificaran todas las subunidades de la capside de VAA, pero pueden estar codificadas menos que todas las subunidades de la capside siempre y cuando se produzca la capside funcional. Normalmente, pero no necesariamente, las secuencias que codifican cap estaran presentes en una unica molecula de acido nucleico. La estructura de la capside del VAA se describe con mas detalle en BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volumen 2, capttulos 69 y 70 (4a edicion, Lippincott-Raven Publishers).

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “libre de componentes animales” se refiere a un medio de cultivo u otra composicion que no contiene ningun producto extrafdo o purificado a partir de animales o de celulas animales, incluyendo suero, enzimas, carbohidratos, acidos nucleicos, protemas, anticuerpos, matriz extracelular, etc.

Lmea celular HEK293 en suspension

En un esfuerzo para generar una tecnologfa de fabricacion que pueda cambiarse de escala para producir VAAr de tftulo elevado y elevadamente puro, se desarrollo una lmea celular HEK293 que crece en condiciones en suspension libre de componentes animales. La lmea celular se desarrollo a partir de un banco maestro de celulas calificado. Despues de la adaptacion al crecimiento en condiciones de suspension libre de componentes animales, la lmea celular HEK293 en suspension mantuvo su capacidad para la transfeccion eficaz y la produccion de VAAr.

Por lo tanto, un aspecto de la invencion se refiere a una celula HEK293 aislada que se deposito en la ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, Virginia, 20108, el 23 de octubre de 2012 (N.° de deposito de ATCC PTA-13274), segun el Tratado de Budapest.

En una realizacion, la lmea celular es adecuada para el cultivo en cualquier volumen de medio de cultivo, desde 10 ml (por ejemplo, en frascos agitadores) hasta 10 l, 50 l, 100 l o mas, (por ejemplo, en biorreactores). La lmea celular es adecuada para la produccion de 11 serotipos, quimeras e tubridos del VAA, por ejemplo, VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, VAA12, VAA13 y cualquier quimera y/o hforido de los mismos, por ejemplo, VAA1-13 2.5, 2i8, 9.45 y otras capsides quimericas o hfbridas.

En algunas realizaciones, la lmea celular puede utilizarse en un metodo de produccion de VAA que proporciona al menos aproximadamente 4 x 104 partmulas que contiene genoma de vector por celula antes de la purificacion, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 x 105 partmulas que contienen un genoma de vector por celula antes de la purificacion. En otras realizaciones, la lmea celular puede utilizarse en un metodo de produccion de VAA que proporciona al menos aproximadamente 1 x 1012 partmulas purificadas que contienen un genoma de vector por litro de cultivo celular, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 x 1013 o 1 x 1014 partmulas purificadas que contienen un genoma de vector por litro de cultivo celular.

Metodos de produccion de vectores de virus

La presente invencion proporciona adicionalmente metodos de produccion de vectores de virus. En un aspecto, la invencion se refiere a un metodo de produccion de partmulas de VAA, que comprende: (a) proporcionar a las celulas HEK293 de la invencion un sistema de expresion de VAA; (b) cultivar las celulas en condiciones en las cuales se producen las partmulas de VAA y (c) de forma opcional aislar las partmulas de VAA. En una realizacion, las celulas se cultivan en suspension. En otra realizacion, las celulas se cultivan en condiciones libres de componentes animales. El medio libre de componentes animales puede ser cualquier medio libre de componentes animales (por ejemplo, medio sin de suero) compatible con las celulas HEK293. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, SFM4Transfx-293 (Hy-clone), Ex-Cell 293 (JRH Biosciences), LC-SFM (Invitrogen) y Pro293-S (Lonza).

Las condiciones suficientes para la replicacion y el empaquetamiento de las partmulas del VAA pueden ser, por

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ejemplo, la presencia de secuencias del VAA suficientes para la replicacion de un molde de VAA y la encapsidacion en capsides de VAA (por ejemplo, secuencias de rep de VAA y secuencias de cap de VAA) y secuencias auxiliares procedentes de adenovirus y/o herpesvirus. En realizaciones particulares, el molde de VAA comprende dos secuencias de ITR del VAA, las cuales se emplazan 5' y 3' con respecto a la secuencia de acido nucleico heterologa, aunque no necesitan estar contiguas de forma directa a la misma.

En algunas realizaciones, el molde de VAA comprende una ITR que no se resuelve mediante Rep para hacer vectores de VAA en duplex como se describe en la publicacion de patente internacional WO 01/92551.

El molde de VAA y las secuencias de rep y cap del VAA se proporcionan en condiciones tales que se produzca en la celula el vector de virus que comprende el molde de VAA empaquetado dentro de la capside de VAA. El metodo puede comprender adicionalmente la etapa de recoger el vector de virus del cultivo. En una realizacion, el vector de virus puede recogerse lisando las celulas, por ejemplo, despues de retirar las celulas del medio de cultivo, por ejemplo, mediante la sedimentacion de las celulas. En otra realizacion, el vector de virus puede recogerse del medio en el cual se cultivan las celulas, por ejemplo, para aislar vectores que se secretan a partir de las celulas. Para la recogida de VAAr puede retirarse del cultivo algo de medio, o todo el medio, una vez o mas de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares durante la etapa de cultivo (tal como cada 12, 18, 24 o 36 horas, o un tiempo mas prolongado que sea compatible con la viabilidad celular y la produccion de vector), por ejemplo, comenzando aproximadamente 48 horas postransfeccion. Despues de retirar el medio, se puede anadir al cultivo medio recien preparado, con o sin los complementos nutritivos adicionales. En una realizacion, las celulas pueden cultivarse en un sistema de perfusion de modo que el medio fluya de forma constante sobre las celulas y se recoja para el aislamiento del VAAr secretado. La recogida de VAAr del medio puede continuar siempre que las celulas transfectadas se mantengan viables, por ejemplo, 48, 72, 96 o 120 horas o mas postransfeccion. En determinadas realizaciones, la recogida de VAAr secretado se lleva a cabo con serotipos de VAA (tales como VAA8 y VAA9), que no se unen o se unen solo de forma debil a las celulas productoras. En otras realizaciones, la recogida de VAAr secretado se lleva a cabo con serotipos de VAA de union heparina (por ejemplo, el VAA2) que se hayan modificado de forma que no se unan a las celulas en las que se producen. Los ejemplos de modificaciones adecuadas, asf como de tecnicas de recogida de VAAr, se divulgan en la publicacion de Estados Unidos N.° 2009/0275107, incorporada como referencia en su totalidad en el presente documento.

La replicacion de VAA y las secuencias de la capside pueden proporcionase mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Los protocolos actuales normalmente expresan los genes de rep/cap del VAA en un plasmido unico. No es necesario proporcionar juntas las secuencias de replicacion y de empaquetamiento del VAA, aunque puede ser conveniente hacerlo. Las secuencias de rep y/o cap de VAA pueden proporcionarse mediante cualquier vector vmco o no vmco. Por ejemplo, las secuencias de rep/cap pueden proporcionarse mediante un vector de adenovirus o herpesvirus hubrido (por ejemplo, insertadas en las regiones E1a o E3 de un vector de adenovirus delecionado). Tambien pueden emplearse vectores de VEB para expresar los genes cap y rep del VAA. Una ventaja de este metodo es que los vectores de VEB son episomicos, aunque aun mantengan un numero elevado de copias a traves de las sucesivas divisiones celulares (es decir, estan integrados de forma estable en la celula como elementos extracromosomicos, denominados como un “episoma nuclear a base de VEB”, vease Margolski, Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67 (1992)).

Como una alternativa adicional, las secuencias de rep/cap pueden incorporarse de forma estable en una celula.

Normalmente, las secuencias de rep/cap del VAA no estaran flanqueadas por las TR, para evitar el rescate y/o empaquetamiento de estas secuencias.

El molde de VAA puede proporcionarse a la celula utilizando cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, el molde puede suministrarse mediante un vector no vmco (por ejemplo, plasmido) o vmco. En realizaciones particulares, el molde de VAA se suministra mediante un vector de herpesvirus o adenovirus (por ejemplo, insertado en las regiones E1a o E3 de un adenovirus lesionado). Como otra ilustracion, Palombo et al., J. Virol. 72: 5025 (1998), describen un vector de baculovirus que porta un gen indicador flanqueado por las TR del VAA. Los vectores de VEB tambien pueden emplearse para suministrar el molde, como se describe anteriormente con respecto a los genes rep/cap.

En otra realizacion representativa, el molde de VAA se proporciona mediante un virus de VAAr que replica. En aun otras realizaciones, un provirus de VAA que comprende el molde de VAA esta integrado de forma estable en el cromosoma de la celula.

Para potenciar los tttulos de virus, pueden proporcionarse a la celula las funciones de un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus o herpesvirus) que promuevan una infeccion de VAA productiva. Las secuencias de virus auxiliar necesarias para la replicacion de VAA son conocidas en la tecnica. Normalmente, estas secuencias se proporcionaran mediante un vector de adenovirus o herpesvirus auxiliar. Como alternativa, las secuencias de adenovirus o herpesvirus pueden proporcionarse mediante otro vector no vmco o vmco, por ejemplo, como un miniplasmido de adenovirus no infeccioso que transporta todos los genes auxiliares que promueven la produccion eficaz de VAA, como se describe en Ferrari et al., Nature Med. 3: 1295 (1997) y las patentes de Estados Unidos

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N.° 6.040.183 y 6.093.570.

Adicionalmente, las funciones del virus auxiliar pueden proporcionarse mediante una celula empaquetadora con las secuencias auxiliares incluidas en el cromosoma o mantenidas como un elemento extracromosomico estable. En general, las secuencias de virus auxiliar no pueden empaquetarse en viriones de VAA, por ejemplo, no estan flanqueadas por las TR.

Los expertos en la materia apreciaran que puede ser ventajoso proporcionar las secuencias de replicacion y de la capside del VAA y las secuencias del virus auxiliar (por ejemplo, secuencias de adenovirus) en una unica construccion auxiliar. Esta construccion auxiliar puede ser una construccion no vmca o vmca. Como una ilustracion no limitativa, la construccion auxiliar puede ser un adenovirus tubrido o un herpesvirus tubrido que comprenda los genes rep/cap del VAA.

En una realizacion particular, las secuencias rep/cap del VAA y las secuencias auxiliares de adenovirus se suministran mediante un unico vector auxiliar de adenovirus. Este vector puede comprender adicionalmente el molde de VAA. Las secuencias rep/cap de VAA y/o el molde de VAA pueden insertarse en una region delecionada (por ejemplo, las regiones E1a o E3) del adenovirus.

En una realizacion adicional, las secuencias rep/cap del VAA y las secuencias auxiliares de adenovirus se suministran mediante un unico vector auxiliar de adenovirus. De acuerdo con esta realizacion, el molde de VAA puede proporcionarse como un molde plasmfdico.

En otra realizacion ilustrativa, las secuencias rep/cap del VAA y las secuencias auxiliares de adenovirus se proporcionan mediante un unico vector auxiliar de adenovirus, y el molde de VAA esta integrado en la celula como un provirus. Como alternativa, el molde de VAA se proporciona mediante un vector de EBV que se mantiene dentro de la celula como un elemento extracromosomico (por ejemplo, como un episoma nuclear a base del VEB).

En una realizacion ejemplar adicional, las secuencias rep/cap del VAA y las secuencias auxiliares de adenovirus se proporcionan mediante un unico adenovirus auxiliar. El molde de VAA puede proporcionarse como un vector vmco que replica distinto. Por ejemplo, el molde de VAA puede proporcionarse mediante una partmula de VAA o una segunda partfcula de adenovirus recombinante.

De acuerdo con los metodos precedentes, el vector de adenovirus tubrido normalmente comprendera las secuencias 5' y 3' en cis de adenovirus suficientes para la replicacion y el empaquetamiento de adenovirus (es decir, las repeticiones terminales de adenovirus y la secuencia PAC). Las secuencias de rep/cap de VAA y, si esta presente, el molde de VAA, estan incluidos en la estructura del adenovirus y estan flanqueadas por las secuencias 5' y 3' en cis, de forma que estas secuencias pueden empaquetarse en capsides de adenovirus. Como se describe anteriormente, las secuencias auxiliares de adenovirus y las secuencias de rep/cap de VAA en general no estan flanqueadas por las TR, de forma que estas secuencias no se empaquetan en los viriones de VAA.

Zhang et al., Gene Ther. 18: 704 ((2001)) describen un auxiliar quimerico que comprende tanto al adenovirus como a los genes rep y cap del VAA.

En los metodos de empaquetamiento de VAA tambien pueden utilizarse como virus auxiliar un herpesvirus. Los herpesvirus tubridos que codificas la protema (o protemas) Rep del VAA pueden facilitar de forma ventajosa esquemas de produccion de vector VAA que puedan cambiarse de escala. Se ha descrito un vector de virus herpes simple tipo I (VHS-1) tubrido que expresa los genes rep y cap del VAA-2 (Conway et al., Gene Ther. 6: 986 (1999) y el documento WO 00/17377).

Pueden obtenerse reservas de vector de VAA libre de virus auxiliar contaminante mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, los virus VAA y auxiliar pueden diferenciarse facilmente a base del tamano. Ademas, el VAA puede separarse del virus auxiliar a base de la afinidad por un sustrato de heparina (Zolotukhin et al., Gene Ther. 6: 973 (1999)). Pueden utilizarse virus auxiliares que tienen replicacion defectuosa delecionados de forma que cualquier virus auxiliar contaminante sea no competente para la replicacion. Como una alternativa adicional, puede emplearse un auxiliar de adenovirus que carece de la expresion del gen tardfo, dado que solo se necesita la expresion del gen temprano del adenovirus para mediar el empaquetamiento del VAA. Se conocen en la tecnica mutantes de adenovirus defectuosos para la expresion del gen tardfo (por ejemplo, los mutantes de adenovirus ts100K y ts149).

En realizaciones representativas, el metodo de la invencion puede cambiarse de escala por completo, de forma que puede llevarse a cabo en cualquier volumen deseado de medio de cultivo, por ejemplo, desde 10 ml (por ejemplo, en matraces agitadores) hasta 10 l, 50 l, 100 l o mas (por ejemplo, en biorreactores tales como los sistemas de biorreactor por ondas y tanques de agitacion).

El metodo es adecuado para la produccion de todos los serotipos y quimeras del VAA, por ejemplo VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, VAA12, VAA13 y cualquier quimera de los mismos.

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En determinadas realizaciones, el metodo proporciona al menos aproximadamente 1 x 104 partfculas que contienen el genoma de vector por celula antes de la purificacion, por ejemplo al menos aproximadamente 2 x 104, 3 x 104, 4 x 104, 5 x 104, 6 x 104, 7 x 104, 8 x 104, 9 x 104 o 1 x 105, o mas pardculas que contienen un genoma de vector por celula antes de la purificacion. En otras realizaciones, el metodo proporciona al menos aproximadamente 1 x 1012 partfculas purificadas que contienen un genoma de vector por litro de cultivo celular, por ejemplo, al menos aproximadamente 5 x 1012, 1 x 1013, 5 x 1013 o 1 x 1014, o mas partfculas purificadas que contienen un genoma de vector por litro de cultivo celular.

Vectores de virus recombinantes

Los vectores de virus producidos mediante la presente invencion son utiles para el suministro de acidos nucleicos a celulas in vitro, ex vivo e in vivo. En particular, los vectores de virus pueden emplearse de forma ventajosa para suministrar o transferir acidos nucleicos a celulas animales, incluyendo de mairnfero.

Puede suministrarse en los vectores de virus producidos mediante la presente invencion cualquier secuencia (o secuencias) de acido nucleico heterologa de interes. Los acidos nucleicos de interes incluyen acidos nucleicos que codifican polipeptidos o los ARN, incluyendo polipeptidos o los ARN indicadores, terapeuticos (por ejemplo, para usos medicos o veterinarios), inmunogenicos (por ejemplo, para vacunas) o diagnosticos.

Como una alternativa adicional, el acido nucleico heterologo puede codificar cualquier polipeptido o ARN que se produzca de forma conveniente en una celula in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, los vectores de virus pueden introducirse en celulas en cultivo y el producto genico expresado aislarse de las mismas.

Los expertos en la materia comprenderan que el acido nucleico (o acidos nucleicos) heterologo de interes puede estar asociado de forma operativa con secuencias de control apropiadas. Por ejemplo, el acido nucleico heterologo puede estar asociado de forma operativa con elementos de control de la expresion, tales como senales de control de la transcripcion/traduccion, ongenes de replicacion, senales de poliadenilacion, sitios de entrada al ribosoma internos (IRES), promotores y/o potenciadores, y similares.

Los expertos en la materia apreciaran que puede utilizarse una diversidad de elementos promotores/potenciadores, dependiendo del nivel y de expresion espedfica de tejido deseados. El promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible, dependiendo del patron de expresion deseado. El promotor/potenciador puede ser nativo o extrano y puede ser una secuencia natural o sintetica. Por extrano, se pretende que la region de iniciacion de la transcripcion no se encuentre en el hospedador de tipo silvestre en el que la region de iniciacion de la transcripcion se introduce.

En realizaciones particulares, los elementos promotores/potenciadores pueden ser nativos para la celula diana o sujeto a tratar. En realizaciones representativas, el elemento promotor/potenciador puede ser nativo para la secuencia de acido nucleico heterologa. En general, el elemento promotor/potenciador se elige de forma que funcione en la celula (o celulas) diana de interes. Adicionalmente, en realizaciones particulares, el elemento promotor/potenciador es un elemento promotor/potenciador de mamffero. El elemento promotor/potenciador puede ser constitutivo o inducible.

Los elementos de control de la expresion inducibles son normalmente ventajosos en las aplicaciones en las que es conveniente proporcionar una regulacion sobre la expresion de la secuencia (o secuencias) de acido nucleico heterologa. Los elementos promotores/potenciadores inducibles para el suministro de genes pueden ser elementos promotores/potenciadores espedficos o preferentes de tejido, e incluyen elementos promotores/potenciadores espedficos o preferentes de musculo (incluyendo espedficos o preferentes de musculo cardiaco, esqueletico y/o liso), espedficos o preferentes de tejido neural (incluyendo espedficos o preferentes de cerebro), espedficos o preferentes para el ojo (incluyendo espedficos de retina o espedficos de cornea), espedficos o preferentes para hugado, espedficos o preferentes para medula osea, espedficos o preferentes para pancreas, espedficos o preferentes para el bazo y espedficos o preferentes para el pulmon. Otros elementos promotores/potenciadores inducibles incluyen elementos inducibles por hormonas e inducibles por metales. Los elementos promotores/potenciadores inducibles ejemplares incluyen, pero sin limitacion, un elemento de activacion/desactivacion de Tet, un promotor inducible por RU486, un promotor inducible por ecdisona, un promotor inducible por rapamicina y un promotor de metalotionema.

En las realizaciones en las que la secuencia (o secuencias) de acido nucleico heterologa se transcribe y despues se traduce en las celulas diana, en general se incluyen senales de iniciacion espedficas para la traduccion eficaz de las secuencias que codifican la protema insertada. Estas secuencias de control de la traduccion exogenas, que pueden incluir el codon de iniciacion ATG y las secuencias adyacentes, pueden ser de una diversidad de ongenes, tanto naturales como sinteticos.

Los vectores de virus producidos de acuerdo con la presente invencion proporcionan un medio para suministrar acidos nucleicos heterologos en una amplia variedad de celulas, incluyendo celulas que se dividen y que no se dividen. Los vectores de virus pueden emplearse para suministrar un acido nucleico de interes a una celula in vitro, por ejemplo, para producir un polipeptido in vitro o para la terapia genica ex vivo. Los vectores de virus son

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adicionalmente utiles en un metodo para suministrar un acido nucleico a un sujeto que lo necesite, por ejemplo, para expresar un polipeptido o un ARN funcional inmunogenico o terapeutico. De esta manera, el polipeptido o el ARN funcional puede producirse in vivo en el sujeto. El sujeto puede necesitar el polipeptido debido a que el sujeto tiene una deficiencia del polipeptido. Adicionalmente, el metodo puede practicarse debido a que la produccion del polipeptido o del ARN funcional en el sujeto puede impartir algun efecto benefico.

Ademas, los vectores de virus pueden utilizarse para producir un polipeptido de interes o ARN funcional en celulas en cultivo o en un sujeto (por ejemplo, utilizando el sujeto como un biorreactor para producir el polipeptido o para observar los efectos del ARN funcional en el sujeto, por ejemplo, en conexion con metodos de exploracion).

Habiendo descrito la presente invencion, la misma se explicara con mas detalle en los siguientes ejemplos, los cuales estan incluidos en el presente documento solo para fines de ilustracion, y los cuales no se pretende que sean limitativos de la invencion.

Ejemplo 1

Materiales y metodos

Obtencion de celulas HEK293 en suspension a partir de un banco maestro de celulas calificado de HEK293 adherentes. La obtencion de la lmea celular en suspension procedente del banco maestro de celulas (BCM) de HEK293 parentales, se realizo en una instalacion de sala limpia de Clase 10.000. La obtencion de la lmea celular en suspension se llevo a cabo en un procedimiento de dos etapas que implico en primer lugar apartar las celulas de los medios que conteman suero bovino y despues adaptar las celulas a medios de suspension sin suero compatibles con celulas HEK293. La lmea celular en suspension se creo como sigue. En primer lugar, se descongelo un banco de celulas maestro (BCM) calificado y se puso en cultivo en medios DMEM que conteman suero fetal bovino (SFB) al 10% y se cultivo durante varios dfas para permitir que las celulas se recuperen del ciclo de congelacion/descongelacion. Las celulas del BCM se cultivaron y se pasaron a lo largo de un penodo 4 semanas mientras la cantidad de SFB en los medios de cultivo tisular se reducfa de forma gradual desde el 10 % al 2,5 %. Despues, las celulas se transfirieron del DMEM con SFB al 2,5 % a medios de suspension sin suero y se cultivaron en matraces agitadores. Despues, las celulas se cultivaron en el medio sin suero durante otras 3 semanas mientras se controlaba su velocidad de crecimiento y la viabilidad. Despues, las celulas adaptadas se amplificaron y congelaron. Posteriormente se descongelaron varios viales procedentes de este banco de celulas y se utilizaron durante los estudios de desarrollo del proceso para crear un procedimiento de fabricacion que pueda cambiarse de escala utilizando frascos agitadores y sistemas de biorreactor por ondas para generar vectores de VAAr. Las celulas HEK293 en suspension se cultivaron en medios de suspension sin suero que sustentaban tanto el crecimiento como la elevada eficacia de transfeccion en matraces agitadores y bolsas de biorreactor por ondas. Para el mantenimiento de las celulas y la generacion de vectores de VAAr se utilizaron incubadores de agitacion Multitron (ATR) a velocidades de agitacion de rpm espedficas (a base de los volumenes de cultivo celular), humedad al 80 % y CO2 al 5 %.

Transfeccion de las celulas HEK293 en suspension. El dfa de la transfeccion, las celulas se contaron utilizando un analizador de viabilidad ViCell XR (Beckman Coulter) y se diluyeron para la transfeccion. Para mezclar el coctel de transfeccion se anadieron a un tubo conico los siguientes reactivos en este orden: ADN plasmfdico, OPTIMEM® I (Gibco) u OptiPro SFM (Gibco), u otros medios de transfeccion compatibles sin suero, y despues el reactivo de transfeccion en una proporcion espedfica con respecto al ADN plasmfdico. En estos estudios se utilizaron plasmidos auxiliares de la serie pXR para generar vectores de multiples serotipos de VAAr (Rabinowitz et al., J. Virol. 76: 791 (2002)). El coctel se invirtio para mezclarlo antes de incubarse a tA. Despues, el coctel de transfeccion se pipeteo en matraces y se coloco otra vez en el agitador/incubador. Todos los estudios de optimizacion se llevaron a cabo en volumenes de cultivo de 30 ml seguido de la validacion en volumenes de cultivo mas grandes. Las celulas se recogieron a las 48 horas postransfeccion.

Produccion de VAAr utilizando sistemas de biorreactor por ondas. Las bolsas de ondas se sembraron 2 dfas antes de la transfeccion. Dos dfas despues de la siembra de la bolsa, se hicieron recuentos del cultivo celular y despues se amplifico/diluyo el cultivo celular antes de la transfeccion. Despues, se transfecto el cultivo celular del biorreactor por ondas. El cultivo celular se recogio a partir de la bolsa del biorreactor por ondas al menos 48 horas postransfeccion.

Analisis de la eficacia de transfeccion/expresion de GFP utilizando citometna de flujo. Aproximadamente a las 24 horas postransfeccion, se retiro 1 ml de cultivo celular de cada matraz o de la bolsa del biorreactor por ondas, asf como un control no transfectado. Las muestras se analizaron utilizando un citometro de flujo Dako Cyan.

Recogida de las celulas en suspension de los matraces agitadores y de las bolsas de biorreactor por ondas. Cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, los cultivos celulares se recogieron en tubos conicos de polipropileno de 500 ml (Corning), ya sea mediante vertido de los matraces agitadores o mediante bombeo de las bolsas del biorreactor por ondas. Despues, el cultivo celular se centrifugo a 655 x g durante 10 min utilizando una centnfuga Sorvall RC3C plus y el rotor H6000A. Los sobrenadantes se descartaron y las celulas se resuspendieron en PBS 1X, se transfirieron a un tubo conico de 50 ml y se centrifugaron a 655 x g durante 10 min. En este punto, los

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sedimentos podfan almacenarse como mmimo a -60 °C o podfa continuarse con la purificacion.

Titulacion de VAAr a partir de lisado celular utilizando qPCR. Se retiraron 10 ml de cultivo celular y se centrifugo a 655 x g durante 10 min utilizando una centnfuga Sorvall RC3C plus y el rotor H6000A. El sobrenadante se decanto a partir del sedimento celular. Despues, el sedimento celular se resuspendio en 5 ml de tampon de ADNasa (CaCl2 5 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0) seguido del tratamiento con ultrasonido para lisar las celulas de forma eficaz. Despues, se retiraron 300 pl y se colocaron en un tubo de mirocentnfuga de 1,5 ml. Despues, se anadieron a cada muestra 140 unidades de ADNasa I y se incubo a 37 °C durante 1 hora. Para determinar la eficacia de la digestion con ADNasa, se anadieron 4-5 pg de plasmido TReGFP en un lisado celular no transfectado con y sin la adicion de ADNasa. Despues, se anadieron a cada tubo 50 pl de solucion de EDTA/sarcosil (sarcosil al 6,3 %, EDTA62,5 mM, pH 8,0) y se incubo a 70 °C durante 20 minutos. Despues, se anadieron 50 pl de Proteinasa K (10 mg/ml) y se incubo a 55 °C durante al menos 2 horas. Despues, las muestras se llevaron a ebullicion durante 15 minutos para inactivar la Proteinasa K. Se retiro una alfcuota de cada muestra para analizarla mediante qPCR. Se llevaron a cabo dos reacciones de qPCR para determinar de forma eficaz cuanto vector de VAAr se genero por celula. Se preparo una reaccion de qPCR utilizando un conjunto de cebadores disenados para unirse a una secuencia homologa en las estructuras de los plasmidos XX680, pXR2 y TReGFP. La segunda reaccion de qPCR se preparo utilizando un conjunto de cebadores para que se unan a y amplifiquen una region dentro del gen eGFP. La qPCR se realizo utilizando reactivos de Sybr green y el Light cycler 480 de Roche. Las muestras se desnaturalizaron a 95 °C durante 10 minutos seguido de 45 ciclos (90 °C durante 10 s, 62 °C durante 10 s y 72 °C durante 10 s) y la curva de fusion (1 ciclo a 99 °C durante 30 s, 65 °C durante 1 minuto continuo).

Purificacion de VAAr a partir de lisado crudo. Cada sedimento celular se ajusto a un volumen final de 10 ml. Los sedimentos se trataron brevemente con agitacion vorticial y se trataron con ultrasonido durante 4 minutos a un rendimiento del 30 % en un segundo, un segundo de rafagas. Despues del tratamiento con ultrasonido, se anadieron 550 U de ADNasa y se incubo a 37 °C durante 45 minutos. Despues, para sedimentar los residuos celulares se centrifugaron los sedimentos a 9400 x g utilizando la centnfuga Sorvall RC5B y el rotor HS-4, y el lisado clarificado se transfirio a un tubo de centnfuga de tipo 70Ti (Beckman 361625). Con respecto a la recogida y al lisado de las celulas HEK293 en suspension para el aislamiento de VAAr, un experto en la materia podna utilizar metodos mecanicos tales como la microfluidificacion o metodos qmmicos tales como detergentes, etc. seguido de una etapa de clarificacion utilizando filtracion de profundidad o filtracion de flujo tangencial (FFT).

Purificacion del vector de VAA. El lisado de VAA clarificado se purifico mediante metodos de cromatograffa en columna como sabna un experto en la materia y que estan descritos en los siguientes manuscritos (Allay et al., Davidoff et al., Kaludov et al., Zolotukhin et al., Zolotukin et al. etc.).

Titulacion de VAAr utilizando transferencia puntual. Se anadieron 100 pl de tampon de ADNasa (ADNasa 140 unidades, CaCl2 5 mM, MgCh 5 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0) a cada pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Se anadieron 1-3 pl de diluciones en serie de virus a cada pocillo y se incubo a 37 °C durante 30 min. Despues, las mezclas se complementaron con 15 pl de solucion sarcosil/EDTA (sarcosil al 6,3 %, EDTA 62,5 mM, pH 8,0) y se coloco a 70 °C durante 20 min. A continuacion, se anadieron 15 pl de Proteinasa K (10 mg/ml) y se incubo a 50 °C durante al menos 2 horas. Se anadieron a cada pocillo 125 pl de tampon de NaOH (NaOH 80 mM, EDTA 4 mM, pH 8,0). Se crearon una serie de patrones espedficos de transgen a traves de diluciones en serie. Despues, se anadio el tampon NaOH y se incubo. Se incubo la membrana de nylon a TA en Tris-HCl 0,4 M, pH 7,5 y despues se instalo en el aparato transferencia puntual. Despues de una incubacion de 10-15 minutos en tampon de NaOH, las muestras y los patrones se cargaron en el aparato de transferencia puntual sobre la membrana de transferencia de hibridacion GeneScreen PlusR (PerkinElmer). Despues, se aplico a la muestra a la membrana utilizando vacfo. La membrana de nylon se remojo en Tris-HCl 0,4 M, pH 7,5 y despues se entrecruzo utilizando un enlazador de estratos por UV 1800 (Stratagene) a 600 ujuliosx100. Despues, la membrana se prehibrido en tampon CHURCH (BSA al 1 %, SDS al 7 %, EDTA 1 mM, NaaPO4 0,5 M, pH 7,5). Despues de la prehibridacion, la membrana se hibrido durante una noche con sonda de transgen marcada con 32P-CTP (kit de marcaje de ADN Roche Random Prime). El siguiente dfa, la membrana se lavo con tampon SSC de baja rigurosidad (SSC 1x, SDS al 0,1 %) y alta rigurosidad (SSC 0,1x, SDS al 0,1 %). Despues, se expuso a una pantalla de phosphorimager y se analizo la densitometna utilizando un escaner STORM840 (GE).

Analisis de la pureza del vector de VAAr utilizando el metodo de tincion de plata. Se cargaron muestras del vector purificado en geles Bis-Tris al 10% NuPage (Invitrogen) y se corrio utilizando tampon de corrida NuPage 1x. Normalmente, se cargaron 1 x 1010 partfculas por pocillo. Los geles se trataron con el kit de tincion de plata SilverXpress n.° LC6100 (Invitrogen).

Analisis de los genomas autocomplementarios utilizando electroforesis en gel alcalino y transferencia de Southern. Brevemente, el VAAr autocomplementario purificado se anadio a 200 pl de tampon de ADNasa I (140 unidades de ADNasa, CaCl2 5 mM, MgCh 5 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0) y se incubo a 37 °C durante 60 minutos, seguido de la inactivacion de la ADNasa anadiendo 30 pl de solucion EDTA sarcosil/EDTA (sarcosil al 6,3 %, EDTA 62,5 mM pH 8,0) y se coloco a 70 °C durante 20 min. Despues, se anadieron a la muestra 20 pl de Proteinasa K (10 mg/ml) y se incubo durante un mmimo de 2 horas a 50 °C. Se anadio fenol/cloroformo en una proporcion de 1:1, seguido de precipitacion con etanol del ADN del vector vmco. Despues, el ADN sedimentado se resuspendio en tampon alcalino

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(NaOH 50 mM, EDTA 1 mM) para la desnaturalizacion, se cargo en un gel de agarosa alcalino al 1 %, y se corrio a 25 V durante una noche. Despues, el gel se equilibro en tampon de transferencia alcalino (NaOH 0,4 M, NaCl 1 M) y se realizo una transferencia de Southern a traves de una transferencia durante una noche del ADN de vector a una membrana de transferencia de hibridacion GeneScreen PlusR (PerkinElmer). Despues, la membrana se neutralizo utilizando Tris 0,5 M pH 7,5 con NaCl 1 M, y se hibrido durante una noche con una sonda de transgen marcada con 32P-CTP. Despues de lavar la membrana como se describe anteriormente, la membrana se expuso a una pantalla de phosphorimager y se analizo utilizando un escaner STORM840.

Ensayos de transduccion. Las celulas HeLaRC-32 (Chadeuf et al., J. Gene Med. 2: 260 (2000)) se sembraron en placa a 2x105 celulas/pocillo en una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C durante una noche. Se observo que las celulas estuvieran al 90-100 % de confluencia. Se precalentaron 50 ml de DMEM con SFB al 2 %, Pen/Estrep al 1 %, y se anadio adenovirus (dl309) a una MOI de 10. El medio que contema dl309 se alicuoto en fracciones de 900 |jl y se utilizo para diluir el VAAr en diluciones en serie con factor diez. Despues, se sembro en placa el VAAr en 400 jl y se dejo incubar durante 48 horas a 37 °C. Se contaron las celulas positivas para GFP para el VAAr que contema el transgen eGFP, utilizando microscopfa de fluorescencia. Para el VAAr que contema el transgen Luciferasa, se aspiro el medio de las celulas y se anadieron 100 jl de tampon de lisis pasivo. Las celulas se congelaron a -80 °C y despues se descongelaron a 37 °C para favorecer la lisis celular. Despues, se pipetearon 50 jl del lisado celular en una placa de 96 pocillos opaca junto con 50 jl de luciferina. Despues, las celulas se leyeron en un lector de placas Wallac para las unidades de luz relativas.

Ensayos de concentracion. Se tomaron muestras de la reserva de vector inicial y se cargaron en una columna vivaspin, y se centrifugo a 470 x g (Sorvall H1000B) en intervalos de 10 minutos. Una vez que se consiguio el volumen/concentracion deseado, ambos lados de la membrana se enjuagaron con la fraccion retenida, que despues se recogio. Se tomaron muestras del VAAr preconcentrado y concentrado para determinar los tttulos ffsicos y las unidades de transduccion.

Microscopfa electronica de transmision (MET) de las partmulas de VAAr tenidas negativamente. La microscopfa electronica permite una visualizacion directa de las partmulas virales. Los vectores de VAAr dializados purificados se colocaron en una rejilla de carbono sin brillo de malla de 400 mediante inversion de la rejilla sobre una gota de 20 jl de virus. Despues, la rejilla se lavo dos veces mediante inversion sobre una gota de 20 jl de H2Odd, seguido de la inversion de la rejilla sobre una gota de 20 jl de acetato de uranilo al 2 % durante 30 segundos. Las rejillas se secan mediante un toque suave con papel Whatman en los extremos de las rejillas. Se visualizo cada vector utilizando un microscopio electronico Zeiss Em 910.

Ejemplo 2

Desarrollo de una lmea celular HEK293 en suspension

El fin de este trabajo era generar una tecnologfa de fabricacion que pueda cambiarse de escala para producir VAAr de tftulo elevado y elevadamente puro utilizando la tecnologfa de transfeccion transitoria y celulas HEK293 de mairnfero. Para comenzar, se adapto una lmea celular HEK293 adherente procedente del banco de celulas maestro calificado de los inventores al crecimiento en condiciones en suspension libre de componentes animales y libre de antibioticos, como se describe en el Ejemplo 1. Despues de la adaptacion a las condiciones en suspension libre de componentes animales y de la seleccion de un medio en suspension libre de componentes animales compatible, la lmea celular HEK293 en suspension mantuvo su capacidad de transfeccion eficaz y de produccion de VAAr.

Ejemplo 3

Optimizacion de las condiciones de transfeccion

Dos de las necesidades principales para la produccion de VAAr utilizando transfeccion transitoria son la determinacion de las proporciones de plasmidos optimas para los tres plasmidos y la proporcion de reactivo de transfeccion con respecto al ADN total. El reactivo de transfeccion puede tener una base qmmica (por ejemplo, fosfato de calcio o polietilenimina) o una base biologica/lipfdica (por ejemplo, 293fectina, lipofectamina, etc.). El dfa de la transfeccion las celulas HEK293 en suspension inicialmente se crecieron en medio sin de suero 1, en un volumen de 30 ml en matraces agitadores de 125 ml. Se probaron diversas proporciones de XX680:Rep/Cap:TReGFP con proporciones de reactivo de transfeccion con respecto al ADN de 2:1 y 4:1, con 1 jg de ADN/ml de celulas y se incubo a temperatura ambiente. Como se muestra en la Fig. 1A, la proporcion de plasmidos de 2:1,5:1 con una proporcion de reactivo de transfeccion con respecto al ADN de 2:1 genero los mayores genomas de vector (gv)/celula. Los gv/celula de los lisados celulares se determinaron utilizando metodos de qPCR, como se describe en el Ejemplo 1. Fue evidente que la proporcion de reactivo de transfeccion con respecto al ADN de 4:1 genero la menor cantidad de gv/celula de todas las proporciones de plasmido probadas. Esto se debio muy probablemente a una viabilidad celular postransfeccion mas baja, detectada con el analizador de Viabilidad Beckman ViCell XR, lo que sugiere que se alcanzo un nivel de toxicidad con el reactivo de transfeccion. Ademas, la proporcion 4:1 de reactivo de transfeccion con respecto al ADN condujo a agregados celulares mas grandes despues de la transfeccion.

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Varios protocolos de transfeccion disponibles de forma comercial describen la importancia del volumen del coctel de transfeccion y como puede influir en la eficacia de transfeccion. Para determinar como afecta a estas celulas el volumen del coctel de transfeccion, se seleccionaron volumenes de coctel de transfeccion del 2,5 y el 10%. El volumen % es a base del volumen final del cultivo celular en el matraz agitador. Por ejemplo, se utilizaron cultivos de 30 ml para determinar el volumen del coctel transfeccion optimo, asf, para un coctel de transfeccion al 10 %, se colocaron 27 ml de cultivo celular en el frasco agitador y el coctel de transfeccion fue de 3 ml. Como se ilustra en la Fig. 1B, un volumen de coctel de transfeccion al 5% mostro tener la mejor eficacia de transfeccion (a base de citometna de flujo de GFP) y genero los mayores gv/celula).

Ejemplo 4

Optimizacion de la densidad celular y de las concentraciones de ADN plasirffdico

Antes de iniciar estos estudios, los inventores comenzaron utilizando otros medios sin suero (medios sin suero 2) que sustentaban un mejor crecimiento, una eficacia de transfeccion aumentada y una produccion de vector/celula aumentada (vease la Tabla 2). Las celulas HEK293 en suspension se diluyeron en los medios libres de suero 2 hasta 1x106 y 2x106 celulas viables/ml para conseguir un volumen de cultivo celular final de 30 ml. En este conjunto de experimentos se utilizaron 1, 1,5 y 2 pg/ml de ADN plasirffdico. A base de los datos mostrados en la Fig. 2A, fue evidente que la produccion de vector de VAAr era mejor cuando la densidad celular era de 1x106 celulas viables/ml en el momento de la transfeccion, utilizando 1,5 pg/ml de ADN plasirffdico.

Tabla 2

Muestras

% de GFP, 24 h Rendimiento de vector total Gv/celula

Medios libres de suero 1

45,7 1,27 x 1012 4,2 x 104

Medios libres de suero 2

73,6 6,50 x 1012 2,2 x 105

Las celulas HEK293 en suspension se pasaron varias veces y cuando estuvieron disponibles celulas de pase bajo, medio y alto, se transfectaron para determinar si la antiguedad del cultivo celular impactaba sobre la eficacia de transfeccion y la produccion de VAAr. Como se muestra en la Fig. 2B, la antiguedad del cultivo celular no afecta la eficacia de transfeccion, pero la produccion de VAAr por celula disminuye a lo largo del tiempo, lo que sugiere que el clon de celulas HEK293 en suspension que se cultivo debfa usarse hasta un maximo de 30-40 pases.

Ejemplo 5

Purificacion de serotipos de VAAr utilizando cromatograffa en columna

Junto con la optimizacion de la produccion de VAAr en celulas HEK293 en suspension, se decidio que otro foco debfa ser la purificacion de VAA. Se deseo desarrollar una estrategia de purificacion universal para todos los tipos del VAA. Estudios anteriores informaron que a traves del uso de la cromatograffa en columna podfa llevarse a cabo la purificacion de serotipos distintos. Por lo tanto, se penso que podna utilizarse la cromatograffa en columna para purificar todos los serotipos a traves de la modulacion de parametros espedficos durante las etapas de union y elucion. Como se ilustra en la Fig. 3, utilizando metodos de cromatograffa en columna se recogieron fracciones de elucion elevadamente puras. Este protocolo universal se utilizo para purificar todos los serotipos y capsides quimericas del VAA.

Ejemplo 6

Produccion y purificacion de los serotipos de VAAr 1-6, 8 y 9 monocatenarios y autocomplementarios

Como se describe en el Ejemplo 1, se transfectaron volumenes de cultivo 1 litro utilizando los parametros de transfeccion optimizados, para generar los serotipos de VAAr 1-6, 8 y 9 monocatenarios y autocomplementarios, que empaquetan casetes transgenicos de CMV-GFP. Como se muestra en la Tabla 3, la eficacia de la transfeccion (a base de citometna de flujo de GFP) fue casi equivalente entre todas las transfecciones. Todos los serotipos que empaquetaron un genoma monocatenario generaron alrededor de y aproximadamente 1x105 gv/celula. Excluyendo el VAAr4, todos los serotipos de VAAr monocatenarios probados generaron de 8,2x1012 a 3,3x1013 VAAr total a partir de 1 litro de cultivo celular pospurificacion y estaban relativamente libres de cualquier protema que no fuera VP1, VP2 y VP3, como se representa en la tincion de plata en la Fig. 4A. Es bien sabido que las preparaciones de vector autocomplementario producen menos parffculas que contienen vector totales que sus contrapartes monocatenarias, y habitualmente estan compuestas por concentraciones variables tanto de genomas autocomplementarios (dfmero) como monocatenarios (monomero) (McCarty et al. , Gene Ther. 8: 1248 (2001)). Otra vez, excluyendo al VAAr4, todos los serotipos de VAAr autocomplementarios probados generaron de 4,0x1012 a 1,3x1013 VAAr totales a partir de 1 litro de cultivo celular pospurificacion. Como se muestra en la Fig. 4B, las parffculas de VAAr empaquetaron de forma eficaz un elevado porcentaje de genomas autocomplementarios. Cuando se generaron vectores de VAAr autocomplementarios adicionales con diversos casetes transgenicos, una mayona de los genomas empaquetados

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fueron autocomplementarios, lo que indica que estos resultados no son exclusivos para los casetes de GFP autocomplementarios.

No se ha encontrado una lmea celular universal que sea permisiva para la mayona de los serotipos de VAA. Sin embargo, todos los serotipos probados pueden transducir en grados diversos una lmea celular HeLa modificada llamada HeLaRC-32 (Chadeuf et al., J. Gene Med. 2: 260 (2000)). La lmea celular contiene integrado un gen rep y cap del VAA2 y, durante la transfeccion con adenovirus (dl309), se replicara cualquier gen de vector flanqueado por las ITR del vAA2. El numero aumentado de copias del genoma suscitara una expresion mas robusta del gen de interes, en este caso de GFP, lo que despues puede visualizarse y contarse utilizando microscopfa de fluorescencia. Despues, se calculan las unidades de transduccion (UT) a base de la dilucion y multiplicando el numero promedio de recuentos/campo por el numero total de campos por pocillo al aumento espedfico. En la Tabla 3 es evidente que existe entre serotipos una variedad de proporciones gv:UT que muy probablemente se debe a la variedad de permisividad de las celulas HeLaRC-32 para cada serotipo. Esto podna ser al nivel de union y de entrada y/o de transito dentro de la celula. Estos experimentos de transduccion se repitieron varias veces y las proporciones de transduccion con respecto a las partmulas se mantuvieron consistentes. Por lo tanto, los ensayos de transduccion tales como este, o similares a este, pueden utilizarse solo como una grna o una herramienta de medicion para determinar de forma cualitativa si una preparacion de un serotipo de VAAr espedfico cumple un criterio de aceptacion espedfico establecido por el investigador. Como se esperaba, los vectores de VAAr autocomplementarios fueron mas infecciosos que los vectores de VAAr monocatenarios. Como se describe en Aucoin et al., debido a la diversidad de ensayos empleados para cuantificar la infectividad la comparacion de los datos de transfeccion o infectividad entre publicaciones debena hacerse con cuidado (Aucoin et al., Biotechnol Adv. 26: 73 (2008)).

Tabla 3

Vector

Eficacia de Transfeccion (%) gv/celula* del lisado gv/l totales pospurificacion Gv:UT

VAA1 CMV-GFP

73,8 9,7x104 1,3x1013 45

VAA2 CMV-GFP

71,2 2,1x105 3,3x1013 155

VAA3 CMV-GFP

74,5 1,1x105 1,1x1013 8

VAA4 CMV-GFP

75,6 8,9x104 2,8x1012 14684

VAA5 CMV-GFP

74,3 1,9x105 2,8x1013 137

VAA6 CMV-GFP

73,6 5,7x104 8,2x1012 17

VAA8 CMV-GFP

74,4 1,9x105 3,3x1013 716

VAA9 CMV-GFP

73,0 2,1x105 2,2x1013 1350

VAAImc CMV-GFP

78,5 4,2x104 5,3x1012 15

VAA2mc CMV-GFP

76,6 1,1x105 1,4x1013 88

VAA3mc CMV-GFP

79,9 6,5x104 7,4x1012 9

VAA4mc CMV-GFP

78,2 4,8x104 1,0x1012 9605

VAA5mc CMV-GFP

76,6 9,3x104 8,7x1012 50

VAA6mc CMV-GFP

77,5 6,1x104 4,0x1012 11

VAA8mc CMV-GFP

78,2 1,1x105 1,3x1013 651

VAA9mc CMV-GFP

76,4 1,2x105 1,2x1013 936

Para confirmar la pureza global del VAAr monocatenario y autocomplementario, se tomaron imagenes de cada serotipo utilizando microscopfa electronica de transmision (MET) de tincion negativa (Fig. 5). Es bien sabido que cuando se produce VAAr con cualquiera de las tecnologfas de produccion actuales se genera una gran cantidad de partmulas vadas. Se necesita descubrir procedimientos que eliminen de forma eficaz las partmulas vadas a partir de las partmulas llenas. La MET de tincion negativa es uno de un par de metodos para determinar la proporcion de partmulas vadas con respecto a las llenas. Las partmulas vadas toman la tincion negativa (acetato de uranilo al 2 %) de forma distinta que las partmulas llenas, lo que hace posible cuantificar el numero de partmulas llenas y vadas en una preparacion de vector. El otro es un metodo basado en ELISA, que utiliza un anticuerpo espedfico de capside que reconoce tanto partmulas llenas como vadas. Despues, para determinar la proporcion de capsides vadas con respecto a las llenas, los tftulos por qPCR o transferencia puntual se sustraen del tftulo de partmulas totales generado a partir del ELISA. Aun tienen que establecerse anticuerpos de capside para la mayona de los serotipos del VAA y caracterizarse para su uso en un ELISA. Como se representa en la tabla incluida en la Fig. 5, la proporcion de partmulas llenas con respecto a las vadas global fue de no menos de 10, sugiriendo que el procedimiento de purificacion elimino las partmulas vadas de forma eficaz. Tambien se utilizaron las imagenes por MET de tincion negativa para determinar la eficacia de la solucion de almacenamiento final en evitar la agregacion de las partmulas de VAAr. Esta claro que el tampon de almacenamiento final tiene la capacidad de evitar la

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agregacion de las partfculas de VAAr, lo que muy probablemente afecte la infectividad y la propagacion del vector cuando se suministra in vivo.

Ejemplo 7

Comparacion in vivo del VAAr generado a partir de celulas HEK293 adherentes y en suspension

Utilizando celulas HEK293 adherentes y celulas HEK293 en suspension se generaron los vectores VAA6, 8 y 9 CBA- Luc. Los vectores producidos en celulas adherentes se purificaron utilizando gradientes de CsCl (Grieger et al., Nat. Protoc.1: 1412 (2006)) y los vectores producidos en celulas en suspension se purificaron utilizando los metodos optimizados descritos en el presente documento. Antes de los estudios in vivo, los vectores se titularon en la misma transferencia puntual. Las celulas HeLaRC32 se infectaron con diluciones en serie de cada vector y se cuantifico la expresion genica utilizando un ensayo de luciferasa. A base del ensayo de transduccion in vitro, la transduccion entre serotipos fue casi equivalente entre las estrategias de purificacion. Se inyectaron en cada raton 1x1011 gv totales de cada serotipo de vector CBA-Luc, a traves de una inyeccion en la vena de la cola. Se tomaron imagenes de los ratones a la semana y al mes posinyeccion (Fig. 6). Esta claro que el tropismo y los perfiles de transduccion de cada serotipo de vector probado eran similares y no estaban afectados por los metodos de purificacion.

Ejemplo 8

Produccion de VAAr utilizando biorreactores por ondas

Se optimizaron los parametros de produccion para generar VAAr en matraces agitadores utilizando medios de suspension libres de componentes animales. La siguiente etapa fue trasladar los parametros optimizados para el biorreactor por ondas a diversos volumenes de cultivo celular para determinar la capacidad de cambio de escala. La Tabla 4 ilustra varias ejecuciones en el biorreactor por ondas que variaban de tamano de 4,3 a 10 litros de cultivo celular, generando distintos vectores de serotipo. Cuando fue posible, se transfecto un cultivo de 1 litro en un frasco agitador para que sirva como un control para comparar la eficacia de transfeccion si se produda un vector de GFP asf como para comparar la produccion de vector por litro de cultivo pospurificacion. La eficacia de transfeccion fue casi equivalente entre matraces y bolsas de biorreactor por ondas. Cabe destacar que los plasmidos de GFP inducidos por CMV mostraron de forma consistente porcentajes mas elevados de celulas que expresaban GFP que los plasmidos de GFP inducidos por el promotor CBA y mini CBA (CBh), pero generaron rendimientos casi equivalentes de vector por litro de cultivo. Esto sugiere que la eficacia de transfeccion entre los plasmidos de GFP con CMV y CBA fue similar, pero en celulas HEK293 la transcripcion difiere entre los promotores. Como se evidencia en los matraces, la mayona de las ejecuciones del biorreactor por ondas generaron 1x1013 vectores de VAAr purificados por litro de cultivo, lo que establecio que los parametros optimizados para la transfeccion y la produccion de VAAr en matraces agitadores se traslada a los biorreactores por ondas. En la mayona de las ejecuciones de produccion del biorreactor por ondas de 10 litros, se generaron mas de 1x1014 vectores de VAAmc purificados. Cuando se tiene en cuenta la diferencia de escala, en volumenes de cultivo de 10 litros se habnan generado en el biorreactor por ondas mas de 1x1014 VAAmc purificado (a base del VAA2 y del VAA9 en la Tabla 4).

Tabla 4

Vector

Volumen de cultivo celular en el matraz Volumen de cultivo celular en la bolsa del biorreactor por ondas Eficacia de transfeccion 24 h Rendimiento de gv total Gv/l

VAA2 CMV- GFP

1 l 78,3 % 2,3 x 1013 2,3 x 1013

5 l 75,0 % 1,4 x 1014 2,7 x 1013

VAA9 CBA- GFP

4 l 64,6 % 6,7 x 1013 1,7 x 1013

VAA9 CBA- GFP

4,3 63,4 % 4,3 x 1013 1,0 x 1013

VAA2i8mc CMV GFP

1 l 83,5 % 1,2 x 1013 1,2 x 1013

10 l 94,1 % 8,8 x 1013 8,8 x 1012

VAA2i8mc CMV I1c

8 x 1 l 1,1 x 1014 1,4 x 1013

10 l 82,4 % 6,7 x 1013 6,7 x 1012

VAA9mc CMV-GFP

1 l 3,1 x 1013 3,1 x 1013

10 l 86,7 % 2,0 x 1014 2,0 x 1013

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Vector

Volumen de cultivo celular en el matraz Volumen de cultivo celular en la bolsa del biorreactor por ondas Eficacia de transfeccion 24 h Rendimiento de gv total Gv/l

VAA9mc CMV I1c

6 x 1 l 2,1 x 1014 3,5 x 1013

10 l 3,0 x 1014 3,0 x 1013

10 l 2,0 x 1014 2,0 x 1013

VAA2.5mc CBh-GFP

8,5 l 60,3 % 7,2 x 1013 8,5 x 1012

VAA9mc CBh-GFP

10 l 65,2 % 1,4 x 1014 1,4 x 1013

Ejemplo 9

Concentracion del VAAr

Determinadas aplicaciones precftnicas y cftnicas tales como las inyecciones directas de VAAr en el cerebro o el ojo requieren dosis de volumen bajo/altamente concentradas de VAAr. A traves del uso de columnas vivaspin de Sartorius, se optimizaron las condiciones espedficas que dieron como resultado VAAr concentrado con poca o ninguna perdida de partfculas e infectividad, como se ilustra en la Tabla 5 (concentracion de vectores de luciferasa; comparacion de los tftulos de vector e infectividad (ensayo de luciferasa) pre y posconcentracion) y la Tabla 6 (concentracion de vectores de los vectores de GFP; comparacion de tftulos de vector y unidades de transduccion (ensayo de transduccion de HeLaRC32) pre y posconcentracion). Las columnas utilizan una membrana de PES con un ftmite de peso molecular de 100 K que permite que el exceso de ftquido pase a traves del filtro mientras se retienen las partfculas de VAAr. Se probaron diversos tamanos de ftmite de peso molecular, pero no fueron tan eficaces en la retencion y concentracion de VAAr. Como se muestra en las Tablas 5 y 6, se midio de forma directa un tftulo equivalente del VAAr preconcentrado con un tftulo equivalente al VAAr concentrado. Por lo tanto, si se observara una perdida en la transduccion, las unidades de luz relativas o las unidades de transduccion para el VAAr concentrado senan menores que las de VAAr preconcentrado. Despues de probar varios serotipos del VAA no hubo perdida significativa en el tftulo y la actividad. Por lo tanto, el VAAr concentrado tema una actividad casi equivalente que el VAAr preconcentrado, indicando que el virus se habfa concentrado de forma eficaz. Para confirmar que el tftulo vftico no habfa cambiado, se evaluaron los gv y las gv/ml mediante transferencia puntual. Cuando las gv totales eran las mismas, gv/ml era con respecto al volumen. Por lo tanto, es posible concentrar vectores de VAAr eliminando volumen a traves de centrifugacion de baja velocidad utilizando un sistema de filtracion con ftmite de peso molecular lo suficientemente pequeno para retener el VAAr. En correlacion con los tftulos preconcentracion y posconcentracion, las imagenes por MET en las Fig. 7A y 7B ilustran un aumento en la concentracion de vector. A concentraciones de 1x10’f3 gv/ml la solucion de almacenamiento final tambien tiene la capacidad de evitar la agregacion de partfculas de VAAr.

Tabla 5

Vector

Muestra Volumen (ml) Volumen de infeccion (|jl) ULR promedio Tftulo gv/ml GV Totales

VAA5 CBA-Luc

Pre-Conc 10 10 1,9x104 1,2x10'' 1,2x1012

VAA5 CBA-Luc

Concentrado 2,2 2,2 1,8x104 7,4x10" 1,6x1012

VAA6 CBA-Luc

Pre-Conc 8,8 8,8 3,5x105 3,1x10" 2,7x1012

VAA6 CBA-Luc

Concentrado 1 1 3,7x105 3,8x1012 3,8x1012

VAA9 CBA-Luc

Pre-Conc 10 10 4,8x104 3,2x10" 3,2x1012

VAA9 CBA-Luc

Concentrado 1 1 5,0x104 2,0x1012 2,0x1012

VAA2i8mc CMV-Ilc

Pre-Conc 16,6 3,7x1012 6,1x1013

VAA2i8mc CMV-Ilc

Concentrado 6 5,6x1013

Tabla 6

Vector

Muestra Volumen (ml) Tftulo gv/ml GV Totales Proporcion GV/UT

VAA2.5mc CBh-GFP

Pre-Conc 17 3,7x1012 6,3x1013 48:1

VAA2.5mc CBh-GFP

Concentrado 6,5 1,2x1013 8,1x1013 57:1

VAA9mc CBh-GFP

Pre-Conc 22 5,8x1012 1,3x1014 2675:1

VAA9mc CBh-GFP

Concentrado 15 9,0x1012 1,4x1014 1246:1

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Ejemplo 10

Recogida continua de VAAr a partir de los medios en suspension

Como se describe en publicaciones anteriores sobre produccion del VAA, en la determinacion del mejor punto de tiempo para recoger VAA a partir de celulas HEK293 adherentes, se demostro recientemente cual es el punto de tiempo optimo para recoger VAA a partir de medios de cultivo celular (Lock et al., Hum Gene Ther 21: 1259 (2010); Vandenberghe et al., Hum Gene Ther 21: 1251 (2010)). Para determinar si el VAA puede recogerse a lo largo del tiempo (de forma aditiva) a partir de los medios, los inventores transfectaron cultivos de 30 ml de celulas HEK293 en suspension para producir vectores CMV-eGFP de VAAr8 y VAAr9, utilizando los parametros optimizados descritos en el presente documento. Cuarenta y ocho horas postransfeccion, los cultivos celulares se sedimentaron mediante centrifugacion de baja velocidad y los medios se retiraron para la titulacion, mediante transferencia puntual y qPCR, de las partfculas resistentes a ADNasa. Despues, los sedimentos celulares se resuspendieron en medios sin suero recien preparados y se colocaron de vuelta en el incubador de agitacion para el cultivo y la produccion continua de VAAr. Despues, se tomaron muestras de los medios cada 24 horas y los medios se reemplazaron cada 48 horas. En el punto de tiempo de 120 horas, se determinaron los tttulos de VAAr8 y VAAr9 a partir tanto de los medios como de los sedimentos celulares. Como se muestra en la Fig. 9, VAAr8 y VAAr9 pueden detectarse y recogerse a partir de los medios 48 horas postransfeccion, encontrandose en los medios cantidades crecientes de vector a medida que pasa el tiempo y se reemplazan los medios. Cuando en la Fig. 9 se compara el rendimiento total con respecto al control de sedimento celular de 48 h, el metodo de recogida continua produjo 6,5 y 4,8 veces mas de vector VAAr8 y VAAr9, respectivamente. Este es el primer informe de recogida continua de VAAr a partir de medios de suspension en numerosos puntos de tiempo postransfeccion utilizando un sistema libre de componentes animales que se puede cambiar de escala. Despues, este procedimiento se adapto a la escala de biorreactor utilizando una bolsa de biorreactor por ondas de perfusion de 2 l. Para generar vector VAAr8 se transfecto un cultivo celular de 1 l. Utilizando una bomba peristaltica se retiraron en cada punto de tiempo 800 ml de cultivo celular (48, 72, 96, 120 y 144 h) a traves del filtro de perfusion dentro de la bolsa del biorreactor por ondas. Despues, se anadieron otra vez a la bolsa de ondas 800 ml de medio de cultivo celular en suspension libre de componentes animales recien preparado. Despues, se concentro el medio recogido utilizando FFT, seguido de clarificacion y de purificacion por cromatograffa en columna. La Tabla 7 muestra los rendimientos de vector VAAr8 del biorreactor por ondas de perfusion en puntos de tiempo espedficos (48, 72, 96, 120 y 144 h) a partir del medio de cultivo asf como a partir de sedimento celular de 144 h. VAAr8 purificado total denomina la suma de los rendimientos de VAAr8 de los medios de 48, 72, 96, 120, 144 h y del sedimento celular de 144 h. Los rendimientos de VAAr de 48 horas tfpicos representan intervalos de rendimiento logrados de forma tfpica para VAAr8 cuando se recoge a partir de sedimento celular a las 48 horas. Como se muestra en la Tabla 7, VAAr8 se puede recoger en todos los puntos de tiempo utilizando la bolsa de biorreactor por ondas de perfusion. El VAAr8 total recogido utilizando la bolsa de biorreactor por ondas de perfusion conduce a rendimientos 5-10 veces mas grandes que los rendimientos de sedimento celular de 48 horas tfpicos. Este es el primer informe de VAAr recogido de forma continua a partir de medios de suspension utilizando un biorreactor en numerosos puntos de tiempo postransfeccion utilizando una tecnologfa de produccion libre de componentes animales que se puede escalar y celulas en suspension. Esto permitira al fabricante utilizar un cultivo en suspension libre de componentes animales para producir, recoger y purificar VAAr de forma continua a partir de los medios de cultivo a todas las escalas, a traves de una unica transfeccion. A su vez, esto generana mas VAAr a partir de una cantidad equivalente de plasmido de entrada que el protocolo de produccion convencional, en donde el procedimiento de produccion se detiene cuando las celulas se recogen a las 48-96 horas postransfeccion. Un experto en la materia comprendera que para sobrepasar las 144 horas se necesitana aumentar la viabilidad celular y mantener la produccion de vector entre los puntos de tiempo. Dependiendo de las funciones del auxiliar de VAA y de la viabilidad celular, un experto en la materia podna extender esto a la generacion de lmeas celulares estables para la generacion de VAAr utilizando un sistema que se pueda regular para activar o desactivar la produccion a base de la viabilidad celular y de los rendimientos de vector, etc.

Tabla 7

Puntos de tiempo (horas)

VAA8 purificado

48

1,4 ' x 1013

72

2,9 x 1013

96

3,0 x 1013

120

1,5 x 1013

144

9,0 x 1012

sedimento celular de 144

8,6 x 1012

VAA8 purificado total

1,1 x 1014

Rendimientos de 48 h de

1,0 x 1013 a 2,0 x 1013

VAA8 tfpicos

Se han realizado a nivel mundial varios ensayos clmicos de Fase I y Fase II para enfermedades hereditarias y adquiridas utilizando VAA (Aucoin et al., Biotechnol Adv. 26: 73 (2008), Mueller et al., Gene Ther., 15: 858 (2008)). El aumento del numero de ensayos clmicos enfatiza la necesidad de establecer una tecnologfa de fabricacion que se puede cambiar de escala, que pueda generar de forma eficaz cantidades importantes de VAA, de tftulo elevado y

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altamente puro para satisfacer la creciente demanda clmica. Se ha persistido en varias estrategias de produccion de vector de VAAr, que incluyen el empaquetamiento de lmeas celulares que contienen los genes rep y cap del VAA, lmeas celulares provfficas estables y la transfeccion transitoria de multiples plasmidos en celulas HEK293 adherentes. La transfeccion transitoria de celulas HEK293 adherentes continua siendo el metodo mas ampliamente utilizado para la produccion de VAAr y representa la mayoffa del VAAr administrado en las aplicaciones preclmicas y clmicas. La siguiente etapa fue adaptar la tecnologfa de transfeccion transitoria a una tecnologfa que se pueda cambiar de escala, transfectando celulas HEK293 que tengan la capacidad de crecer en condiciones en suspension libre de componentes animales. Algunos estudios han notificado la produccion de VAAr utilizando celulas HEK293 en suspension (Durocher et al., J. Virol. Meth. 144: 32 (2007), Hildinger et al., Biotechnol., Lett. 29: 1713 (2007), Park et al. , Biotechnol, Bioeng. 94: 416 (2006)), pero los rendimientos de vector (aproximadamente 1,4x104 y 3x104 gv/celula) continuan siendo un impedimento para la tecnologfa de transfeccion transitoria de celulas HEK293 en suspension.

La presente divulgacion detalla una tecnologfa de fabricacion por transfeccion transitoria que se puede cambiar de escala robusta, utilizando una lmea celular HEK293 que puede crecer en condiciones en suspension libre de componentes animales y generar rendimientos de VAAr mas elevados por celula que el sistema de vector de expresion de baculovirus, y rendimientos comparables por celula con la reciente tecnologfa de infeccion por VHSr. Se adapto para el cultivo en condiciones en suspension libre de componentes animales un clon de celulas HEK293 adherentes, seleccionado por la eficacia de transfeccion (>70 %) y la produccion de vector de VAAr elevadas. Se exploraron varios medios de suspension sin suero disponibles de forma comercial para seleccionar los que sustentaban el crecimiento y una eficacia de transfeccion elevada. Se encontro que un medio de suspension libre de componentes animales sustentaba el mejor crecimiento, una eficacia de transfeccion elevada y rendimientos de vector de VAAr elevados (Tabla 2 y Fig. 2 y 4). Ademas de identificar los medios optimos se optimizaron varias variables. Utilizando los parametros optimizados es posible generar a partir de 1 litro de medio de cultivo celular, mas de 1x105 genomas de vector que contienen VAAr por celula y mas de 1x1013 genomas de vector purificados que contienen VAAr. Esto se valido a partir de cultivos celulares de 30 ml a 1 l, en matraces agitadores, y hasta volumenes de 10 l en bolsas de biorreactor por ondas (vease la Tabla 3), lo que ilustra que esta tecnologfa se puede cambiar de escala. Ademas, se demostro que el VAAr puede recogerse de forma continua a partir de los medios de suspension libres de componentes animales, a diversos puntos de tiempo postransfeccion, utilizando matraces agitadores y bolsas de biorreactor por ondas de perfusion, aumentando de forma significativa los rendimientos de VAAr globales a partir de un volumen de cultivo celular y de plasmido de entrada equivalente.

El VAAr se purifico a partir de lisado celular utilizando un gradiente de densidad discontinuo seguido de cromatograffa en columna. Se optimizo la capacidad de carga del gradiente discontinuo para determinar la cantidad maxima de lisado que se podfa clarificar de forma eficaz (eliminacion eficaz de contaminantes de protema) antes de la cromatograffa en columna. Se optimizaron los tampones de cromatograffa en columna para desarrollar un sistema de purificacion universal para unir y eluir de forma eficaz todos los serotipos y capsides quimericas del VAA (probados hasta la fecha). A traves de un extenso trabajo de desarrollo del procedimiento, fue posible eliminar los contaminantes de protema principales y menores a traves de una manipulacion simple de los tampones de cromatograffa, sin afectar los perfiles de union y de elucion para todos los serotipos y capsides quimericas de VAA (tinciones de plata de referencia en las Fig. 3 y 4). A traves de un procedimiento que muy probablemente se relaciona con el uso del gradiente de densidad discontinuo y de la cromatograffa en columna, se elimina una cantidad significativa de parffculas vadas dejando en el producto final un elevado porcentaje de VAAr que contiene genoma (Figura 5). En resumen, los VAAr generados estan altamente puros, tienen una proporcion elevada de capsides llenas con respecto a las vadas, y tienen una proporcion de genomas con respecto a la infectividad (a base del ensayo de recuento de fluorescencia de GFP) similar a los vectores generados utilizando los metodos anteriores de produccion (celulas HEK293 adherentes) y purificacion (Aucoin et al., Biotechnol, Adv. 26: 73 (2008)).

Se han desarrollado para la produccion de VAAr varios sistemas que se pueden cambiar de escala, los cuales incluyen metodos a base de adenovirus, a base de VHSr, a base de SVEB y a base de transfeccion transitoria. En comparacion, la presente tecnologfa de transfeccion transitoria que se puede cambiar de escala utilizando celulas HEK293 en suspension genera mas VAAr y mas VAAr infeccioso por celula que las tecnologfas de VAAr a base de adenovirus y de SVEB, y rendimientos comparables con la tecnologfa de produccion a base de VHSr. Ademas, el tiempo global invertido para generar VAAr utilizando este sistema es nominal (Fig. 8).

Claims (16)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Una celula HEK293 aislada depositada como ATCC n.° PTA-13274.
2. 2. Un metodo de produccion de partfculas de VAA, que comprende:

   (a) proporcionar a las celulas HEK293 de la reivindicacion 1 un sistema de expresion de VAA;

   (b) cultivar las celulas en condiciones en las cuales se producen partfculas de VAA; y

   (c) de forma opcional aislar las partfculas de VAA.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que las celulas se cultivan en suspension.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 2 o 3, en el que las celulas se cultivan en condiciones libres de componentes animales.
5. 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la etapa (c) comprende aislar las partfculas de VAA de las celulas.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la etapa (c) comprende aislar las partfculas de

   VAA del medio en el cual se cultivan las celulas.
7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que las celulas se cultivan en matraces agitadores.
8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que las celulas se cultivan en biorreactores.
9. 9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que el metodo tiene la capacidad de producir todos

   los serotipos, quimeras e hfbridos de VAA.
10. 10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que dicho VAA se selecciona del grupo que consiste en VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, VAA12 y VAA13, o un VAA quimerico que consta de VAA1-13 2.5, 2i8, 9.45 y de otras capsides quimericas o hforidas.
11. 11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en el que dicho sistema de expresion de VAA comprende un plasmido de VAA recombinante que comprende un transgen, un plasmido que contiene rep-cap de empaquetamiento y un plasmido auxiliar de adenovirus.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en el que dicho transgen es un gen indicador, terapeutico, inmunogenico o de diagnostico.
13. 13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en el que el metodo proporciona al menos aproximadamente 4 x 104 partfculas que contienen un genoma de vector por celula antes de la purificacion.
14. 14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-13, en el que el metodo proporciona al menos aproximadamente 1 x 105 partfculas que contienen un genoma de vector por celula antes de la purificacion.
15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-14, en el que el metodo proporciona al menos aproximadamente 1 x 1012 partfculas purificadas que contienen un genoma de vector por litro de cultivo celular.
16. 16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2-15, en el que el metodo proporciona al menos aproximadamente 1 x 1013 partfculas purificadas que contienen un genoma de vector por litro de cultivo celular.