KR20220118436A - 바이러스 벡터의 자동화된 생산 - Google Patents

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앤드류 레이처
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론자 워커스빌 아이엔씨.
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Abstract

본 개시내용은 완전-밀폐된 세포 조작 시스템 내에서, 조작된 바이러스 벡터-생산 세포주, 또는 패키징 세포를 활용하여, 바이러스 벡터를 생산하는 자동화된 방법을 제공한다. 생산될 수 있는 예시적인 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.

Description

바이러스 벡터의 자동화된 생산
본 개시내용은 완전-밀폐된 세포 조작 시스템 내에서, 조작된 바이러스 벡터-생산 세포주, 또는 패키징 세포를 활용하여, 바이러스 벡터를 생산하는 자동화된 방법을 제공한다. 생산될 수 있는 예시적인 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 바쿨로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
바이러스 벡터는 기본 연구 도구로서 그리고 유전자 치료에 사용하기 위한 것으로서 매우 중요하다. 예를 들어, 안전성 프로파일 및 장기간 발현 능력은 인간의 유전자 치료를 위한 우수한 바이러스 벡터인 아데노-연관 바이러스(AAV)를 만든다. 렌티바이러스 벡터는 마찬가지로 유전자 및 세포 치료 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 전달 방법 중 하나이다. 그러나 대부분의 바이러스 벡터를 생산하는 전통적인 방법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 번거롭다. 또한, 브리징 플랫폼(bridging platforms)(예를 들어 AAV) 또는 다수의 일시적 형질감염(예를 들어 렌티바이러스)에 의존하는 방법으로부터의 벡터 수율은 너무 낮거나 너무 많은 플라스미드 DNA를 필요로 해서 대부분의 치료 적용을 실현할 수 없다. 또한, 소규모 바이러스 벡터 생산을 위해, 큰 배치 공정이 요구되거나 바람직하지 않을 수 있다.
바이러스 벡터 생산의 자동화의 이점으로는 자동화 사용과 관련된 노동 시간 절감뿐만 아니라 제품 일관성 향상, 공간 분류 감소, 청정실 공간 감소, 교육 복잡성 감소, 규모 확대 및 추적 물류 개선 등을 포함한다. 또한, 소프트웨어는 자동으로 생성된 전자식 배치 기록을 사용하여 모든 공정 장비, 시약, 작업자 식별, 공정 중 센서 데이터 등의 이력을 제공함으로써 문서 공정을 간소화하는데 사용될 수 있다.
조작된 포유동물 세포가 바이러스 벡터를 최적으로 생산하는 자동화된 자기 완비 시스템은 유전자 치료 분야에 혁명을 일으킬 것이다. 대규모 또는 소규모 생산을 위한 바이러스 생산의 제어가 가능하고, 재현성 있고 안정적인 결과를 제공함과 동시에 오염을 제한하고 비용을 절감할 수 있는 기술이 절실히 요구된다.
요약
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 조작된 바이러스 생산자 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계; 상기 조작된 바이러스 생산자 세포를 관심 유전자를 코딩하는 벡터로써 형질도입하여 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 생산하는 단계; 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포 내에서 생산하는 단계; 상기 증식된 생산자 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되, 여기서 (a) 내지 (e)는 폐쇄되고 자동화된 공정으로 수행된다.
또한, 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 패키징 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계; 상기 패키징 세포를 바이러스 헬퍼 유전자, 바이러스 패킹 유전자 및 관심 유전자를 코딩하는 하나 이상의 벡터로 형질도입하여 형질도입 세포를 생산하는 단계; 상기 형질도입된 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 세포 내에서 생산하는 단계; 상기 증식된 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되, 여기서 (a) 내지 (e)는 폐쇄되고 자동화된 공정으로 수행된다.
도 1은 본원의 구현예에 따른 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 흐름도를 나타낸다.
도 2는 본원의 구현예에 설명된 바와 같이 폐쇄되고 자동화된 세포 조작 시스템을 도시한다.
도 3은 본원의 구현예에 설명된 바와 같이 예시적인 폐쇄되고 자동화된 세포 조작 시스템을 포함하는 실험실 공간을 나타낸다.
도 4는 본원의 구현예에 설명된 바와 같이 폐쇄되고 자동화된 시스템의 카세트에서 수행될 수 있는 바이러스 벡터 생산 공정의 다이어그램를 나타낸다.
도 5는 본원에 설명된 바와 같이 자동화된 세포 조작 시스템 내의 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 6은 본원의 구현예에 따른 다운스트림 공정의 구성도를 나타낸다.
도 7은 본원의 구현예에 따른 다운스트림 공정의 흐름도를 나타낸다.
도 8a 내지 8d는 본원의 구현예에 따른 다운스트림 공정 모듈의 구성요소들을 나타낸다.
도 9는 본원의 구현예에 따른 다운스트림 공정 모듈과 함께 사용하기 위한 예시적인 소프트웨어 제어 설계를 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 본원의 구현예에 따른 다운스트림 공정 모듈의 2개의 도면들을 나타낸다.
청구항 및/또는 명세서에서의 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우, 단수형("a" 또는 "an") 단어의 사용은 "하나"를 의미할 수 있으나, "하나 이상(one or more)", "적어도 하나", "하나 또는 그 이상(one or more than one)"의 의미와도 일치한다.
본 출원 전체에서, "약"이라는 용어는 어떤 수치가 그 수치를 결정하기 위해 사용되는 방법/장치에 대한 오차의 고유한 변동을 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 전형적으로, 용어는 상황에 따라 대략 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만의 변동성을 포함하는 것을 의미한다.
청구항에서 "또는"의 사용은, 비록 개시내용이 대안 및 "및/또는"만을 지칭하는 정의를 지지하지만, 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 나타내지 않거나 또는 상기 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)" 및 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 같은 임의의 형태, "가지는(having)" 및 "가지다(have)" 및 "가지다(has)"와 같은 임의의 형태, "포함하는(including)" 및 "포함하다(includes)" 및 "포함하다(include)"와 같은 임의의 형태, 또는 "함유하는(containing)" 및 "함유하다(contains)" 및 "함유하다(contain)"와 같은 임의의 형태의 단어는 포괄적이거나 한계를 두지 않으면서, 추가적인, 미인용된, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법, 시스템, 숙주 세포, 발현 벡터, 및/또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물, 시스템, 세포 및/또는 핵산은 본원에 설명된 임의의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법이 본원에 제공된다. 본원에 설명된 자동화 방법은 폐쇄되고 자동화된 공정에서 적합하게 수행된다.
본원에 설명된 방법에 의해 생산된 "바이러스 벡터"는 치료 또는 산업 목적에 적합하게, 핵산 분자를 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있는 생산물 바이러스를 지칭한다. 본원에 설명된 다양한 방법에 의해 생산된 바이러스 벡터는 수확되거나, 분리되고, 최종의 원하는 적용까지 저장될 수 있다.
도 1은 본원에 설명된 자동화된 생산 공정의 흐름의 구성도를 나타낸다.
적합하게는, 본원에 설명된 상기 방법은 조작된 바이러스 생산자 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 것을 포함한다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 상기 방법에 활용되는 "조작된 바이러스 생산자 세포"는 바이러스 벡터의 생산을 허용하는 헬퍼 유전자 또는 발현 시스템을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 적합하게 포함하는 세포이다.
본원에 지칭된 바와 같이, "도입"이라는 단어는 조작된 바이러스 생산자 세포를 복수의 챔버 중 하나에 첨가하는 것을 의미할 수 있거나, 또는 조작된 바이러스 생산자 세포가 상기 방법을 시작하기 전에 카세트 내에 존재하는 것을 나타낼 수 있다.
구현예에서, 본원에 설명된 방법은 조작된 바이러스 생산자 세포의 공급, 세척 및 관찰 중 하나 이상을 여러 차례 수행하도록 구성된다. 이러한 다양한 활동들은 임의의 순서로 수행될 수 있고, 단독으로 또는 다른 활동과 조합하여 수행될 수 있다. 구현예에서, 세포의 농축은 원심분리, 침전 후의 상등액 제거, 또는 여과를 포함한다. 적합하게는, 최적화 공정은, 원심분리 또는 여과의 파라미터를 조절하는 단계를 적합하게는 자기-조절 공정에서, 추가로 포함한다.
본원에 설명된 방법은 적합하게는, 관심 유전자를 코딩하는 벡터로 조작된 바이러스 생산자 세포를 형질도입하여 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 지칭된 바와 같이, "형질도입(transduction or transducing)"은 벡터를 포함하는 외인성 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. "형질도입된" 세포는 세포 내부에 외인성 핵산 분자를 포함하고, 세포의 표현형 변화를 유도한다. 형질도입된 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈 DNA에 통합될 수 있고/있거나 세포에 의해 일시적으로 또는 장기간 동안, 염색체 외에서 유지될 수 있다. 외인성 핵산 분자 또는 단편을 발현하는 숙주 세포 또는 유기체를 "재조합", "형질도입", "형질감염", 또는 "형질전환" 유기체로 지칭한다. 다수의 형질도입 및 형질감염 기술은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 (Graham et al., Virology, 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); 및 Chu et al., Gene 13:197 (1981))를 참조할 수 있다. 형질도입은 리포좀, 지질-기반 또는 중합체-기반 시스템과 같은 형질감염 시스템의 사용을 포함할 수 있고, 또한 유전자 총, 전기천공 등과 같은 기계적 형질감염의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터" 또는 "발현 벡터"는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 코스미드와 같은 복제단위이며, 본원에 설명된 핵산 분자는 세포 내에서 부착된 핵산 분자의 복제 및/또는 발현을 야기하기 위해 여기서 부착될 수 있다. "벡터"는 에피좀 (예를 들어 플라스미드) 및 비-에피좀 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 핵산 분자를 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 세포 내로 도입하기 위한 바이러스 및 비-바이러스 수단을 모두 포함한다. 용어 벡터는 합성 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 형질감염, 형질도입, 세포 융합 및 리포펙션(lipofection)을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 잘 알려진 방법에 의해 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 프로모터를 포함하는 다양한 조절 요소를 포함할 수 있다.
"유전자"는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 집합체를 지칭하며, cDNA 및 게놈 DNA 핵산 분자를 포함한다. "유전자"는 또한 코딩 서열 선행 (5' 비-코딩 서열) 및 후행 (3' 비-코딩 서열) 조절 서열로서 작용할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유전자는 다중 카피와 통합된다. 일부 구현예에서, 유전자는 사전 정의된 카피 수로 통합된다.
본원에 지칭된 바와 같이, 용어 "관심 유전자" 또는 "GOI"는 이종 유전자를 설명하는데 사용된다. 본원에 지칭된 바와 같이, 코딩 서열 또는 조절 서열과 같은 핵산 서열에 관한 용어 "이종 유전자" 또는 "HG"는, 정상적으로 함께 결합되지 않고/ 않거나 특정 세포와 정상적으로 결합되지 않는 핵산 서열, 즉 유전자를 나타낸다. 일부 구현예에서, 이종 유전자는 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 구조물 (예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열)이다. 대립유전자 변이 또는 자연적으로 발생하는 돌연변이 돌발 사건은 본원에서 사용되는 바와 같이 이종 DNA를 발생시키지 않는다.
적합하게는, 바이러스 생산자 세포 내로 형질도입된 관심 유전자는 치료 관심 유전자이다. 본원에서 사용되는 "치료 관심 유전자"는 기능적으로 관련된 임의의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 치료 관심 유전자는 표적 세포 게놈으로부터 결함 또는 결실된 단백질을 코딩하거나, 원하는 생물학적 또는 치료 효과(예를 들어 항바이러스 기능)를 갖는 비-천연 단백질을 코딩하는 임의의 원하는 유전자를 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열은 안티센스 또는 리보자임 기능을 갖는 분자에 상응할 수 있다. 적합한 치료 관심 유전자의 대표적인 (비-제한적) 예는 AIDS, 암, 신경학적 질환, 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증과 같은 질환을 포함하는 염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환; 각종 빈혈, 지중해 빈혈 및 혈우병을 포함하는 각종 혈액 질환; 낭포성 섬유증, 가우처병, 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍, 폐기종 등과 같은 유전적 결함의 치료에 사용되는 것을 포함한다. 암 및 바이러스 질환에 대한 안티센스 요법에 유용한 몇몇 안티센스 올리고뉴클레오티드(예를 들어, mRNA의 번역 개시 부위(AUG 코돈) 주위의 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)가 당업계에 설명되어 있고 또한 적합한 치료 관심 유전자의 예이다.
따라서, 예시적인 구현예에서, 본원에 설명된 방법, 및 치료 관심 유전자는 초희귀 질환에서의 적용을 위한 바이러스 벡터를 생산하는데 유용하다. 이러한 질환은 상당한 양의 바이러스 벡터를 필요로 하지 않을 수 있지만(치료를 위한 한 명 또는 소수의, 또는 10명의, 또는 100명의 환자일 수 있기 때문에), 무균, 재현성 및 공정 제어는 이러한 적용에서 매우 중요하다. 폐쇄되고 자동화된 시스템을 활용하는 본 원에 설명된 방법들은 원하는 수준의 생산 제어를 허용한다.
구현예에서 방법은 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 증식시키고, 바이러스 벡터를 형질도입된 바이러스 생산자 세포 내에서 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 설명된 바와 같이, 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 증식시키는 방법은 적합하게는 공급, 세척 및 관찰 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 형질도입 바이러스 생산자 세포를 "증식시키는" 것은 세포가 사전-정의된 원하는 배양물 크기에 도달할 때까지 성장하도록 하는 다양한 방법을 지칭한다. 사전-정의된 배양물 크기는 적합한 또는 바람직한 수의 바이러스 벡터의 생산을 허용하는 충분한 수의 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 생산자 세포의 수는 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 또는 약 1010개의 세포이다.
도 1에 묘사된 바와 같이, 적합하게는, 형질도입(104) 및 증식(106)은 완전 밀폐형 세포 조작 시스템(102) 내에서 일어난다. 적합하게는, 이러한 완전 밀폐형 세포 조작 시스템은 자동화 시스템이다.
본원에 설명된 바와 같이, "완전히 밀폐된 세포 조작 시스템"은 복수의 챔버를 적합하게 포함하는 폐쇄된 시스템을 지칭하며, 본원에 설명된 다양한 방법의 각각의 단계는 세포 조작 시스템의 복수의 챔버 중 동일하거나 상이한 챔버에서 수행된다. 적합하게는, 다양한 세포, 벡터 및 세포 배양 배지 각각은 방법을 시작하기 전에 복수의 챔버 중 상이한 챔버에 함유된다. 세포 조작 시스템은 적합하게는 세포를 성장시키기 위한 온도(예를 들어, 약 37℃)에서 유지되는 하나 이상의 챔버를 포함하고, 복수의 챔버 중 적어도 하나는 냉장 온도(예를 들어, 약 4-8℃)에서 유지된다. "완전히 밀폐된"은 적합하게, 완전히 밀폐된 시스템의 청결 및 적합한 무균성을 유지하기 위해 다양한 배관 또는 다른 유동적으로 연결된 경로 및 연결을 통해 상호연결되는 복수의 챔버를 지칭한다.
본원에 설명된 바와 같이, 구현예에서, 제공된 방법은 단일 턴키 플랫폼에서 다수의 장치 작동을 통합하는 COCOON 플랫폼(Octane Biotech (Octane Biotech, Kingston, ON))을 활용한다. 효율적이고 효과적인 자동화 번역을 제공하기 위해, 설명된 방법들은 다수의 단위 조작 장치들을 조합하는 적용-특정/스폰서-특정 일회용 카세트들의 개념을 활용한다 - 모든 장치들은 바이러스 벡터 제품의 핵심 요구사항들에 초점을 맞췄다. 예시적인 완전 밀폐형 세포 조작 시스템은 미국 공개 특허 출원 제 2019-0169572호에 설명되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 설명된 방법에 유용한 예시적인 완전 밀폐된 세포 조작 시스템(102)이 도 2에 나타나 있다. 도 3은 본원의 구현예에 설명된 바와 같은 바이러스 벡터를 고처리량(high throughput) 방식으로 생산하는데 유용한 예시적인 완전히 둘러싸인 세포 조작 시스템(102)을 함유하는 실험실 공간을 나타낸다. 구현예들에서, 폐쇄되고 자동화된 시스템들 각각은 분리되고 고유한 바이러스 벡터를 생산할 수 있다.
구현예에서, 본원에 설명된 형질도입 및 증식은 완전 밀폐된 세포 조작 시스템(102)의 카세트(202)(도 2 및 도4 참조)에서 일어난다. 카세트(202)는 세포 배양 배지의 저장을 위한 저온 챔버; 바이러스 벡터의 생산에 관여하는 공정을 수행하기 위한 고온 챔버로서, 열 장벽에 의해 상기 저온 챔버로부터 분리되고, 세포 배양 챔버를 포함하는, 고온 챔버; 그리고 세포 배양 챔버에 연결된 하나 이상의 유동성 경로로서, 세포 배양 챔버 내의 세포를 교란시키지 않으면서 세포 배양 챔버로의 재순환, 폐물의 제거 및 균질한 기체 교환 및 영양분의 배분을 제공하는, 유동성 경로;를 포함할 수 있다. 도 4는 본원의 구현예들에 설명된 바와 같이 카세트(202)에서 수행될 수 있는 바이러스 벡터 생산 공정의 요소들의 흐름도를 나타낸다.
도 5는 카세트(202)의 다양한 구성요소의 흐름도를 나타낸다. 도 5는 세포 배양 챔버(510)와 위성 부피(530) 사이의 연결을 묘사한 개략도이다. 또한 도 5에 묘사된 것은 다양한 센서(예를 들어, pH 센서(550), 용존 산소 센서(551)), 뿐만 아니라 샘플링/샘플 포트(552) 및 다양한 밸브(제어 밸브(553), 바이패스 체크 밸브(554))뿐만 아니라, 구성요소를 연결하는 실리콘-기반 배관 구성요소를 적절하게 포함하는 하나 이상의 유체 경로(540)의 위치 설정이다. 본원에 설명된 바와 같이, 실리콘-기반 배관 구성요소의 사용은 배관 구성요소를 통한 산소화를 허용하여 세포 배양을 위한 가스 전달 및 최적의 산소화를 용이하게 한다. 또한, 도 5에는 펌프 튜브(557) 및 백/밸브 모듈(558)과 함께, 카세트의 흐름 경로에서 하나 이상의 소수성 필터(555) 또는 친수성 필터(556)의 사용이 나타나 있다. 도 5는 또한, 조작된 바이러스 생산자 세포(또는 패키징 세포)가 카세트(202) 내로 도입될 수 있는 입력(580)에 대한 예시적인 위치뿐만 아니라, 증식된 생산자 세포주(또는 증식된 패키징 세포)가 인출되어 다운스트림 공정 모듈(108)로 전달될 수 있는 출력(590)을 묘사한다.
도 1에 나타난 바와 같이, 증식 후에, 증식된 생산자 세포 라인(또는 증식된 패킹 셀 라인)은 다운스트림 공정 모듈(108)로 전달된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "전달"은, 예를 들어, 밀폐된 시스템 및 공정을 유지하기 위해 시스템(102)의 출력(590)을 다운스트림 공정 모듈(108)의 입력에 연결함으로써, 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템(102)과 다운스트림 공정 모듈(108) 사이의 직접 연결을 적합하게 지칭한다. 본원에 설명된 바와 같이, 자동화 생산 방법의 모든 요소(형질도입, 증식, 분리로부터 정제까지)는 폐쇄되고 자동화된 공정에서 적합하게 수행된다. "폐쇄" 공정이라는 용어는 적합하게, 멸균 공정을 유지하기 위해 다운스트림 공정 모듈(108)로의 직접 연결과 (원하는 것이 아닌) 외부 환경과의 상호작용을 허용하지 않는 카트리지 및 다른 내장 시스템의 사용을 지칭한다. "자동화된" 공정 또는 공정의 "자동화"는 정의된 또는 미리 설정된 상황들 또는 원하는 특성들에 기초하여 파라미터들을 관찰하고 변경하기 위해 마이크로프로세서를 포함하는 외부 제어에 의해 본 명세서에 설명된 하나 이상의 공정의 제어를 의미한다.
적합하게는, 다운스트림 공정 모듈(108)은 바이러스 벡터의 분리 및 바이러스 벡터의 정제와 같은 공정을 수행한다. 도 1에 나타난 바와 같이, 다운스트림 공정 모듈(108)은 적합하게는 소형이고, 자동화되고, 쉽게 구성되고 변경된 공정 모듈이다. 다운스트림 공정 모듈(108)은 전자 제어 및 조자, 및 기계적 구성요소 및 센싱을 적합하게 포함한다. 적합하게는, 전자 제어 및 기계적 구성요소는 각각의 바이러스 생산 공정으로 쉽게 대체될 필요가 없다는 점에서 내구성 구성요소다. 다운스트림 공정 모듈(108)은 또한 각각의 바이러스 생산(또는 적어도 생산되는 상이한 유형의 바이러스 사이)에 이어서 교체가능한(및 적합하게 교체되는) 일회용 카세트 및 시약을 적합하게 포함한다.
도 6은 다운스트림 공정 모듈(108) 내에서 일어나는 적합한 활동들의 예시적인 구성도를 나타낸다. 나타난 바와 같이, 구현예에서, 증식된 세포 생산물(샘플)은 먼저 1차 회수되어 세포 배양 액체 배지로부터 세포를 제거한다. 이어서, 세포를 적합하게는 기계적(예를 들어, 비드, 진탕 등) 또는 화학적 수단(예를 들어, 용해 완충제, 세제 등)으로 적합하게 용해시켜 생산물 바이러스 벡터를 노출시킨다. 이어서, 포획 단계를 사용하여 바이러스 벡터를 분리시킨다. 이러한 분리는 적합하게는 생산물(바이러스 벡터)이 매트릭스에 남아 있고 불순물이 흐르는 결합/용출물 컬럼 단계이다. 적합한 컬럼 조건 및 배지는 당업계에 공지되어 있다. 레트로넥틴 또는 피브로넥틴 코팅된 표면도 사용될 수 있다. 이 포획 단계는 바이러스의 총량이 수집될 때까지 원하는 만큼 여러 번 반복될 수 있다. 이러한 분리는 또한, 기능화된 표면을 포함할 수 있는 세파로오스 컬럼을 포함하는, 크로마토그래피 컬럼 및 다양한 친화성 컬럼뿐만 아니라 침전 컬럼의 사용을 포함할 수 있다. 초기 포획 후에, 상기 용액은 pH 5 내지 최대 약 pH 7로 적합하게 적정된다.
이어서, 연마 단계, 예를 들어, 흐름(flow-through) 모드에서 막 연마 단계를 수행하여, 상기 바이러스 벡터를 정제한다. 이러한 연마에 있어서, 불순물은 막 상에 흡수되고 원하는 생산물(바이러스 벡터)이 흐른다. 예시적인 연마 단계는 SARTOBIND® Q 이온 교환기(SARTORIUS®, G
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ttingen, Germany)와 같은 강한 이온 교환기를 활용한다. 이 연마 단계는 원하지 않는 바이러스, DNA, 숙주 세포 단백질, 침출 단백질 A 및 엔도톡신을 제거한다. 연마 단계를 수행하기 위한 예시적인 완충제 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
상기 연마 후, pH 적정 및 유지 단계를 적절히 수행한다. 이는 적합하게는 pH를 pH 6 또는 pH 5 미만으로 떨어뜨리고, 원하는 시간 동안 유지한 다음, pH를 약 pH 7로 다시 적정하는 것을 포함한다. 상기 공정은 원하는 농도를 달성하기 위해 바이러스 입자를 농축하거나 정용 여과(diafiltering)하는 것을 적합하게는 추가로 포함한다.
상기 농축에 이어서, 바이러스 벡터 생산물은 최종 생산물에 대해 제형화될 수 있다. 이는 다양한 부형제(예를 들어, 염, 완충제, 오스몰농도 조절제) 뿐만 아니라 상이한 배지 등의 첨가물을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터 생산물은 그 후 환자에게 투여되거나, 포장/선적되거나 저장될 수 있을 때까지 감소된 온도(예를 들어, 약 4 내지 8 ℃)에서 적합하게 유지된다.
다운스트림 공정 모듈의 다양한 요소들 사이에서, 인라인 0.2 미크론 필터가 박테리아 오염으로부터 보호하고 침전물을 제거하는데 적합하게 사용된다.
도 7은 본원에 설명된 바와 같은 다운스트림 공정 모듈(108)의 예시적인 흐름도 및 예시적인 구성요소들을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 다운스트림 공정 모듈은 각각의 실행 또는 상이한 바이러스 벡터 시스템에 대해 대체될 수 있는 다양한 완충제 및 시약, 컬럼 뿐만 아니라, 펌프, 밸브, 제어 시스템 등과 같이 대체되지 않는 구성요소를 적합하게 포함한다.
도 8a는 예시적인 다운스트림 공정 모듈(108)을 나타낸다. 도 8b-8d는 바꿔 넣을 수 있는 상이한 완충제 및 컬럼을 함유하는 일회용/교체가능한 요소를 나타낸다.
도 9는 시스템의 관찰뿐만 아니라 다양한 밸브, 펌프 등을 제어하기 위한 인터페이스를 보여주는 다운스트림 공정 모듈(108)에 대한 예시적인 컴퓨터 제어 설정을 도시한다. 또한 pH, 전도도, UV, 온도, 압력 등과 같이 관찰될 수 있는 다양한 요소들을 예시하는 모의 출력이 나타난다.
도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이, 다운스트림 공정 모듈(108)은 사용자 또는 특정 샘플을 특정 모듈과 연관시키기 위해 RFID(radio frequency identification) 판독기와 같은 구성요소들을 포함할 수 있다. 또한 압력, 전도도 및 pH 센서, UV 센서, 연동 펌프 및 서보 밸브가 나타나 있다.
도 1에 예시된 바와 같이, 상기 다운스트림 공정 모듈(108)에 이어서, 상기 바이러스 벡터 생산물은 바이러스 역가, 활성 수준, 오염 등의 측정을 포함하는 추가 분석(110)을 위해 전달될 수 있다.
구현예에서, 폐쇄되고 자동화된 공정은 자기-조절 공정, 즉 외부(인간) 사용자로부터의 입력을 요구하지 않는 공정이며, 다양한 컴퓨터 프로그램 및 조건을 통해 세포 배양 또는 다른 특성에 대한 요구되는 수정을 결정하여 자동화 공정을 최적화할 수 있다. 구현예에서, 폐쇄되고 자동화된 공정은 온도 센서, pH 센서, 포도당 센서, 유당 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및 광학 밀도 센서 중 하나 이상을 이용한 관찰을 포함한다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로서 이러한 다양한 센서의 사용은 시스템 내의 다양한 시간 및 위치에서 발생하고, 최적화를 제공하기 위해 협력하여 작동한다. 예를 들어, 상기 폐쇄되고 자동화된 공정은 관찰에 기초하여, 바이러스-생산 세포 배양물의 온도, pH 수준, 글루코오스 수준, 유당 수준, 산소 수준, 이산화탄소 수준, 및 광학 밀도 중 하나 이상을 조절(예를 들어, 상승 또는 하강)할 수 있다.
상기 자동화된 공정은 또한, 예를 들어, 총 세포 수, 세포의 공급원, 세포의 밀도, 세포의 연령 등을 포함하는, 출발 세포 집단의 고유한 특성에 기초할 수 있다. 이러한 출발 세포 집단 특성은 상기 자동화된 방법을 시작하기 전에 컴퓨터 제어 시스템에 입력될 수 있으며, 이 경우 시스템은 방법을 최적화하기 위해, 예를 들어, 유당, 산소 및 이산화탄소 농도, 유속, 배양 시간, pH 등의 다양한 초기 수정을 수행할 것이다. 대안적으로, 세포 공정의 관찰은 출발 집단으로부터의 세포 배양 서열의 진행의 자동화된 특성화를 가능하게 하여 최적화된 최종 세포 배양 특성에 대한 조건의 개별적인 조절을 가능하게 한다.
추가의 구현예에서, 세포 조작 시스템은 다양한 방법 공정 동안 영양분, 폐기물, 방출된 사이토카인, 및/또는 용해된 가스를 재순환시킨다. 이러한 재순환은 원하는 바이러스 벡터의 생산에 도움을 준다. 바이러스 벡터의 생산을 최적화하기 위한 다른 메커니즘은 세포에 제공된 배지의 유속을 수정하고 제어하는 것을 포함한다. 세포가 성장하기 시작함에 따라, 제공된 배지의 순환 속도가 증가되어, 세포의 상태 및 당시의 요건에 따라 기체 교환이 개선되고 산소 및 이산화탄소가 세포 배양물에 들어가거나 이탈할 수 있도록 한다.
추가의 구현예에서, 본원에 설명된 방법 및 시스템은 또한 일시적 형질감염 시스템과 함께 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법은, 패키징 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계; 상기 패키징 세포를 바이러스 헬퍼 유전자, 바이러스 패킹 유전자 및 관심 유전자를 코딩하는 하나 이상의 벡터로써 형질도입하여 형질도입 세포를 생산하는 단계; 상기 형질도입된 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 세포 내에서 생산하는 단계; 상기 증식된 생산자 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 방법의 요소들은 폐쇄되고 자동화된 공정으로 수행된다.
일시적 형질감염을 활용하는 구현예에서, 패키징 세포가 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "패키징 세포"는 그의 게놈 내에 하나 이상의 바이러스 헬퍼 및/또는 패키징 유전자를 통합하지 않은 세포를 지칭하지만, 대신에 이러한 유전자가 형질감염을 통해 첨가되어 일시적으로 형질감염된 세포를 생산한다.
구현예에서, 자동화된 방법에 활용되는 조작된 바이러스 생산자 세포 또는 패키징 세포는 포유동물 세포이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포유동물 세포"는 예를 들어, 인간 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포 등과 같은 포유동물 목의 임의의 구성원(member)으로부터의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 마우스 세포, 인간 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, CHOK1 세포, CHO-DXB11 세포, CHO-DG44 세포, 모든 변이체 (예를 들어, POTELLIGENT®, Lonza, Slough, UK)를 포함하는 CHOK1SV 세포, 모든 변이체 (예를 들어, XCEEDTM Lonza, Slough, UK)를 포함하는 CHOK1SV GS-KO (글루타민 신타아제 녹아웃) 세포이다. 예시적인 인간 세포에는 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 예컨대 HEK293, HEK293T, HeLa 세포, 또는 HT1080 세포가 포함된다.
포유동물 세포는 부착 배양물 또는 현탁 배양물일 수 있는 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 부착 배양물은 기재 표면, 예를 들어 플라스틱 표면, 플레이트, 접시 또는 다른 적합한 세포 배양 성장 플랫폼 상에서 성장되는 세포를 지칭하고, 고정(anchorage) 의존적일 수 있다. 현탁 배양물이란, 예를 들어, 배양 플라스크 또는 큰 현탁 통에서 유지될 수 있는 세포를 지칭하며, 이는 가스 및 영양 교환을 위한 넓은 표면적을 허용한다. 현탁 세포 배양물은 휘저음 또는 교반 메커니즘을 자주 활용하여 적절한 혼합을 제공한다. 현탁 내의 세포를 유지하기 위한 배지 및 조건은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 현탁 세포 배양액은 인간 HEK293 클론 세포를 포함한다.
구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터의 생산 방법은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터"는 파보비리대(Parvoviridae) 과 및 디펜도파보바이러스(Dependoparvovirus) 속의 단일 가닥 DNA를 함유하는 작은 크기의, 복제-결함, 비외피 바이러스를 지칭한다. 10개 초과의 아데노-연관 바이러스 혈청형이 지금까지 확인되었으며, 혈청형 AAV2가 가장 잘 특징화되어 있다. AAV 혈청형의 다른 비-제한적인 예는 ANC80, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 및 AAV11이다. 이들 혈청형 이외에, AAV 유사형이 개발되었다. AAV 유사형은 제1 혈청형의 캡시드 및 제2 혈청형의 게놈을 함유한다(예를 들어, 유사형 AAV2/5는 혈청형 AAV2의 게놈 및 AAV5의 캡시드를 갖는 AAV에 상응할 것이다).
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "아데노바이러스"는 아데노비리대(Adenoviridae) 과의 이중 가닥 DNA를 함유하는 이십면체 뉴클레오캡시드를 갖는 비외피 바이러스를 지칭한다. 50개 초과의 아데노바이러스 아형은 인간으로부터 분리되었고 많은 추가적인 아형은 다른 포유동물 및 조류로부터 분리되었다. 예를 들어, 문헌 (Ishibashi et al., "Adenoviruses of animals," In The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, N.Y., pp. 497-562 (1984); Strauss, "Adenovirus infections in humans," In The Adenovirus, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, N.Y., pp. 451-596 (1984))를 참조할 수 있다. 이들 아형은 현재 두 가지 속, 즉 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus) 및 아비아데노바이러스(Aviadenovirus)로 구분된 아데노비리대(Adenoviridae)과에 속한다. 모든 아데노바이러스는 형태학적으로 및 구조적으로 유사하다. 그러나, 인간에서 아데노바이러스는 분기하는 면역학적 특성을 보이고, 따라서 혈청형으로 구분된다. 아데노바이러스의 두 가지 인간 혈청형, 즉 AV2와 AV5가 집중적으로 연구되어 아데노바이러스에 대한 일반적인 정보의 대부분을 제공하였다.
구현예에서, 본원에서 제공되는 바이러스 벡터의 생산 방법은 렌티바이러스 벡터를 생산한다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "렌티바이러스 벡터"는 2개의 단일 가닥 RNA 분자를 함유하는, 레트로비리대(Retroviridae) 과에 속하는 작은 구형의 외피 바이러스를 지칭한다. 렌티바이러스는 gag, pol 및 env 유전자를 함유하며, 2개의 조절 유전자, tat 및 rev를 가짐으로써 다른 레트로바이러스 과와 추가로 구별된다. 렌티바이러스 벡터는 배양된 세포 및 동물 조직에서 관심 유전자의 발현을 유도하는 분자 생물학에서 유용한 도구로서 당업계에 널리 공지되어 있다.
구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터의 생산 방법은 레트로바이러스 벡터를 생산한다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "레트로바이러스"는 레트로비리대(family Retroviridae) 과의 하나 이상의 구성원을 지칭하고, 이는 2개의 단일 가닥 RNA 분자를 함유하는 작은 구형을 갖는 외피 바이러스이다. 레트로바이러스는 그들의 RNA 분자를 DNA로 전환시키고, 이는 감염된 세포의 숙주 게놈으로 통합된다. 레트로바이러스-기반 벡터는 면역세포가 암세포를 표적화해 파괴하도록 재프로그래밍되는 암 치료를 위한 유전자 치료 분야에서 잘 알려져 있다.
구현예에서, 본원에 제공된 바이러스 벡터의 생산 방법은 바쿨로바이러스 벡터를 생산한다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "바쿨로바이러스"는 원형 dsDNA를 함유하는 막대형 바이러스이고, 곤충 유충 내에서 주로 감염되고 복제되는 것으로 알려진 바쿨로비리대 과의 하나 이상의 구성원을 지칭한다. 바쿨로바이러스 발현 벡터 시스템은 잘 확립되어 있고 진핵 세포에서 단백질의 생산에 매우 유용하다 (Summers et al., 2006).
추가의 구현예에서 방법은 바이러스 생산자 세포로써 곤충 세포를 적합하게 활용한다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, "곤충 세포"는 단백질 및/또는 바쿨로바이러스 벡터 생산의 발현 및 제조에 사용되는 나비인대 목(lepidopteran order)의 구성원과 같지만, 이에 제한되지 않는 곤충으로부터 기원하는 세포를 적합하게 지칭한다.
구현예에서 방법은 Sf9 세포를 적절하게 활용한다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, "Sf9 세포"는 일반적으로 단백질 및/또는 바쿨로바이러스 벡터 생산의 발현 및 생산에 사용되는 벌레 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 번데기 난소 조직으로부터 유래된 곤충 세포주이다.
구현예에서, 본원에 설명된 방법에 의해 생산된 바이러스 벡터의 양은 적어도 약 1010개의 바이러스 벡터이다. 예를 들어, 상기 본원에 설명된 방법에 의해 생산된 바이러스 벡터의 양은 적어도 약 1010개, 또는 적어도 약 1011개, 또는 적어도 약 1012개, 또는 적어도 약 1013개, 또는 적어도 약 1014개, 또는 적어도 약 1010 내지 1014개, 또는 약 1010 내지 1013개, 또는 약 1010 내지 1012개, 또는 약 1010개, 약 1011개, 약 1012개, 또는 약 1013개의 바이러스 벡터이다.
구현예에서, 본원에 설명된 방법은 아데노-연관 바이러스 (AAV) 바이러스 벡터의 생산을 위한 것이다. 이러한 공정은 적합하게, 조작된 포유동물 AAV 바이러스 생산자를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "바이러스 생산자 세포"는 그의 게놈 내에 통합되거나, 또는 더 많은 바이러스 헬퍼 또는 바이러스 패키징 유전자를 포함하는 세포를 지칭한다. AAV 바이러스 생산자 세포는 적합하게는 그의 게놈 내로 통합된, 제1 억제성 프로모터의 제어 하에 E2A 및 E4Orf6 유전자를 포함하는 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 포함한다. AAV 바이러스 벡터를 생산하는 방법에서 적합하게 활용되는 예시적인 조작된 포유동물 AAV 바이러스 생산자 세포는 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 가출원 제 62/783,589호 및 제 62/866,092호에서 상세히 설명된다.
본원에 설명된 바와 같이, 적합하게는 상기 방법에 활용되는 포유동물 AAV 바이러스 생산자 세포는 바이러스 헬퍼 유전자를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 바이러스 헬퍼 유전자는 다양한 아데노바이러스 유전자, 헤르페스 바이러스 유전자 및 보카바이러스 유전자를 포함한다(예를 들어, Guido et al., "Human bocavirus: Current knowledge and future challenges," World J. Gateroenterol 22:8684-8697를 참조할 수 있고, 이의 개시내용은 전체가 본원에 참조로 포함됨). 예시적인 구현예에서, 바이러스 헬퍼 유전자는 아데노바이러스 헬퍼 유전자이다. 본원에 지칭되는 바와 같이, 용어 "아데노바이러스 헬퍼 유전자" 또는 "AV 헬퍼 유전자"는 아데노-연관 바이러스 복제 및 패키징에 기여하는 하나 이상의 아데노바이러스 아형 또는 혈청형으로부터 유래된 하나 이상의 핵산 서열로 구성된 유전자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 E1A, E1B, E2A, E4 (E4Orf6 포함), VA, 또는 이들의 조합 또는 임의의 다른 아데노바이러스 헬퍼 유전자이다. 예시적인 구현예에서, 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 E2A 및 E4Orf6 유전자 둘 다를 포함한다. 적합하게는 E2A 및 E4Orf6 유전자 사이에 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 요소를 포함한다. IRES 요소는 단일 발현 카세트에서 E2A 유전자 후에 E4Orf6 유전자의 번역을 개시하여, 이러한 구조물에 안정성을 제공한다. 이러한 바이러스 헬퍼 유전자는 또한 일시적 형질감염을 이용한 도입에 의해 패키징 세포에 첨가될 수 있다.
추가의 구현예에서, AAV 바이러스 벡터의 자동화된 생산 방법은 프로모터의 제어 하에 Rep 및 Cap 유전자를 포함하는 AAV 유전자를 함유하는 조작된 포유동물 바이러스 생산자 세포를 포함한다. 이러한 AAV 유전자는 또한 바이러스 패키징 세포 내로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "Rep" 유전자는 바이러스 게놈을 복제하기 위해 집합적으로 요구되는 바이러스의 복제 단백질, 또는 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로 또한 알려진 상기 인간 헤르페스바이러스 6(HHV-6) rep 유전자와 같은 그의 기능적 동족체를 코딩하는 AAV 게놈의 미지의 인식 영역(art-recognized region)을 지칭한다. 따라서, 상기 rep 코딩 영역은 AAV Rep78 및 Rep68 ("Rep의 긴 형태"), 및 Rep52 및 Rep40 ("Rep의 짧은 형태"), 또는 그의 기능적 동족체를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 rep 코딩 영역은 본원에 설명된 AAV 혈청형과 같은 임의의 바이러스 혈청형으로부터 유도될 수 있다. 상기 영역은 모든 야생형 유전자를 포함할 필요는 없지만, 존재하는 상기 rep 유전자가 적합한 표적 세포에서 발현될 때 충분한 통합 기능을 제공하는 한 (예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해) 변경될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Muzyczka, N., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 (1992); 및 Kotin, R. M., Human Gene Therapy 5:793-801 (1994))를 참조할 수 있다.
본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "Cap" 유전자는 바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 AAV 게놈의 미지의 인식 영역을 의미한다. 이러한 캡시드 단백질의 예시적인 (비-제한적) 예는 AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3이다. 본 개시내용에서 사용되는 Cap 유전자는 임의의 AAV 혈청형 또는 AAV 혈청형의 조합으로부터 나올 수 있다.
추가의 구현예에서 방법은 적합하게는 형질도입된 세포를 증식하는 단계 및 상기 AAV 바이러스 벡터를 생산하는 단계, 및 이어서 바이러스 벡터를 분리하는 단계를 포함한다.
구현예에서 방법의 단계들은 폐쇄되고 자동화된 공정에서 수행된다.
구현예에서, 생산 방법에 활용되는 조작된 포유동물 AAV 바이러스 생산자 세포는 포유동물 세포 배양물이며, 이는 일부 구현예에서 적합하게는 현탁 배양물이다. 예시적인 포유동물 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포를 포함하는 인간 세포를 포함한다.
구현예에서, AAV 바이러스 벡터의 자동화된 생산의 방법은 적어도 약 1010 개의 바이러스 벡터를 생산한다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법에 의해 생산된 AAV 바이러스 벡터의 양은 적어도 약 1010개, 또는 적어도 약 1011개, 또는 적어도 약 1012개, 또는 적어도 약 1013개, 또는 적어도 약 1014개, 또는 약 1010 내지 1014개, 또는 약 1010 내지 1013개, 또는 약 1010 내지 1012개, 또는 약 1010개, 또는 약 1011개, 또는 약 1012개, 또는 약 1013개의 AAV 바이러스 벡터이다.
추가의 예시적인 구현예에서, 개시된 상기 방법은, 조작된 포유동물 렌티바이러스 벡터 생산자 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법이다. 패키징 세포는 또한 렌티바이러스 벡터를 생산하는데 사용될 수 있다. 렌티바이러스를 생산하는 예시적인 방법은 2019 년 8 월 23 일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제 62/890,904호 및 2019 년 12 월 18 일에 출원된 제 62/949,848호에서 찾을 수 있다. 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 "렌티바이러스 벡터 생산자 세포"는 렌티바이러스 벡터를 생산하는데 필요한 요소들을 그의 게놈에 통합하여 함유하는 세포를 지칭한다. 이러한 요소들은 또한 패키징 세포 내로 도입되어 렌티바이러스 벡터를 생산할 수 있다.
일 구현예에 따르면 방법은 제1 프로모터의 제어 하에 비리온 단백질(REV) 유전자의 발현의 렌티바이러스 조절자, 제2 프로모터의 제어 하에 렌티바이러스 외피 유전자, 및 제3 프로모터의 제어하에 렌티바이러스군 특이적 항원(GAG) 유전자 및 렌티바이러스 중합효소(POL) 유전자 둘 모두를 그의 게놈 내로 통합시키는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터 생산자 세포를 활용한다. 적합한 구현예에서, 핵산 서열은 트랜스포존-특이적 역말단반복(ITR)의 재조합으로부터 초래되는 서열에 의해 5' 및 3' 말단 모두에 플랭킹된다.
본원에 개시된 바와 같이, 비리온 단백질 (REV) 발현의 상기 렌티바이러스 조절자는 후기 유전자 발현을 촉진하는 RNA-결합 단백질이다. 바이러스 구조 단백질을 코딩하는, 스플라이싱되지 않거나 단일 스플라이싱된 mRNA를 핵에서 세포질로 수송하는 것 또한 중요하다.
상기 렌티바이러스 외피막(ENV) 유전자, 적합하게는 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 유전자는 세포 분해효소에 의해 상기 표면(SU) 외피막 당단백질 gp120 및 상기 막관통(TM) 당단백질 gp41로 절단되는 다단백질(polyprotein) 전구체를 코딩한다.
GAG는 스플라이싱되지 않은 mRNA로부터 번역되는 다단백질을 코딩하고, 이는 이후 바이러스 분해효소(PR)에 의해 매트릭스 단백질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드 단백질로 절단된다. 상기 렌티바이러스 중합효소(POL)는 GAG mRNA 번역 시 리보좀 프레임시프팅(ribosomal frameshifting)의 결과로 GAG-POL 다단백질로 발현되며, 상기 효소 단백질 역전사효소, 분해효소 및 통합효소를 코딩한다. 이들 3개의 단백질은 비리온 내의 상기 바이러스 게놈과 결합된다. 적합하게는 상기 GAG 유전자는 HIV GAG 유전자이고 상기 POL 유전자는 HIV POL 유전자이다.
적합한 구현예에서, 발현 카세트는 트랜스포존-특이적 역말단반복(ITR)에 의해 5' 및 3' 말단 둘 다에 플랭킹된다.
상기 렌티바이러스 벡터-생산 세포에 사용하기 위한 예시적인 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 억제성 프로모터를 포함하며, 적합하게는 상기 발현 카세트는 제1, 제2 및 제3 억제성 프로모터의 억제자 요소를 추가로 코딩한다. 구현예에서, 억제성 프로모터는 기능성 프로모터 및 테트라사이클린 작동 서열(TetO)을 포함하고, 상기 억제자 요소는 본원에 설명된 바와 같은 테트라사이클린 억제자 단백질이다.
추가의 구현예에서, 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법은 포유동물 렌티바이러스 벡터 생산자 세포를 관심 유전자를 코딩하는 벡터로써 형질도입하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 관심 유전자는 치료 관심 유전자이다.
추가의 구현예에서 방법은 렌티바이러스 벡터 생산자 세포 내에서의 제1, 제2 및 제3 프로모터의 활성화 및 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 증식시키는 단계를 포함한다.
추가의 구현예에서 방법은 생산된 렌티바이러스 벡터를 적합하게 분리하는 단계를 포함한다. 분리된 생산된 바이러스 벡터에 대한 방법이 본원에 설명된다.
예시적인 구현예에 있어서 방법은 폐쇄되고 자동화된 공정에서 수행된다.
본원에 설명된 바와 같이, 적합하게는 자동화된 방법은 포유동물 세포 배양물인 포유동물 세포를 활용하고, 구현예에서 현탁 배양물이다. 예시적인 세포는 HEK293 또는 HEK293T 세포와 같은 인간 세포를 포함한다.
구현예에서, 렌티바이러스 벡터의 자동화된 생산 방법은 적어도 약 1010개의 바이러스 벡터를 생산한다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법에 의해 생산된 렌티바이러스 벡터의 양은 적어도 약 1010 개, 또는 적어도 약 1011 개, 또는 적어도 약 1012 개, 또는 적어도 약 1013 개, 또는 적어도 약 1014 개, 또는 적어도 약 1010 내지 1014 개, 또는 약 1010 내지 1013 개, 또는 약 1010 내지 1012 개, 또는 약 1010 개, 약 1011 개, 약 1012 개, 또는 약 1013 개의 렌티바이러스 벡터이다.
구현예에서 방법의 단계들은 폐쇄되고 자동화된 공정에서 수행되며, 적합하게는 온도 센서, pH 센서, 포도당 센서, 유당 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및 광학 밀도 센서 중 하나 이상으로 관찰하고, 온도, pH 수준, 포도당 수준, 유당 수준, 산소 수준, 이산화탄소 수준, 및 광학 밀도 중 하나 이상을 자동으로 조절하는 단계를 포함한다.
또한, 본원에서 포유동물 대상체, 적합하게는 인간 대상체를 본원에 설명된 다양한 방법에 따라 생산된 AAV 또는 렌티바이러스 벡터로 치료하는 방법을 제공한다. 적합하게는, 상기 방법은 치료 관심 유전자를 포함하는 관심 유전자를 갖는 인간 대상체를 치료하는데 사용된다. 인간 대상체로의 투여는 예를 들어, 흡입, 주사 또는 정맥내 투여뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 투여 방법을 포함할 수 있다.
추가의 예시적인 구현예
구현예 1은 바이러스 벡터의 자동화된 생산 방법으로서, 조작된 바이러스 생산자 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계; 상기 조작된 바이러스 생산자 세포를 관심 유전자를 코딩하는 벡터로써 형질도입하여 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 생산하는 단계; 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포 내에서 생산하는 단계; 상기 증식된 생산자 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 및 바이러스 벡터를 분리하는 단계; 및 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되, 상기 요소들은 폐쇄되고 자동화된 공정으로 수행된다.
구현예 2는 구현예 1의 방법을 포함하며, 상기 조작된 바이러스 생산자 세포는 포유동물 세포이다.
구현예 3은 구현예 2의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물이다.
구현예 4는 구현예 3의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포 배양은 현탁 배양물이다.
구현예 5는 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터이다.
구현예 6은 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터이다.
구현예 7은 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터이다.
구현예 8은 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 바쿨로바이러스 벡터이다.
구현예 9는 구현예 2 내지 8 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
구현예 10은 구현예 2 내지 8 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포가 인간 세포이다.
구현예 11은 구현예 10의 방법을 포함하며, 상기 인간 세포가 인간 배아 신장 (HEK) 세포이다.
구현예 12는 구현예 10의 방법을 포함하며, 상기 인간 세포가 HEK293T 세포이다.
구현예 13은 구현예 1의 방법을 포함하며, 상기 조작된 생산자 세포는 곤충 세포이다.
구현예 14는 구현예 1의 방법을 포함하며, 상기 조작된 생산자 세포가 Sf9 세포이다.
구현예 15는 구현예 1의 방법을 포함하며, 상기 생산된 바이러스 벡터의 양이 적어도 약 1010개의 바이러스 벡터이다.
구현예 16은 구현예 1 내지 15 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 폐쇄되고 자동화된 공정은 온도 센서, pH 센서, 포도당 센서, 유당 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서, 및 광학 밀도 센서 중 하나 이상으로 관찰하는 단계, 및 온도, pH 수준, 포도당 수준, 유당 수준, 산소 수준, 이산화탄소 수준, 광학 밀도 중 하나 이상을 자동으로 조절하는 단계를 포함한다.
구현예 17은 구현예 1 내지 16 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 형질도입하는 단계는 바이러스 감염, 전기천공, 리포좀 형질감염, 또는 막 파괴를 포함한다.
구현예 18은 구현예 1 내지 17 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 분리하는 단계는 상기 증식된 생산자 세포를 용출 컬럼을 통해 통과시키는 것을 포함한다.
구현예 19는 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 정제하는 단계는 막 연마를 포함한다.
구현예 20은, 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
구현예 21은 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법으로서, 패키징 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계; 상기 패키징 세포를 바이러스 헬퍼 유전자, 바이러스 패킹 유전자 및 관심 유전자를 코딩하는 하나 이상의 벡터로써 형질도입하여 형질도입 세포를 생산하는 단계; 상기 형질도입된 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 세포 내에서 생산하는 단계; 상기 증식된 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; 및 상기 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되, 상기 요소들은 폐쇄되고 자동화된 공정으로 수행된다.
구현예 22는 구현예 21의 방법을 포함하며, 상기 패키징 세포는 포유동물 세포이다.
구현예 23은 구현예 22의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물이다.
구현예 24는 구현예 23의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물이다.
구현예 25는 구현예 21 내지 24 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
구현예 26은 구현예 21 내지 24 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터이다.
구현예 27은 구현예 21 내지 24 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터이다.
구현예 28은 구현예 21 내지 24 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 바쿨로바이러스 벡터이다.
구현예 29는 구현예 22 내지 28 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
구현예 30은 구현예 22 내지 28 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 포유동물 세포가 인간 세포이다.
구현예 31은 구현예 30의 방법을 포함하며, 상기 인간 세포가 인간 배아 신장 (HEK) 세포이다.
구현예 32는 구현예 30의 방법을 포함하며, 상기 인간 세포가 HEK293T 세포이다.
구현예 33은 구현예 21의 방법을 포함하며, 상기 패키징 세포가 곤충 세포이다.
구현예 34는 구현예 21의 방법을 포함하며, 상기 패키징 세포가 Sf9 세포이다.
구현예 35는 구현예 21의 방법을 포함하며, 생산된 바이러스 벡터의 양이 적어도 약 1010개의 바이러스 벡터이다.
구현예 36은 구현예 21 내지 35 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 폐쇄되고 자동화된 공정은 온도 센서, pH 센서, 포도당 센서, 유당 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서 및 광학 밀도 센서 중 하나 이상으로 관찰하는 단계, 및 온도, pH 수준, 포도당 수준, 유당 수준, 산소 수준, 이산화탄소 수준 및 광학 밀도 중 하나 이상을 자동으로 조절하는 단계를 포함한다.
구현예 37은 구현예 21 내지 36 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 형질도입하는 단계는 바이러스 감염, 전기천공, 리포좀 형질감염, 또는 막 파괴를 포함한다.
구현예 38은 구현예 21 내지 37 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 분리하는 단계는 상기 증식된 생산자 세포를 용출 컬럼을 통해 통과시키는 것을 포함한다.
구현예 39는 구현예 21 내지 38 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 상기 정제하는 단계는 막 연마를 포함한다.
구현예 40은 구현예 21 내지 39 중 어느 하나의 방법을 포함하며, 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 특정 구현예들이 예시되고 설명되었지만, 상기 청구항들은 설명되고 나타난 부분들의 특정 형태들 또는 배열에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 명세서에서는 예시적인 구현예들이 개시되어 있고, 구체적인 용어들이 사용되지만, 이들은 제한의 목적이 아닌 일반적이고 서술적인 의미로만 사용된다. 상기 교시 내용들에 비추어 본 구현예의 수정 및 변형이 가능하다. 따라서, 상기 구현예는 구체적으로 설명된 바와 다르게 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 출판물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로 포함된다.

Claims (40)

  1. 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법으로서,
    (a) 조작된 바이러스 생산자 세포를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 조작된 바이러스 생산자 세포를 관심 유전자를 코딩하는 벡터로써 형질도입하여 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 생산하는 단계;
    (c) 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 바이러스 생산자 세포 내에서 생산하는 단계;
    (d) 상기 증식된 생산자 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 및
    (e) 바이러스 벡터를 분리(isolating)하는 단계; 및
    (f) 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되,
    여기서 (a) 내지 (e)는 폐쇄되고 자동화된 공정에서 수행되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조작된 바이러스 생산자 세포는 포유동물 세포인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양물은 현탁 배양물인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentivirus) 벡터인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 바쿨로바이러스(baculovirus) 벡터인 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인 방법.
  10. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인간 세포는 인간 배아 신장(HEK) 세포인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 인간 세포는 HEK293T 세포인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조작된 생산자 세포는 곤충 세포인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 조작된 생산자 세포는 Sf9 세포인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 생산된 바이러스 벡터의 양은 적어도 약 1010개의 바이러스 벡터인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄되고 자동화된 공정은
    (a) 온도 센서, pH 센서, 포도당 센서, 유당 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서 및 광학 밀도 센서 중 하나 이상으로 관찰하는 단계; 및
    (b) 온도 수준, pH 수준, 포도당 수준, 유당 수준, 산소 수준, 이산화탄소 수준 및 광학 밀도 중 하나 이상을 자동으로 조절하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입하는 단계는 바이러스 감염, 전기천공, 리포좀 형질감염, 또는 막 파괴를 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 증식된 생산자 세포를 용리 컬럼을 통해 통과시키는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제하는 단계는 막 연마를 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 바이러스 벡터의 자동화된 생산을 위한 방법으로서,
    (a) 패키징 세포(packaging cell)를 완전히 밀폐된 세포 조작 시스템 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 패키징 세포를 바이러스 헬퍼 유전자(viral helper gene), 바이러스 패킹 유전자(viral packing gene) 및 관심 유전자를 코딩하는 하나 이상의 벡터로써 형질도입하여 형질도입된 세포를 생산하는 단계;
    (c) 상기 형질도입된 세포를 증식시키고, 상기 바이러스 벡터를 상기 형질도입된 세포 내에서 생산하는 단계;
    (d) 상기 증식된 세포를 다운스트림 공정 모듈로 전달하는 단계; 및
    (e) 바이러스 벡터를 분리하는 단계; 및
    (f) 바이러스 벡터를 정제하는 단계를 포함하되,
    여기서 (a) 내지 (e)는 폐쇄되고 자동화된 공정에서 수행되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 패키징 세포는 포유동물 세포인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 포유동물 세포 배양물인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 포유동물 세포 배양액은 현탁 배양물인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV)인 방법.
  26. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인 방법.
  27. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 방법.
  28. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 바쿨로바이러스 벡터인 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO)인 방법.
  30. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 세포인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 인간 세포는 인간 배아 신장(HEK) 세포인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 인간 세포는 HEK293T 세포인 방법.
  33. 제21항에 있어서, 상기 패키징 세포는 곤충 세포인 방법.
  34. 제21항에 있어서, 상기 패키징 세포는 Sf9 세포인 방법.
  35. 제21항에 있어서, 상기 생성된 바이러스 벡터의 양은 적어도 약 1010개의 바이러스 벡터인 방법.
  36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄되고 자동화된 공정은 다음을 포함하는 방법:
    (c) 온도 센서, pH 센서, 포도당 센서, 유당 센서, 산소 센서, 이산화탄소 센서 및 광학 밀도 센서 중 하나 이상으로 관찰하는 단계, 및
    (d) 온도 수준, pH 수준, 포도당 수준, 유당 수준, 산소 수준, 이산화탄소 수준 및 광학 밀도 중 하나 이상을 자동으로 조절하는 단계.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입하는 단계는 바이러스 감염, 전기천공, 리포좀 형질감염, 또는 막 파괴를 포함하는 방법.
  38. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리하는 단계는 상기 증식된 생산자 세포를 용리 컬럼을 통해 통과시키는 방법.
  39. 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제하는 단계는 막 연마를 포함하는 방법.
  40. 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 벡터를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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