CN108290927A - Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 - Google Patents
Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108290927A CN108290927A CN201680053464.6A CN201680053464A CN108290927A CN 108290927 A CN108290927 A CN 108290927A CN 201680053464 A CN201680053464 A CN 201680053464A CN 108290927 A CN108290927 A CN 108290927A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- capturing agent
- epitope
- agent according
- connector
- ligand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 0 CC(C(O)=O)N*(C)C Chemical compound CC(C(O)=O)N*(C)C 0.000 description 4
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
Abstract
本申请提供了稳定的肽基IL‑17F捕获剂和用作检测剂的方法。本申请还提供了制备IL‑17F捕获剂的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月15日提交的申请号为62/192,899的美国临时专利申请和2016年1月11日提交的申请号为62/277,430的美国临时专利申请以及2016年3月17日提交的申请号为62/309,756的美国临时专利申请的优先权,其各自通过引用以整体并入本文中。
背景技术
人白细胞介素-17(IL-17A)是由活化的T细胞分泌的促炎性细胞因子。IL-17A是治疗严重斑块型银屑病的有效靶标。在IL-17细胞因子家族中有六种不同的同源二聚体细胞因子(IL-17A-F)和异源二聚体IL-17A/F。IL-17F是与IL-17A最接近的同系物,并且在序列中有50%相同。IL-17A和IL-17F均既以二硫键连接的同源二聚体(32至38kDa)、又以IL-17A/F共价异源二聚体(40至45kDa)分泌。与IL-17A相似,IL-17F活化免疫和非免疫细胞以诱导促炎调节因子。这些调节因子可诱导炎症部位募集嗜中性粒细胞,促进局部组织破坏,诱导肿瘤新生血管形成,增强破骨细胞生成,并防止病原体感染,从而导致疾病发展和宿主保护。
IL-17A是治疗严重斑块型银屑病的有效靶标。目前的方法是通过中和循环的IL-17A来阻断IL-17A与其细胞表面受体的相互作用。这主要通过单克隆抗体及其片段完成。
IL-17细胞因子家族成员通过与IL-17受体家族(其中有五个相关成员(IL-17RA-IL-17RE))结合来调节它们的作用。IL-17A和IL-17F均以同源二聚体或异源二聚体与IL-17RA和IL-17RC之间形成的异源二聚受体复合物结合。虽然IL-17F的活性似乎与IL-17A的活性相关,但效力不同,与受体结合亲和力的差异一致。
由于IL-17A和IL-17F在免疫和免疫介导的疾病中的作用,它们已成为治疗药物开发中的热点领域。循环IL-17A和IL-17A/F的天然丰度非常低,这对于通过传统夹心免疫测定法检测这些生物标志物来说是一项挑战。高度灵敏地检测每个同源二聚体(IL17A,IL-17F)以及IL-17A/F异源二聚体的循环水平将有助于理解每种细胞因子参与疾病和治疗的过程。
发明内容
本公开涉及被设计为结合以检测白介素17F(IL-17F)的化学合成的捕获剂(称为蛋白质催化的捕获剂或PCC试剂)、利用迭代原位点击化学制备所述捕获剂的方法,使用所述捕获剂检测IL-17F的方法以及利用所述方法的检测。
一方面,本文提供了特异性结合IL-17F的稳定的合成的捕获剂,其中捕获剂包含一种或多种设计的锚配体。在某些实施方案中,捕获剂包含通过接头连接的两个锚配体。另一方面,本文提供了包含一种或多种如本文所述的特异性结合IL-17F的合成的捕获剂的组合物。根据一些实施方案,捕获剂以比IL-17A更大的亲和力结合IL-17F。根据某些实施方案,捕获剂结合IL-17F的亲和力比IL-17A高至少0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100或1000倍。
另一方面,本文提供了特异性结合IL-17F的稳定的合成的捕获剂,其中捕获剂包含对IL-17F上的第一表位具有亲和力的第一配体、对IL-17F上的第二表位具有亲和力的第二配体、以及将第一配体共价连接至第二配体的接头。特别地,第一配体孤立地结合第一表位(或其合成形式),第二配体孤立地结合第二表位(或其合成形式)。在捕获剂中,第一配体和第二配体协同地分别结合IL-17F的第一表位和第二表位。
另一方面,本文提供了用于检测生物样品中的IL-17F的方法,包括用本文所述的一种或多种捕获剂处理生物样品的步骤。
锚配体
在捕获剂的一个实施方案中,捕获剂包含两个配体,该两个配体特异性结合IL-17F的两个不同表位。然后可以通过接头将这些锚配体(有时在本文中简称为“配体”)彼此结合,该接头提高对IL-17F亲和力。在某些实施方案中,存在分别结合第一表位和第二表位的第一配体和第二配体。
根据某些实施方案,第一表位包含FFQKPES或FFQKPESCPPVPGG的氨基酸序列。在某些实施方案中,第一表位的长度在5至20个氨基酸之间。在其它实施方案中,第一表位的长度在7至13个氨基酸之间。在其它实施方案中,第一表位的长度至多为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
根据某些实施方案,第一表位包含NENQRVS或GIINENQRVS的氨基酸序列。在某些实施方案中,第一表位的长度在5至20个氨基酸之间。在其它实施方案中,第一表位的长度在7至10个氨基酸之间。在其它实施方案中,第一表位的长度至多为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
根据某些实施方案,第一配体包含选自FYKTH、FYKQH、FYLTH、FYLQH、RRATS和RRAQS的氨基酸序列。根据某些实施方案,第一配体包含选自RRATS和RRAQS的氨基酸序列。在某些实施方案中,第一配体是环状的。在某些实施方案中,第一配体包含1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代-1,2,3-***残基(Tz5)。
根据某些实施方案,第一配体包含选自KYGEV、LYGEV、VHKSG、VHLSG、QKHGP、TKHGP、QLHGP、TLHGP、YDLQR、YDLTR、YDKQR、YDKTR、KKGWP、KLGWP、LKGWP、LLGWP、RSYNL和RSYNK的氨基酸序列。根据某些实施方案,第一配体包含选自TKHGP、QKHGP、KKGWP和RSYNK的氨基酸序列。在某些实施方案中,第一配体是环状的。在某些实施方案中,第一配体包含1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代-1,2,3-***残基(Tz5)。
根据某些实施方案,第一配体包含序列RRATS,第二配体包含序列QKHGP。在其它实施方案中,第一配体包含序列RRATS,第二配体包含序列RSYNK。在其它实施方案中,第一配体和第二配体是环状的并且包含Tz4残基。
接头
根据某些实施方案,捕获剂还包含同时结合第一配体和第二配体的接头。根据某些实施方案,接头的长度对应于第一表位和第二表位之间的距离。接头的长度必须至少是第一表位和第二表位之间的距离。在某些实施方案中,接头长于第一表位和第二表位之间的距离。根据某些实施方案,所述接头比第一表位和第二表位之间的距离长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%。
根据某些实施方案,接头的长度为约至约约至约或约至约在某些实施方案中,接头的长度为约
在其它实施方案中,接头包含一个或多个乙二醇重复单元。在一些实施方案中,接头是PEG1、PEG2、PEG3、PEG4或PEG5。在其它实施方案中,接头包含肽。在其它实施方案中,接头包含氨基酸。在特定的实施方案中,接头是甘氨酸。在其它实施方案中,接头包含亚烷基部分,其中亚烷基部分任选取代有本文提供的一个或多个部分取代。
***连接
在捕获剂的一个实施方案中,锚配体和第二配体通过1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)连接在一起。在另一个实施方案中,第二配体和第三配体通过1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)连接在一起。在又另一个实施方案中,第三配体和第四配体通过1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)连接在一起。在又另一个实施方案中,锚配体和第二配体通过1,4-取代-1,2,3-***残基连接在一起,第二配体和第三配体通过1,4-取代-1,2,3-***残基连接在一起。在又另一个实施方案中,锚配体和第二配体通过1,4-取代的-1,2,3-***残基连接在一起,第二配体和第三配体通过1,4-取代的-1,2,3-***残基连接在一起,并且第三配体和第四配体通过1,4-取代-1,2,3-***残基连接在一起。
捕获剂
根据某些实施方案,捕获剂具有选自以下的结构:
和
根据其它实施方案,捕获剂具有选自以下的结构:
性质
在某些实施方案中,本文提供的IL-17F捕获剂在宽范围的温度、pH值、储存时间、储存条件和反应条件下稳定,并且在某些实施方案中,捕获剂比同等的(comparable)抗体或生物制品更稳定。在某些实施方案中,捕获剂作为冻干粉储存稳定。在某些实施方案中,捕获剂在约-80℃至约60℃的温度下储存稳定。在某些实施方案中,捕获剂在室温下稳定。在某些实施方案中,捕获剂在人血清中稳定至少24小时。在某些实施方案中,捕获剂在约3至约12的范围内的pH下稳定。在某些实施方案中,捕获剂作为粉末在约60℃的温度下稳定两个月。
可检测的标签
在一些实施方案中,捕获剂标记有标签,该标签选自由生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨基氧乙酸盐(aminooxyacetate)、19FB、18FB和FITC-PEG3组成的组。在其它实施方案中,捕获剂标记有可检测的部分,该可检测的部分由64Cu DOTA、68Ga DOTA、18F、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C和76Br组成。在其它实施方案中,标签是荧光标签。在特定的实施方案中,可检测的标签是18F。
方法和用途
如本文所用,术语“本发明的捕获剂”或“本发明的一些捕获剂”是指如本文所述结合IL-17F的合成的蛋白质催化的捕获剂。
还提供了检测受试者中的IL-17F的方法,包括将来自受试者的生物样品与本发明的一种或多种捕获剂进行接触的步骤。还提供了本发明的一种或多种捕获剂用于检测受试者中IL-17F的用途。
还提供了采用免疫测定法检测生物样品中的IL-17F的方法,其中免疫测定法利用如本文所述的捕获剂,其中所述捕获剂替代免疫测定法中的抗体或其等同物。在某些实施方案中,提供了利用如本文所述的捕获剂鉴定、检测、定量或分离生物样品中的IL-17F的方法。在该方法的一个实施方案中,免疫测定法选自蛋白质印迹(Western blot)、拉下实验(pull-down assay)、斑点印迹(dot blot)和ELISA的组。
还提供了检测人或哺乳动物受试者中IL-17F存在的方法,该方法包括以下步骤:
a)向受试者的生物样品施用一种或多种本发明的捕获剂,其中每种捕获剂连接至可检测的部分;和
b)检测受试者中与每种捕获剂连接的部分;其中检测到所述部分则指示受试者中存在IL-17F。
本文还提供了检测样品中的IL-17F的方法,其包括:
a)将样品暴露于本发明的一种或多种捕获剂,其中每种捕获剂连接至可检测的部分;
b)将生物样品中的IL-17F与捕获剂结合,和
c)检测底物上每种捕获剂连接的部分;其中底物上检测到该部分则说明检测到样品中存在IL-17F。
试剂盒
本文在某些实施方案中提供了包含一种或多种本发明捕获剂的试剂盒。在某些实施方案中,这些试剂盒可以用于鉴定、检测、定量和/或分离IL-17F,并且在某些实施方案中,试剂盒可用于对与IL-17F存在相关的病症的诊断和/或分期(staging)。在某些实施方案中,本文提供的试剂盒包含:(a)其上包含吸附剂的底物,其中吸附剂适用于结合IL-17F,和(b)清洗溶液或用于制备清洗溶液的说明书,其中吸附剂和清洗溶液的组合允许检测IL-17F。在其它实施方案中,本文提供的试剂盒可用于治疗与IL-17F存在相关的病症。
在某些实施方案中,试剂盒可以进一步包含标签形式或单独插页形式的用于合适操作参数的说明书。例如,试剂盒可以具有标准说明书,通知消费者/试剂盒使用者在将血浆样品或其它组织样品与探针接触后如何清洗探针。
在某些实施方案中,试剂盒包含(a)特异性结合IL-17F的一种或多种捕获剂;和(b)检测试剂。这样的试剂盒可以由本文所述的材料制备。
本文提供的试剂盒可以任选地包含标准或对照信息和/或对照量的材料,从而可以将测试样品与对照信息标准和/或对照量进行比较以确定在样本中的检测到的IL-17F的测试量是否是与特定病症的诊断一致的量。
捕获剂的合成
本文提供了制备(即合成)本发明的IL-17F特异性捕获剂的方法。在一个实施方案中,该方法包括以下步骤:
a.选择与靶蛋白上的第一表位结合的第一配体,
b.选择与靶蛋白上的第二表位结合的第二配体,
c.选择接头,其中该接头的长度允许当第一配体和第二配体分别特异性结合第一表位和第二表位时该接头同时结合该第一配体和该第二配体,以及
d.将接头与第一配体和第二配体结合,由此产生特异性结合靶蛋白的合成的捕获剂。
在某些实施方案中,采用以下步骤来鉴定配体:
1)预净化以消除非特异性结合物,
2)产品筛选以鉴定由表位模板原位点击化学产生的击中物(hit),
3)针对His-标记的IL-17F蛋白的靶标筛选,和
4)在2%(体积/体积)人血清中针对His-标记的IL-17F蛋白的另一次靶标筛选以鉴定与IL-17F的结合未受血清蛋白干扰的肽。
在某些实施方案中,第一表位和第二表位彼此间的距离为约至约约至约或约至约或约在一些实施方案中,接头长于第一表位和第二表位之间的距离。任选地,接头比第一表位和第二表位之间的距离长10至50%、5至25%或1至10%。
在某些实施方案中,捕获剂对靶蛋白的结合亲和力大于任一种配体。在一些实施方案中,捕获剂具有至少为全协同结合物(full cooperative binder)的结合亲和力的50、75或90%的结合亲和力。在其它实施方案中,捕获剂具有至少为全协同结合物的结合亲和力的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的结合亲和力。
在某些实施方案中,靶蛋白是合成的表位,其中合成的表位包含全长蛋白质的至少20个氨基酸的序列,其中合成的表位的至少一个氨基酸包含叠氮基团或乙炔基团。在一些实施方案中,合成的表位是全长蛋白质的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、150、200、250或300个氨基酸序列。在一些实施方案中,合成的表位的至少两个氨基酸包含叠氮基团或乙炔基团。在其它实施方案中,合成的表位的至少3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸包含叠氮基团或乙炔基团。
根据某些实施方案,全长蛋白质是天然存在的蛋白质。根据其它实施方案,天然存在的蛋白质是IL-17。
根据某些实施方案,捕获剂以是全协同结合物的结合亲和力的至少50%的结合亲和力结合合成的表位和全长蛋白质。根据某些实施方案,捕获剂以是全协同结合物的结合亲和力的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的结合亲和力结合合成的表位和全长蛋白质。
附图说明
图1:来源于IL-17F蛋白的表位。图1A、N-末端序列的差异存在于将IL-17A与IL-17F区分开的成熟蛋白质中。该区域的独特性对应于IL-17F中的Arg-31至Thr-79。图1B、设计的表位1片段的序列,表位1片段包含生物素-PEG3测定手柄(handle)和策略性取代有叠氮的点击手柄(C48Az4;Az4=L-叠氮赖氨酸)。图1C、设计的表位2片段的序列,表位2片段包含生物素-PEG3测定手柄和策略性取代有叠氮的点击手柄(I62Az4)。
图2:针对IL-17F表位1开发的大环的体外表征。图2A、针对PEG3-生物素修饰的Cy(RRATS)和Cy(RRAQS)的人IL-17F蛋白的夹心ELISA产生66至52nM的EC50值。类似测定的生物素化单克隆抗体(TA319597,Origene)显示出类似的结合亲和力。图2B、针对两种大环肽配体的人IL-17F和IL-17A蛋白的点ELISA表明优先与IL-17F结合。图2C、Cy(RRATS)-PEG3-生物素的质谱。图2D、Cy(RRAQS)-PEG3-生物素的质谱。
图3:与IL-17F表位1结合的大环的定位。图3A、合成His-标记的IL-17F表位以包含经过策略性加扰的序列,该加扰可以在点击手柄位置(C48S)的N-末端或C-末端进行。加扰的残基以斜体字显示。图3B、针对两个大环肽配体的His-标记的IL-17F表位的点ELISA表明优先与序列FFQKPES结合。
图4:针对IL-17F表位2开发的大环的体外表征。图4A、针对PEG3-生物素修饰的Cy(QKHGP)、Cy(TKHGP)、Cy(KKGWP)和Cy(RSYNK)的人IL-17F蛋白的夹心ELISA产生72至15nM的EC50值。图4B、针对四种大环肽配体的人IL-17F和IL-17A蛋白的点ELISA表明优先与IL-17F结合。图4C、针对大环肽配体的人IL-17F和IL-17A蛋白的点ELISA表明优先与IL-17F或IL-17A结合。
图5:IL-17F同源二聚体的3-D结构表示。IL-17F表位1-2的序列与代表性靶向表位的大环(Tz=***)相互覆盖。两个表位之间测量的距离用虚线表示。图5A、在单体IL-17F蛋白中,序列FFQKPES(在IL-17F表位1中)和IL-17F表位2之间的距离是约利用长度与蛋白质上两个结合位点之间的距离相近的接头,可以合成含有靶向两个IL-17F表位中的每一个的大环的双配体。图5B、在同源二聚体IL-17F蛋白中,来自一个单体的序列FFQKPES(在IL-17F表位1中)与来自另一个单体的IL-17F表位2之间的距离是约利用长度与桥接蛋白质二聚体的两个结合位点之间的距离相似的接头,可以合成另一个含有靶向两个IL-17F表位中的每一个的大环的双配体。PDB ID:1JPY。
图6:以范围在4.4至的接头连接两个大环的协同双配体候选化合物的结构。图6A、生物素-PEG3-Cy(RRATS)-Gly-Cy(QKHGP)图6B、生物素-PEG3-Cy(RRATS)-PEG1-Cy(QKHGP)图6C、生物素-PEG3-Cy(RRATS)-PEG2-Cy(QKHGP)图6D、生物素-PEG3-Cy(RRATS)-PEG3-Cy(QKHGP)图6E、生物素-PEG3-Cy(RRATS)-PEG4-Cy(QKHGP)图6F、生物素-PEG3-Cy(RRATS)-PEG5-Cy(QKHGP)
图7:开发一套针对蛋白质靶标的PCC结合物的起点。初始目标是鉴定出与蛋白质靶标上的一个表位结合的一个或多个PCC(12),以及与第二表位结合的一个或多个不同的PCC(13)。与第三表位、第四表位等表位结合的其它PCC也可能是有用的。靶向表位的PCC方法教导了这可以通过筛选针对合成的表位(SynEps)(14,15)的肽文库来完成。SynEp是具有天然存在靶表位序列的多肽,不同之处在于一个位点含有呈现叠氮或乙炔化学基团(16)(称为点击手柄)的人工氨基酸。SynEp被进一步修饰成在N-末端或C-末端(17)包含检测手柄,例如生物素基团。先前已经描述了筛选过程(Das,S.等人,A General SyntheticApproach for Designing Epitope Targeted Macrocyclic PeptideLigands.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2015,通过引用以整体并入本文)。利用该过程,可以鉴定出靶标上至少两个表位中的每一个的至少一种独特的肽结合物。通过针对完整蛋白质靶标(11)以及针对SynEps进行结合测定来验证这些肽结合物。对于这些结合测定,用天然存在的残基代替点击手柄(16)来制备SynEps。理想地,不同配体结合的靶蛋白质的不同区域在三级蛋白质结构中会相对接近(几纳米或更小)。即使是单个SynEp,筛选也可以产生与两个不同位点结合的PCC。
图8:与两个不同位点结合的PCC。使代表感兴趣表位(12)的区域相对于全长蛋白质(11)的暗淡背景突出显示出来。用星号(22)表示在SynEp结构中被替换为点击手柄的氨基酸残基。在SynEp筛选步骤中,可以鉴定出与表位的N-末端侧(23)或C-末端侧(24)结合的PCC。
图9:评估最佳接头长度。显示了与一个表位(12)的N侧结合的第一PCC(31)和与第二表位(13)的C侧结合的第二PCC(32)。对该结合排列与来自例如蛋白质数据库的蛋白质的结构一起进行分析以允许估计最佳接头(33)的长度。这样的评估可以将选择出的候选接头的数目缩小到非常小。一个示例中,可以利用这个评估出的长度值来选择一种或两种长度匹配的聚乙二醇低聚物以用于测试。最好的接头(34)是使双配体亲和力最接近于完全协同的结合物的亲和力的接头。
图10:IL-17F和IL-17A是紧密的同源物。暗绿色表示的残基是相同的,黄色表示的残基是同源的,没有突出显示的残基是唯一的。
图11:产生IL-17F和IL-17A的配体。利用两个表位产生针对IL-17F的锚配体,并利用一个表位产生针对IL-17A的锚配体。
图12:通过利用协同性设计针对IL-17F的优化的PCC双配体。图12A、绘制全长IL-17F。针对标记为L1和L2的表位开发PCC。图12B、显示出靶标区域的IL-17F展开图。PCC上化学可接触点之间的距离被评估为图12C、证明长度最接近的接头(PEG3)产生最佳结合物(约10倍)。双配体是生物素-PEG3-Cy(RSYNK)-PEGx-Cy(RRATS)(x=1至5)的形式。图12D、显示长度最接近的接头(PEG3)产生最佳结合物(约10倍)的图。
图13:以范围在8.8到的PEG接头连接的两个大环的双配体的结构。图13A、生物素-PEG3-Cy(RSYNK)-PEG1-Cy(RRATS)图13B、生物素-PEG3-Cy(RSYNK)-PEG2-Cy(RRATS)图13C、生物素-PEG3-Cy(RSYNK)-PEG3-Cy(RRATS)图13D、生物素-PEG3-Cy(RSYNK)-PEG4-Cy(RRATS)图13E、生物素-PEG3-Cy(RSYNK)-PEG5-Cy(RRATS)
图14:恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)组氨酸富集蛋白-2(Pf.HRP-2)。显示了Pf.HRP-2的序列图谱。
图15:YKYYR二聚体的结构和EC50数据。
图16:通过文库筛选开发出的具有接头的cy(YKYYR)-接头-cy(GWNVDL)双配体。
具体实施方式
本发明的以下描述仅旨在说明本发明的各种实施方案。因此,所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员来说显而易见的是,在不脱离本发明的范围的情况下,可以做出各种等同、改变和修改,并且应该理解,本文包括这些等效实施方案。
除非上下文另有要求,否则贯穿整个说明书和权利要求书,单词“包含(comprise)”及其变体,例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应被解释为开放式包含性意义,即“包括但不限于”。
整个说明书中涉及的“一个(one)实施方案”或“(an)实施方案”是指结合实施方案描述的特定的特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此,贯穿整个说明书各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指同一实施方案。此外,特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。
定义
“氨基”是指-NH2基团。
“氰基”是指-CN基团。
“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”是指-OH基团。
“亚氨基”是指=NH取代基。
“硝基”是指-NO2基团。
“氧代”是指=O基团。
“硫基”是指=S基团。
“烷基”是指仅由碳院子和氢原子组成的直链或支链的烃链基团,其是饱和或不饱和的(即,含有一个或多个双键和/或三键),具有1至12个碳原子(C1至C12烷基)、优选1至8个碳原子(C1至C8烷基)或1至6个碳原子(C1至C6烷基),并且其通过单键连接到分子的其余部分,例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非说明书中另由特别说明,否则烷基可以是任选取代的。
“亚烷基”或“亚烷基链”是指仅由碳和氢组成的直链或支链的二价烃链,其将分子的其余部分连接至基团,其为饱和或不饱和的(即,含有一个或多个双键和/或三键),并具有1至12个碳原子,例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基、亚丙炔基、正亚丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键与分子的其余部分连接,并通过单键或双键与基团连接。亚烷基链与分子的其余部分和基团的连接点可以是通过链内的一个碳或任何两个碳。除非说明书中另有特别说明,否则亚烷基链可以是任选取代的。
“烷氧基”是指式-ORa的基团,其中Ra是如上定义的含有1至12个碳原子的烷基基团。除非说明书中另有特别说明,否则烷氧基可以是任选取代的。
“氨基羰基”是指式-C(=O)NRaRa的基团,其中每个Ra独立地为H、烷基或接头部分。
“α-氨基羰基”是指式-C(=O)CRb(NRaRa)的基团,其中每个Ra独立地为H、烷基或接头部分,Rb为H或烷基。在一些实施方案中,α-氨基羰基是环状部分(例如肽)的一部分,其中羰基在环内并且氨基(NRaRa)在环外。例如,在某些实施方案中,α-氨基羰基可用于环肽的埃德曼降解(Edman degradation)。
“α-酰胺基羰基”是指式-C(=O)CRb(N(C=O)RaRa)的基团,其中每个Ra独立地为H、烷基或接头部分,Rb为H或烷基。在一些实施方案中,α-酰胺基羰基是环状部分(例如肽)的一部分,其中羰基在环内且酰胺基(N(C=O)RaRa)在环外。
“烷基氨基”是指式-NHRa或-NRaRa的基团,其中每个Ra独立地是如上定义的含有1至12个碳原子的烷基基团。除非说明书中另有特别说明,否则烷基氨基可以是任选取代的。
“硫代烷基”是指式-SRa的基团,其中Ra是如上定义的含有1至12个碳原子的烷基自由基。除非说明书中另有特别说明,否则硫代烷基可以是任选取代的。
“芳香基”是指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳香环的烃环体系基团。为了本发明的目的,芳香基基团可以是单环、双环、三环或四环环系,其可以包括稠环体系或桥环体系。芳香基基团包括但不限于衍生自醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、二氢化茚、茚、萘、迫苯并萘、菲、七曜烯)、芘和苯并菲的芳香基基团。除非说明书中另有特别说明,术语“芳香基”或前缀“芳-”(例如在“芳烷基”中)是指包括任选取代的芳香基。
“芳烷基”是指式-Rb-Rc的基团,其中Rb是如上定义的亚烷基链,Rc是如上定义的一个或多个芳香基基团,例如苄基、二苯基甲基等。除非说明书中另有特别说明,否则芳烷基可以是任选取代的。
“环烷基”或“碳环”是指仅由碳原子和氢原子组成的稳定的非芳香族单环或多环烃基,其可包括具有3至15个碳原子、优选具有3至10个碳原子的稠环或桥环体系,其是饱和或不饱和的,并通过单键连接到分子的其余部分。单环基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环基团包括例如金刚烷基、降冰片基、十氢化萘基、7,7-二甲基双环[2.2.1]庚烷基等。除非说明书中另有特别说明,否则环烷基基团可以是任选取代的。
“环烷基烷基”是指式-RbRd的自由基,其中Rb是如上定义的亚烷基链,Rd是如上定义的环烷基基团。除非说明书中另有特别说明,否则环烷基烷基可以是任选取代的。
“稠合”是指本发明化合物中与现有环结构稠合的本文所描述的任何环结构。当稠合环是杂环基环或杂芳香基环时,可以用氮原子代替成为稠合杂环基环或稠合杂芳香基环的一部分的现有环结构上的任何碳原子。
“卤代”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘。
“卤代烷基”是指被一个或多个如上定义的卤素基团取代的如上定义的烷基基团,例如三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。除非说明书中另有特别说明,否则卤代烷基基团可以是任选取代的。
“杂环基”或“杂环”是指由2至12个碳原子和1至6个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子组成的稳定的3至18元非芳香环基团。除非说明书中另有特别说明,否则杂环基基团可以是单环、双环、三环或四环体系,其可以包括稠环或桥环体系;并且杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化;氮原子可以任选地被季铵化;并且杂环基基团可以是部分或完全饱和的。这样的杂环基基团的示例包括但不限于,二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫杂吗啉基、1-氧代硫代吗啉基和1,1-二氧代硫代吗啉基。除非说明书中另有特别说明,否则杂环基基团可以是任选取代的。
“N-杂环基”是指含有至少一个氮的如上定义的杂环基基团,其中杂环基基团与分子其余部分的连接点是通过杂环基基团中的氮原子。除非说明书中另有特别说明,否则N-杂环基基团可以被任选地取代。
“杂环基烷基”是指式-RbRe的自由基,其中Rb是如上定义的亚烷基链,Re是如上定义的杂环基基团,并且如果杂环基是含氮杂环基,则该杂环基可以在氮原子上与烷基基团连接。除非说明书中另有特别说明,否则杂环基烷基基团可以是任选取代的。
“杂芳香基”是指包含氢原子、1至13个碳原子、1至6个选自由氮、氧和硫组成的组的杂原子和至少一个芳香环的5至14元环体系基团。为了本发明的目的,杂芳香基可以是单环、双环、三环或四环环系,其可以包括稠环或桥环体系;并且杂芳香基中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化;氮原子可以任选地被季铵化。示例包括但不限于氮杂基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二噁英基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并苯硫基)、苯并***基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异吲哚啉基、异喹啉基、吲嗪基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、2-氧杂氮杂基、噁唑基、环氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基、1-氧化哒嗪基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、***基、四唑基、三嗪基和苯硫基(即噻吩基)。除非说明书中另有特别说明,否则杂芳香基基团可以是任选取代的。
“N-杂芳香基”是指含有至少一个氮的如上定义的杂芳香基基团,并且其中杂芳香基基团与分子其余部分的连接点是通过杂芳香基基团中的氮原子。除非说明书中另有特别说明,否则N-杂芳香基基团可以是任选取代的。
“杂芳香基烷基”是指式-RbRf的基团,其中Rb是如上定义的亚烷基链,Rf是如上定义的杂芳香基基团。除非说明书中另有特别说明,否则杂芳香基烷基基团可以是任选取代的。
本文所用术语“取代的”是指任何上述基团(例如烷基、亚烷基、烷氧基、烷基氨基、氨基羰基、α-氨基羰基、α-酰氨基羰基、硫代烷基、芳香基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳香基、N-杂芳香基和/或杂芳香基烷基),其中至少一个氢原子被与非氢原子连接的键代替,所述非氢原子例如但不限于:卤素原子例如F、Cl、Br、和I;例如羟基基团、烷氧基基团和酯基基团的基团中的氧原子;例如硫醇基团、硫代烷基基团、砜基基团、磺酰基基团和亚砜基基团的基团中的硫原子;例如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳香基胺、烷基芳香基胺、二芳香基胺、N-氧化物、酰亚胺和烯胺基团中的氮原子;例如三烷基甲硅烷基基团、二烷基芳香基甲硅烷基基团、烷基二芳香基甲硅烷基基团和三芳香基甲硅烷基基团的基团中的硅原子;和各种其它基团中的其它杂原子。“取代的”还表示任何上述基团中一个或多个氢原子被与杂原子连接的高级键(例如双键或三键)代替,例如氧代、羰基、羧基和酯基团中的氧;以及亚胺、肟、腙和腈基团中的氮。例如,“取代的”包括上述基团中的任意一个中的一个或多个氢原子被-NRgRh、-NRgC(=O)Rh、-NRgC(=O)NRgRh、-NRgC(=O)ORh、-NRgCNRgSO2Rh、-OC(=O)NRgRh、-ORg、-SRg、-SORg、-SO2Rg、-OSO2Rg、-SO2ORg、=NSO2Rg和-SO2NRgRh取代。“取代的”还意指上述基团中的任意一个中的一个或多个氢原子被-C(=O)Rg、-C(=O)ORg、-C(=O)NRgRh、-CH2SO2Rg、-CH2SO2NRgRh取代。在前述中,Rg和Rh相同或不同且独立地为氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳香基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳香基、N-杂芳香基和/或杂芳香基烷基。“取代的”进一步意指上述基团中的任意一个中的一个或多个氢原子被与氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧代、硫代、卤素、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳香基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳香基、N-杂芳香基和/或杂芳香基烷基连接的键取代。另外,每个前述取代基也可以任选地被一个或多个上述取代基取代。
“前药”意指可以在生理条件下或通过溶剂分解转化成本发明的生物活性化合物(即公开的捕获剂)的化合物。因此,术语“前药”是指药学上可接受的本发明化合物的代谢前体。当向有需要的受试者施用时,前药可以是无活性的,但在体内转化为本发明的活性化合物。前体药物通常在体内被快速地转化以产生本发明的母体化合物,例如通过在血液中的水解。前药化合物通常在哺乳动物生物体中具有溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见Bundgard,H.,Design of Prodrugs(1985),页码:7 9,21 24(Elsevier,Amsterdam))。在Higuchi,T.,等人,A.C.S.研讨会系列,第14卷以及1987年出版的Bioreversible Carriers in Drug Design(Edward B.Roche(编者),美国制药协会和佩加蒙出版社(American Pharmaceutical Association and Pergamon Press))中提供了关于前药的讨论。
术语“前药”还意味着包括任何共价键合的载体,当将这样的前药施用给哺乳动物受试者时,前药在体内释放本发明的活性化合物。本发明化合物的前体药物可通过修饰本发明化合物中存在的官能团来制备,以这样的方式使得修饰物以常规操作或体内裂解成本发明的母体化合物。前药包括本发明化合物,其中羟基、氨基或巯基基团与任何基团键合,使得在将本发明化合物的前药施用给哺乳动物受试者时,其分别裂解形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的示例包括但不限于本发明化合物中醇的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物等。
本文公开的本发明还意图涵盖所有药学上可接受的公开的捕获剂,所有药学上可接受的公开的捕获剂通过使一个或多个原子被具有不同原子量或质量数的原子代替而被同位素标记。可以引入到所公开化合物的同位素的示例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素,例如分别为2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I和125I。这些放射性标记的化合物可用于通过表征例如作用位点或作用模式或与药理学重要作用位点的结合亲和力来帮助确定或测量化合物的有效性。所公开的某些同位素标记的捕获剂,例如那些引入放射性同位素的捕获剂可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚(即3H)和碳-14(即14C)鉴于其易于引入和便于检测的方式而对此目的特别有用。
用较重的同位素例如氘(即2H)的取代可以提供由更大代谢稳定性产生的某些治疗优势,例如体内半衰期延长或剂量需求降低,因此在某些情况下可能是优选的。
用正电子发射同位素例如11C、18F、15O和13N取代,可用于正电子发射断层摄影(PET)研究以检查底物受体占据率。同位素标记的捕获剂通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与以下列出的制备和示例中描述的方法类似的方法采用适当的同位素标记的试剂代替之前采用的未标记的试剂进行制备。
本文公开的发明还意图涵盖所公开的捕获剂的体内代谢产物。这些产物可以来自例如所施用的化合物的主要是由于酶促过程的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等。因此,本发明包括通过包括将本发明化合物施用给哺乳动物足以产生其代谢产物的时间的方法产生的化合物。通常通过以可检测的剂量向动物(如大鼠、小鼠、豚鼠、猴)或人本发明施用放射性标记的化合物、允许足够的时间进行代谢、并从尿液、血液或其它生物样品中分离其转化产物来鉴定这种产物。
“哺乳动物”包括人和家畜例如实验动物和家庭宠物(例如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔)和非家畜如野生动物等。
“任选”或“任选地”是指随后描述的情况事件可能发生或可能不发生,并且该描述包括所述事件或情况发生的情况以及情况不发生的情况。例如,“任选取代的芳香基”是指芳香基可以是取代的或可以不是取代的,并且该描述包括取代的芳香基自由基和不具有取代基的芳香基自由基。
“药学上可接受的载体、稀释剂或辅料”包括但不限于任何已被美国食品和药物管理局批准为可接受用于人或家畜的佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。
“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物学效力和性质的那些盐,其不具有生物学或其它方面的不利条件,并且是与无机酸一起形成的,无机酸例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等,以及有机酸例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物学效力和性质的那些盐,其不具有生物学或其它方面的不利条件。这些盐通过向游离酸添加无机碱或有机碱而制备。来源于无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。来源于有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐,取代的胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂,例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺(deanol)、2二甲基氨基乙醇、2二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
本发明的化合物(捕获剂)或其药学上可接受的盐可以含有一个或多个不对称中心,因此可以产生对映异构体,非对映异构体和其它可以根据绝对立体化学(以(R)或(S),或者对于氨基酸的(D)或(L))被定义的立体异构体形式。本发明意在包括所有这些可能的异构体以及它们的外消旋和光学纯的形式。光学活性(+)和(-)、(R)和(S)、或(D)和(L)异构体可以利用手性合成子或手性试剂来制备,或采用常规技术(例如色谱法和分步结晶)来拆分。用于单个对映体的制备/分离的常规技术包括采用例如手性高压液相色谱(HPLC)的来自外消旋体(或外消旋体的盐或衍生物)的合适的光学纯前体的手性合成。当本文所述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时,除非另有说明,否则所述化合物旨在包括E和Z几何异构体。同样,所有的互变异构形式也被包括在内。(D)-氨基酸(也称为D-氨基酸)在本文中以小写字母表示(例如D-缬氨酸被称为“v”),而(L)-氨基酸(在本文中也被称为作为L-氨基酸)以大写字母表示(例如L-缬氨酸或缬氨酸被称为“V”)。甘氨酸是非手性的并且被称为“G”。
“立体异构体”是指由相同键键合的相同原子构成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明设想了各种立体异构体及其混合物,并包括“对映异构体”,对映异构体指两种分子是彼此不可重叠的镜像的立体异构体。
“互变异构体”是指从分子的一个原子到同一分子的另一个原子的质子转移。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。
通常结晶产生本发明化合物的溶剂化物。如本文所用,术语“溶剂化物”是指包含一个或多个本发明化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水,在这种情况下溶剂化物可以是水合物。或者,溶剂可以是有机溶剂。因此,本发明的化合物可以以水合物存在,包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真正的溶剂化物,而在其它情况下,本发明的化合物可以仅保留外来的水或者是水加一些外来溶剂的混合物。
如本文所用的术语“捕获剂”是指包含两个或更多个靶结合部分的组合物,组合物通过那些靶结合部分特异性结合靶蛋白。每个靶结合部分单独或与其它靶结合部分组合地显示出对靶蛋白的结合亲和力。在某些实施方案中,每个靶标结合部分经由一个或多个非共价相互作用(包括例如氢键、疏水相互作用和范德华相互作用)与靶蛋白结合。捕获剂可包含一种或多种有机分子,包括例如多肽、肽、多核苷酸和其它非聚合物分子。在一些方面,捕获剂是蛋白质催化的捕获剂(PCC)。
如本文所用的术语“表位”是指蛋白质(例如IL-17F)的独特分子表面。通常,表位是一种多肽,它可以自己作为10至40个氨基酸的有限序列起作用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用,是指包含氨基酸残基聚合物的氨基酸序列。该术语适用于氨基酸聚合物,其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物,以及指天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸,以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物以及它们的异构体。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸,以及稍后被修饰的那些氨基酸,例如羟脯氨酸、羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸以及它们的异构体。术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物,即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳,例如,高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。
本文所用的术语“非天然氨基酸”是指在其侧链官能度上与20种天然存在的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)不同的氨基酸。非天然氨基酸可以是二十种天然氨基酸之一的紧密类似物,或者其可以引入全新的官能度和化学结构,或者只要非天然氨基酸的疏水性等于或大于天然氨基酸的疏水性。非天然氨基酸可以代替蛋白质中的现有氨基酸(取代),或者是野生型序列的添加物(***)。非天然氨基酸的掺入可以通过已知的化学方法实现,包括固相肽合成或天然化学连接、或通过生物学方法。
本文使用的术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”或“特异性地结合”是指捕获剂与预定抗原上的表位结合。通常地,捕获剂以大约小于10-7M,例如大约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合。
如本文所用,术语“KD”是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离平衡常数。通常地,本发明的捕获剂以小于约10-6M、10-7M,例如小于约10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的解离平衡常数(KD)与IL-17结合例如,解离平衡常数利用表面等离子体共振(SPR)技术在Biacore仪器中采用抗原作为配体和采用捕获剂作为分析物进行测定的,捕获剂以比与非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)而不是预定的抗原或紧密相关的抗原结合的亲和力的低至少10倍、例如至少低100倍、例如低至少1000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的对应于KD的亲和力与预定的抗原结合。亲和力较低的量取决于捕获剂的KD,使得当捕获剂的KD非常低(即捕获剂具有高度特异性)时,因此抗原的亲和力低于非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。
如本文所用的术语“kd”(sec-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也被称为koff值。
如本文所用的术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的结合速率常数。
如本文所用的术语“KD”(M)是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离平衡常数。
如本文所用的术语“KA”(M-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的结合平衡常数,并且通过将ka除以kd而获得。
“药物组合物”是指本发明化合物和本领域通常接受的用于将生物活性化合物递送至哺乳动物例如人的介质的制剂。这种介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或辅料。
如本文所用的术语“病症”通常是指疾病、事件或健康状态的改变。健康状态的改变可能与特定的疾病或事件相关,在这种情况下,该改变可能与疾病或事件同时发生或在疾病或事件发生之前发生。在健康状态的变化于疾病或事件发生之前的情况下,健康状态的变化可以作为疾病或事件的预测指标。例如,健康状态的改变可能是与疾病或事件相关的特定基因的表达水平的改变。或者,健康状态的改变可能与特定的疾病或事件无关。
本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”通常是指预防病症或事件,减缓病症发作或发展速度或延迟事件的发生,降低发展为病症或经历事件的风险,预防或延迟与病症或事件相关的症状的发展,减少或终止与病症或事件相关的症状,使病症完全或部分消退,减轻病症或事件的严重性,或者它们的一些组合。
如本文所用的“有效量”或“治疗有效量”是指实现期望治疗结果所需要的剂量和时间段内有效的量。所公开的捕获剂的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及捕获剂在个体中引起所需应答的能力等因素而变化。
如本文关于捕获剂蛋白质催化的捕获剂或其药物制剂所使用的术语“稳定的”是指在足够的时间段内保持结构和功能完整性以在本文所述的方法中利用的药剂或制剂。
如本文中关于蛋白质催化捕获剂或捕获剂所使用的术语“合成的”是指捕获剂通过化学方式而不是生物学方式产生。
除非另有说明,否则本文提供的序列同一性/相似性值是指利用BLAST 2.0程序集采用默认参数所获得的值(Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402)。
如本领域普通技术人员理解的那样,BLAST搜索假设可以将蛋白质建模为随机序列。然而,许多真正的蛋白质包含非随机序列的区域,其可以是均聚物片段、短周期重复序列或富含一个或多个氨基酸的区域。即使蛋白质的其它区域完全不相似,这种低复杂性区域也可以在无关蛋白质之间进行比对。可以采用许多低复杂度的过滤程序来减少这种低复杂度的比对。例如,可以单独或组合使用SEG(Wooten和Federhen,(1993)Comput.Chem.17:149-63)以及XNU(Claverie and States,(1993)Comput.Chem.17:191-201)低复杂度过滤器。
如本文所用,在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括对两个序列中的残基的引用,当在指定的比较窗口上比对以达到最大对应性时,这两个序列中的残基是相同的。当涉及蛋白质使用序列同一性百分比时,认识到不相同的残基位置经常因保守性氨基酸取代而不同,其中氨基酸残基被取代为具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基,因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时,可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。称这类保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。通常这涉及将保守取代评分为部分而不是完全错配,由此增加序列同一性百分比。因此,例如,在相同的氨基酸被赋予1分并且非保守性取代被赋予0分的情况下,保守性替代被赋予0和1之间的分数。例如根据Meyers和Miller的算法,(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17、例如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中所实现的计算保守性取代的得分。
如本文所用,“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列而确定的值,其中为了两个序列的最佳比对而与参考序列(其不包含添加或缺失)相比较,比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即缺口)。通过以下来计算百分比:确定两个序列中都出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
术语多核苷酸序列的“基本同一性”或“基本相同”是指采用标准参数、利用所描述的比对程序之一而与参考序列进行比较时,多核苷酸包含的序列具有50至100%之间序列同一性、优选至少50%序列同一性、优选至少60%序列同一性、优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%且最优选至少95%。技术人员将认识到,通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框架定位等,可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性通常是指55至100%之间、优选至少55%、优选至少60%、更优选至少70%、80%、90%以及最优选至少95%的序列同一性。
在某些实施方案中,如本文所用的术语“IL-17F”是指人IL-17F。在一些实施方案中,IL-17包含以下氨基酸序列或与其基本上相同的氨基酸序列。
1 MTVKTLHGPA MVKYLLLSIL GLAFLSEAAA RKIPKVGHTF FQKPESCPPV PGGSMKLDIG
61 IINENQRVSM SRNIESRSTS PWNYTVTWDP NRYPSEVVQA QCRNLGCINA QGKEDISMNS
121 VPIQQETLVV RRKHQGCSVS FQLEKVLVTV GCTCVTPVIH RVQ
在其它实施方案中,IL-17F是由Entrez基因ID号112744表示的基因编码的蛋白质。
开发IL-17F捕获剂
目前抗体是用于诊断平台的默认检测剂。然而,抗体具有一些缺点,包括成本高、稳定性差,并且在许多情况下缺乏适当的表征和高特异性。用于诊断试验的理想替代品应该是合成的、对一一定范围的热和化学条件下使稳定的、并且对感兴趣的靶标显示出高亲和力和特异性。
高质量的单克隆抗体具有低纳摩尔亲和力和高靶标特异性。有趣的是,抗原识别表面的结构和遗传分析表明,大部分可变环的分子多样性包含在单个高度可变环(CDR-H3)中。在人体中,这种环的大小范围为1至35个残基(平均15个),可以采用广泛的结构构象,并且是与抗原的相互作用的主要原因。其它五个环的多样性明显较少,并且只采用少数几种构象。这表明精心挑选的“锚”肽可以主导捕获剂与其靶蛋白之间相互作用的模式和强度。还表明,其它多肽组分虽然对总相互作用能量仅提供适度贡献,但它们可以提供重要的支架特征和特异性元素。
原位点击化学是一种将小分子酶抑制剂分离成两个部分,然后使每个部扩展成一部分含有乙炔官能团而其余含有叠氮基团的小文库的技术。然后酶本身通过选择性地促进乙炔和叠氮基团之间的1,3-偶极环加成形成***键而从这些文库组分中组装“最佳匹配”的抑制剂(“点击”反应)。该蛋白质有效地起到了通常用于这种偶联的Cu(I)催化剂的非常有选择性的变体的作用。该酶只在与正确方向与蛋白质组分结合的这些文库组分之间促进点击反应。所得到的抑制剂相对于基于两个文库所形成的起始抑制剂可以表现出远远优异的亲和特征。
顺序原位点击化学扩展了原位点击化学概念以使得能够发现多配体捕获剂(参见:USSN20100009896,通过引用并入本文)。该过程先前用于产生针对模型蛋白碳酸酐酶II(CAII)的三配体捕获剂。顺序原位点击化学具有一些优点。首先,将有关蛋白质靶标的结构信息替换为对非常大的化学空间进行采样以识别捕获剂的配体组分的能力。例如,可通过针对大型(>106元件)单珠-单化合物(one-bead-one-compound,OBOC)肽文库筛选蛋白质来鉴定起始配体,其中肽本身可由天然的、非天然的和/或人工氨基酸组成。然后将得到的锚配体用于原位点击筛选,再次利用大型OBOC文库来鉴定双配体结合物。第二个优点是可以重复该过程,使得双配体被用作锚以识别三配体,等等。然后可以利用相对简单且大部分自动化的化学反应来按比例放大最终的捕获剂,并且可以用诸如生物素基团等标签作为其结构的固有部分来开发。这种方法允许探索支链的、环状的和线性的捕获剂体系结构。尽管已经描述了许多用于蛋白质定向的多配体装配的策略,但是大多数需要有关靶标的详细结构信息来指导筛选策略,并且针对低多样性小分子库,优化了大多数方法(例如原始的原位点击方法)。
本发明的实施方案进一步概括了原位点击应用以利用原位点击容易地找到锚配体。在先前的方法中,需要已知的结合物来开始配体。本方法提供了从头开始寻找锚配体的机制。
如本文所述,利用迭代原位点击化学方法来合成特异性结合IL-17F的双配体捕获剂。这种原位点击化学方法包括两个步骤。首先,发现在不同但相对接近的位点结合IL-17F的两个“锚”配体。其次,发现结合这两种配体的适当大小的接头,从而产生对IL-17F具有更高亲和力的捕获剂。
发现通过本文公开的方法产生的捕获剂表现出对IL-17F的结合亲和力。显示捕获剂在ELISA测定中同时作为捕获剂和检测剂发挥作用,并有效地免疫沉淀IL-17F。
IL-17F捕获剂
一方面,本文提供了特异性结合IL-17F的稳定的合成的捕获剂,其中捕获剂包含两个或更多个“锚”配体(在本文中也简称为“配体”)和接头,其中配体选择性结合IL-17F。
在某些实施方案中,配体包含一种或多种多肽或肽。在这些实施方案的一些中,靶结合部分包含一种或多种肽,所述肽包含D-氨基酸、L-氨基酸和/或被官能团取代的氨基酸,所述官能团选自由取代的和未取代的烷基、取代的和未取代的叠氮基、取代的和未取代的炔基、取代的和未取代的生物素基、取代的和未取代的氮杂烷基、取代的和未取代的聚乙二醇、以及取代的和未取代的1,2,3-***组成的组。
在某些实施方案中,配体通过接头经由共价键相互连接。在这些实施方案的一些中,配体和接头经由酰胺键或如下所示的1,4-二取代-1,2,3-***键相互连接:
1,4-二取代-1,2,3-***键。
在其中配体和接头经由1,4-二取代-1,2,3-***键相互连接的那些实施方案中,1,4-二取代-1,2,3-***键可以由Cu-催化的叠氮化物/炔烃环加成反应(CuAAC)形成。
在某些实施方案中,配体和接头通过具有以下结构的Tz4键互相连接:
在某些实施方案中,配体和接头通过具有以下结构的Tz5键互相连接:
在其中一个或多个配体和接头经由酰胺键互相连接的那些实施方案中,酰胺键可以通过在偶联剂(例如,O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N-羟基-7-氮杂-苯并***(HOAt)或二异丙基乙胺(DIEA)的DMF溶液)的存在下将羧酸基团和胺基基团偶联而形成。
在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在一定范围的反应条件和/或储存时间内是稳定的。如本文所用的“稳定的”的捕获剂保持特异性结合靶蛋白的能力。在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在一种或多种反应和/或储存条件下比与相同靶蛋白结合的抗体更稳定。例如,在某些实施方案中,本文提供的捕获剂比结合相同靶蛋白的抗体更能抵抗蛋白质水解性降解。
在某些实施方案中,本文提供的捕获剂具有大于六个月的保质期,这意味着它们在超过六个月的储存期间是稳定的。在这些实施方案中的一些中,捕获剂的保质期为一年或更多年、两年或更多年、或超过三年。在这些实施方案中的一些中,捕获剂以冻干粉储存。在某些实施方案中,本文提供的捕获剂的保质期比结合相同靶蛋白的抗体的保质期更长。
在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在约-80℃至约120℃的温度范围内是稳定的。在这些实施方案中的某些实施方案中,捕获剂在-80℃至-40℃、-40至-20℃、-20至0℃、0至20℃、20至40℃、40至60℃、60至80℃、和/或80至120℃的温度范围内是稳定的。在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在较宽的温度范围内比结合相同靶蛋白的抗体更稳定,和/或在特定温度下比结合相同靶蛋白的抗体在更长时间段内保持稳定。
在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在约3.0至约8.0的pH范围内是稳定的。在某些实施方案中,该范围是约4.0至约7.0。在某些实施方案中,该范围是约7.0至约8.0。
在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在人血清中稳定超过12小时。在这些实施方案的某些实施方案中,捕获剂在人血清中稳定超过18小时、超过24小时、超过36小时或超过48小时。在某些实施方案中,本文提供的捕获剂在人类血清中比结合相同靶蛋白的抗体稳定更长的时间段。在某些实施方案中,捕获剂在约60℃的温度下以粉末形式稳定两个月内。
在某些实施方案中,本文提供的捕获剂可包含一种或多种检测标签,包括例如生物素、铜-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(铜-DOTA)、64Cu DOTA、68Ga DOTA、18F、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C、76Br、123I、131I、67Ga、111In和99mTc或其它放射性标记产物,其它放射性标记产物可以包括γ发射体、质子发射体、正电子发射体、氚或通过其它方法可检测到的覆盖标签(即钆)等。在特定的实施方案中,检测标签是18F。在某些实施方案中,捕获剂可以被修饰以用作成像剂。成像剂可以用作诊断剂。
在某些实施方案中,可以修饰本文提供的捕获剂以获得所需的化学或生物学活性。所需的化学或生物学活性的示例包括但不限于改善的溶解度、稳定性、生物利用度、可检测性或反应性。可以引入捕获剂的特定修饰的示例包括但不限于通过形成二硫键使捕获剂环化;用其它官能团或分子修饰捕获剂。类似地,可以合成捕获剂以结合蛋白质上的非经典或非生物表位,由此增加它们的多功能性。在某些实施方案中,可以在偶联反应之前通过修饰靶结合部分的合成嵌段来修饰捕获剂。
制备/筛选捕获剂的方法
本文在某些实施方案中提供了筛选靶结合部分和/或制备包含这些靶结合部分的捕获剂的方法。用于筛选靶结合部分和/或制备包含这些靶结合部分的捕获剂的方法也可以在国际公布号WO2012/106671、WO2013/033561、WO2013/009869和WO2014/074907中找到,每个通过引用以整体并入本文。
在某些实施方案中,将结合相同蛋白质(靶标)的两个不同区域的两个单独识别的配体化学连接在一起形成双配体。通过优化两个配体的接头,由配体和接头形成的双配体可以显示出远优于任一个配体的结合亲和力。这种增强的结合效应称为结合协同性。对于理想的协同结合物,各个配体与靶标的热力学结合能将加和以产生连接的双配体的结合能。这意味着连接的双配体的结合亲和常数(KD)将是各个配体的结合亲和力的乘积(即,KD=KD1×KD2,其中下标1和2是指两个配体)。在实践中,如果有的话,完全协同的结合很少实现。因此,连接的双配体的特性与完全协同的结合物的性质之间的比较可以提供两种配体如何最佳连接的度量。
如果蛋白质靶标具有已知的且明确定义的三级(折叠)结构,则该靶向方法的关键方面涉及用于鉴定与蛋白质的优选区域结合的配体的策略,随后是用于鉴定优化的接头的方法。如果蛋白质没有明确的三级结构,则该公开内容描述了旨在仍然实现来自双配体的协同结合的显著性度量的策略。
图7描述了开发一套针对蛋白质靶标(11)的PCC结合物的起点。初始目标鉴定出与蛋白质靶标上的一个表位结合的一个或多个PCC(12),以及与第二表位结合的一个或多个不同的PCC(13)。与第三表位、第四表位等表位结合的其它PCC也可能是有用的。靶向表位的PCC方法教导了这可以通过筛选针对合成的表位(SynEps)的肽文库来实现,如图7(14,15)所示。SynEp是具有天然存在靶表位序列的多肽,不同之处在于一个位点含有呈现叠氮或乙炔化学基团(16)(称为点击手柄)的人工氨基酸。SynEp被进一步修饰成在N-末端或C-末端(17)包含检测手柄,例如生物素基团。筛选过程可以使用本文公开的或本领域已知的任何过程完成。通过筛选,可以鉴定出靶标上至少两个表位中的每一个的至少一种独特的肽结合物。通过针对完整蛋白质靶标(11)以及针对SynEps进行结合测定来验证这些肽结合物。对于这些结合测定,用天然存在的残基代替点击手柄(16)来制备SynEps。
理想地,不同配体结合的靶蛋白质的不同区域在三级蛋白质结构中会相对接近(几纳米或更小)。即使是单个SynEp,筛选也可以产生与两个不同位点结合的PCC。在图8中,使代表感兴趣表位(12)的区域相对于全长蛋白质(11)的暗淡背景突出显示出来。用星号(22)表示在SynEp结构中被替换为点击手柄的氨基酸残基。在SynEp筛选步骤中,可以鉴定出与表位的N-末端侧(23)或C-末端侧(24)结合的PCC。
一旦确定了靶向表位的PCC,就有几种选择接头的方法。
在第一个实施方案中,如果蛋白质的折叠结构是已知的,并且如果PCC结合到该折叠结构上,则可以利用该信息以及哪些PCC结合哪些表位的知识来评估最佳接头长度。这在图9中示出。该图显示了与一个表位(12)的N侧结合的一个PCC(31)和与第二表位(13)的C侧结合的第二PCC(32)。对该结合排列与来自例如蛋白质数据库的蛋白质的结构一起的分析以允许对估计最佳接头(33)的长度。这样的评估可以将选择出的候选接头的数目到非常小。一个示例中,可以利用这个评估出的长度来选择一种或两种长度匹配的聚乙二醇低聚物以用于测试。最好的接头(34)是使双配体亲和力最接近于完全协同的结合物的亲和力的接头。
在第二个实施方案中,如果蛋白质的折叠结构未知,或者如果蛋白质仅仅不具有明确的折叠结构,则利用尽可能多的可用信息来确定候选接头分子文库的组成。然后筛选该文库以鉴定出最佳接头。
在第三个实施方案中,如果蛋白质的折叠结构未知,或者如果蛋白质仅仅没有明确的折叠结构,则利用已经存在的关于蛋白质的知识,只需选择接头以添加两个PCC。即使以这种没有鉴别出优化的、完全协同的结合物,但由于协同效应,相连的双配体几乎肯定会胜过两种单配体中的任一种。
体外
为了检测溶液中的IL-17F,以可检测地标记本发明的捕获剂,然后将其与溶液接触,然后可以检测到捕获剂和IL-17F靶标之间形成复合物。作为示例,荧光标记的捕获剂可以用于体外IL-17F检测测定,其中在允许发生结合的条件下将捕获剂加入至待测试的IL-17F溶液中。荧光标记的捕获剂和IL-17F靶标之间的复合物可以通过例如测量由复合物结合的肽产生的相对于游离肽的荧光偏振的增加的荧光偏振来检测和定量。
或者,可以使用夹心型“ELISA”测定法,其中将捕获剂固定在固体载体如塑料管或孔上,然后将疑似含有IL-17F的溶液与固定的结合部分接触,将非结合材料清洗掉,兵利用用于识别IL-17F的合适的检测试剂检测复合多肽。
为了检测或纯化溶液中的可溶性IL-17F,可以将本发明的捕获剂固定在固体基底如色谱载体或其它基体材料上,然后可以在适合形成捕获剂/IL-17F复合物的条件下将固定的结合物装载或与溶液接触。可以除去溶液的非结合部分,并且可以例如利用抗IL-17F抗体或抗结合多肽抗体检测复合物,或者可以在适当的洗脱条件下从结合部分释放出IL-17F。
体内诊断成像
本发明的捕获剂的特别优选的用途是用于在生物流体(例如诸如在人血清中)中产生IL-17F或表达IL-17F的细胞的视觉可读图像。本文公开的IL-17F捕获剂可以通过将捕获剂与适于诊断检测的标记物缀合而转化为成像试剂。优选地,将表现出比对其它血清蛋白特异性大得多的对IL-17F的特异性的捕获剂缀合或连接至适合于所用检测方法的标签。例如,捕获剂可以与或不与接头缀合成适用于磁共振成像(MRI)的顺磁性螯合物,捕获剂可以与适用于x射线、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)或闪烁成像(包括用于放射性金属的螯合剂)的放射性标记缀合,捕获剂可以与适用于超声检测的超声造影剂(例如,稳定的微气泡,微气球(microballoon)、微球体(microsphere)或已被称为气体填充的“脂质体”)缀合,或捕获剂可以与光学成像染料缀合。
在另一个实施方案中,不是将捕获剂与可检测的标记物或放射性治疗的构建体直接标记,而是可以将本发明的一种或多种肽或构建体与例如亲和素、生物素或与可检测的标记物或放射性治疗剂结合的抗体或抗体片段缀合。
A、磁共振成像
本文所述的IL-17F捕获剂可以有利地与顺磁性金属螯合物缀合以形成用于MRI的造影剂。
优选的顺磁性金属离子的原子序数为21至29、42、44或57至83。这包括具有一个、更优选五个或更多个未成对电子和至少1.7个玻尔磁子的磁矩的过渡金属或镧系元素的离子。优选的顺磁性金属包括但不限于铬(III)、锰(II)、锰(III)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、铕(III)和镱(III)、铬(III)、铁(III)和钆(III)。三价阳离子Gd3+由于其高弛豫性和低毒性而特别优选用于MRI造影剂,其具有进一步的优点是其仅存在于一种生物可接近的氧化态中,这使得患者不希望的金属代谢分解最小化。另一种有用的金属是Cr3+,它比较便宜。Gd(III)螯合物自1988年以来一直用于临床和放射性MR应用,约30%的MRI检查目前采用钆基造影剂。
顺磁性金属螯合剂是具有一个或多个极性基团的分子,所述极性基团充当顺磁性金属的配体并且与顺磁性金属络合。合适的螯合剂在本领域中是已知的并且包括具有亚甲基膦酸基团、亚甲基羧肟胺酸(carbohydroxamine acid)基团、羧基亚乙基基团或羧基亚甲基基团的酸。螯合剂的示例包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环-十四烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1-取代-1,4,7-三羧甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3A)、乙二胺四乙酸(EDTA)和1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物,包括5-CI-EHPG、5-Br-EHPG、5-甲基-EHPG、5-叔丁基-EHPG和5-仲丁基-EHPG;苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物,包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基DTPA;双-2(羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物;包含至少3个、更优选至少6个碳原子,和至少两个杂原子(O和/或N)的大环化合物类别,该大环化合物可以由一个环、或由在杂环元素处连接在一起的两个或三个环组成,例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA(其中NOTA是1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸)、苯并-TETA、苯并-DOTMA(其中DOTMA是1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四(甲基四乙酸))和苯并-TETMA(其中TETMA是1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-(甲基四乙酸));1,3-亚丙基-二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTNA)的衍生物;1,5,10-N,N’,N”-三(2,3-二羟基苯甲酰)-三儿茶酚酸酯(LICAM)的衍生物;和1,3,5-N,N’,N”-三(2,3-二羟基苯甲酰基)氨基甲基苯(MECAM)。用于本发明的优选螯合剂是DTPA,并且采用DO3A的使用是特别优选的。本发明预期的代表性螯合剂和螯合基团的示例描述于WO98/18496、WO86/06605、WO91/03200、WO95/28179、WO96/23526、WO97/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182、美国专利号4,899,755、美国专利号5,474,756,美国专利号5,846,519和美国专利号6,143,274,所有这些在此通过引用而并入。
根据本发明,MRI造影剂的螯合剂与IL-17F捕获剂偶联。应该选择螯合剂的位置使得不干扰IL-17F捕获剂的结合亲和力或特异性。螯合剂也可以连接在捕获剂上的任何地方。
通常地,IL-17F捕获剂可以直接地或共价地结合至金属螯合剂(或其它可检测的标记物),或者它可以利用接头偶联或缀合至金属螯合剂,所述接头可以是但不限于酰胺、脲、乙缩醛、缩酮、双酯、羰基、氨基甲酸酯、硫脲、砜、硫酯、酯、醚、二硫基、内酯、亚胺、磷酰基或磷酸二酯键;取代的或未取代的饱和或不饱和烷基链;单个氨基酸或不同氨基酸(例如IL-17F结合部分的N-末端或C-末端的延伸)的直链、支链或环状氨基酸链;衍生的或未衍生的聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯或聚乙烯吡啶链;取代的或未取代的聚酰胺链;衍生或未衍生的聚胺、聚酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚甘油或寡糖(例如葡聚糖)链;交替嵌段共聚物;丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和庚二酸;己酸;简单的二胺和二醇;本文公开的任何其它接头;或本领域已知的任何其它简单的聚合物接头(参见例如WO 98/18497和WO98/18496)。优选地,可以严格控制接头的分子量。分子量的范围可以从小于100至大于1000。优选地,接头的分子量小于100。另外,可以期望的是利用体内可生物降解的接头以提供本发明的成像试剂的有效的***途径。取决于它们在接头内的位置,这样的可生物降解的官能团可以包括酯、双酯、酰胺、磷酸酯、醚、乙缩醛和缩酮官能团。
通常地,可以采用已知方法利用这些接头来偶联金属螯合物和IL-17F捕获剂(WO95/28967、WO 98/18496、WO 98/18497和其中的讨论)。IL-17F结合部分可以通过N-末端或C-末端经由酰胺键连接至例如金属螯合物的金属配位骨架氮上或连接至金属螯合物本身的乙酸盐臂上。本公开预期在任何位置连接螯合物,条件是金属螯合物保持紧密结合金属以使毒性最小化的能力。
根据本文公开内容制备的MRI造影剂可以以与常规MRI造影剂相同的方式使用。可以优选某些MR技术和脉冲序列来增强该位点与背景血液和组织的对比度。这些技术包括(但不限于)例如试图使血液变暗的黑色血液血管造影序列,例如快速自旋回波序列(Alexander,A.等人,1998.Magn.Reson.Med.,40:298-310)和流动扰相梯度回波序列(flow-spoiled gradient echo sequences)(Edelman,R.等人,1990.Radiology,177:45-50)。这些方法还包括增强对比度差异的流动独立技术,例如反转恢复制备的序列或饱和恢复制备的序列,其将增加表达IL-17F的组织和背景组织之间的对比度。最后,磁化转移制剂也可以改善与这些试剂的对比度(Goodrich,K.等人,1996.Invest.Radia,31:323-32)。
标记的试剂以可注射组合物的形式施用给患者。施用MRI造影剂的方法优选肠道外给药,意指静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、间质给药或颅内给药。为了使表达IL-17F的组织(例如肿瘤)成像,静脉内施用或动脉内施用是优选的。对于MRI,预期受试者将接受足以将IL-17F表达位点的MR信号增强至少10%的剂量的造影剂。注射含有MRI试剂的IL-17F捕获剂后,在MRI机器中扫描患者以确定任何IL-17F表达位点的位置。在治疗设置中,一旦识别IL-17F表达位点(例如流体或组织)时,如果需要,可以立即施用抗癌剂(例如IL-17F的抑制剂),并可以随后扫描患者以将病毒载量可视化。
B、核成像(放射性核素成像)和放射治疗
本发明的IL-17F捕获剂可以与适用于闪烁成像、SPECT或PET成像的放射性核素报道分子和/或与适用于放射治疗的放射性核素缀合。其中IL-17F捕获剂与用于诊断成像的放射性核素螯合剂和用于放射治疗的螯合剂两者缀合的构建体均在本发明的范围内。
为了用作PET剂,所公开的捕获剂可以与各种正电子发射金属离子之一络合,例如51Mn、52Fe、60Cu、68Ga、72As、94mTc或110In络合。本发明的结合部分还可以通过利用放射性核素例如18F、124I、125I、131I、123I、77Br和76Br的卤化作用进行标记。用于闪烁成像或放射疗法的优选的金属放射性核素包括99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、51Cr、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、214Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Au和199Au。将根据所需的治疗或诊断应用来确定所选择的金属。例如,为了诊断目的,优选的放射性核素包括64Cu、67Ga、68Ga、99mTc和111In。为了治疗目的,优选的放射性核素包括64Cu、90Y、105Rh、111In、117mSn、149Pm、153Sm、161Tb、166Tb、166Dy、166Ho、175Yb、177Ln、186/188Re和199Au。99mTc由于其低成本、可用性、成像特性和高比活度而对诊断应用非常有用。99mTc的核和放射性质使该同位素成为理想的闪烁成像剂。该同位素具有140keV的单光子能量和约6小时的放射性半衰期,并且容易从99Mo-99mTc发生器获得。18F、4-[18F]氟苯甲醛(18FB)、Al[18F]-NOTA、68Ga-DOTA和68Ga-NOTA是用于与用于诊断成像的IL-17F捕获剂缀合的典型放射性核素。
金属放射性核素可以通过例如直链、大环、三联吡啶和N3S、N2S2或N4螯合剂(也参见美国专利号5,367,080、美国专利号5,364,613、美国专利号5,021,556、美国专利号5,075,099,美国专利号5,886,142)、和本领域已知的其它螯合剂螯合,其它螯合剂包括但不限于HYNIC、DTPA、EDTA、DOTA、DO3A、TETA、NOTA和二氨基双硫醇(BAT)螯合剂(也参见美国专利号5,720,934)。例如,N4螯合剂描述于美国专利号6,143,274;美国专利号6,093,382;美国专利号5,608,110;美国专利号5,665,329;美国专利号5,656,254;和美国专利号5,688,487。某些N3S螯合剂描述于PCT/CA94/00395、PCT/CA94/00479、PCT/CA95/00249、和美国专利号5,662,885;美国专利号5,976,495;和美国专利号5,780,006中。螯合剂还可以包括螯合配体巯基-乙酰基-乙酰基-甘氨酰-甘氨酸(MAG3)的衍生物,其含有N3S、N2S2体系例如MAMA(单酰胺单氨基二硫醇)、DADS(N2S二胺二硫醇)、CODADS等。这些配体体系和多种其它体系描述于例如Liu,S和Edwards,D.,1999.Chem.Rev.,99:2235-2268以及其中的参考文献中。
螯合剂还可以包括含有配体原子的复合物,所述配体原子不以四齿阵列形式提供给金属。这些包括锝和铼二肟的硼酸加合物,例如在美国专利号5,183,653;美国专利号5,387,409;和美国专利号5,118,797中进行了描述,它们的公开内容通过引用以整体并入本文。
如前所述,螯合剂可以通过接头直接与IL-17F捕获剂共价连接,然后直接用选择的放射性金属进行标记(参见WO 98/52618、美国专利号5,879,658和美国专利,No.5,849,261)。
包含18F、4-[18F]氟苯甲醛(18FB)、Al[18F]-NOTA、68Ga-DOTA和68Ga-NOTA的IL-17F捕获剂对于诊断成像是优选的。放射性锝复合物也可用于诊断成像,放射性铼复合物对放射性治疗特别有用。在用本发明的试剂形成放射性锝复合物时,锝复合物、优选99mTc高锝酸盐,在还原剂的存在下与试剂反应。优选的还原剂是连二亚硫酸盐、亚锡离子和亚铁离子;最优选的还原剂是氯化亚锡。用于制备这种复合物的方法便利地以试剂盒形式提供,试剂盒形式包含含有预定量的待标记的本发明试剂的密封小瓶和足量的用99mTc标记试剂的还原剂。或者,该复合物可以通过使本发明的与适当的螯合剂缀合的肽与预先形成的不稳定的锝复合物和另一种称为转移配体的化合物反应而形成。该过程被称为配体交换并且是本领域技术人员所熟知的。例如,可以采用例如酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐或甘露醇等转移配体形成不稳定的复合物。在本发明中有用的99mTc高锝酸盐包括碱金属盐如钠盐、或铵盐或低级烷基铵盐。
其中金属是放射性铼的本发明复合物的制备可以采用+5或+7氧化态的铼原料完成。其中铼处于Re(VII)态的化合物的示例是NH4ReO4或KReO4。Re(V)可以以例如[ReOCl4](NBu4)、[ReOCl4](AsPh4)、ReOCl3(PPh3)2和以ReO2(吡啶)4+获得,其中Ph是苯基且Bu是正丁基。也可以使用其它能够形成铼复合物的铼试剂。
包含本发明提供的放射性标记的PET、SPECT或闪烁成像剂具有合适量的放射性。通常地,待施用的单位剂量具有约0.01mCi至约100mCi、优选1mCi至20mCi的放射性。以单位剂量注射的溶液为约0.01mL至约10mL。通常优选的是,在含有浓度为约0.01mCi至100mCi/mL的放射性的溶液中形成放射性复合物。
根据本发明的放射性核素标记的IL-17F捕获剂的典型剂量提供为10至20mCi。在向患者注射放射性核素标记的IL-17F捕获剂之后,使用针对掺入成像剂中的核素的伽马射线能量进行校准的伽马照相机来对该试剂的摄取区域进行成像并且量化存在于位点处的放射性的量。体内位点的成像可以在几分钟内完成。然而,如果需要,可以在将放射性标记的肽注射入患者后几小时或甚至更长时间下进行成像。在大多数情况下,施用剂量的足够量将在大约0.1小时内累积在将要成像的区域中以允许摄取闪烁照片。
本发明的放射性治疗化合物的适当的剂量方案对于本领域技术人员是已知的。可以利用许多方法施用化合物,包括但不限于单次或多次静脉注射或腹腔内注射,采用足以引起靶向的表达IL-17F的组织的损伤或消融的放射性量,但不是那么多以引起非靶标(正常组织)的实质性损害。取决于所使用的同位素的能量和半衰期、从体内摄取和清除试剂的程度以及表达IL-17F的组织的质量,所需的量和剂量对于不同构建体是不同的。通常地,剂量可以在约30至50mCi的单剂量到多达约3Ci的累积剂量的范围内。
本发明的放射性治疗组合物可以包括生理上可接受的缓冲剂,并且可以需要辐射稳定剂以防止注射前对化合物的辐射损伤。辐射稳定剂是本领域技术人员已知的,并且可以包括例如对氨基苯甲酸、抗坏血酸、明胶酸等。
除放射性核素以外,含有制备本发明复合物所需的所有组分的单个或多个小瓶试剂盒是本发明的组成部分。
单个小瓶试剂盒优选含有螯合配体、亚锡盐来源或其它药学上可接受的还原剂,并且用药学上可接受的酸或碱适当缓冲以将pH值调节至约3至约9的值。所用还原剂的类型和数量取决于待形成的交换复合物的性质。适当的条件对于本领域技术人员来说是熟知的。试剂盒内容物优选为冻干形式。这样的单个小瓶试剂盒可以任选地含有不稳定或交换配体,例如葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、甘露醇、苹果酸盐、柠檬酸或酒石酸,并且还可以含有反应调节剂例如二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)或用于改善最终产品的放射化学纯度和稳定性的α、β或γ-环糊精。试剂盒还可以包含稳定剂、填充剂如甘露醇(被设计用于帮助冷冻干燥过程)、以及本领域技术人员已知的其它添加剂。
多个小瓶试剂盒优选包含相同的通用组分,但在重构放射性药物时使用多于一个的小瓶。例如,一个小瓶可含有加入高锝酸盐(例如亚锡源或其它还原剂)时形成不稳定Tc(V)复合物所需的所有成分。将高锝酸盐加入到该小瓶中,等待适当的时间后,将该小瓶的内容物加入到含有配体及适合将pH调节至其最佳值的缓冲液的第二小瓶中。约5至60分钟的反应时间后,形成本发明的复合物。有利的是,这个多个小瓶试剂盒的两个小瓶的内容物被冻干。如上所述,反应调节剂、交换的配体、稳定剂、填充剂等可存在于任一个或两个小瓶中。
本文还提供了将18F放射性标记的辅助基团并入IL-17F捕获剂上的方法。在一个实施方案中,将4-[18F]氟苯甲醛(18FB)缀合到携带氨氧基部分的捕获剂上,导致肟的形成。在另一个实施方案中,将[18F]氟苯甲醛缀合到携带酰基酰肼部分的捕获剂上,产生腙加合物。4-氟苯甲醛可以以18F形式利用18F离子通过用已知方法置换离去基团来制备。
18F-标记的捕获剂也可以在促进硫代半缩氨基酸形成的条件下从具有氨基硫脲部分的捕获剂或通过利用18F-标记的亚硫酸氢盐加成复合物来制备。
上述方法特别适用于标记捕获剂,例如本文所述的捕获剂,本文的捕获剂可在合成过程中被修饰成含有可用于与标记的醛反应的亲核性羟胺、氨基硫脲或肼(或酰肼)部分。该方法可以用于任何可以容纳合适的亲核部分的捕获剂。通常将亲核部分连接到肽的N-末端,但技术人员将认识到亲核体也可连接到氨基酸侧链或肽的C-末端。提供了合成放射性标记的肽序列的方法,其中4-[18F]氟苯甲醛与包含羟胺、氨基硫脲或肼(或酰肼)基团的肽序列反应,由此分别形成相应的肟、缩氨基硫脲或腙。4-[18F]氟苯甲醛通常通过4-[18F]氟苯甲醛和亚硫酸氢钠的加成复合物的酸催化分解而原位产生。亚硫酸氢盐加成复合物的使用提高了纯化速度,因为与醛不同,该复合物可以浓缩至干燥。复合物的形成在酸性和碱性条件下也是可逆的。特别是当复合物与酸性介质中含有羟胺、氨基硫脲或肼(或酰肼)基团的肽接触时,活性游离的4-[18F]氟苯甲醛因其原位形成而被消耗,产生相应的18F放射性标记的肽序列。
在肟、缩氨基硫脲或腙键存在于体内不稳定性的情况下,可以采用另外的还原步骤来减少将肽连接至含18F底物的双键。相应的还原的肽键会增强稳定性。本领域技术人员了解可用于执行这种还原步骤的各种方法。在Wilson等人,Journal of LabeledCompounds and Radiopharmaceuticals,XXVIII(10),1189-1199,1990中描述的还原胺化步骤也可以用于形成包含肽和4-[18F]氟苯甲醛的席夫碱,并且利用还原剂例如氰基硼氢化钠直接还原该席夫碱。
4-[18F]氟苯甲醛可以如Wilson等人,Journal of Labeled Compounds andRadiopharmaceuticals,XXVIII(10),1189-1199,1990;Iwata等人,Applied radiationand isotopes,52,87-92,2000;Poethko等人The Journal of Nuclear Medicine,45,892-902,2004;和Schottelius等人Clinical Cancer Research,10,3593-3606,2004中描述的那样进行制备。可以将水中的Na18F加入到kryptofix和K2CO3的混合物中。可以加入无水乙腈并将溶液在氩气流下在加热块中蒸发。可以加入额外的乙腈部分并蒸发以使样品完全干燥。4-三甲基铵苯甲醛三氟甲基磺酸盐可溶于DMSO中并加入到干燥的F-18中。然后可以在加热块中加热溶液。该溶液可以短暂冷却,用水稀释并通过Oasis HLB LP提取盒过滤。盒可以用9:1的水:乙腈和水洗涤以去除未结合的18F和未反应的4-三甲基铵苯甲醛三氟甲基磺酸盐。4-[18F]氟苯甲醛然后可以用洗脱液中的甲醇从盒上洗脱。
治疗应用
本文在某些实施方案中提供了利用本文公开的IL-17F捕获剂来鉴定、检测、定量和/或分离生物样品中的IL-17F的方法。在某些实施方案中,这些方法利用免疫测定法,其中捕获剂代替抗体或其等同物。在某些实施方案中,免疫测定可以是蛋白质印迹、拉下实验、斑点印迹或ELISA。
用于在本文提供的方法中使用的生物样品可以选自由器官、组织、体液和细胞组成的组。在生物样品是体液的情况下,流体可以选自由血液、血清、血浆、尿液、痰液、唾液、粪便、脊髓液、脑脊液、淋巴液、皮肤分泌物、呼吸道分泌物、肠分泌物、泌尿生殖道分泌物、泪液和乳汁组成的组。器官包括例如肾上腺、膀胱、骨骼、脑、***、子宫颈、食道、眼睛、胆囊、生殖器、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、***、卵巢、胰腺、脑垂体、***、唾液腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、胸腺、气管、甲状腺、睾丸、输尿管和尿道。组织包括例如上皮组织、***、神经组织和肌肉组织。
本文在某些实施方案中提供了利用本文公开的IL-17F捕获剂来诊断和/或分类(例如分期)与IL-17F表达相关的病症的方法。在这些实施方案的某些实施方案中,该方法包括(a)从受试者获得生物样品;(b)用IL-17F捕获剂测定样品中IL-17F的存在或不存在;(c)将IL-17F的水平与IL-17F的预定对照范围进行比较;和(d)基于生物样品中与预定对照之间的IL-17F水平的差异诊断与IL-17F表达相关的病症。
在其它实施方案中,本文公开的IL-17F捕获剂用作突变特异性靶向治疗剂。在该实施方案的某些方面,单独施用IL-17F捕获剂而不递送DNA、放射性药物或另一种活性剂。
本发明的IL-17F捕获剂也可用于将遗传物质靶向至表达IL-17F的细胞。遗传物质可以包括天然或合成来源的核酸,例如RNA或DNA,包括重组RNA和DNA以及反义RNA和DNA。可以使用的遗传物质的类型包括例如携带在表达载体例如质粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)和缺陷或“辅助”病毒、反义基因核酸、单链和双链RNA和其DNA及其类似物(例如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸)上的基因。另外,遗传物质可以与例如脂质、蛋白质或其它聚合物组合。用于遗传物质的递送载体可以包括,例如病毒颗粒、逆转录病毒或其它基因治疗载体、脂质体、脂类(特别是阳离子脂质)和遗传物质的复合物、葡聚糖衍生物和遗传物质的复合物等。
在一个实施方案中,本发明的捕获剂用于基因治疗。在该实施方案中,遗传物质或一种或多种含有遗传物质的递送载体可以与本公开的一种或多种IL-17F捕获剂缀合并施用给患者。
本文公开的治疗剂和IL-17F捕获剂可以以已知方式连接或融合,任选地利用本申请中别处讨论的相同类型的接头。优选的接头将是取代的或未取代的烷基链、氨基酸链、聚乙二醇链和本领域已知的其它简单聚合物接头。更优选地,如果治疗剂本身是已知编码DNA序列的蛋白质,则治疗性蛋白质和IL-17F结合的多肽可以从相同的合成基因共表达,相同的合成基因如上所述利用重组DNA技术产生。可将IL-17F结合的多肽的编码序列与治疗性蛋白质的编码序列融合在框架中,使得肽在治疗性蛋白质的氨基末端或羧基末端或在末端之间的位置处表达,如果确定这个放置不会破坏治疗性蛋白质或IL-17F结合的多肽的所需生物学功能。该通用方法的特别优点是多个衔接着排列的IL-17F捕获剂的多联化(concatamerization)是可能的,从而增加与每种治疗性蛋白质相关的IL-17F结合位点的数量和浓度。以这种方式,增加了IL-17F结合亲合力,这将预期改善重组治疗性融合蛋白的功效。
提供以下示例以更好地说明要求保护的发明,并且不被解释为限制本发明的范围。在提及具体材料的范围内,这仅仅是为了说明的目的,而不是为了限制本发明。本领域技术人员可以开发等同的手段或反应物而不需要运用创造能力并且不偏离本发明的范围。
示例
示例1、IL-17F表位设计
检查了IL-17F和IL-17A的一级序列,以了解哪里存在同一性或相似性的区域,哪里存在差异。为了产生可以有效区分IL-17F与IL-17A的大环肽配体,注意力放在这两种蛋白质独特的序列上。发现区分IL-17F与IL-17A的序列差异出现在成熟蛋白质的N-末端区域。在IL-17F中,该区域的独特性对应于Arg-31至Thr-79(图1A)。
化学合成两种多肽表位并用作产生针对IL-17F的特异性大环肽配体的靶标。将表位设计成具有生物素-PEG3测定手柄和策略性取代有叠氮点击手柄(Az4=L-叠氮基赖氨酸)。每个表位中的点击手柄取代的位点是通过检查蛋白质结构并鉴定其侧链表面暴露且不与蛋白质中的其它原子相互作用的氨基酸(a)和与Az4化学性质相似的氨基酸(b)而确定。IL-17F表位1(Phe-40至Ser-54)位于非常接近IL-17F的N-末端,并且在中心位置(Cys-48)取代有Az4。在一级序列中IL-17F表位2(Gly-60至Ser-69)位于表位1之后,并且在Ile-62处取代有Az4。表位1和表位2的序列显示在图1B和C中。
示例2、筛选针对IL-17F表位1的大环锚
利用H2N-Pra-Cy(XXXXX)-Met-TG形式的***环化的OBOC文库进行筛选,其中 S NH2树脂(S 30 902,Rapp Polymere),X=17个L-氨基酸(缺少Cys、Met和Ile)中的一个,Pra=L-炔丙基甘氨酸,Cy()=通过侧翼的Pra和Az4残基的***环化。采用四步筛选法鉴定针对IL-17F表位1片段的大环:1)预净化以消除非特异性结合物,2)产品筛选以鉴定由表位模板原位点击化学产生的击中物,3)针对His-标记的IL-17F蛋白的靶标筛选,和4)针对2%(体积/体积)人血清中His-标记的IL-17F蛋白的另外的靶标筛选以鉴定那些与IL-17F的结合未受血清蛋白影响的肽。
预净化。用封闭缓冲液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,1%(重量/体积)BSA和0.05%(体积/体积)吐温-20,pH 7.6)将溶胀的文库珠粒(500mg)在4℃下过夜封闭,然后用封闭缓冲液洗涤三次。将以1:10,000稀释在5mL封闭缓冲液中的链霉亲和素-碱性磷酸酶(V559C,Promega)加入到珠粒中并在室温温和振荡孵育1小时。随后用3×3mL TBS(25mMTris-HCl,150mM NaCl,pH 7.6)(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸pH 2.8洗涤缓冲液、3×3mL TBS、然后3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM MgCl2,pH9)(每次5分钟)洗涤珠粒。结合通过在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)底物(S3771,Promega)存在的情况下将珠粒孵育25分钟而可视化。紫色珠子表示背景结合物,并通过吸管移除并丢弃。收集剩余的透明珠子并用7.5M盐酸胍pH 2.0解吸(stripped)30分钟,用水洗涤10次,并在1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中过夜孵育以脱色。
用IL-17F表位1进行产品筛选。将预净化的珠子用水洗涤10次,TBS洗涤3次。然后用3mL 100μM IL-17F表位1片段(生物素-PEG3-FFQKPES[Az4]PPVPGGS)的TBS溶液将珠粒在室温下孵育1.5小时以允许进行原位点击反应。将珠粒用TBS洗涤10次,然后与7.5M盐酸胍pH 2.0孵育1小时以除去所有不与珠粒共价连接的IL-17F表位。将这些珠粒用TBS洗涤10次,并用封闭缓冲液再封闭2小时。加入以1:10,000稀释在5mL封闭缓冲液中的链霉亲和素-碱性磷酸酶(V559C,Promega),持续1小时以检测点击至珠粒的IL-17F表位的存在。随后用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸pH 2.8洗涤缓冲液、3×3mL TBS、然后3×3mL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次5分钟)洗涤珠粒。在此之后,如预净化所概述的,将珠粒用BCIP/NBT显影25分钟。通过移液管选择紫色的表位缀合的击中珠粒并保存。将这些击中珠粒(共25个:5个暗紫色,20个中等至浅紫色)用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去附着的链霉亲和素,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。
用His-标记的IL-17F蛋白进行靶标筛选。将击中产品用水洗涤10次并在4℃下储存在TBS中。将这25个珠粒转移到8162Spin-离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中,并在室温下与封闭缓冲液孵育3小时。将珠粒用封闭缓冲液漂洗三次,然后与150nM全长的His-标记的IL-17F蛋白(ab167911,Abcam)在封闭缓冲液(制备:在200μL封闭缓冲液中的0.5μL His-标记的IL-17F蛋白)中在室温下孵育1小时。将珠粒用封闭缓冲液洗涤三次,然后与500μL 1:10,000的抗-6×His抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746,Abcam)在封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。随后将珠粒用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS、然后3×500μL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次洗涤后在7000rpm下离心30秒)洗涤。之后,将珠粒用BCIP/NBT显影10分钟。通过移液管选择与IL-17F蛋白结合的紫色击中珠粒并保存。20个珠粒为紫色,表明与IL-17表位和蛋白质都结合,而5个珠子是透明的,表明未与IL-17F蛋白结合。将20个靶标击中珠粒用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去结合蛋白质,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。
用2%(体积/体积)人血清中的His标记的IL-17F蛋白进行靶标筛选。将靶标击中珠粒用水洗涤10次。将这20个珠粒与封闭缓冲液在8162Spin-离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中孵育7小时。将珠粒用封闭缓冲液漂洗三次,然后与150nM全长的His-标记的IL-17F蛋白(ab167911,Abcam)在含有2%(体积/体积)人血清(HS-30,Omega)封闭缓冲液中在室温下孵育1小时(制备:1.25μL His-标记的IL-17F蛋白+10μL过滤后的血清+490μL封闭缓冲液)。注意:在筛选之前,利用8162Spin-管式过滤器通过离心(7000rpm,30秒)从血清中除去颗粒物质。将珠粒用封闭缓冲液洗涤三次,然后与500μL 1:10,000的抗-6×His抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746,Abcam)在封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。随后将珠粒用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS、然后3×500μL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次洗涤后在7000rpm下离心30秒)洗涤。之后,将珠粒用BCIP/NBT显影10分钟。通过移液管选择紫色击中珠粒并保存。将与IL-17F蛋白的结合未受血清蛋白干扰的2个击中珠粒用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去结合的蛋白质,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。将2个击中珠粒最后用水洗涤10次以准备测序分析。
在Caltech的蛋白质/肽微量分析实验室(Protein/Peptide Micro AnalyticalLaboratory)中通过埃德曼降解在Applied BiosystemscLC 2-cartridge***上进行测序。埃德曼测序仪不能区分1)残基K(赖氨酸)和L(亮氨酸),以及2)残基Q(谷氨酰胺)和T(苏氨酸)。包括K/L和Q/T变体的测序结果显示在表1中。
表1:针对IL-17F表位1鉴定的大环肽击中物的序列
这些候选肽在可裂解树脂上重新合成,通过利用C18柱(Phenomenex Luna,5μm,250×10mm)的反相HPLC进行纯化,并通过ELISA测试针对IL-17F蛋白的亲和力和特异性。
IL-17F表位1击中物的合成数据
Cy(FYKTH)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C65H97N17O14S(M+H)计算值1372.71;测试值1374.24。
Cy(FYKQH)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C66H98N18O14S(M+H)计算值1399.72;测试值1401.36。
Cy(FYLTH)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C65H96N16O14S(M+H)计算值1357.70;测试值1360.15。
Cy(FYLQH)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C66H97N17O14S(M+H)计算值1384.71;测试值1386.24。
Cy(RRATS)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C53H94N20O14S(M+H)计算值1269.70;测试值1269.91(图2C)。
Cy(RRAQS)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C54H95N21O14S(M+H)计算值1295.71;测试值1296.19(图2D)。
示例3、用IL-17F表位1靶向的配体进行的体外试验
夹心ELISA。将黑色96孔NeutrAvidin包被的高结合容量板(15510,Pierce)用2μM大环肽配体的TBS(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH 7.6)溶液在室温下包被2小时。以4μg/mL的生物素化的单克隆抗-IL17F(TA319597,Origene)的TBS溶液进行包被作为对照。对板进行抽吸,然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05%(体积/体积)吐温-20的PBS溶液,1×)洗涤。全长的His标记的IL-17F蛋白(ab167911,Abcam)在洗涤缓冲液中连续稀释(800至0nM)并在指定的微孔中在室温下孵育90分钟。对微孔进行抽吸,随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的IL-17F蛋白,以1:10,000的稀释度制备碱性磷酸酶(AP)偶联的抗6×His抗体[HIS-1](ab49746,Abcam),并加入微孔中,在室温下持续1小时。对板进行抽吸并用洗涤缓冲液(5×)洗涤。利用AP荧光底物***(S1000,Promega)使微孔显影。采用430nm的激发波长,通过Beckman Coulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。使用四参数回归曲线拟合程序(Origin 8.5)拟合滴定曲线以确定EC50值。
结果如图2A所示。以ELISA格式测试PEG3-生物素修饰的Cy(RRATS)和Cy(RRAQS)的结合亲和力。对于这些测定,利用固定在NeutrAvidin包被的平板上的大环肽配体捕获连续稀释的全长的His-标记的IL-17F蛋白。人IL-17F蛋白的Cy(RRATS)和Cy(RRAQS)分别展现出66±9nM和52±5nM的EC50值。类似测定的生物素化的单克隆抗-IL17F显示出类似的结合亲和力。
点ELISA(IL-17F相对于IL-17A的选择性测定)。将黑色96孔NeutrAvidin包被的高结合容量板(15510,Pierce)用2μM大环肽配体的TBS(pH 7.6)溶液在室温下包被2小时。对板进行抽吸,然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05%(体积/体积)吐温-20的PBS溶液,1×)洗涤。在洗涤缓冲液中制备200和50nM的全长His标记的IL-17F(ab167911,Abcam)和IL-17A(ab166882,Abcam)蛋白,并在指定的微孔中在室温下孵育90分钟。对微孔进行抽吸,随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的IL-17F和IL-17A蛋白,以1:10,000的稀释度制备碱性磷酸酶(AP)偶联的抗6×His抗体[HIS-1](ab49746,Abcam),并加入到微孔中,在室温下持续1小时。对板进行抽吸并用洗涤缓冲液(5×)洗涤。利用AP荧光底物***(S1000,Promega)使微孔显影。采用430nm的激发波长,通过Beckman Coulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。
结果如图2B所示。以ELISA格式测试PEG3-生物素修饰的Cy(RRATS)和Cy(RRAQS)的选择性。对于这些测定,利用固定在NeutrAvidin包被的平板上的大环肽配体捕获全长的His-标记的IL-17F和IL-17A蛋白。在200至50nM浓度范围内,Cy(RRATS)和Cy(RRAQS)均对IL-17F表现出2:1的选择性。这些结果证实了表位靶向策略的选择性。
测定以确定与IL-17F表位1结合大环的定向。将黑色96孔NeutrAvidin包被的高结合容量板(15510,Pierce)用2μM大环肽配体的TBS(pH 7.6)溶液在室温下包被2小时。以4μg/mL的生物素化的单克隆抗-IL17F(TA319597,Origene)的TBS溶液进行包被作为对照。对板进行抽吸,然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05%(体积/体积)吐温-20的PBS溶液,1×)洗涤。在洗涤缓冲液中制备2μM的化学合成的His-标记的IL-17F表位,并在指定的微孔中在室温下孵育90分钟。加入不含表位的洗涤缓冲液作为对照。对微孔进行抽吸,随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的IL-17F表位,以1:10,000的稀释度制备碱性磷酸酶(AP)偶联的抗6×His抗体[HIS-1](ab49746,Abcam),并加入微孔中,在室温下持续1小时。对板进行抽吸并用洗涤缓冲液(5×)洗涤。利用AP荧光底物***(S1000,Promega)使微孔显影。采用430nm的激发波长,通过Beckman Coulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。在减去无表位背景之后显示数据。
结果显示在图3中。对于该实验,将IL-17F表位1用His6测定手柄和C48S取代基代替点击手柄重新合成。合成了两个另外的His-标记的IL-17F表位,以包含经过策略性加扰的序列,其位于C48S的N-末端或C-末端。针对固定的大环肽配体进行三种His-标记的IL-17F表位的点ELISA。对于PEG3-生物素修饰的Cy(RRATS)和Cy(RRAQS),获得His-标记的IL-17F表位1(C48S)和点击手柄C-末端被加扰的表位(黑色和红色的条)的ELISA阳性信号。当点击手柄的N-末端的表位是被加扰的(蓝色条)时,结合被破坏。因此,大环肽配体显示优先结合IL-17F表位1(C48S)内的序列FFQKPES。另一方面,生物素化的单克隆抗-IL17F显示与His-标记的IL-17F表位没有明显的结合,因为它是针对蛋白质免疫原产生的。
总之,图2至3的结果证实表位靶向策略产生选择性识别IL-17F表位以及全长蛋白的亲和力在100nM以下的大环肽配体。
示例4、筛选针对IL-17F表位2的大环锚
利用H2N-Pra-Cy(XXXXX)-Met-TG形式的***环化的OBOC文库类似地进行靶向IL-17F表位2片段(生物素-PEG3-GI[Az4]NENQRVS)的筛选。采用上述四步筛选法鉴定针对IL-17F表位2片段的大环:1)预净化以消除非特异性结合物,2)产品筛选以鉴定由表位模板原位点击化学产生的击中物,3)针对His-标记的IL-17F蛋白的靶标筛选,和4)针对1%至5%(体积/体积)人血清中His-标记的IL-17F蛋白的另外的靶标筛选以鉴定那些与IL-17F的结合不受血清蛋白影响的肽。
用IL-17F表位2进行产品筛选。用3mL 100μM IL-17F表位2片段(生物素-PEG3-GI[Az4]NENQRVS)的TBS溶液在室温下孵育1.5小时以允许进行原位点击反应而进行产品筛选。将珠粒用TBS洗涤10次,然后与7.5M盐酸胍pH 2.0孵育1小时以除去所有不与珠粒共价连接的IL-17F表位。将这些珠粒用TBS洗涤10次,并用封闭缓冲液再封闭2小时。加入以1:10,000稀释在5mL封闭缓冲液中的链霉亲和素-碱性磷酸酶(V559C,Promega),持续1小时以检测点击至珠粒的IL-17F表位的存在。随后用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸pH 2.8洗涤缓冲液、3×3mL TBS、然后3×3mL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次5分钟)洗涤珠粒。在此之后,如预净化所概述的,将珠粒用BCIP/NBT显影25分钟。通过移液管选择紫色表位缀合的击中珠粒并保存。将这些击中珠粒(共98个:50个暗紫色,48个中等至浅紫色)用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去附着的链霉亲和素,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。
用His标记的IL-17F蛋白进行靶标筛选。将击中产品用水洗涤10次并在4℃下储存在TBS中。将这98个珠粒转移到8162Spin-离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中,并在室温下与封闭缓冲液孵育3小时。将珠粒用封闭缓冲液漂洗三次,然后与150nM全长的His-标记的IL-17F蛋白(ab167911,Abcam)在封闭缓冲液(制备:在200μL封闭缓冲液中的0.5μL His-标记的IL-17F蛋白)中在室温下孵育1小时。将珠粒用封闭缓冲液洗涤三次,然后与500μL 1:10,000的抗-6×His抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746,Abcam)在封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。随后将珠粒用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS、然后3×500μL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次洗涤后在7000rpm下离心30秒)洗涤。之后,将珠粒用BCIP/NBT显影10分钟。通过移液管选择与IL-17F蛋白结合的紫色击中珠粒并保存。53个珠粒为紫色,表明与IL-17表位和蛋白质都结合,而40个珠子是透明的,表明未与IL-17F蛋白结合。将53个靶标击中珠粒用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去结合蛋白质,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。。
用1%(体积/体积)人血清中的His标记的IL-17F蛋白进行靶标筛选。将靶标击中珠粒用水洗涤10次。将这53个珠粒与封闭缓冲液在8162Spin-离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中孵育7小时。将珠粒用封闭缓冲液漂洗三次,然后与150nM全长的His-标记的IL-17F蛋白(ab167911,Abcam)在含有1%(体积/体积)人血清(HS-30,Omega)封闭缓冲液中在室温下孵育1小时(制备:1.25μL His-标记的IL-17F蛋白+5μL过滤后的血清+495μL封闭缓冲液)。注意:在筛选之前,利用8162Spin-管式过滤器通过离心(7000rpm,30秒)从血清中除去颗粒物质。将珠粒用封闭缓冲液洗涤三次,然后与500μL 1:10,000的抗-6×His抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746,Abcam)在封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。随后将珠粒用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS、然后3×500μL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次洗涤后在7000rpm下离心30秒)洗涤。之后,将珠粒用BCIP/NBT显影10分钟。通过移液管选择紫色击中珠粒并保存。将与IL-17F蛋白的结合未受血清蛋白干扰的23个击中珠粒用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去结合的蛋白质,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。
用5%(体积/体积)人血清中的His标记的IL-17F蛋白进行靶标筛选以优化击中物的数量。将23个珠粒用水洗涤10次,然后与封闭缓冲液在8162Spin-离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中孵育7小时。将珠粒用封闭缓冲液漂洗三次,然后与150nM全长的His-标记的IL-17F蛋白(ab167911,Abcam)在含有5%(体积/体积)人血清(HS-30,Omega)封闭缓冲液中在室温下孵育1小时(制备:1.25μL His-标记的IL-17F蛋白+25μL过滤后的血清+475μL封闭缓冲液)。注意:在筛选之前,利用8162Spin-管式过滤器通过离心(7000rpm,30秒)从血清中除去颗粒物质。将珠粒用封闭缓冲液洗涤三次,然后与500μL 1:10,000的抗-6×His抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746,Abcam)在封闭缓冲液中在室温下孵育1小时。随后将珠粒用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS、然后3×500μL碱性磷酸酶(pH 9)缓冲液(每次洗涤后在7000rpm下离心30秒)洗涤。之后,将珠粒用BCIP/NBT显影10分钟。通过移液管选择紫色击中珠粒并保存。将与IL-17F蛋白的结合未受血清蛋白背景增加干扰的6个击中珠粒用7.5M盐酸胍pH 2.0处理30分钟以除去结合的蛋白质,用水洗涤10次,并在NMP中过夜孵育以脱色。将6个击中珠粒最后用水洗涤10次以准备测序分析。
通过埃德曼降解进行测序。埃德曼测序仪不能区分1)残基K(赖氨酸)和L(亮氨酸),以及2)残基Q(谷氨酰胺)和T(苏氨酸)。包括K/L和Q/T变体的测序结果显示在表2中。
表2:针对IL-17F表位2鉴定的大环肽击中物的序列
这些候选肽在可裂解树脂上重新合成,通过利用C18柱的反相HPLC进行纯化,并通过ELISA针对IL-17F蛋白进行测试。
IL-17F表位2击中物的合成数据
Cy(KYGEV)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C58H93N15O15S(M+H)计算值1272.67;测试值1274.02。
Cy(LYGEV)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C58H92N14O15S(M+H)计算值1257.66;测试值1259.13。
Cy(VHKSG)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C53H89N17O13S(M+H)计算值1204.65;测试值1206.20。
Cy(VHLSG)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C53H88N16O13S(M+H)计算值1189.64;测试值1191.11。
Cy(QKHGP)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C55H90N18O13S(M+H)计算值1243.67;测试值1245.18。
Cy(TKHGP)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C54H89N17O13S(M+H)计算值1216.65;测试值1218.25。
Cy(QLHGP)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C55H89N17O13S(M+H)计算值1228.65;测试值1228.84。
Cy(TLHGP)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C54H88N16O13S(M+H)计算值1201.64;测试值1201.73。
Cy(YDLQR)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C61H98N18O16S(M+H)计算值1371.71;测试值1372.16。
Cy(YDLTR)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C60H97N17O16S(M+H)计算值1344.70;测试值1345.13。
Cy(YDKQR)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C61H99N19O16S(M+H)计算值1386.72;测试值1387.00。
Cy(YDKTR)-PEG3-生物素。MALDI-MS(m/z):C60H98N18O16S(M+H)计算值1359.71;测试值1359.94。
生物素-PEG3-Cy(KKGWP)。MALDI-MS(m/z):C59H91N17O13S(M+H)计算值1278.67;测试值1278.83。
生物素-PEG3-Cy(KLGWP)。MALDI-MS(m/z):C59H90N16O13S(M+H)计算值1263.66;测试值1263.92。
生物素-PEG3-Cy(LKGWP)。MALDI-MS(m/z):C59H90N16O13S(M+H)计算值1263.66;测试值1263.86。
生物素-PEG3-Cy(LLGWP)。MALDI-MS(m/z):C59H89N15O13S(M+H)计算值1248.65;测试值1248.89。
生物素-PEG3-Cy(RSYNL)。MALDI-MS(m/z):C57H90N18O16S(M+H)计算值1315.65;测试值1315.95。
生物素-PEG3-Cy(RSYNK)。MALDI-MS(m/z):C57H91N19O16S(M+H)计算值1330.66;测试值1331.06。
示例5、用IL-17F表位2靶向的配体进行的体外试验
夹心ELISA。这些测定采用与用于评估IL-17F表位1靶向的配体相同的方案进行。
结果如图4A所示。以ELISA格式测试PEG3-生物素修饰的Cy(QKHGP)、Cy(TKHGP)、Cy(KKGWP)和Cy(RSYNK)。对于这些测定,利用固定在NeutrAvidin包被的平板上的大环肽配体捕获稀释系列的全长的His-标记的IL-17F蛋白。人IL-17F蛋白的Cy(QKHGP)和Cy(TKHGP)分别展现出64±10nM和72±16nM的EC50值。人IL-17F蛋白的Cy(KKGWP)和Cy(RSYNK)分别展现出24±3nM和15±5nM的EC50值。有趣的是,Cy(RSYNK)超过了类似测定的生物素化的单克隆抗IL17F的结合亲和力。
点ELISA(IL-17F相对于IL-17A的选择性测定)。将黑色96孔NeutrAvidin包被的高结合容量板(15510,Pierce)用2μM大环肽配体的TBS(pH 7.6)溶液在室温下包被2小时。在TBS中以4μg/mL的生物素化的单克隆抗-IL17F(TA319597,Origene)进行包被作为对照。对板进行抽吸,然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05%(体积/体积)吐温-20的PBS溶液,1×)洗涤。在洗涤缓冲液中制备100nM的全长His标记的IL-17F(ab167911,Abcam)和IL-17A(ab166882,Abcam)蛋白,并在指定的微孔中在室温下孵育90分钟。对微孔进行抽吸,随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的IL-17F和IL-17A蛋白,以1:10,000的稀释度制备碱性磷酸酶(AP)偶联的抗6×His抗体[HIS-1](ab49746,Abcam),并加入到微孔中,在室温下持续1小时。对板进行抽吸并用洗涤缓冲液(5×)洗涤。利用AP荧光底物***(S1000,Promega)使微孔显影。采用430nm的激发波长,通过Beckman Coulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。
结果如图4B所示。以ELISA格式测试PEG3-生物素修饰的Cy(QKHGP)、Cy(TKHGP)、Cy(KKGWP)和Cy(RSYNK)的选择性。对于这些测定,利用固定在NeutrAvidin包被的平板上的大环肽配体捕获全长的His-标记的IL-17F和IL-17A蛋白。Cy(KKGWP)和Cy(RSYNK)对于100nM的IL-17F表现出4:1的选择性。包括Cy(QKHGP)和Cy(TKHGP)的其它配体和生物素化的单克隆抗-IL17F显示出对IL-17F更高(几乎绝对)的选择性。再次,这些结果证实了表位靶向策略的选择性。
示例6、设计接头以共价连接两个大环配体
随后将IL-17F蛋白的三级结构用作支架,用于开发表现出真正的协同结合(KD范围<1nM)的双配体PCC剂。将两个大环的组合共价连接在一起以产生显示对两个表位的高亲和力的双配体PCC剂。
该过程的重要之处在于设计合适的接头以桥接蛋白质的两个表位之间的距离。在PyMOL(DeLano Scientific)中分析IL-17F的3-D晶体结构(PDB ID:1JPY)以确定IL-17F表位1和IL-17F表位2之间的距离(图5)。在IL-17F表位1中,由于大环Cy(RRATS)和Cy(RRAQS)被确定为优先与此区域相互作用(图3),所以将焦点放在序列FFQKPES上。由于点击手柄的N-末端所处的位置,IL-17F表位2内的序列NENQRVS是大环Cy(QKHGP)、Cy(TKHGP)、Cy(KKGWP)和Cy(RSYNK)的假定结合区域。由于IL-17F天然存在为同源二聚体,所以测量一个单体内和两个单体之间的两个表位之间的距离。在单体的IL-17F蛋白中,序列FFQKPES(在IL-17F表位1中)和IL-17F表位2被隔开约因此,约的化学接头可用于共价连接靶向IL-17F表位1的一个大环与靶向IL-17F表位2的一个大环。所得到的协同双配体可用于检测或治疗IL-17F和IL-17A/F异源二聚体。在同源二聚体IL-17F蛋白质,来自一个单体的序列FFQKPES(在IL-17F表位1中)和来自其它单体的IL-17F表位2被隔开约因此,约的化学接头可用于共价连接靶向IL-17F表位1的一个大环与靶向IL-17F表位2的一个大环。由此产生的协同双配体可用于检测或治疗IL-17F。
示例7、协同双配体候选物的合成
协同双配体候选物用可变长度接头合成,所述接头共价连接来自IL-17F表位1的一个大环与来自IL-17F表位2的一个大环。连接两个大环的接头是单个的聚乙二醇化的氨基酸(Fmoc-NH-PEGx-丙酸;x=1至5)或甘氨酸(Gly)。选择PEG接头是因为它有多种长度可以桥接蛋白质的两个表位之间7至的距离。预计PEG还会显示出抗生物污染性能。
首先从Cy(RRATS)(靶向IL-17F表位1)和Cy(QKHGP)(靶向IL-17F表位2)产生协同双配体候选物。基于其对IL-17F的高选择性而优先考虑Cy(QKHGP)。图6显示了协同双配体候选物生物素-PEG3-Cy(RRATS)-PEGx-Cy(QKHGP)的结构。也可以从Cy(RRATS)(靶向于IL-17F表位1)和Cy(RSYNK)(靶向IL-17F表位2)产生协同双配体候选物。基于其对IL-17F的高亲和力而优先考虑Cy(RSYNK)。
示例8、白细胞介素17F(IL17F):利用晶体结构和PCC测定数据来估计两个配体之间的距离,并从该信息中选择最佳接头。
图10显示了IL-17F和IL-17A的序列相似性。图11显示了IL-17F和IL-17A的配体的产生。制备结合两个不同表位的IL-17F的双配体PCC,而制备IL-17A的单配体PC。图12A提供了IL-17F的完整结构(PDB:1JPY)。图的左侧显示了两个PCC靶向的表位L1和L2。这是区分IL-17F与IL-17A的两个表位。注意到这些表位不是序列相邻的,但是在折叠的蛋白质结构内是临近的。图12B是蛋白质的靶向区域(来自晶体结构)的展开图,绘制了两种表位靶向的PCC大环配体的结合位置和序列。每个PCC显示处在15至70nM范围内的KD值。
用化学手柄构造PCC Cy(RRATS)(靶向IL-17F表位1)和Cy(RSYNK)(靶向IL-17F表位2)以供进一步阐述。基于其对IL-17F的高亲和力(KD=15nM)Cy(RSYNK)是优先的。当PCCs与IL-17F结合时,这些化学手柄之间的距离预计为这预测了连接两个PCC的优化的接头将具有接近的长度。在图12C中,通过测试不同长度的基于聚乙二醇(PEG)寡聚物的接头来验证该预测。当通过采用长度最接近的PEG寡聚物将两个PCC彼此共价连接时,得到的双配体Cy(RSYNK)-PEG3-Cy(RRATS)显示出针对IL-17F的250pM的KD值。这表明相对于各个PCC大环配体的亲和力得到了>100倍的改善。更短或更长的接头产生虽然比任何单配体上都有改善、但比最佳接头低约10倍的双配体亲和性。
图13显示了双配体候选物生物素-PEG3-C(RSYNK)-PEGx-Cy(RRATS)(x=1至5)的结构。
示例9、利用最佳可用知识连接两个配体,导致双配体具有与各个配体相比的改善的亲和力
具有比更短(PEG1、PEG2)或更长(PEG4、PEG5)接头的IL-17F的双配体结合物显示出了针对IL-17F的1至4nM的KD值。这些值代表相对于各个PCC大环配体的亲和力得到了5至25倍的改善。
恶性疟原虫组氨酸富集蛋白-2(Pf.HRP-2)是一种非结构蛋白,但具有许多在整个结构中重复的表位。针对各种Pf.HRP-2表位开发了一系列PCC。图14中提供了Pf.HRP-2的序列图谱。
针对AHHAHHAAD表位开发了环状肽Cy(YKYYR)。Cy(YKYYR)表现出220nM的EC50。由于表位重复的数目,通过简单地将两个Cy(YKYYR)PCC与约1.5nm长的接头连接在一起寻求协同结合物。得到的连接的双配体表现出20nM的EC50(图15)。
开发针对Pf.HRP-2(AHHATDAHHAAAHHEAATHCL)的C-末端序列的具有可变序列GWNVDL的环状PCC(EC50=50nM)。通过筛选可变长度接头分子的10,000个元件文库开发该PCC和环状YKYYR(参见上文;EC50=220nM)之间的接头。得到的双配体表现出540pM的EC50,这产生了相对于两种配体组分中更好一个的100倍改善(图16)。
Claims (62)
1.一种特异性结合IL-17F的稳定的合成的捕获剂,其中所述捕获剂包含对IL-17F上的第一表位具有亲和力的第一配体、对IL-17F上的第二表位具有亲和力的第二配体和将所述第一配体与所述第二配体共价连接的接头。
2.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述捕获剂相对于IL-17A对IL-17F具有选择性。
3.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述第一表位包含氨基酸序列FFQKPES。
4.根据权利要求3所述的捕获剂,其中所述第一表位包含氨基酸序列FFQKPESCPPVPGG。
5.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述第二表位包含氨基酸序列NENQRVS。
6.根据权利要求5所述的捕获剂,其中所述第二表位包含氨基酸序列GIINENQRVS。
7.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述第一配体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有80至100%同一性的氨基酸序列:
a.FYKTH;
b.FYKQH;
c.FYLTH;
d.FYLQH;
e.RRATS;和
f.RRAQS。
8.根据权利要求7所述的捕获剂,其中所述第一配体包含与选自由RRATS和RRAQS组成的组的氨基酸序列具有80至100%同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的捕获剂,其中所述第一配体包含序列RRATS。
10.根据权利要求7所述的捕获剂,其中所述第一配体包含序列RRAQS。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的捕获剂,其中所述第一配体是环状的。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的捕获剂,其中所述第一配体包含1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代-1,2,3-***残基(Tz5)。
13.根据权利要求12所述的捕获剂,其中所述***残基是1,4-取代-1,2,3-***(Tz4)残基。
14.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述第二配体包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有80至100%同一性的氨基酸序列:
a.KYGEV;
b.LYGEV;
c.VHKSG;
d.VHLSG;
e.QKHGP;
f.TKHGP;
g.QLHGP;
h.TLHGP;
i.YDLQR;
j.YDLTR;
k.YDKQR;
l.YDKTR;
m.KKGWP;
n.KLGWP;
o.LKGWP;
p.LLGWP;
q.RSYNL;和
r.RSYNK。
15.根据权利要求14所述的捕获剂,其中所述第二配体包含与选自由:TKHGP、QKHGP、KKGWP和RSYNK组成的组的氨基酸序列具有80至100%同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的捕获剂,其中所述第二配体包含氨基酸序列TKHGP。
17.根据权利要求15所述的捕获剂,其中所述第二配体包含氨基酸序列QKHGP。
18.根据权利要求15所述的捕获剂,其中所述第二配体包含氨基酸序列KKGWP。
19.根据权利要求15所述的捕获剂,其中所述第二配体包含氨基酸序列RSYNK。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的捕获剂,其中所述第二配体是环状的。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的捕获剂,其中所述第二配体包含1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代-1,2,3-***残基(Tz5)。
22.根据权利要求21所述的捕获剂,其中所述***残基是1,4-取代-1,2,3-***残基(Tz4)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的捕获剂,其中所述接头是二价的。
24.根据前述权利要求中任一项所述的捕获剂,其中所述接头的长度对应于所述第一表位和所述第二表位之间的距离。
25.根据权利要求24所述的捕获剂,其中所述接头的所述长度为约至约约至约或约至约
26.根据权利要求24所述的捕获剂,其中所述接头的所述长度为约
27.根据前述权利要求中任一项所述的捕获剂,其中所述接头包含一个或多个乙二醇重复单元。
28.根据前述权利要求中任一项所述的捕获剂,其中所述接头包含肽。
29.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述第一配体包含序列RRATS,并且所述第二配体包含序列QKHGP。
30.根据权利要求1所述的捕获剂,其中所述第一配体包含序列RRATS,并且所述第二配体包含序列RSYNK。
31.根据权利要求29至30中任一项所述的捕获剂,其中所述第一配体和所述第二配体是环状的且包含Tz4残基。
32.根据权利要求31所述的捕获剂,其中所述接头是甘氨酸。
33.根据权利要求31所述的捕获剂,其中所述接头是PEG1。
34.根据权利要求31所述的捕获剂,其中所述接头是PEG2。
35.根据权利要求31所述的捕获剂,其中所述接头是PEG3。
36.根据权利要求31所述的捕获剂,其中所述接头是PEG4。
37.根据权利要求31所述的捕获剂,其中所述接头是PEG5。
38.根据前述权利要求中任一项所述的捕获剂,其中所述捕获剂标记有可检测部分。
39.根据权利要求38所述的捕获剂,其中所述可检测部分选自由生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨基氧乙酸盐、19FB、18FB和FITC-PEG3组成的组。
40.根据权利要求38所述的捕获剂,其中所述可检测部分选自由64Cu DOTA、68Ga DOTA、68Ga NOTA、18F、Al18F NOTA、64Cu、68Ga、89Zr、124I、86Y、94mTc、110mIn、11C和76Br组成的组。
41.根据权利要求1所述的捕获剂,其具有选自由以下组成的组的结构:
42.根据权利要求1所述的捕获剂,其具有选自由以下组成的组的结构:
43.一种用于检测生物样品中的IL17F的方法,该方法包括将所述生物样品与权利要求1所述的一种或多种捕获剂接触的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述捕获剂标记有可检测部分。
45.根据权利要求44所述的方法,其进一步包括将IL-17F与所述一种或多种捕获剂结合并检测与所述一种或多种捕获剂连接的所述可检测部分的步骤。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法,其中所述IL-17F是同源二聚体的形式,或与IL-17A的异源二聚体的形式。
47.一种产生特异性结合靶蛋白的合成的捕获剂的方法,该方法包括
a.选择与所述靶蛋白上的第一表位结合的第一配体,
b.选择与所述靶蛋白上的第二表位结合的第二配体,
c.选择接头,其中所述接头的长度允许当所述第一配体和所述第二配体分别特异性结合所述第一表位和所述第二表位时所述接头同时结合所述第一配体和所述第二配体,以及
d.将所述接头与所述第一配体和所述第二配体结合,由此产生特异性结合所述靶蛋白的所述合成的捕获剂。
48.根据权利要求47所述的方法,其中所述第一表位和所述第二表位彼此间的距离为约至约约至约约至约或约
49.根据权利要求47或48中任一项所述的方法,其中所述接头比所述第一表位和所述第二表位之间的距离长10至50%。
50.根据权利要求47或48中任一项所述的方法,其中所述接头在所述第一表位和所述第二表位之间的距离的5至25%内。
51.根据权利要求47或48中任一项所述的方法,其中所述接头在所述第一表位和所述第二表位之间的距离的1至10%内。
52.根据权利要求47或48中任一项所述的方法,其中所述捕获剂对所述靶蛋白的结合亲和力大于任一种所述配体。
53.根据权利要求52所述的方法,其中所述捕获剂具有至少为全协同结合物的结合亲和力的50%的结合亲和力。
54.根据权利要求52所述的方法,其中所述捕获剂具有至少为全协同结合物的结合亲和力的75%的结合亲和力。
55.根据权利要求52所述的方法,其中所述捕获剂具有至少为全协同结合物的结合亲和力的90%的结合亲和力。
56.根据权利要求47所述的方法,其中所述靶蛋白是合成的表位,其中所述合成的表位包含全长蛋白质的至少20个氨基酸的序列,其中所述合成表位的至少一个氨基酸包含叠氮基团或乙炔基团。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述全长蛋白质是天然存在的蛋白质。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述天然存在的蛋白质是IL-17。
59.根据权利要求56所述的方法,其中所述合成的表位包含全长蛋白质的至少50个氨基酸的序列。
60.根据权利要求56所述的方法,其中所述捕获剂以是全协同结合物的结合亲和力的至少50%的结合亲和力结合所述合成的表位和所述全长蛋白质。
61.根据权利要求56所述的方法,其中所述捕获剂以是全协同结合物的结合亲和力的至少75%的结合亲和力结合所述合成的表位和所述全长蛋白质。
62.根据权利要求56所述的方法,其中所述捕获剂以是全协同结合物的结合亲和力的至少90%的结合亲和力结合所述合成的表位和所述全长蛋白质。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210652244.2A CN115112898A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562192899P | 2015-07-15 | 2015-07-15 | |
US62/192,899 | 2015-07-15 | ||
US201662277430P | 2016-01-11 | 2016-01-11 | |
US62/277,430 | 2016-01-11 | ||
US201662309756P | 2016-03-17 | 2016-03-17 | |
US62/309,756 | 2016-03-17 | ||
PCT/US2016/042558 WO2017011769A2 (en) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Il-17f-specific capture agents, compositions, and methods of using and making |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210652244.2A Division CN115112898A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108290927A true CN108290927A (zh) | 2018-07-17 |
CN108290927B CN108290927B (zh) | 2022-06-24 |
Family
ID=56557906
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680053464.6A Active CN108290927B (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
CN202210652244.2A Pending CN115112898A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210652244.2A Pending CN115112898A (zh) | 2015-07-15 | 2016-07-15 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10598671B2 (zh) |
EP (1) | EP3322716A2 (zh) |
CN (2) | CN108290927B (zh) |
IL (1) | IL256833A (zh) |
WO (1) | WO2017011769A2 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115120719B (zh) * | 2022-05-24 | 2023-10-03 | 浙江中医药大学 | 一种协同治疗结肠癌的自组装纳米片及其制备方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016149404A1 (en) | 2015-03-16 | 2016-09-22 | California Institute Of Technology | Botulinum neurotoxin-specific capture agents, compositions, and methods of using and making |
CN108290927B (zh) * | 2015-07-15 | 2022-06-24 | 加州理工学院 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
WO2018064597A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Indi Molecular, Inc. | Compositions for detection, inhibition and imaging of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (ido1) and methods of making and using same |
EP3638687A1 (en) * | 2017-06-15 | 2020-04-22 | Indi Molecular, Inc. | Il-17f and il-17a-specific capture agents, compositions, and methods of using and making |
WO2020097531A1 (en) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | Indi Molecular, Inc. | Theranostic capture agents, compositions, and methods of using and making |
WO2022098743A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1) |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6902735B1 (en) * | 1995-07-19 | 2005-06-07 | Genetics Institute, Llc | Antibodies to human IL-17F and other CTLA-8-related proteins |
US20060153839A1 (en) * | 2002-09-16 | 2006-07-13 | Elusys Therapeutics, Inc. | Production of bispecific molecules using polyethylene glycol linkers |
WO2006088925A2 (en) * | 2005-02-14 | 2006-08-24 | Wyeth | Use of il17-f in diagnosis and therapy of airway inflammation |
WO2007106769A2 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind both il-17a and il-17f and methods of using the same |
WO2008133684A1 (en) * | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind both il-17a and il-17f and methods of using the same |
CN101484182A (zh) * | 2005-04-06 | 2009-07-15 | Ibc药品公司 | 由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的稳定连接复合体的生产方法及用途 |
CN102083858A (zh) * | 2008-05-05 | 2011-06-01 | 诺维莫尼公司 | 抗il-17a/il-17f交叉反应性抗体及其使用方法 |
CN102159949A (zh) * | 2008-06-18 | 2011-08-17 | 加州理工学院 | 多配位体捕获剂及相关组合物,方法和*** |
CN102458437A (zh) * | 2009-05-05 | 2012-05-16 | 诺维莫尼公司 | 抗il-17f 抗体及其使用方法 |
CN105709237A (zh) * | 2005-12-16 | 2016-06-29 | Ibc 医药公司 | 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体 |
Family Cites Families (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4899755A (en) | 1985-05-08 | 1990-02-13 | The General Hospital Corporation | Hepatobiliary NMR contrast agents |
MX174467B (es) | 1986-01-23 | 1994-05-17 | Squibb & Sons Inc | 1,4,7-triscarboximetil-1,4,7,10-tetraazaciclodo decano substituido en 1 y compuestos analogos |
US5021556A (en) | 1987-07-22 | 1991-06-04 | Neorx Corporation | Method of radiolabeling chelating compounds comprising sulfur atoms with metal radionuclides |
US5075099A (en) | 1988-05-31 | 1991-12-24 | Neorx Corporation | Metal radionuclide chelating compounds for improved chelation kinetics |
US5364613A (en) | 1989-04-07 | 1994-11-15 | Sieving Paul F | Polychelants containing macrocyclic chelant moieties |
WO1991003200A1 (en) | 1989-08-28 | 1991-03-21 | The General Hospital Corporation | Hydroxy-aryl metal chelates for diagnostic nmr imaging |
US5118797A (en) | 1989-08-28 | 1992-06-02 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Rhenium tris dioxime complexes |
CA2034042C (en) | 1990-01-18 | 1999-08-17 | Adrian D. Nunn | Boronic acid adducts of rhenium dioxime and technetium-99m dioxime complexes containing a biochemically active group |
US5183653A (en) | 1990-04-13 | 1993-02-02 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Boronic acid adducts of metal dioxime complexes useful in labelling proteins and other amine-containing compounds |
US5367080A (en) | 1990-11-08 | 1994-11-22 | Sterling Winthrop Inc. | Complexing agents and targeting radioactive immunoreagents useful in therapeutic and diagnostic imaging compositions and methods |
US5849261A (en) | 1991-02-08 | 1998-12-15 | Diatide, Inc. | Radiolabeled vasoactive intestinal peptides for diagnosis and therapy |
US5965107A (en) | 1992-03-13 | 1999-10-12 | Diatide, Inc. | Technetium-99m labeled peptides for imaging |
KR930703024A (ko) | 1991-02-08 | 1993-11-29 | 리챠드 티. 딘 | 영상용 테크네튬-99m표지폴리펩티드 |
US5808091A (en) | 1991-10-29 | 1998-09-15 | Bracco International B.V. | Rhenium and technetium complexes containing a hypoxia localizing moiety |
US5608110A (en) | 1993-06-15 | 1997-03-04 | Bracco International B.V. | Heteroatom-bearing ligands and metal complexes thereof |
EP0710228B1 (en) | 1993-07-19 | 1998-01-21 | Resolution Pharmaceuticals Inc. | Hydrazino-type radionuclide chelators having an n 3?s configuration |
US5574140A (en) | 1993-09-03 | 1996-11-12 | Resolution Pharmaceutical Inc. | Hydrazino-type N2 S2 chelators |
US5582814A (en) | 1994-04-15 | 1996-12-10 | Metasyn, Inc. | 1-(p-n-butylbenzyl) DTPA for magnetic resonance imaging |
WO1995028967A1 (en) | 1994-04-20 | 1995-11-02 | Nycomed Salutar Inc | Contrast agents |
US5662885A (en) | 1994-07-22 | 1997-09-02 | Resolution Pharmaceuticals Inc. | Peptide derived radionuclide chelators |
TW319763B (zh) | 1995-02-01 | 1997-11-11 | Epix Medical Inc | |
NZ331629A (en) | 1996-04-01 | 2000-04-28 | Epix Medical Inc | Bioactivated diagnostic imaging contrast agents |
ATE314097T1 (de) | 1996-10-28 | 2006-01-15 | Amersham Health As | Kontrastmittel |
WO1998018497A2 (en) | 1996-10-28 | 1998-05-07 | Nycomed Imaging As | Contrast agents |
US5919967A (en) | 1997-04-11 | 1999-07-06 | Epix Medical, Inc. | Process for synthesizing phosphodiesters |
US5886142A (en) | 1997-05-20 | 1999-03-23 | Thomas Jefferson University | Radiolabeled thrombus imaging agents |
NZ503402A (en) | 1997-10-02 | 2002-03-01 | Epix Medical Inc | Contrast-enhanced diagnostic imaging method for monitoring interventional therapies |
US6093382A (en) | 1998-05-16 | 2000-07-25 | Bracco Research Usa Inc. | Metal complexes derivatized with folate for use in diagnostic and therapeutic applications |
EP2670419A4 (en) | 2011-02-03 | 2014-12-03 | Indi Molecular Inc | PSA DETECTORS, COMPOSITIONS, PROCESS AND PREPARATION THEREOF |
EP2732291B1 (en) | 2011-07-11 | 2017-11-29 | Indi Molecular, Inc. | Akt-specific capture agents, compositions, and methods of using and making |
EP2751135A4 (en) | 2011-08-31 | 2015-06-03 | Indi Molecular Inc | VEGF SPECIFIC CAPTURING AGENTS, COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND METHODS OF USE AND PRODUCTION THEREOF |
WO2014074907A1 (en) | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Indi Molecular, Inc. | C-met-specific capture agents, compositions, and methods of using and making |
CN108290927B (zh) * | 2015-07-15 | 2022-06-24 | 加州理工学院 | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 |
EP3638687A1 (en) * | 2017-06-15 | 2020-04-22 | Indi Molecular, Inc. | Il-17f and il-17a-specific capture agents, compositions, and methods of using and making |
-
2016
- 2016-07-15 CN CN201680053464.6A patent/CN108290927B/zh active Active
- 2016-07-15 CN CN202210652244.2A patent/CN115112898A/zh active Pending
- 2016-07-15 WO PCT/US2016/042558 patent/WO2017011769A2/en active Application Filing
- 2016-07-15 EP EP16745579.9A patent/EP3322716A2/en active Pending
- 2016-07-15 US US15/211,759 patent/US10598671B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-10 IL IL256833A patent/IL256833A/en unknown
-
2020
- 2020-03-23 US US16/827,001 patent/US20210025901A1/en active Pending
Patent Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6902735B1 (en) * | 1995-07-19 | 2005-06-07 | Genetics Institute, Llc | Antibodies to human IL-17F and other CTLA-8-related proteins |
US20060153839A1 (en) * | 2002-09-16 | 2006-07-13 | Elusys Therapeutics, Inc. | Production of bispecific molecules using polyethylene glycol linkers |
WO2006088925A2 (en) * | 2005-02-14 | 2006-08-24 | Wyeth | Use of il17-f in diagnosis and therapy of airway inflammation |
CN101160528A (zh) * | 2005-02-14 | 2008-04-09 | 惠氏公司 | Il17-f在诊断和治疗气道炎症中的用途 |
CN101484182A (zh) * | 2005-04-06 | 2009-07-15 | Ibc药品公司 | 由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的稳定连接复合体的生产方法及用途 |
CN105709237A (zh) * | 2005-12-16 | 2016-06-29 | Ibc 医药公司 | 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体 |
WO2007106769A2 (en) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind both il-17a and il-17f and methods of using the same |
WO2008133684A1 (en) * | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind both il-17a and il-17f and methods of using the same |
CN102083858A (zh) * | 2008-05-05 | 2011-06-01 | 诺维莫尼公司 | 抗il-17a/il-17f交叉反应性抗体及其使用方法 |
CN102159949A (zh) * | 2008-06-18 | 2011-08-17 | 加州理工学院 | 多配位体捕获剂及相关组合物,方法和*** |
US20110263515A1 (en) * | 2008-06-18 | 2011-10-27 | Agnew Heather | Capture agents and related compositions, methods and systems |
CN102458437A (zh) * | 2009-05-05 | 2012-05-16 | 诺维莫尼公司 | 抗il-17f 抗体及其使用方法 |
US20150132314A1 (en) * | 2009-05-05 | 2015-05-14 | Novimmune S.A. | Anti-il-17f antibodies and methods of use thereof |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
HEATHER D. AGNEW等: "Iterative In Situ Click Chemistry Creates Antibody‐like Protein‐Capture Agents", 《ANGEWANDTE CHEMIE》 * |
JASON E. HUDAK等: "Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions Using Copper‐Free Click Chemistry and the Aldehyde Tag", 《ANGEWANDTE CHEMIE》 * |
MATTHEW B等: "Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays", 《OPTICAL SENSING II》 * |
STEVEN W. MILLWARD等: "In situ click chemistry: from small molecule discovery to synthetic antibodies", 《INTEGR BIOL (CAMB)》 * |
XIAOPING ZHANG等: "Structure and function of interleukin-17 family cytokines", 《PROTEIN & CELL》 * |
赵正达等: "点击化学及其在生物医学领域的应用", 《化学进展》 * |
邱素艳等: "点击化学最新进展", 《化学进展》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115120719B (zh) * | 2022-05-24 | 2023-10-03 | 浙江中医药大学 | 一种协同治疗结肠癌的自组装纳米片及其制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210025901A1 (en) | 2021-01-28 |
US10598671B2 (en) | 2020-03-24 |
US20170052199A1 (en) | 2017-02-23 |
IL256833A (en) | 2018-03-29 |
EP3322716A2 (en) | 2018-05-23 |
WO2017011769A2 (en) | 2017-01-19 |
WO2017011769A3 (en) | 2017-02-23 |
CN115112898A (zh) | 2022-09-27 |
CN108290927B (zh) | 2022-06-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11365219B2 (en) | Cyclic peptides as protein targeting agents | |
CN108290927A (zh) | Il-17f-特异性捕获剂、组合物以及使用和制造的方法 | |
CN109476721B (zh) | Cd8-特异性捕获剂、组合物及使用和制备方法 | |
US11723944B2 (en) | Botulinum neurotoxin-specific capture agents, compositions, and methods of using and making | |
US20090082551A1 (en) | Method, compositions and classification for tumor diagnostics and treatment | |
US20230019342A1 (en) | Phosphorylated akt-specific capture agents, compositions, and methods of using and making | |
US20220372077A1 (en) | Antibody specific capture agents, compositions, and methods of using and making | |
US20220062449A1 (en) | Labeled Probe and Methods of Use | |
WO2018064597A1 (en) | Compositions for detection, inhibition and imaging of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (ido1) and methods of making and using same | |
Reubi et al. | Switch from antagonist to agonist after addition of a DOTA chelator to a somatostatin analog | |
US11719705B2 (en) | IL-17F and IL-17A-specific capture agents, compositions, and methods of using and making | |
US11638764B2 (en) | Theranostic capture agents, compositions, and methods of using and making | |
US20200291391A1 (en) | Cross-linked epitopes and methods of use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |