CN109476721B - Cd8-特异性捕获剂、组合物及使用和制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供稳定的基于肽的CD8捕获剂和作为检测剂使用的方法。本申请还提供了制备CD8捕获剂的方法。

Description

CD8-特异性捕获剂、组合物及使用和制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年4月4日提交的美国临时专利申请第62/317,907号的优先权，通过引用将其内容作为整体并入本文。

背景技术

人类CD8(分化簇8)是作为T细胞受体(TCR)的共同受体的跨膜糖蛋白。CD8与抗原呈递细胞上的主要肽-组织相容性复合物(pMHC)结合，导致抗原特异性激活幼稚或效应CD8+T细胞(Kroger等人，Immunology 2007)。由于合适激活且未被抑制的CTL可以识别肿瘤相关抗原并杀死肿瘤细胞，因而CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是免疫***的重要组成部分。

免疫疗法是一类利用免疫***对抗癌症的癌症治疗方法。对于实体瘤，免疫疗法在易于进行活检的癌症(如黑素瘤和淋巴瘤)中取得了最大的成功。对于那些患者，发现位于侵袭性肿瘤边缘的预先存在的CD8+T细胞与PD-1/PD-L1免疫抑制轴的表达相关，并且可以预测治疗产生的反应(Tumeh等人，Nature 2014；doi:10.1038/nature13954)。随着将免疫疗法扩展到其它癌症，检测体内CD8+T细胞的能力具有极大希望以将患者分层，并且有望跟踪治疗反应。

对于检测CD8的灵敏的选择性工具仍存在需要。

发明内容

因此，本公开涉及靶向表位的大环肽配体和对CD8具有亲和力的捕获剂。将配体和捕获剂设计为以与单克隆抗体(mAb)相似的方式结合CD8的特定合成表位，并通过单珠-单化合物(OBOC)肽文库的原位点击筛选来进行开发。在某些实施方式中，配体和捕获剂包含环肽。环肽具有显示出有受限构象灵活性的蛋白样表位的能力，因此与其线性对应物相比，其通常显示出增强的生物利用度、代谢降解的稳定性增加及优异的结合亲和力。

一方面，本文提供了特异性结合CD8的稳定的合成捕获剂，其中捕获剂包含对CD8上的第一表位具有亲和力的第一配体、对CD8上的第二表位具有亲和力的第二配体、和将第一配体与第二配体共价连接的接头。

另一方面，本文提供了包含一个或多个如本文所述的特异性结合CD8的合成捕获剂的组合物。

表位

在一个实施方式中，第一表位的长度为5至30个氨基酸。在一个实施方式中，第一表位的长度为8至20个氨基酸。在一个实施方式中，第一表位的长度为7至13个氨基酸。在一个实施方式中，第一表位的长度为最多5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。在一个实施方式中，第一表位包含序列SQFRVSPLD。在一个实施方式中，第一表位包含序列

SQFRVSPLDRTWNLGETVELKSQ。

在一个实施方式中，第二表位的长度为5至30个氨基酸。在一个实施方式中，第二表位的长度为8至20个氨基酸。在一个实施方式中，第二表位的长度为7至13个氨基酸。在一个实施方式中，第二表位的长度为最多5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。在一个实施方式中，第一表位或第二表位包含序列FLLYLSQNKP。在一个实施方式中，第二表位包含序列AAEGLDTQR。在一个实施方式中，第一表位或第二表位包含序列

FLLYLSQNKPKAAEGLDTQR。

在一个实施方式中，第一表位和第二表位位于CD8α胞外域。

在某些实施方式中，第一表位和/或第二表位是合成的，其与靶蛋白的相应天然表位具有至少90％的同源性，并且其具有至少一个包含叠氮化物或乙炔基团(acetylenegroup)的氨基酸。

在一个实施方式中，第一配体独立地结合第一表位(或其合成形式)，并且第二配体独立地结合第二表位(或其合成形式)。在捕获剂中，第一配体和第二配体分别与CD8的第一表位和第二表位协同结合。

配体

在一个实施方式中，第一配体的长度为5-9个氨基酸。在另一实施方式中，第一配体的长度为2-7个氨基酸。在一个实施方式中，第一配体是线性肽。在一个实施方式中，第一配体是环肽。在一个实施方式中，第一配体包含1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代的-1,2,3-***残基(Tz5)。在具体的实施方式中，***残基是1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)。在一个实施方式中，第一配体包含与选自由以下所组成的组的氨基酸序列具有80-100％同一性的氨基酸序列：a)HGSYG；b)KRLGA；c)AKYRG；d)hallw；e)lrGyw；f)vashf；g)nGnvh；h)wplrf；i)rwfnv；j)havwh；k)wvplw；l)ffrly；和m)wyyGf。

在一个实施方式中，第二配体的长度为5-9个氨基酸。在另一实施方式中，第二配体的长度为2-7个氨基酸。在一个实施方式中，第一配体或第二配体包含与选自由以下所组成的组的氨基酸序列具有80-100％同一性的氨基酸序列：a)AGDSW；b)HVRHG；c)HGRGH；d)THPTT；e)FAGYH；f)WTEHG；g)PWTHG；h)TNDFD；i)LFPFD；j)slrfG；k)yfrGs；l)wnwvG；m)vawlG；n)fhvhG；o)wvsnv；p)wsvnv；q)lnshG；r)yGGvr；s)nsvhG；t)ttvhG；u)fdvGh；v)rhGwk；w)Ghtwp；和x)hGrGh。在一个实施方式中，第二配体是线性肽。在一个实施方式中，第二配体是环肽。在一个实施方式中，第二配体包含1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代的-1,2,3-***残基(Tz5)。在具体的实施方式中，***残基是1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)。

在一个实施方式中，第一配体选自表3。在一个实施方式中，第二配体选自表6。在一个实施方式中，捕获剂包含选自表7和表8的捕获剂的第一配体和第二配体。

接头

在一个实施方式中，接头是二价的。在一个实施方式中，接头的长度对应于第一表位和第二表位之间的距离。在一个实施方式中，接头的长度为约

至约

约

至约

约

至约

约

至约

约

至约

或约

至约

在具体的实施方式中，接头的长度为约

至约

约

至约

或约

在更加具体的实施方式中，接头的长度为约

在一个实施方式中，接头包含一个或多个乙二醇重复单元。在具体的实施方式中，接头包含PEG₁、PEG₂、PEG₃、PEG₄、PEG₅、PEG₆、PEG₇或PEG₈。在更加具体的实施方式中，接头包含PEG₅。在一个实施方式中，接头包含氨基酸或肽。

捕获剂

在一个实施方式中，捕获剂标记有可检测部分。在具体的实施方式中，可检测部分选自由生物素、铜-DOTA、生物素-PEG3、氨氧基乙酸酯、¹⁹FB、¹⁸FB和FITC-PEG₃所组成的组。在另一具体的实施方式中，可检测部分选自由⁶⁴Cu DOTA、⁶⁸Ga DOTA、⁶⁸Ga NOTA、¹⁸F、Al¹⁸FNOTA、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁹Zr、¹²⁴I、⁸⁶Y、^94mTc、^110mIn、¹¹C和⁷⁶Br所组成的组。

在一个实施方式中，第一配体包含HGRGH，且第二配体包含wplrf；或第一配体包含HGRGH，且第二配体包含AKYRG；或第一配体包含Ghtwp，且第二配体包含hGrGh；或第一配体包含PWTHG，且第二配体包含AKYRG。

在一个实施方式中，捕获剂选自表7和表8。在一个实施方式中，表7-8的双配体包括四个家族。

(1)：HGRGH-接头-wplrf，靶向表位2C(AAEGLDTQR)和表位1N(SQFRVSPLD)。

(2)：HGRGH-接头-AKYRG，靶向表位2C(AAEGLDTQR)和表位1N(SQFRVSPLD)。

(3)：Ghtwp-接头-hGrGh，靶向表位2N(FLLYLSQNKP)和表位2C(AAEGLDTQR)。

(4)：PWTHG-接头-AKYRG，靶向表位2N(FLLYLSQNKP)和表位1N(SQFRVSPLD)。

使用方法

如在本文中所使用的，术语“本发明的捕获剂(capture agent of theinvention)”或“本发明的一些捕获剂(capture agents of the invention)”是指如本文所述与CD8结合的蛋白质催化的合成捕获剂。

还提供了检测受试者中CD8的方法，包括将来自受试者的生物样品与本发明的一种或多种捕获剂接触的步骤。还提供了本发明的一种或多种捕获剂用于检测受试者中CD8的用途。

还提供了采用免疫测定法检测生物样品中的CD8的方法，其中免疫测定法利用如本文所述的捕获剂，其中所述捕获剂替代免疫测定法中的抗体或其等同物。在某些实施方式中，提供了方法以利用如本文所述的捕获剂来确定、检测、定量或分离生物样品中的CD8。在该方法的一个实施方式中，免疫测定法选自蛋白质印迹(Western blot)、拉下实验(pull-down assay)、斑点印迹(dot blot)和ELISA的组。

一方面，本文提供了用于检测生物样品中的CD8(例如，CD8+T细胞)的方法，其包括将生物样品与如本文所述的一种或多种捕获剂接触。

在一个实施方式中，捕获剂标记有可检测部分。

在一个实施方式中，该方法还包括将CD8与所述一种或多种捕获剂结合，并检测与所述一种或多种捕获剂连接的可检测部分。

制备方法

另一方面，本文提供了生产与靶蛋白特异性结合的合成捕获剂的方法，其包括：

a.选择与靶蛋白上的第一表位结合的第一配体，

b.选择与靶蛋白上的第二表位结合的第二配体，

c.选择接头，其中该接头的长度允许当第一配体和第二配体分别特异性结合第一表位和第二表位时该接头同时与第一配体和第二配体结合，和

d.将接头与第一配体和第二配体结合，由此产生与靶蛋白特异性结合的合成捕获剂。

在一个实施方式中，第一表位和第二表位彼此相距为约

至约

约

至约

约

至约

约

至约

约

至约

或约

至约

或约

在一个实施方式中，接头比第一表位和第二表位之间的距离短10-50％或长10-50％。在一个实施方式中，接头比第一表位和第二表位之间的距离短5-25％或长5-25％。在一个实施方式中，接头比第一表位和第二表位之间的距离短1-10％或长1-10％。

在该方法的实施方式中，捕获剂对靶蛋白的结合亲和力大于任一配体对靶蛋白的结合亲和力。在具体的实施方式中，捕获剂的结合亲和力是全协同结合物(fullcooperative binder)的结合亲和力的至少50％、至少75％或至少90％。

另一方面，本文提供了生产与靶蛋白特异性结合的合成捕获剂的方法，其包括：

a.选择与第一合成表位结合的第一配体，其中第一合成表位与靶蛋白的第一表位具有至少90％的同源性，并且其中第一合成表位的至少一个氨基酸包含叠氮化物或乙炔基团；

b.选择与第二合成表位结合的第二配体，其中第二合成表位与靶蛋白的第二表位具有至少90％的同源性，并且其中第二合成表位的至少一个氨基酸包含叠氮化物或乙炔基团；

c.选择接头，其中该接头的长度允许当第一配体和第二配体分别特异性结合第一表位和第二表位时该接头同时与第一配体和第二配体结合，和

d.将接头与第一配体和第二配体结合，由此产生与靶蛋白特异性结合的合成捕获剂。

在一个实施方式中，靶蛋白是天然存在的蛋白质。在一个实施方式中，靶蛋白是CD8。

在一个实施方式中，捕获剂与合成表位结合，并且该全长蛋白质的结合亲和力为全协同结合物结合亲和力的至少50％。在一个实施方式中，捕获剂与合成表位结合，并且该全长蛋白质的结合亲和力为全协同结合物结合亲和力的至少75％。在一个实施方式中，捕获剂与合成表位结合，并且该全长蛋白质的结合亲和力为全协同结合物结合亲和力的至少90％。

在一个实施方式中，第一表位和第二表位包含与靶蛋白相同的序列。

试剂盒

本文在某些实施方式中提供了包含本发明的一种或多种捕获剂的试剂盒。在某些实施方式中，这些试剂盒可以用于确定、检测、定量和/或分离CD8，并且在某些实施方式中，试剂盒可用于对与存在CD8相关的病症进行诊断和/或分期(staging)。在某些实施方式中，本文提供的试剂盒包含：(a)其上包含吸附剂的底物，其中吸附剂适合用于与CD8结合，和(b)清洗溶液或用于制备清洗溶液的说明书，其中吸附剂和清洗溶液的组合允许检测CD8。在其它实施方式中，本文提供的试剂盒可用于治疗与存在CD8相关的病症。

在某些实施方式中，试剂盒可以还包含以标签形式或以单独插页形式的针对合适的操作参数的说明书。例如，试剂盒可以具有通知消费者/试剂盒使用者在将血浆样品或其它组织样品与探针接触后如何清洗探针的标准说明书。

在某些实施方式中，试剂盒包含(a)特异性结合CD8的一种或多种捕获剂；和(b)检测试剂。这样的试剂盒可以由本文所述的材料制备。

本文提供的试剂盒可以任选地包含标准或对照信息和/或对照量的材料，从而可以将测试样品与对照信息标准和/或对照量进行比较以确定在样本中检测到的CD8测试量是否具有与特定病症的诊断结果一致的量。

附图说明

图1示出源自CD8蛋白的表位。(A)人类CD8αα-pMHC复合物(PDB ID:1AKJ)的晶体结构，以紫色突出显示表位。以红色/橙色显示一个CD8α单体，而以蓝色显示另一个单体。HLA-A2/肽(pMHC)以绿色和黄色表示。(B)经设计的CD8α表位的序列。在加括号的氨基酸位置处取代有叠氮手柄(Az4)。

图2示出制备用于MALDI-TOF/TOF测序的环肽击中物(cyclic peptide hit)的流程图。(1)以H₂N-Pra-Cy(XXXXX-点击)-Met-TG形式的***环化的击中珠粒。(2)第1次手动Edman降解步骤后的珠粒。(3)第2次手动Edman降解步骤后的珠粒。所得的线性ATZ-肽具有与MALDI-TOF/TOF测序相兼容的形式。

图3示出生物素-PEG₃-Cy(wplrf)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(wplrf)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为16nM。类似测定的生物素化单克隆抗体(MA1-19484，Life Technologies)示出相似的结合亲和力(EC₅₀≈60nM)。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(wplrf)的人类CD8α蛋白的点ELISA(Point ELISA)。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(wplrf)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图4示出生物素-PEG₃-Cy(AKYRG)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(AKYRG)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为11nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(AKYRG)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(AKYRG)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图5示出生物素-PEG₃-Cy(rwfnv)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(rwfnv)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为62nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(rwfnv)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(rwfnv)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图6示出生物素-PEG₃-Cy(ffrly)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(ffrly)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为56nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(ffrly)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(ffrly)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图7示出生物素-PEG₃-Cy(PWTHG)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(PWTHG)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为8nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(PWTHG)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(PWTHG)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图8示出生物素-PEG₃-Cy(yGGvr)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(yGGvr)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为10nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(yGGvr)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(yGGvr)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图9示出生物素-PEG₃-Cy(slrfG)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(slrfG)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为20nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(slrfG)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(slrfG)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图10示出生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(HGRGH)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为6nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(HGRGH)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图11示出生物素-PEG₃-Cy(wsvnv)大环化合物的体外表征。(A)质谱分析。(B)对于针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(wsvnv)的人类CD8α蛋白，夹心ELISA产生的EC₅₀值为9nM。(C)在0％、10％、50％和100％人血清中的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(wsvnv)的人类CD8α蛋白的点ELISA。(D)在用蛋白酶胰蛋白酶处理(在37℃下1小时)之前和之后的针对生物素-PEG₃-修饰的Cy(wsvnv)的人类CD8α蛋白的点ELISA。

图12示出与CD8表位1和2结合的大环化合物的取向。(A)将His标记的CD8表位1合成为序列中N-末端至点击手柄(R10)的位置含有聚甘氨酸取代和序列中C-末端至点击手柄(R10)的位置含有聚甘氨酸取代。(B)类似地，将His标记的CD8表位2合成为N-末端至K58含有聚甘氨酸取代和C-末端至K58含有聚甘氨酸取代。甘氨酸残基以斜体显示。(C)针对大环肽配体的His标记的CD8表位的点ELISA证明与每个表位内的特定区域优先结合。

图13示出与CD8α晶体结构(PDB ID:1AKJ)重叠的大环化合物结合取向的概述。发现四个PCC(Cy(AKYRG)、Cy(wplrf)、Cy(ffrly)和Cy(rwfnv))与CD8表位1的N端结合。发现三个PCC(Cy(PWTHG)、Cy(yGGvr)和Cy(slrfG))与CD8表位2的N端结合。发现两个PCC(Cy(HGRGH)和Cy(wsvnv))与CD8表位2的C端结合。星号(*)表示合成表位中的叠氮化物手柄(Az4)的位置。

图14描绘了CD8α的3-D结构示意图。CD8表位1-2的序列与代表性靶向表位的大环化合物重叠(Tz＝***)。用黄色线表示两个表位之间测量的距离

在单体CD8α蛋白中，序列AAEGLD(CD8表位2的C端中)和序列RVSPLD(CD8表位1的N端中)之间的距离为

使用其长度与蛋白质上两个结合位点之间距离类似的接头，可以合成含有靶向两个CD8表位中的每一个的PCC大环化合物的双配体。PDB ID:1AKJ。

图15示出具有用于连接两个大环化合物的PEG接头(8.8至

的范围)的协同双配体候选物的常规结构。(A)生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG₁-Cy(Epi1N PCC)

(B)生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG₂-Cy(Epi1N PCC)

(C)生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG₃-Cy(Epi1N PCC)

(D)生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG₄-Cy(Epi1N PCC)

(E)生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG₅-Cy(Epi1N PCC)

(F)生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG₈-Cy(Epi1N PCC)

大环化合物Epi2C PCC和Epi1N PCC中的氨基酸侧链分别显示为R₁-R₅和R₆-R₁₀。

图16描绘了用连接两个大环化合物的氨基酸接头(长度范围为0至5个D-氨基酸)的协同双配体筛选的常规方案。CD8α蛋白通过使反应性叠氮化物基团(来自Epi2C PCC＝L2)和炔烃基团(来自Epi1N PCC＝L1)紧密接近来模拟引导靶标的双配体合成。

图17示出利用协同性与CD8特异性结合的PCC双配体。针对生物素-PEG₃-修饰的双配体的人类CD8α蛋白的夹心ELISA证明，长度最接近

的接头(PEG₅)产生最佳的结合物(～10倍)。双配体具有生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG_x-Cy(wplrf)的形式(x＝3至7)。生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(wplrf)显示出针对CD8的EC₅₀值为200pM，其表示相对于各自的PCC大环化合物配体在亲和力上改善>30倍。

图18示出利用协同性与CD8特异性结合的其它PCC双配体。以CD8ELISA测试生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG_x-Cy(AKYRG)形式的双配体(x＝5至6)。获得的针对CD8的双配体的EC₅₀值为25pM，表明PEG₅和PEG₆均能够有效地桥接CD8表位2的C端和CD8表位1的N端之间的距离

这表示相对于各自的PCC大环化合物配体在亲和力上改善>200倍。

图19示出示例性说明协同性的双配体的结合测定。(A)双配体Cy(Ghtwp)-Lys(生物素)-PEG₁-Cy(hGrGh)显示出针对CD8的EC₅₀值为58pM。(B)生物素-PEG₃-Cy(PWTHG)-PEG_x-Cy(AKYRG)(x＝4至6)双配体显示出针对CD8的EC₅₀值为6pM。

图20示出双配体的细胞结合测定。(A)Alexa Fluor 488标记的双配体Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(AKYRG)的化学结构。(B)用CD3-APC mAb(pan T细胞标志物)和Alexa Fluor 488标记的Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(AKYRG)染色的人类PBMC的流式细胞术。在Q2和Q4中的细胞群是由双配体检测到的CD8⁺。(C)用CD3-APC mAb和CD8-FITC mAb(克隆：RPA-T8)染色的人类PBMC的流式细胞术，作为对照。AF488＝Alexa Fluor 488。APC＝别藻蓝素。FITC＝异硫氰酸酯荧光素。

图21示出通过ELISA测量的针对人类CD8α蛋白(黑色)和鼠CD8α蛋白(灰色)的抗-人类CD8α大环锚的结合亲和力。

图22示出用[¹⁸F]FB对氨氧基-PCC(大环锚和双配体)进行¹⁸F标记。

图23示出正常小鼠中CD8大环锚的生物分布。(A)[¹⁸F]FB标记的锚Cy(AKYRG)的化学结构。(B)随时间推移C57BL/6小鼠的[¹⁸F]FB标记的Cy(AKYRG)小动物PET/CT扫描。冠状MIP图像表示在被扫描的5只小鼠中所观察到的生物分布。％ID/g＝每克组织的注射剂量百分数；H＝心脏；G＝胆囊；K＝肾脏；B＝膀胱。(C)PET测量值，随时间推移在器官中的总注射剂量的平均百分数。MIP＝最大强度投影。

图24示出正常小鼠中CD8大环锚的生物分布。(A)[¹⁸F]FB标记的锚Cy(HGRGH)的化学结构。(B)随时间推移C57BL/6小鼠的[¹⁸F]FB标记的Cy(HGRGH)小动物PET/CT扫描。冠状MIP图像表示在被扫描的5只小鼠中所观察到的生物分布。％ID/g＝每克组织的注射剂量百分数；H＝心脏；K＝肾脏；I＝肠；B＝膀胱。(C)PET测量值，随时间推移在器官中的总注射剂量的平均百分数。MIP＝最大强度投影。

图25示出正常小鼠中CD8大环锚的生物分布。(A)[¹⁸F]FB标记的锚Cy(wplrf)的化学结构。(B)随时间推移C57BL/6小鼠的[¹⁸F]FB标记的Cy(wplrf)小动物PET/CT扫描。冠状MIP图像表示在被扫描的5只小鼠中所观察到的生物分布。％ID/g＝每克组织的注射剂量百分数；L＝肝脏；；I＝肠；B＝膀胱。(C)PET测量值，随时间推移在器官中的总注射剂量的平均百分数。MIP＝最大强度投影。

图26示出正常小鼠中[¹⁸F]FB的生物分布。(A)随着时间推移的C57BL/6小鼠的[¹⁸F]FB小动物PET/CT扫描。冠状MIP图像表示在被扫描的2只小鼠中所观察到的生物分布。％ID/g＝每克组织的注射剂量百分数；K＝肾脏；B＝膀胱。(B)PET测量值，随时间推移在器官中的总注射剂量的平均百分数。MIP＝最大强度投影。

图27示出正常小鼠中CD8双配体的生物分布。(A)[¹⁸F]FB标记的双配体Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(wplrf)的化学结构。(B)随时间推移C57BL/6小鼠的[¹⁸F]FB标记的Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(wplrf)小动物PET/CT扫描。冠状MIP图像表示在被扫描的2只小鼠中所观察到的生物分布。％ID/g＝每克组织的注射剂量百分数；L＝肝脏；K＝肾脏；B＝膀胱。(C)PET测量值，随时间推移在器官中的总注射剂量的平均百分数。MIP＝最大强度投影。

图28示出用于开发一组针对蛋白靶标的PCC结合物的起始点。

图29示出与两个不同位点结合的PCC。

图30示出最佳接头长度的估计。

具体实施方式

本发明的以下描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。因此，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以做出各种等同、改变和修改，并且应该理解，本文包括这些等效实施方式。

除非上下文另有要求，否则贯穿整个说明书和权利要求书，单词“包含(comprise)”及其变体，例如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应被解释为开放式包含性意义，即“包括但不限于”。

贯穿整个说明书所涉及的“一个实施方式(one embodiment)”或“实施方式(anembodiment)”是指结合实施方式描述的特定的特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方式中。因此，贯穿整个说明书各处出现的短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”不一定都指同一个实施方式。此外，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施方式中。

本公开还意图涵盖所有药学上可接受的已公开的捕获剂，所有药学上可接受的已公开的捕获剂通过使一个或多个原子被具有不同原子量或质量数的原子代替而被同位素标记。可以引入到所公开化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，例如分别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl、¹²³I和¹²⁵I。这些放射性标记的化合物可用于通过表征例如作用位点或作用模式或与药理学重要作用位点的结合亲和力来帮助确定或测量化合物的有效性。所公开的某些同位素标记的捕获剂，例如那些引入放射性同位素的捕获剂可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚(即³H)和碳-14(即¹⁴C)鉴于其易于引入和便于检测的方式而对此目的特别有用。

用较重的同位素例如氘(即²H)进行取代可以提供由更强代谢稳定性所产生的某些治疗优势，例如体内半衰期延长或剂量需求降低，因此在某些情况下可能是优选的。

用正电子发射同位素(例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N)进行取代，可用于正电子发射断层摄影(PET)研究，用于检查底物受体占有率。通常可以采用适当的同位素标记的试剂代替之前采用的未标记的试剂，由本领域技术人员已知的常规技术或由与以下所列出的制备和实施例中描述的方法类似的方法来制备同位素标记的捕获剂。

本公开还意图涵盖所公开的捕获剂的体内代谢产物。这些产物可以由将所施用的化合物例如氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等产生，主要是由酶促过程所产生。因此，本发明包括通过以下方法所产生的化合物，该方法包括将本发明化合物施用至哺乳动物，持续足以产生其代谢产物的时间段。通常通过以下方法来确定这种产物：向动物(如大鼠、小鼠、豚鼠、猴)或向人类施用可检测剂量的本发明放射性标记的化合物，允许足够时间以进行代谢，并且从尿液、血液或其它生物样品中分离其转化产物。

“哺乳动物”包括人类以及家畜(例如，实验动物和家庭宠物(如猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔))和非家畜(如野生动物等)两者。

如在本文中所使用的，术语“捕获剂”是指包含两个或更多个结合靶的部分的组合物，并且该组合物通过那些结合靶的部分与靶蛋白特异性结合。每个结合靶的部分单独地或与其它结合靶的部分组合地显示出对靶蛋白的结合亲和力。在某些实施方式中，每个结合靶的部分经由一个或多个非共价相互作用(包括例如氢键、疏水相互作用和范德华相互作用)与靶蛋白结合。捕获剂可以包含一种或多种有机分子，包括例如多肽、肽、多核苷酸和其它非聚合物分子。在一些方面，捕获剂是蛋白质催化的捕获剂(PCC)。

提及“捕获剂”还指其药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。

“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物学效力和性质的那些盐，其不具有生物学或其它方面的不利条件，并且是与无机酸或有机酸一起形成的，无机酸例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，有机酸例如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸(galactaric acid)、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸(mucic acid)、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。

“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物学效力和性质的那些盐，其不具有生物学或其它方面的不利条件。通过向游离酸添加无机碱或有机碱而制备这些盐。来源于无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。来源于有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、环胺和碱性离子交换树脂，例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺(deanol)、2二甲基氨基乙醇、2二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明盐(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星青霉素、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本文所述的捕获剂或其药学上可接受的盐可以含有一个或多个不对称中心，因此可以产生对映异构体、非对映异构体和其它可以根据绝对立体化学(如(R)或(S)或(D)或(L)型氨基酸)所定义的立体异构体形式。本发明意在包括所有这些可能的异构体以及它们的外消旋和光学纯的形式。光学活性(+)和()、(R)和(S)、或(D)和(L)异构体可以利用手性合成子或手性试剂来制备，或采用常规技术(例如色谱法和分步结晶)来拆分。用于单个对映体的制备/分离的常规技术包括采用例如手性高压液相色谱(HPLC)，对外消旋体(或外消旋体的盐或衍生物)的合适的光学纯前体的手性合成。当本文所述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，否则所述化合物旨在包括E和Z几何异构体。同样，所有的互变异构形式也被包括在内。在本文中将(D)-氨基酸(也被称为D-氨基酸)以小写字母表示(例如D-缬氨酸被称为“v”)，而将(L)-氨基酸(在本文中也被称为L-氨基酸)以大写字母表示(例如L-缬氨酸或缬氨酸被称为“V”)。甘氨酸是非手性的，并且被称为“G”。

“立体异构体”是指由相同键键合的相同原子构成、但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本发明设想了多种立体异构体及其混合物，并包括“对映异构体”，该对映异构体指两种分子是彼此不可重叠镜像的立体异构体。

“互变异构体”是指从分子的一个原子到同一分子的另一原子的质子转移。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。

如在本文中所使用的，术语“表位”是指蛋白质(例如，CD8)的独特分子表面。通常，表位是一种多肽，并且其可以作为10至40个氨基酸有限序列以其本身起作用。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指包含氨基酸残基聚合物的氨基酸序列。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物以及它们的异构体。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及稍后被修饰的那些氨基酸(例如，羟脯氨酸、羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸及它们的异构体)。术语“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的碳、羧基基团、氨基基团和R基团(例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。这些类似物具有经过修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。术语“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的常规化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。在本文中可以通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示氨基酸。

如在本文中所使用的，术语“非天然氨基酸”是指在其侧链官能度方面与20种天然存在的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)不同的氨基酸。非天然氨基酸可以是二十种天然氨基酸之一的密切相关的类似物，或者其可以引入完全新的官能度和化学结构，只要非天然氨基酸的疏水性等于或大于天然氨基酸的疏水性。非天然氨基酸可以代替蛋白质中的现有氨基酸(取代)，或者是添加至野生型序列(***)。可以通过已知的化学方法(包括固相肽合成或天然化学连接)或通过生物学方法来实现非天然氨基酸的掺入。

如在本文中所使用的，术语“特异性结合(specific binding)”、“选择性结合(selective binding)”、“选择性地结合(specifically binds)”或“特异性地结合(specifically binds)”是指捕获剂与预先确定的抗原上的表位结合。通常地，捕获剂以约小于10^-7M，例如约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或甚至更低的亲和力(K_D)结合。

如在本文中所使用的，术语“K_D”是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的捕获剂以小于约10^-6M、10^-7M、如小于约10^-8M、10^-9M或10^-10M甚至更低的解离平衡常数(K_D)与CD8结合，例如，采用抗原作为配体和捕获剂作为分析物，利用表面等离子体共振(SPR)技术以Biacore仪器进行测定，并且以相应于结合至非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)(而不是预先确定的抗原或紧密相关的抗原)的亲和力的至少1/10，如至少1/100，例如至少1/1000，如至少1/10,000，例如至少1/100,000的K_D的亲和力与预先确定的抗原结合。亲和力较低的量取决于捕获剂的K_D，因此在捕获剂的K_D非常低(即，捕获剂是高度特异性)时，则抗原的亲和力低于非特异性抗原的亲和力的量可以为至少10,000倍。

如在本文中所使用的，术语“k_d”(sec^-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也被称为k_off值。

如在本文中所使用的，术语“k_a”(M^-1×sec^-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的结合速率常数。

如在本文中所使用的，术语“K_D”(M)是指特定捕获剂-抗原相互作用的解离平衡常数。

如在本文中所使用的，术语“K_A”(M^-1)是指特定捕获剂-抗原相互作用的结合平衡常数，并且通过将k_a除以k_d而获得。

“药物组合物”是指本发明化合物和本领域通常接受用于将生物活性化合物递送至哺乳动物(例如人类)的介质的制剂。因此，这种介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或辅料。

如在本文中所使用的，术语“病症”通常是指疾病、事件或健康状况的变化。健康状况的变化可能与特定疾病或事件相关，在这种情况下，该变化可能与疾病或事件同时发生或在疾病或事件之前发生。在健康状况的变化于疾病或事件之前发生的情况下，健康状况的变化可能作为疾病或事件的预测因素。例如，健康状况的变化可能是与疾病或事件相关的特定基因的表达水平的改变。可替换地，健康状况的变化可能与特定疾病或事件无关。

如在本文中所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”通常是指预防病症或事件、减缓病症的发病或发展速度或延缓事件的发生、降低病症发展或经历事件的风险、预防或延缓与病症或事件相关的症状的发展、减少或终止与病症或事件相关的症状、使病症完全或部分消退、减轻病症或事件的严重性或其某种组合。

如在本文中所使用的，“有效量”或“治疗有效量”指在实现期望治疗结果所需要的剂量和时间段内有效的量。所公开捕获剂的治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及捕获剂在个体内引起期望反应的能力而变化。

在关于捕获剂蛋白质催化的捕获剂或其药物制剂方面，如在本文中使用的术语“稳定的”是指在足够的时间段内保持结构和功能完整性的在本文所述方法中使用的试剂或制剂。

在关于蛋白质催化的捕获剂或捕获剂方面，如在本文中使用的术语“合成的”是指捕获剂是已经通过化学而非生物学方法所产生的。

除非另有说明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值是指采用默认参数利用BLAST 2.0程序集所获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。

如本领域普通技术人员理解的那样，BLAST搜索假设可以将蛋白质建模为随机序列。然而，许多真正的蛋白质包含非随机序列的区域，其可以是均聚段、短周期重复序列或富含一个以上的氨基酸的区域。即使蛋白质的其它区域完全不相同，这类低复杂度区域也可以在不相关的蛋白质之间进行比对。可以采用许多低复杂度过滤程序来减少这种低复杂度比对。例如，可以单独地或组合地使用SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂度过滤器。

如在本文中所使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括对两个序列中的残基的参照，其在指定比较窗口内进行最大对应性比对时是相同的。在有关蛋白质方面使用序列同一性百分数时，认识到不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被替代为具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不改变分子的功能特性。在保守取代中序列相异的情况下，可以将序列同一性百分数上调以校正取代的保守性质。称因这类保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行该调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常包括将保守取代作为部分而不是完全不匹配进行评分，从而增加序列同一性百分数。因此，例如，在相同的氨基酸得分为1且非保守取代得分为零的情况下，保守取代评分为0至1之间。例如，根据Meyers和Miller的算法(Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17(1988))计算保守取代的评分，例如，如以程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，Calif.，USA)实现的。

如在本文中所使用的，“序列同一性百分数”是指通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列而确定的值，其中为了两个序列的最佳比对而与参考序列(其不包括添加或缺失)相比较时，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括添加或缺失(即，间隙)。通过以下计算百分数：确定在两个序列中都出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分数。

多核苷酸序列的术语“基本同一性”或“基本相同”是指采用标准参数、利用所描述的比对程序之一而与参考序列进行比较时，多核苷酸包含的序列具有50-100％序列同一性、优选至少50％序列同一性、优选至少60％序列同一性、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％且最优选至少95％。技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框架定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性通常是指序列同一性在55-100％之间、优选至少55％、优选至少60％、更优选至少70％、80％、90％且最优选至少95％。

在某些实施方式中，如在本文中所使用的，术语“CD8”是指人类CD8。在一些实施方式中，CD8包含以下氨基酸序列中的一种，或与其基本相同的氨基酸序列。

人类CD8α的胞外域序列：

SQFRVSPLDR TWNLGETVEL KCQVLLSNPT SGCSWLFQPR GAAASPTFLL

YLSQNKPKAA EGLDTQRFSG KRLGDTFVLT LSDFRRENEG YYFCSALSNS

IMYFSHFVPV FLPAKPTTTP APRPPTPAPTIASQPLSLRP EACRPAAGGA

VHTRGLDFAC D

小鼠CD8α的胞外域序列：

KPQAPELRIF PKKMDAELGQ KVDLVCEVLG SVSQGCSWLF QNSSSKLPQP

TFVVYMASSH NKITWDEKLN SSKLFSAMRD TNNKYVLTLN KFSKENEGYY

FCSVISNSVM YFSSVVPVLQ KVNSTTTKPV LRTPSPVHPT GTSQPQRPED

CRPRGSVKGT GLDFACDIY

CD8捕获剂的开发

目前抗体是用于诊断平台的默认检测剂。然而，抗体具有一些缺点，包括成本高、稳定性差，并且在许多情况下，缺乏适当的表征且缺乏高特异性。用于诊断测定的理想替代物应该是合成的，在一定范围的热和化学条件下是稳定的，并且对感兴趣的靶标显示出高亲和性和特异性。

高质量的单克隆抗体具有低纳摩尔亲和力和高靶标特异性。有趣的是，抗原识别表面的结构和遗传分析表明，可变环的大部分分子多样性都包含在单个高度可变环(CDR-H3)中。人类的这种环的大小范围为1-35个残基(平均15个)，可以采用广泛的结构构象，并且是与抗原的相互作用的主要原因。其它五个环的差异不明显，并且仅采用少数几种构象。这表明精心选择的“锚”肽可以主导捕获剂与其靶蛋白之间的相互作用的模式和强度。其还表明，虽然其它肽组分对总相互作用能量仅仅提供适度贡献，但它们可以提供重要的支架(scaffold)特征和特异性单元。

原位点击化学是一种将小分子酶抑制剂分离成两个部分，然后使每个部分扩展成一部分含有乙炔官能团而其余含有叠氮基团的小文库的技术。然后酶本身通过选择性地促进乙炔和叠氮基团之间的1,3-偶极环加成形成***键(“点击”反应)，而从这些文库组分中组装“最佳配合”抑制剂。该蛋白质有效地起到通常用于这种偶联的Cu(I)催化剂的极其有选择性的变体的作用。该酶仅在以正确方向与蛋白质结合的那些文库组分之间促进点击反应。相对于基于两个文库所形成的初始抑制剂，所得到的抑制剂可表现出远远优异的亲和特性。

顺序原位点击化学延伸了原位点击化学概念，以使得能够发现多配体捕获剂(参见USSN 20100009896，通过引用并入本文)。以前使用该方法以产生针对模型蛋白质碳酸酐酶II(CAII)的三配体捕获剂。顺序原位点击化学具有一些优点。首先，将有关蛋白质靶标的结构信息替换为采集非常大的化学空间以确定捕获剂的配体组分的能力。例如，可以通过针对大型(>10⁶个单元)的单珠-单化合物(OBOC)肽文库筛选蛋白质来确定初始配体，其中肽本身可以由天然的、非天然的和/或人造氨基酸组成。然后将所得锚定配体用于原位点击筛选，再次使用大型OBOC文库来确定双配体结合物。第二个优点是，可以重复该过程，使得将双配体用作锚以识别三配体，等等。然后可以使用相对简单且大部分自动化的化学方法来扩大最终的捕获剂，并且可以用如生物素基团的标记物作为其结构的固有部分来进行开发。这种方法允许探索支化、环状和线性的捕获剂体系结构。虽然已经描述了用于蛋白质指导的多配体组装的许多策略，但是大多数需要有关靶标的详细结构信息来指导筛选策略，并且针对低多样性的小分子文库，优化了大多数策略(如，原始的原位点击方法)。

本发明的实施方式还概括了原位点击应用以利用原位点击而以质朴的方式寻找锚配体。在先前的方法中，需要已知的结合物来着手配体。本方法提供了从头开始寻找锚配体的机制。

如在本文中所述的，利用迭代原位点击化学方法来合成与CD8特异性结合的双配体捕获剂。这种原位点击化学方法包括两个步骤。首先，寻找在不同但相对接近的位点与CD8结合的两个“锚”配体。其次，寻找大小适当的结合这两种配体的接头，从而生产对CD8具有更高亲和力的捕获剂。

通过本文公开的方法所生产的捕获剂被发现表现出对CD8具有结合亲和力。捕获剂显示为在ELISA测定中同时作为捕获剂和检测剂发挥作用，并有效地免疫沉淀CD8。

CD8捕获剂

一方面，本文提供了特异性结合CD8的稳定的合成捕获剂，其中捕获剂包含两个或更多个“锚”配体(在本文中也被简称为“配体”)和接头，其中配体与CD8选择性结合。

在某些实施方式中，配体包含一种或多种多肽或肽。在这些实施方式的一些实施方式中，结合靶的部分包含一种或多种肽，所述肽包含D-氨基酸、L-氨基酸和/或被官能团取代的氨基酸，所述官能团选自由取代的和未取代的烷基、取代的和未取代的叠氮基、取代的和未取代的炔基、取代的和未取代的生物素基、取代的和未取代的氮杂烷基、取代的和未取代的聚乙二醇、和取代的和未取代的1,2,3-***所组成的组。

在某些实施方式中，配体通过接头经由共价键相互连接。在这些实施方式的一些实施方式中，配体和接头经由酰胺键或如下所示的1,4-二取代-1,2,3-***键相互连接：

1,4-二取代-1,2,3-***键。

在那些其中经由1,4-二取代的-1,2,3-***键将配体和接头相互连接的实施方式中，1,4-二取代的-1,2,3-***键可以由Cu-催化的叠氮化物/炔烃环加成反应(CuAAC)形成。

在某些实施方式中，配体和接头通过具有以下结构的Tz4键互相连接：

在某些实施方式中，配体和接头通过具有以下结构的Tz5键互相连接：

在那些其中经由酰胺键将一个或多个配体和接头互相连接的实施方式中，可以通过在偶联剂(例如，O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、N-羟基-7-氮杂-苯并***(HOAt)或二异丙基乙胺(DIEA)的DMF溶液)的存在下将羧酸基团和胺基团偶联而形成酰胺键。

在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在一定范围的反应条件和/或储存时间内是稳定的。如在本文中所使用的“稳定的”捕获剂保持与靶蛋白特异性结合的能力。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在一种或多种反应和/或储存条件下比与相同靶蛋白结合的抗体更稳定。例如，在某些实施方式中，本文提供的捕获剂比结合相同靶蛋白的抗体更能抵抗蛋白质水解性降解。

在某些实施方式中，本文提供的捕获剂具有大于六个月的保质期，这意味着它们在超过六个月的储存内是稳定的。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂的保质期为一年以上、两年以上或超过三年。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂作为冻干粉末储存。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂的保质期比结合相同靶蛋白的抗体的保质期更长。

在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在约-80°至约120℃的温度范围内是稳定的。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂在以下温度范围内是稳定的：-80°至-40℃；-40°至-20℃；-20°至0℃；0°至20℃；20°至40℃；40°至60℃；60°至80℃；和/或80℃至120℃。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在较宽的温度范围内比结合相同靶蛋白的抗体更稳定，和/或在特定温度下比结合相同靶蛋白的抗体能够在更长时间段内保持稳定。

在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在约3.0至约8.0的pH范围内是稳定的。在某些实施方式中，该范围是约4.0至约7.0。在某些实施方式中，该范围是约7.0至约8.0。

在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在人血清中稳定超过12小时。在这些实施方式的某些实施方式中，捕获剂在人血清中稳定超过18小时、超过24小时、超过36小时或超过48小时。在某些实施方式中，本文提供的捕获剂在人血清中比结合相同靶蛋白的抗体稳定更长的时间段。在某些实施方式中，捕获剂在约60℃的温度下以粉末形式稳定两个月。

在某些实施方式中，本文提供的捕获剂可以包含一种或多种检测标记物，包括例如生物素、铜-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(铜-DOTA)、⁶⁴Cu DOTA、⁶⁸GaDOTA、¹⁸F、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁹Zr、¹²⁴I、⁸⁶Y、^94mTc、^110mIn、¹¹C、⁷⁶Br、¹²³I、¹³¹I、⁶⁷Ga、¹¹¹In和^99mTc或其它放射性标记产物，其它放射性标记产物可以包括γ发射体、质子发射体、正电子发射体、氚或通过其它方法可检测到的覆盖标签(即钆)等。在特定的实施方式中，检测标记物是¹⁸F。在某些实施方式中，可以将捕获剂修饰以作为成像剂使用。成像剂可以作为诊断剂使用。

在某些实施方式中，可以将本文提供的捕获剂修饰以获得所需的化学或生物学活性。所需的化学或生物活性的实例包括但不限于改善的溶解度、稳定性、生物利用度、可检测性或反应性。可以引入至捕获剂的特定修饰的实例包括但不限于通过形成二硫键使捕获剂环化；用其它官能团或分子修饰捕获剂。类似地，可以合成捕获剂以结合蛋白质上的非典型或非生物的表位，从而增加其通用性。在某些实施方式中，可以通过在偶联反应之前修饰结合靶的部分的合成嵌段来修饰捕获剂。

特性

在某些实施方式中，本文提供的CD8捕获剂在较宽的温度、pH值、储存时间、储存条件和反应条件范围内是稳定的，并且在某些实施方式中，捕获剂比可比较的抗体或生物制剂更加稳定。在某些实施方式中，捕获剂作为冻干粉末储存是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在约-80℃至约60℃的温度下储存是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在室温下是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在人血清中稳定至少24小时。在某些实施方式中，捕获剂在约3至约12的pH范围内是稳定的。在某些实施方式中，捕获剂在约60℃的温度下作为粉末在两个月内是稳定的。

制备/筛选捕获剂的方法

本文在某些实施方式中提供了筛选结合靶的部分和/或制备包含这些结合靶的部分的捕获剂的方法。用于筛选结合靶的部分和/或制备包含这些结合靶的部分的捕获剂的方法也可以出现在国际公开号WO 2012/106671、WO 2013/033561、WO 2013/009869和WO2014/074907中，其中的每一个通过引用将其全部内容并入本文。

在某些实施方式中，将结合相同蛋白质(靶标)的两个不同区域的两个单独识别的配体以化学方式连接在一起来形成双配体。通过优化两个配体的接头，由配体和接头形成的双配体可以显示出远优于任一个配体的结合亲和力。这种增强的结合效应被称为结合协同性。对于理想的协同结合物，各个配体与靶标的热力学结合能会加和而产生相连双配体的结合能。这意味着相连双配体的结合亲和常数(K_D)将是各个配体的结合亲和力的乘积(即，K_D＝K_D1×K_D2，其中下标1和2是指两个配体)。在实践中，如果有的话，完全协同的结合很少实现。因此，相连双配体的特性与全协同结合物的特性之间的比较可以提供两种配体如何最佳连接的度量。

如果蛋白质靶标具有已知的且明确定义的三级(折叠)结构，则这种靶向方法的关键方面涉及确定与蛋白质优选区域结合的配体的策略，随后确定优化接头的方法的策略。如果蛋白质没有明确的三级结构，则该公开描述了旨在仍实现双配体协同结合的重要度量的策略。

图28描述了开发一套针对蛋白质靶标(11)的PCC结合物的起始点。初始目标是确定出与蛋白质靶标上的一个表位(12)结合的一个或多个PCC，和与第二表位(13)结合的一个或多个不同的PCC。与第三表位、第四表位等表位结合的其它PCC也可能是有用的。靶向表位的PCC方法教导了这可以通过筛选针对合成表位(SynEp)的肽文库来实现，如图28所示的合成表位(14，15)。SynEp是具有天然存在靶表位序列的多肽，不同之处在于一个位置含有呈现叠氮或乙炔化学基团(被称为点击手柄)的人工氨基酸(16)。SynEp被进一步修饰成包含测定手柄，例如在N-末端或C-末端的生物素基团(17)。筛选过程可以使用本文公开的或本领域已知的任何过程完成。通过筛选，可以确定出靶标上至少两个表位中的每一个的至少一种独特的肽结合物。通过针对完整蛋白质靶标(11)以及针对SynEps进行结合测定来验证这些肽结合物。对于这些结合测定，用天然存在的残基代替点击手柄(16)来制备SynEp。

理想地，不同配体结合的靶蛋白质的不同区域在三级蛋白质结构中会相对接近在一起(几纳米或更小)。即使是单个SynEp，筛选也可以产生与两个不同位点结合的PCC。在图29中，相对于完整蛋白质(11)的暗淡背景，将代表感兴趣表位(12)的区域突出显示出来。用星号(22)表示在SynEp结构中被替换为点击手柄的氨基酸残基。在SynEp筛选步骤中，可以同时确定出与表位的N-末端侧(23)或C-末端侧(24)结合的PCC。

一旦确定了靶向表位的PCC，那就有几种选择接头的方法。

在第一个实施方式中，如果蛋白质的折叠结构是已知的，并且如果PCC结合到该折叠结构上，则可以利用该信息以及哪些PCC结合哪些表位的知识来评估最佳接头长度。这在图30中示出。该图示出了结合一个表位(12)N侧的一个PCC(31)和结合第二表位(13)C侧的第二PCC(32)。将这种结合排列与来自例如蛋白质数据库的蛋白质的结构一起进行分析允许估计最佳接头(33)的长度。这种估计可以将候选接头的选择缩小到非常小的数目。在一个实例中，可以利用这类长度估计来选择一种或两种长度匹配的聚乙二醇低聚物以用于测试。最佳的接头(34)是使双配体亲和力与全协同结合物的亲和力最接近的接头。

在第二个实施方式中，如果蛋白质的折叠结构未知，或者如果蛋白质仅仅没有明确的折叠结构，则利用尽可能多的可用信息来确定候选接头分子文库的组成。然后对该文库进行筛选以确定出最佳的接头。

在第三个实施方式中，如果蛋白质的折叠结构未知，或者如果蛋白质仅仅没有明确的折叠结构，则利用现有的蛋白质知识，只需选择接头来连接两个PCC。即使以这种方法未确定出优化的全协同结合物，但由于协同效应，相连的双配体基本上肯定会优于这两种单配体中的任一种。

体外

为了检测溶液中的CD8，可以可检测地标记本发明的捕获剂，然后将其与溶液接触，之后可以检测到捕获剂与CD8靶标之间形成复合物。作为实例，荧光标记的捕获剂可用于体外CD8检测测定，其中在允许发生结合的条件下，将捕获剂加入至待测试CD8的溶液中。可以对荧光标记的捕获剂与CD8靶标的复合物进行检测和定量，例如通过测量相对于游离肽由结合复合物的肽所产生的增强的荧光偏振。

可替换地，可以使用夹心型“ELISA”测定法，其中将捕获剂固定到固体支持物(如塑料管或孔)上，然后将疑似含有CD8的溶液与固定化的结合部分接触，将未结合的物质洗涤掉，并使用用于识别CD8的合适的检测试剂检测复合多肽。

为了检测或纯化溶液中的可溶性CD8，可以将本发明的捕获剂固定到固体基质(如，色谱载体)或其它基质材料上，然后可以在适合形成捕获剂/CD8复合物的条件下，加载固定化的结合物或将其与溶液接触。可以去除溶液中的非结合部分，并且可以例如使用抗CD8抗体或抗结合多肽抗体检测复合物，或者可以在适当的洗脱条件下，从结合部分释放出CD8。

体内诊断成像

本发明捕获剂的特别优选的用途是用于创建生物流体(例如，如人血清)中的CD8或表达CD8的细胞的视觉可读图像。可以通过将捕获剂与适合用于诊断检测的标记物缀合而将本文公开的CD8捕获剂转化为成像试剂。优选地，将表现出针对CD8比针对其它血清蛋白质更高特异性的捕获剂缀合或连接至适合用于待使用的检测方法的标记物。例如，捕获剂可以与或不与接头缀合成适合用于磁共振成像(MRI)的顺磁性螯合物，捕获剂可以与适合用于x射线、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)或闪烁照相成像(包括用于放射性金属的螯合剂)的放射性标记物缀合，捕获剂可以与适合用于超声检测的超声造影剂(例如，稳定的微泡、微珠、微球或被称为气体填充的“脂质体”)缀合，或者捕获剂可以与光学成像染料缀合。

在另一个实施方式中，不是用可检测的标记物或放射治疗的构建体直接标记捕获剂，而是可以将本发明的一种或多种肽或构建体与例如结合可检测的标记物或放射治疗物的亲和素、生物素或抗体或抗体片段缀合。

A、磁共振成像

本文所述的CD8捕获剂可以有利地与顺磁性金属螯合物缀合，以便形成用于MRI的造影剂。

优选的顺磁性金属离子的原子序数为21-29、42、44或57-83。这包括具有一个、更优选五个或更多个不成对电子和至少1.7个玻尔磁子的磁矩的过渡金属或镧系元素的离子。优选的顺磁性金属包括但不限于铬(III)、锰(II)、锰(III)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、铕(III)和镱(III)、铬(III)、铁(III)和钆(III)。由于三价阳离子Gd³⁺的弛豫性高和毒性低，特别优选其以用于MRI造影剂，其另外的优点是其仅存在于一种生物可及的氧化态，这将患者不期望的金属代谢分解最小化。另一种有用的金属是相对便宜的Cr³⁺。Gd(III)螯合物是自从1988年以来一直被用于临床和放射学MR应用，约30％的MRI检查目前使用钆基造影剂。

顺磁性金属螯合剂是具有一个或多个极性基团的分子，所述极性基团充当顺磁性金属的配体，并且与顺磁性金属复合。合适的螯合剂在本领域中是已知的，并且包括具有亚甲基膦酸基团、亚甲基碳酸羟胺酸(methylene carbohydroxamine acid)基团、羧基亚乙基基团或羧基亚甲基基团的酸。螯合剂的实例包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环-十四烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1-取代的1,4,7-三羧甲基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(DO3A)、乙二胺四乙酸(EDTA)和1,4,8,11-四-氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)。另外的螯合配体是亚乙基双-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-CI-EHPG、5-Br-EHPG、5-甲基-EHPG、5-叔丁基-EHPG和5-仲丁基-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基DTPA；双-2(羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；包含至少3个碳原子、更优选至少6个碳原子和至少两个杂原子(O和/或N)的大环化合物类，该大环化合物可以由在杂环元素处连接起来的一个环或两个或三个环组成，例如，苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA(其中NOTA是1,4,7-三氮杂环壬烷N,N',N”-三乙酸)、苯并-TETA、苯并-DOTMA(其中DOTMA是1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-四(甲基四乙酸))和苯并-TETMA(其中TETMA是1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-(甲基四乙酸))；1,3-亚丙基-二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTNA)的衍生物；1,5,10-N,N',N”-三(2,3-二羟基苯甲酰基)-三儿茶酚酯(LICAM)的衍生物；和1,3,5-N,N',N”-三(2,3-二羟基苯甲酰基)氨基甲基苯(MECAM)。用于本发明的优选螯合剂是DTPA，特别优选地使用DO3A。本发明考虑的代表性螯合剂和螯合基团的实例在WO 98/18496、WO 86/06605、WO 91/03200、WO 95/28179、WO96/23526、WO 97/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182和美国专利第4,899,755号、美国专利第5,474,756号、美国专利第5,846,519号以及美国专利第6,143,274号中进行了描述，通过引用将其全部并入。

根据本发明，MRI造影剂的螯合剂与CD8捕获剂偶联。应选择螯合物的定位，以免干扰CD8捕获剂的结合亲和力或特异性。螯合物也可以附着在捕获剂上的任何位置。

通常，CD8捕获剂可以直接地或共价地结合到金属螯合物(或其它可检测的标记物)上，或者可以使用接头偶联或缀合到金属螯合剂，该接头可以但不限于是酰胺、脲、缩醛、缩酮、双酯、羰基、氨基甲酸酯、硫脲、砜、硫酯、酯、醚、二硫化物、内酯、亚胺、磷酰基或磷酸二酯键；取代或未取代的饱和或不饱和烷基链；单个氨基酸或不同氨基酸的线性、支化或环状的氨基酸链(例如，CD8结合部分的N-末端或C-末端的延伸)；衍生化或未衍生的聚乙二醇(PEG)、聚氧化乙烯或聚乙烯吡啶链；取代或未取代的聚酰胺链；衍生化或未衍生的多胺、聚酯、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸酯、聚(乙烯醇)、聚甘油或寡糖(例如，葡聚糖)链；交替的嵌段共聚物；丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和庚二酸；己酸；简单的二胺和二醇；本文公开的任何其它接头；或本领域已知的任何其它简单的聚合物接头(参见，例如WO 98/18497和WO98/18496)。优选地，可以严格控制接头的分子量。分子量可以在小于100到大于1000的范围内。优选地，接头的分子量小于100。此外，可以期望地利用在体内可生物降解的接头，为本发明的成像试剂提供有效的***途径。根据这种可生物降解的官能团在接头内的位置，它们可以包括酯、双酯、酰胺、磷酸酯、醚、缩醛和缩酮官能团。

通常，已知的方法可用于利用这类接头(WO 95/28967、WO 98/18496、WO 98/18497及其中的讨论)来偶联金属螯合物和CD8捕获剂。可以通过N-末端或C-末端经由酰胺键将结合CD8的部分连接至例如金属螯合物的金属配位骨架氮或金属螯合物本身的乙酸酯臂上。本公开考虑了螯合物在任何位置的连接，条件是金属螯合物保持紧密结合金属以最小化毒性的能力。

根据本文公开内容制备的MRI造影剂可以以与常规MRI造影剂相同的方式使用。可以优选某些MR技术和脉冲序列来增强位点与背景血液和组织的对比度。这些技术包括(但不限于)，例如，试图使血液变暗的黑血管造影术序列，例如快速自旋回波序列(Alexander,A.等人,1998.Magn.Reson.Med.,40:298-310)和流动扰相梯度回波序列(Edelman,R.等人,1990.Radiology,177:45-50)。这些方法还包括增强对比度差异的流动独立技术，如反转恢复制备的序列或饱和恢复制备的序列，其将增加表达CD8的组织和背景组织之间的对比度。最后，磁化转移制剂也可以改善与这些试剂的对比度(Goodrich,K.等人,1996.Invest.Radia,31:323-32)。

将标记的试剂以可注射组合物的形式向患者施用。施用MRI造影剂的方法优选肠道外给药，意指静脉内给药、动脉内给药、鞘内给药、间质给药或腔内给药。为了使表达CD8的组织(例如肿瘤)成像，静脉内给药或动脉内给药是优选的。对于MRI，预期受试者将接受足以将在CD8表达位点处的MR信号增强至少10％的造影剂剂量。注射含有CD8捕获剂的MRI试剂后，以MRI机器扫描患者以确定任何CD8表达位点的位置。在治疗性设置中，一旦识别CD8表达位点(例如，流体或组织)时，如果需要，可以立即施用抗癌剂(例如，CD8的抑制剂)，并可以随后扫描患者以将病毒载量可视化。

B、核成像(放射性核素成像)和放射治疗

本发明的CD8捕获剂可以与适合用于闪烁成像、SPECT或PET成像的放射性核素报道分子和/或与适合用于放射治疗的放射性核素缀合。其中CD8捕获剂与用于诊断成像的放射性核素螯合剂和用于放射治疗的螯合剂两者缀合的构建体均属于本发明的范围内。

为了用作PET剂，所公开的捕获剂可以与各种正电子发射金属离子(例如，⁵¹Mn、⁵²Fe、⁶⁰Cu、⁶⁸Ga、⁷²As、⁹⁴mTc或¹¹⁰In)之一复合。本发明的结合部分还可以通过利用放射性核素(例如，¹⁸F、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、⁷⁷Br和⁷⁶Br)的卤化作用进行标记。用于闪烁成像或放射疗法的优选的金属放射性核素包括^99mTc、⁵¹Cr、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴⁷Sc、⁵¹Cr、¹⁶⁷Tm、¹⁴¹Ce、¹¹¹In、¹⁶⁸Yb、¹⁷⁵Yb、¹⁴⁰La、⁹⁰Y、⁸⁸Y、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²⁰³Pb、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹⁴Bi、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹⁷mSn、¹⁴⁹Pm、¹⁶¹Tb、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁸Au和¹⁹⁹Au。将根据所需的治疗或诊断应用来确定所选择的金属。例如，为了诊断目的，优选的放射性核素包括⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc和¹¹¹In。为了治疗目的，优选的放射性核素包括⁶⁴Cu、⁹⁰Y、¹⁰⁵Rh、¹¹¹In、¹¹⁷mSn、¹⁴⁹Pm、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Ln、^186/188Re和¹⁹⁹Au。^99mTc由于其低成本、可用性、成像特性和高比活度而对诊断应用非常有用。^99mTc的核和放射性质使该同位素成为理想的闪烁成像剂。该同位素具有140keV的单光子能量和约6小时的放射性半衰期，并且容易从⁹⁹Mo-^99mTc发生器获得。¹⁸F、4-[¹⁸F]氟苯甲醛(¹⁸FB)、Al[¹⁸F]-NOTA、⁶⁸Ga-DOTA和⁶⁸Ga-NOTA是用于与用于诊断成像的CD8捕获剂缀合的典型放射性核素。

可以通过以下来螯合金属放射性核素，例如直链的大环三联吡啶和N₃S、N₂S₂或N₄螯合剂(还参见美国专利第5,367,080号、美国专利第5,364,613号、美国专利第5,021,556号、美国专利第5,075,099号，美国专利第5,886,142号)和本领域已知的其它螯合剂，包括但不限于HYNIC、DTPA、EDTA、DOTA、DO3A、TETA、NOTA和二氨基双硫醇(BAT)螯合剂(还参见美国专利第5,720,934号)。例如，在美国专利第6,143,274号；美国专利第6,093,382号；美国专利第5,608,110号；美国专利第5,665,329号；美国专利第5,656,254号；和美国专利第5,688,487号中描述了N₄螯合剂。在PCT/CA94/00395、PCT/CA94/00479、PCT/CA95/00249和美国专利第5,662,885号；美国专利第5,976,495号；和美国专利第5,780,006号中描述了某些N₃S螯合剂。螯合剂还可以包括螯合配体巯基-乙酰基-乙酰基-甘氨酰-甘氨酸(MAG3)的衍生物，其含有N₃S、N₂S₂体系例如MAMA(单酰胺单氨基二硫醇)、DADS(N₂S二胺二硫醇)、CODADS等。在例如Liu,S和Edwards,D.,1999.Chem.Rev.,99:2235-2268及其中的参考文献中描述了这些配体体系和多种其它体系。

螯合剂还可以包括含有并不以四齿阵列形式提供至金属的配体原子的复合物。这些螯合剂包括锝和铼二肟的硼酸加合物，例如在美国专利第5,183,653号；美国专利第5,387,409号；和美国专利第5,118,797号中描述的，其公开内容通过引用以整体并入本文。

如前所述，螯合剂可以通过接头直接与CD8捕获剂共价连接，然后直接用所选择的放射性金属进行标记(参见WO 98/52618、美国专利第5,879,658号和美国专利第5,849,261号)。

包括¹⁸F、4-[¹⁸F]氟苯甲醛(¹⁸FB)、Al[¹⁸F]-NOTA、⁶⁸Ga-DOTA和⁶⁸Ga-NOTA的CD8捕获剂对于诊断成像是优选的。放射性锝复合物也可用于诊断成像，放射性铼复合物对放射性治疗特别有用。在利用本发明试剂形成放射性锝复合物时，锝复合物(优选^99mTc高锝酸盐)在还原剂存在下与试剂反应。优选的还原剂是连二亚硫酸盐、亚锡离子和亚铁离子；最优选的还原剂是氯化亚锡。以试剂盒的形式便利地提供用于制备这种复合物的手段，该试剂盒包括含有预先确定量的待标记的本发明试剂的密封小瓶和利用^99mTc标记该试剂的足够量的还原剂。可替换地，该复合物可以通过使本发明的与适当螯合剂缀合的肽与预先形成的不稳定锝复合物和另一种被称为转移配体的化合物反应而形成。该过程被称为配体交换，并且是本领域技术人员所熟知的。例如，可以采用例如酒石酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐或甘露醇等转移配体形成不稳定复合物。在本发明中有用的^99mTc高锝酸盐包括碱金属盐如钠盐、或铵盐或低级烷基铵盐。

制备其中金属是放射性铼的本发明复合物可以采用+5或+7氧化态的铼原料进行。其中铼处于Re(VII)态的化合物的实例是NH₄ReO₄或KReO₄。Re(V)是可获得的，例如[ReOCl₄](NBu₄)、[ReOCl₄](AsPh₄)、ReOCl₃(PPh₃)₂和ReO₂(吡啶)⁴⁺，其中Ph是苯基且Bu是正丁基。也可以采用其它能够形成铼复合物的铼试剂。

本发明所提供的放射性标记的PET、SPECT或闪烁成像剂具有合适量的放射性。通常地，待施用的单位剂量具有约0.01mCi至约100mCi、优选1mCi至20mCi的放射性。以单位剂量注射的溶液为约0.01mL至约10mL。通常优选的是形成含有浓度为每毫升约0.01mCi至100mCi放射性的放射性复合物溶液。

根据本发明的放射性核素标记的CD8捕获剂的典型剂量提供10至20mCi。在向患者注射放射性核素标记的CD8捕获剂之后，使用为掺入至成像剂中的核素的伽马射线能量进行校准的伽马照相机来对吸收试剂的区域进行成像，并且量化存在于该位点处的放射性量。位点的体内成像可以在几分钟内完成。然而，如果需要的话，可以在将放射性标记的肽注射入患者后几小时或甚至更长时间进行成像。在大多数情况下，足够量的施用剂量将在约0.1小时内累积在待成像的区域中，以允许得到闪烁照片。

本发明的放射性治疗化合物的适当剂量方案对于本领域技术人员是已知的。可以利用多种方法施用化合物，包括但不限于单次或多次静脉注射或腹腔内注射，采用足以引起表达靶CD8的组织损伤或消融的放射性量，而不会对非靶标(正常组织)造成多大的实质性损伤。取决于所使用的同位素的能量和半衰期、体内试剂的吸收和清除程度以及表达CD8的组织的质量，所需的数量和剂量随不同构建体而不同。通常地，剂量可以在约30至50mCi的单剂量至高达约3Ci的累积剂量的范围内。

本发明的放射性治疗组合物可以包括生理上可接受的缓冲剂，并且可以需要辐射稳定剂以防止注射前对化合物造成辐射损伤。辐射稳定剂是本领域技术人员已知的，并且可以包括例如对氨基苯甲酸、抗坏血酸、龙胆酸等。

除放射性核素以外，含有制备本发明复合物所需的所有组分的单个或多个小瓶试剂盒是本发明的组成部分。

单个小瓶的试剂盒优选含有螯合配体、亚锡盐来源或其它药学上可接受的还原剂，并且用药学上可接受的酸或碱适当缓冲以将pH值调节至约3至约9的值。所用还原剂的量和类型取决于待形成的交换复合物的性质。适当的条件对于本领域技术人员来说是熟知的。试剂盒的内含物优选为冻干形式。这类单个小瓶试剂盒可以任选地含有不稳定配体或交换配体(exchange ligand)，如葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、甘露醇、苹果酸盐、柠檬酸或酒石酸，并且还可以含有用于改善终产物的放射化学纯度和稳定性的反应调节剂(如二亚乙基三胺五乙酸(DPTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)或α、β或γ-环糊精)。试剂盒还可以包含稳定剂、填充剂如甘露醇(被设计用于辅助冷冻干燥过程)和本领域技术人员已知的其它添加剂。

多个小瓶的试剂盒优选包含相同的通用组分，但在重构放射性药物时使用多于一个的小瓶。例如，一个小瓶可以含有加入高锝酸盐(例如，亚锡来源或其它还原剂)时形成不稳定Tc(V)复合物所需的所有成分。将高锝酸盐加入至该小瓶中，并且在等待适当的时间段后，将该小瓶的内含物加入至含有配体及适合将pH调节至其最佳值的缓冲液的第二小瓶中。在约5至60分钟的反应时间后，形成本发明的复合物。有利的是，该多个小瓶的试剂盒中的两个小瓶的内含物均被冻干。如上所述，反应调节剂、交换配体、稳定剂、填充剂(bulkingagent)等可以存在于任一小瓶或两个小瓶中。

本文还提供了将¹⁸F放射性标记的辅助基团掺入至CD8捕获剂上的方法。在一个实施方式中，将4-[¹⁸F]氟苯甲醛(¹⁸FB)缀合到携带氨氧基部分的捕获剂上，导致肟的形成。在另一个实施方式中，将[¹⁸F]氟苯甲醛缀合到携带酰基酰肼部分的捕获剂上，产生腙加合物。可以通过已知方法利用¹⁸F离子置换离去基团来制备以¹⁸F形式的4-氟苯甲醛。

也可以在促进硫代半缩氨基酸形成的条件下，由具有缩氨基硫脲部分的捕获剂或通过利用¹⁸F-标记的亚硫酸氢醛加成复合物来制备¹⁸F-标记的捕获剂。

上述方法特别适用于标记捕获剂，例如本文所述的捕获剂，该捕获剂可在合成过程中被修饰成含有可用于与标记的醛反应的亲核性羟胺、氨基硫脲或肼(或酰肼)部分。这些方法可以用于任何能够容纳合适的亲核部分的捕获剂。通常将亲核部分连接到肽的N-末端，但技术人员将认识到也可以将亲核体连接至氨基酸侧链或肽C-末端。提供了合成放射性标记的肽序列的方法，其中4-[¹⁸F]氟苯甲醛与包含羟胺、氨基硫脲或肼(或酰肼)基团的肽序列反应，由此分别形成相应的肟、缩氨基硫脲或腙。通常通过将4-[¹⁸F]氟苯甲醛和亚硫酸氢钠的加成复合物进行酸催化分解来原位产生4-[¹⁸F]氟苯甲醛。亚硫酸氢盐加成复合物的使用提高了纯化速度，由于与醛不同，可以将该复合物浓缩至干。在酸性和碱性条件下复合物的形成也是可逆的。特别是当复合物在酸性介质中与含有羟胺、氨基硫脲或肼(或酰基酰肼)基团的肽接触时，反应性的游离4-[¹⁸F]氟苯甲醛因其原位形成而被消耗，产生相应的¹⁸F放射性标记的肽序列。

在存在于体内的肟、缩氨基硫脲或腙键不稳定的情况下，可以采用其它还原步骤来还原将肽连接至含¹⁸F底物的双键。相应的被还原的肽键会增强稳定性。本领域技术人员将理解可用于进行这种还原步骤的多种方法。Wilson等人描述的还原性胺化步骤也可以用于形成包含肽和4-[¹⁸F]氟苯甲醛的席夫碱(Schiff's base)，并且利用还原剂(如氰基硼氢化钠)将该席夫碱直接还原(Wilson等人，Journal of Labeled Compounds andRadiopharmaceuticals,XXVIII(10),1189-1199,1990)。

可以按照如下描述制备4-[¹⁸F]氟苯甲醛(Wilson等人，Journal of LabeledCompounds and Radiopharmaceuticals,XXVIII(10),1189-1199,1990；Iwata等人，Applied radiation and isotopes,52,87-92,2000；Poethko等人，The Journal ofNuclear Medicine,45,892-902,2004；和Schottelius等人，Clinical Cancer Research,10,3593-3606,2004)。可以将Na¹⁸F的水溶液加入至克瑞吐菲(kryptofix)和K₂CO₃的混合物中。可以添加无水乙腈，并在氩气流中在加热器中蒸发溶液。可以添加额外份量的乙腈，并将样品蒸发至完全干燥。可以将4-三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐溶于DMSO中，并添加至干燥的F-18中。然后，可以在加热器中加热溶液。可以将该溶液短暂冷却，用水稀释，并通过

Oasis HLB LP提取盒过滤。可以用水:乙腈(9:1)和水洗涤盒，以去除未结合的¹⁸F和未反应的4-三甲基铵苯甲醛三氟甲基磺酸盐。然后，可以利用分批的甲醇从盒上洗脱出4-[¹⁸F]氟苯甲醛。

治疗性应用

本文在某些实施方式中提供了利用本文公开的CD8捕获剂来确定、检测、定量和/或分离生物样品中的CD8的方法。在某些实施方式中，这些方法利用免疫测定法，其中捕获剂代替抗体或其等同物。在某些实施方式中，免疫测定可以是蛋白质印迹、拉下实验、斑点印迹或ELISA。

在本文提供的方法中使用的生物样品可以选自由器官、组织、体液和细胞所组成的组。在生物样品是体液的情况下，体液可以选自由血液、血清、血浆、尿液、痰液、唾液、粪便、脊髓液、脑脊液、淋巴液、皮肤分泌物、呼吸道分泌物、肠分泌物、泌尿生殖道分泌物、泪液和乳汁所组成的组。器官包括例如肾上腺、膀胱、骨骼、脑、***、子宫颈、食道、眼睛、胆囊、生殖器、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、***、卵巢、胰腺、脑垂体、***、唾液腺、骨骼肌、皮肤、小肠、脊髓、脾、胃、胸腺、气管、甲状腺、睾丸、输尿管和尿道。组织包括例如上皮组织、***、神经组织和肌肉组织。

本文在某些实施方式中提供了利用本文公开的CD8捕获剂来诊断和/或分类(例如分期)与CD8表达相关的病症的方法。在这些实施方式的某些实施方式中，该方法包括(a)从受试者获得生物样品；(b)用CD8捕获剂测定样品中CD8的存在或不存在；(c)将CD8水平与预先确定的CD8对照范围进行比较；和(d)基于生物样品中的CD8水平与预先确定对照之间的差异来诊断与CD8表达相关的病症。

在其它实施方式中，将本文公开的CD8捕获剂用于作为特异性靶向突变的治疗剂。在该实施方式的某些方面，单独施用CD8捕获剂而不递送DNA、放射性药物或其它活性剂。

本文所述的CD8捕获剂还可以被用于将遗传物质靶向至表达CD8的细胞。遗传物质可以包括天然或合成来源的核酸，如RNA或DNA，包括重组RNA和DNA及反义RNA和DNA。可以使用的遗传物质的类型包括例如表达载体(如质粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)和缺陷或“辅助”病毒)所携带的基因、反基因核酸(antigene nucleic acid)、单链和双链RNA及单链和双链DNA及它们类似物(例如，硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸和二硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸)。另外，遗传物质可以与例如脂质、蛋白质或其它聚合物组合。用于遗传物质的递送载体可以包括，例如病毒颗粒、逆转录病毒或其它基因治疗载体、脂质体、脂类(特别是阳离子脂质)和遗传物质的复合物、葡聚糖衍生物和遗传物质的复合物等。

在一个实施方式中，将本发明的捕获剂用于基因治疗。在该实施方式中，可以将遗传物质或一种或多种含有遗传物质的递送载体与本公开的一种或多种CD8捕获剂缀合，并施用至患者。

可以以已知方式，任选地利用本申请中其它地方讨论的相同类型的接头，将本文公开的治疗剂和CD8捕获剂连接或融合。优选的接头将是取代的或未取代的烷基链、氨基酸链、聚乙二醇链和本领域已知的其它简单的聚合物接头。更优选地，如果治疗剂本身是编码DNA的序列已知的蛋白质，则可以从利用如上所述的重组DNA技术所建立的同一合成基因将治疗性蛋白质和结合CD8的多肽共表达。可以将结合CD8的多肽的编码序列与治疗性蛋白质的编码序列融合在框架中，使得肽在治疗性蛋白质的氨基末端或羧基末端或在末端之间的位置处表达，如果确定这种放置并不会破坏治疗性蛋白质或结合CD8的多肽的所需生物学功能。该通用方法具体的优势在于多个衔接排列的CD8捕获剂可以多联化(concatamerization)，从而增加与每种治疗性蛋白质相关的CD8结合位点的数量和浓度。以这种方式，增加了CD8结合亲合力，这将预期改善重组治疗性融合蛋白的功效。

提供以下示例以更好地说明要求保护的发明，并且不被解释为限制本发明的范围。在提及具体材料的范围内，这仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制本发明。本领域技术人员可以开发等同的手段或反应物而不需要运用创造能力并且不偏离本发明的范围。

实施例

实施例1：CD8表位设计

在T细胞表面上CD8被表达为αα同二聚体或αβ异二聚体。CD8单体由四个不连续的功能域组成：(1)细胞外Ig样胞外域、(2)近膜茎(铰链)区、(3)跨膜结构域和(4)细胞质结构域。基于公众可获得的蛋白质结构数据，检查CD8α，因为该单体对CD8αα和CD8αβ两者都是共同的，因此开发的PCC试剂将能检测较宽范围的CD8⁺T细胞亚群。

使用人类CD8αα-pMHC复合物(PDB ID:1AKJ)的晶体结构，在将会是用于合成表位靶向的良好候选物的CD8α的细胞外Ig样胞外域中确定表位。在CD8α胞外域中确定两个非结构化的环，其在三级结构中相邻

(图1A)。基于以下标准，这些环被认为是用于PCC试剂开发的合适表位：

·表位是连续的序列(8至30个氨基酸)；

·表位出现在当蛋白质被折叠成其天然构象时会被暴露且可接近的蛋白质区域中；

·表位是短距离分开的。

CD8α环1和CD8α环2的序列示于图1B中。

将每个表位合成为在选定的内部氨基酸位置处包含叠氮化物手柄(Az4＝叠氮基L-赖氨酸)。对于CD8α环1，基于(a)精氨酸和Az4在化学方面是相似的，(b)该氨基酸的侧链向外指向并且不与蛋白质中的其它原子相互作用，和(c)它位于暴露的感兴趣环的中间，进行R10Az4取代。对于CD8α环2，基于类似的考虑进行K58Az4取代。在每个经设计的CD8α表位中的取代的叠氮化物手柄(Az4)的位置示于图1B中。

实施例2：筛选针对CD8表位1和2的大环化合物文库

使用形式为H₂N-Pra-Cy(XXXXX-点击)-Met-TG的***环化的OBOC文库进行筛选，其中

S NH₂树脂(S 30 902，Rapp Polymere)，X＝16种L-氨基酸(缺少Cys、Met、Ile和Gln)之一，和Pra＝L-炔丙基甘氨酸。使用四步筛选方法来确定针对两种CD8表位片段的大环化合物：1)预清洗以消除非特异性的结合物，2)产物筛选以确定由以CD8表位1为模板的原位点击化学所产生的击中物，3)另一产物筛选以确定由CD8表位2为模板的原位点击化学所产生的击中物，和4)针对带有His标签的CD8α人类重组蛋白的靶标筛选以确定与蛋白质和表位结合的肽。

预清洗。在4℃下用封闭缓冲液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％(w/v)BSA和0.05％(v/v)吐温-20,pH 7.6)将溶胀的文库珠粒(400mg)封闭过夜，随后用封闭缓冲液洗涤三次。将1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶(V559C，Promega)的封闭缓冲液(5mL)加入至珠粒中，并在室温中在温和摇动下孵育1小时。随后用3×3mL TBS(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.6)(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH 2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，然后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM MgCl₂,pH9)洗涤珠粒(每次5分钟)。通过在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)底物(S3771，Promega)存在下将珠粒孵育25分钟来使得结合可视化。紫色珠粒表示背景结合物，并通过移液管移除并丢弃。收集剩余的澄清珠粒，用7.5M盐酸胍(pH 2.0)剥离30分钟，用水洗涤10次，并在1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中孵育过夜以脱色。

用CD8表位1筛选产物。用水将从预清洗剩余的珠粒洗涤十次，并用TBS洗涤三次。随后在室温下将珠粒与3mL的100μM CD8表位1片段(生物素-PEG₃-SQFRVSPLD[Az4]TWNLGETVELKSQ)的TBS溶液孵育3小时以允许原位点击反应发生。用TBS洗涤珠粒十次，随后用7.5M盐酸胍(pH2.0)孵育1小时以去除未与珠粒共价连接的所有CD8表位。用TBS洗涤这些珠粒十次，并用封闭缓冲液重新封闭2小时。加入1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶的封闭缓冲液(5mL)，保持1小时，以检测点击至珠粒的CD8表位的存在。随后用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH 2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，随后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(每次5分钟)。此后，如预清洗中所述的，用BCIP/NBT将珠粒显影25分钟。通过移液管选择紫色的表位缀合的击中珠粒。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)将这24个击中物和单独的未击中物处理30分钟，以去除附着的链霉亲和素，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

用CD8表位2筛选产物。用水将从产物筛选所获得的24个击中物和单独的未击中珠粒洗涤十次，并且用TBS洗涤三次。随后在室温下将未击中珠粒与3mL的100μM CD8表位2片段(生物素-PEG₃-FLLYLSQNKP[Az4]AAEGLDTQR)的TBS溶液孵育3小时，以允许原位点击反应发生。用TBS洗涤珠粒十次，随后用7.5M盐酸胍(pH 2.0)孵育1小时，以去除未与珠粒共价连接的所有CD8表位。用TBS洗涤这些珠粒十次，并用封闭缓冲液重新封闭2小时。加入1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶的封闭缓冲液(5mL)，持续1小时，以检测点击至珠粒的CD8表位的存在。随后用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，随后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(每次5分钟)。此后，如预清洗中所述的，用BCIP/NBT将珠粒显影25分钟。通过移液管选择紫色的表位缀合的击中珠粒。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)将这45个击中物处理30分钟，以去除附着的链霉亲和素，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

用带有His标签的CD8α蛋白进行靶标筛选。用水将从第二次产物筛选所获得的45个点击物洗涤十次，并用TBS洗涤三次。接下来，将针对CD8表位1所分离的24个击中物和针对CD8表位2所分离的45个击中物转移至两个

8162

离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中，并在室温下用封闭缓冲液孵育3小时。用封闭缓冲液冲洗珠粒三次，然后在室温下用150nM带有His标签的CD8α人重组蛋白(TP760215，Origene)的封闭缓冲液(制剂：在630μL封闭缓冲液中的20μL带有His标签的CD8α人重组蛋白)孵育1小时。用封闭缓冲液将珠粒洗涤三次，然后在室温下用500μL的1:10,000抗-6X His

抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746，Abcam)的封闭缓冲液孵育1小时。随后用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS洗涤珠粒，随后用3×500μL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(在每次洗涤后，以7000rpm离心30秒)。此后，用BCIP/NBT将珠粒显影10分钟。通过移液管选择与CD8α蛋白结合的紫色珠粒，并将其保存。在针对CD8表位1所分离的24个击中物中，3个珠粒是紫色的，表明同时与CD8表位和蛋白质结合，而21个珠粒是澄清的，表明未与CD8蛋白质结合。在针对CD8表位2所分离的45个击中物中，10个珠粒是紫色的，表明同时与CD8表位和蛋白质结合，而35个珠粒是澄清的，表明未与CD8蛋白质结合。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)将CD8表位1的3个靶标击中物和CD8表位2的10个靶标击中物处理30分钟，以去除结合的蛋白质，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。最后用水将这13个击中物洗涤10次，从而为测序分析做准备。

实施例3：通过MALDI-TOF/TOF测序环肽击中物

手动Edman降解。用图2中的化学结构式显示该过程。Edman步骤改编自KlemmMethods Mol.Biol.1984。环1(去除Pra点击手柄)：将环肽击中物转移至10×75mm Pyrex管中的5-10μL水中。通过向珠粒中加入50μL异硫氰酸苯酯(2.5％(v/v)，50％水性吡啶溶液)来引发偶联反应。用N₂(g)冲洗管10秒，用橡皮塞密封，并允许其在50℃下反应20分钟。用300μL庚烷:乙酸乙酯(10:1)将溶液洗涤一次。以500rpm将管离心30秒，并通过移液管移除有机层(注意不要干扰管底部的珠粒)。然后用300μL庚烷:乙酸乙酯(1:2)洗涤溶液一次。以500rpm将管离心30秒，并再次通过移液管移除有机层。在60℃下将管中剩余的溶液在离心真空中干燥10分钟。通过向珠粒中加入50μL三氟乙酸来引发断裂反应。用N₂(g)冲洗管10秒，用橡胶塞轻轻覆盖，并允许其在45℃下反应10分钟。然后通过真空离心10分钟来去除三氟乙酸。然后将管置于冰浴中。加入吡啶(50μL)，随后用250μL冰冷的乙酸正丁酯饱和水溶液将溶液洗涤三次。然后在60℃下将剩余的溶液(含有珠粒)在离心真空下干燥15分钟。环2 (开环)：将珠粒置于10μL水中，并允许其重新平衡。再次进行偶联和断裂反应(按照与环1相同的步骤)。将含有线性苯胺噻唑啉酮(ATZ)-肽的所得珠粒置于200μL水中，并允许其在室温下重新平衡过夜。在第二天，将珠粒转移至

8170

离心管过滤器(尼龙膜)中，并通过离心(30秒，7000rpm)用10×500μL水洗涤。

用氰化溴(CNBr)使来自单珠的击中肽断裂。在手动Edman降解之后，将每个击中珠粒转移到含有纯水(10μL)的微量离心管中。加入CNBr(10μL，0.50M的0.2N HCl溶液)后，用氩气吹扫反应容器，然后置于微波下持续1分钟(Lee等人，J.Comb.Chem.2008)。CNBr酸性水溶液导致在线性ATZ-肽的C-末端处甲硫氨酸特异性断裂，导致肽从珠粒上断裂。在45℃下将所得溶液在离心真空下浓缩2小时。

通过MALDI-MS和MS/MS对从单珠断裂的线性ATZ-肽进行测序。向每个管中加入α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)(0.5μL，5mg/mL基质溶液于含有0.1％TFA(v/v)的乙腈/水(70:30)中)。吸取混合物，将其置于384孔MALDI板中，允许将其静置15分钟以自然干燥。随后采用在反射模式下操作的Bruker ultrafleXtreme^TM TOF/TOF仪器(Bruker Daltonics；不来梅，德国)，通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)分析样品。以LIFT^TM模式获得每个样品的MS/MS谱图。基于MS/MS谱图的分析结果，将BioTools^TM用于分配序列。

测序结果示于表1和表2中。这些候选环肽在可切割的树脂上重新合成，采用C₁₈柱(Phenomenex Luna，5μm，250×10mm)通过反相HPLC进行纯化，并通过ELISA测试针对人类CD8α蛋白的亲和力和特异性。化学结构和质谱数据示于图3-11(小图A)中。图3-11详细说明了关键化合物的体外表征数据。

表1：针对CD8表位1所确定的大环肽击中物的序列

表2：针对CD8表位2所确定的大环肽击中物的序列

实施例4：CD8表位1击中物的表征数据

表3：CD8表位1击中物

实施例5：筛选针对CD8表位1和2的线性文库

使用形式为H₂N-(D-Pra)-xxxxx-(D-Met)-TG的线性OBOC文库进行筛选，其中

S NH₂树脂(S 30 902，Rapp Polymere)，x＝16种D-氨基酸(缺少D-Cys、D-Met、D-Ile和D-Gln)之一，和D-Pra＝D-炔丙基甘氨酸。使用四步筛选方法来确定针对两种CD8表位片段的线性肽配体：1)预清洗以消除非特异性的结合物，2)产物筛选以确定由以CD8表位1为模板的原位点击化学所产生的击中物，3)另一产物筛选以确定由CD8表位2为模板的原位点击化学所产生的击中物，和4)针对带有His标签的CD8α人类重组蛋白的靶标筛选以确定与蛋白质以及表位结合的肽。

预清洗。在4℃下用封闭缓冲液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％(w/v)BSA和0.05％(v/v)吐温-20,pH 7.6)将溶胀的文库珠粒(400mg)封闭过夜，随后用封闭缓冲液洗涤三次。将1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶(V559C，Promega)的封闭缓冲液(5mL)加入至珠粒中，并在室温中在温和摇动下孵育1小时。随后用3×3mL TBS(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.6)(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH 2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，然后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM MgCl₂,pH9)洗涤珠粒(每次5分钟)。通过在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)底物(S3771，Promega)存在下将珠粒孵育25分钟来使得结合可视化。紫色珠粒表示背景结合物，并通过移液管移除并丢弃。收集剩余的澄清珠粒，用7.5M盐酸胍(pH2.0)剥离30分钟，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

用CD8表位1筛选产物。用水将从预清洗剩余的珠粒洗涤十次，并用TBS洗涤三次。随后在室温下将珠粒与3mL的100μM CD8表位1片段(生物素-PEG₃-SQFRVSPLD[Az4]TWNLGETVELKSQ)的TBS溶液孵育3小时以允许原位点击反应发生。用TBS洗涤珠粒十次，随后用7.5M盐酸胍(pH2.0)孵育1小时以去除未与珠粒共价连接的所有CD8表位。用TBS洗涤这些珠粒十次，并用封闭缓冲液重新封闭2小时。加入1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶的封闭缓冲液(5mL)，保持1小时，以检测点击至珠粒的CD8表位的存在。随后用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH 2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，随后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(每次5分钟)。此后，如预清洗中所述的，用BCIP/NBT将珠粒显影25分钟。通过移液管选择紫色的表位缀合的击中珠粒。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)将这19个击中物和单独的未击中物处理30分钟，以去除附着的链霉亲和素，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

用CD8表位2筛选产物。用水将从产物筛选所获得的19个击中物和单独的未击中珠粒洗涤十次，并且用TBS洗涤三次。随后在室温下将未击中珠粒与3mL的100μM CD8表位2片段(生物素-PEG₃-FLLYLSQNKP[Az4]AAEGLDTQR)的TBS溶液孵育3小时，以允许原位点击反应发生。用TBS洗涤珠粒十次，随后用7.5M盐酸胍(pH 2.0)孵育1小时，以去除未与珠粒共价连接的所有CD8表位。用TBS将这些珠粒洗涤十次，并用封闭缓冲液重新封闭2小时。加入1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶的封闭缓冲液(5mL)，持续1小时，以检测点击至珠粒的CD8表位的存在。随后用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，随后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(每次5分钟)。此后，如预清洗中所述的，用BCIP/NBT将珠粒显影25分钟。通过移液管选择紫色的表位缀合的击中珠粒。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)将这19个击中物处理30分钟，以去除附着的链霉亲和素，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

用带有His标签的CD8α蛋白进行靶标筛选。用水将从第二次产物筛选所获得的19个点击物洗涤十次，并用TBS洗涤三次。接下来，将针对CD8表位1所分离的19个击中物和针对CD8表位2所分离的19个击中物转移至两个

8162

离心管过滤器(醋酸纤维素膜)中，并在室温下用封闭缓冲液孵育3小时。用封闭缓冲液冲洗珠粒三次，然后在室温下用1.5μM带有His标签的CD8α人重组蛋白(TP760215，Origene)的封闭缓冲液(制剂：在303.6μL封闭缓冲液中的136.4μL带有His标签的CD8α人重组蛋白)孵育1小时。用封闭缓冲液将珠粒洗涤三次，然后在室温下用500μL的1:10,000抗-6X His

抗体[HIS-1](碱性磷酸酶缀合的)(ab49746，Abcam)的封闭缓冲液孵育1小时。随后用3×500μL封闭缓冲液、3×500μL TBS洗涤珠粒，随后用3×500μL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(在每次洗涤后，以7000rpm离心30秒)。此后，用BCIP/NBT将珠粒显影10分钟。通过移液管选择与CD8α蛋白结合的紫色珠粒，并将其保存。在针对CD8表位1所分离的19个击中物中，10个珠粒是紫色的，表明同时与CD8表位和蛋白质结合，而9个珠粒是澄清的，表明未与CD8蛋白质结合。在针对CD8表位2所分离的19个击中物中，13个珠粒是紫色的，表明同时与CD8表位和蛋白质结合，而6个珠粒是澄清的，表明未与CD8蛋白质结合。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)将针对CD8表位1的10个靶标击中物和针对CD8表位2的13个靶标击中物处理30分钟，以去除结合的蛋白质，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。最后用水将这23个击中物洗涤10次，从而为测序分析做准备。

实施例6：通过MALDI-TOF/TOF测序线性肽击中物

用氰化溴(CNBr)使来自单珠的击中肽断裂。将每个击中珠粒转移到含有纯水(10μL)的微量离心管中。在加入CNBr(10μL，0.50M的0.2N HCl溶液)后，用氩气吹扫反应容器，然后置于微波下持续1分钟(Lee等人，J.Comb.Chem.2008)。CNBr酸性水溶液导致在肽C-末端处甲硫氨酸特异性断裂，导致肽从珠粒上断裂。在45℃下将所得溶液在离心真空下浓缩2小时。

通过MALDI-MS和MS/MS对从单珠断裂的击中肽进行测序。向每个管中加入α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)(0.5μL，5mg/mL基质溶液于含有0.1％TFA(v/v)的乙腈/水(70:30)中)。吸取混合物，将其置于384孔MALDI板中，允许将其静置15分钟以自然干燥。随后采用在反射模式下操作的Bruker ultrafleXtreme^TM TOF/TOF仪器(Bruker Daltonics；不来梅，德国)，通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)分析样品。以LIFT^TM模式获得每个样品的MS/MS谱图。基于MS/MS谱图的分析结果，将BioTools^TM用于分配序列。

测序结果示于表4和表5中。这些候选肽仅仅以***环化的形式在可切割的树脂上重新合成，采用C₁₈柱(Phenomenex Luna，5μm，250×10mm)通过反相HPLC进行纯化，并通过ELISA测试针对人类CD8α蛋白的亲和力和特异性。化学结构和质谱数据示于图3-11(小图A)中。图3-11详细说明了关键化合物的体外表征数据。

表4：针对CD8表位1确定的线性肽击中物的序列

表5：针对CD8表位2确定的线性肽击中物的序列

实施例7：CD8表位2击中物的表征数据

表6：CD8表位2击中物

实施例8：靶向CD8表位的配体的体外测定

CD8 ELISA(亲和力测定)。步骤：在室温下用2μM大环肽配体的TBS溶液(25mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 7.6)将黑色中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)包被的高结合容量96孔板(15510，Pierce)包被2小时。用生物素化的单克隆抗CD8(MA1-19484，LifeTechnologies)以4μg/mL(在TBS中)进行包被，作为对照。抽吸(aspirate)平板，然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05％(v/v)吐温-20的PBS溶液，1×)洗涤。将带有His标签的CD8α人重组蛋白(TP760215，Origene)连续稀释于洗涤缓冲液中(从400至0nM)，并在室温下在指定的微孔中孵育90分钟。抽吸微孔，随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的CD8α蛋白，以1:10,000稀释度制备碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-6X His

抗体[HIS-1](ab49746，Abcam)，并在室温下加入至微孔中，保持1小时。抽吸平板，并用洗涤缓冲液洗涤(5×)。使用

AP荧光底物***(S1000，Promega)对微孔显影。使用430nm的激发波长，通过Beckman Coulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。使用四参数回归曲线拟合程序(Origin 8.5)拟合滴定曲线以确定EC₅₀值。

以ELISA形式测试生物素-PEG₃-修饰的大环肽配体的结合亲和力。对于这些测定，采用固定在中性抗生物素蛋白包被的板上的大环肽配体捕获带有His标签的CD8α人重组蛋白的系列稀释溶液。对于人类CD8α蛋白，大环肽配体显示出6至62nM的EC₅₀值。以类似方式测定的生物素化的单克隆抗CD8显示出相似的结合亲和力(EC₅₀≈60nM)。图3-11示出了关键化合物的结果(小图B)。

点ELISA(血清选择性测定)。步骤：在室温下用2μM大环肽配体的TBS溶液(pH 7.6)将黑色中性抗生物素蛋白包被的高结合容量96孔板(15510，Pierce)包被2小时。抽吸平板，然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05％(v/v)吐温-20的PBS溶液，1×)洗涤。在0％、10％、50％和100％(v/v)人血清(HS-30，Omega Scientific；以洗涤缓冲液制备稀释溶液)中制备50nM的带有His标签的CD8α人重组蛋白(TP760215，Origene)，并在室温下在指定的微孔中孵育90分钟。抽吸微孔，随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的CD8α蛋白，以1:10,000稀释度制备碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-6X His

抗体[HIS-1](ab49746，Abcam)，并在室温下加入至微孔中，保持1小时。抽吸平板，并用洗涤缓冲液洗涤(5×)。使用

AP荧光底物***(S1000，Promega)对微孔显影。使用430nm的激发波长，通过BeckmanCoulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。

以ELISA形式测试血清背景中生物素-PEG₃-修饰的大环肽配体的选择性靶向。对于这些测定，使用固定化的大环肽配体，捕获0％、10％、50％和100％(v/v)人血清中的50nM带有His标签的CD8α人重组蛋白。最具有选择性的配体是Cy(yGGvr)和Cy(HGRGH)，其可以检测50％血清中的CD8蛋白。包括Cy(AKYRG)、CY(PWTHG)和Cy(wsvnv)的其它PCC可以检测10％血清中的CD8蛋白。图3-11示出关键化合物的结果(小图C)。

点ELISA(蛋白酶灵敏性测定)。步骤：制备1:30比率的胰蛋白酶溶液(T0303，Sigma-Aldrich；1mg/mL储液的HCl(1m M)溶液，pH 3)。用2.5μL大环肽配体、5μL1:100稀释的胰蛋白酶和17.5μL1×TBS建立反应，并在37℃下孵育1小时。此外，用2.0μL生物素化的单克隆抗CD8(MA1-19484，Life Technologies)、5μL未稀释的胰蛋白酶和18μL 1×TBS建立反应，并在37℃下孵育1小时。在消化结束后，用1×TBS将每个样品的体积增加至总共500μL，并且中性抗生物素蛋白包被的96孔板(15510，Pierce)的每个孔为100μL。如上所述，采用50nM的带有His标签的CD8α人重组蛋白(TP760215，Origene)进行CD8ELISA(亲和力测定)。

胰蛋白酶可以在赖氨酸残基和精氨酸L-氨基酸残基的C-末端侧切割肽和蛋白质(包括抗体)。对于该测定法，用胰蛋白酶蛋白酶处理测试化合物(在37℃下保持1小时)，将不处理作为对照。CD8 ELISA显示经过消化的抗CD8抗体几乎丧失了其所有CD8捕获能力，而大多数大环肽配体对蛋白酶消化具有抗性。5个含D-氨基酸的PCC(Cy(wplrf)、Cy(slrfG)、Cy(ffrly)、Cy(yGGvr)和Cy(wsvnv))非常稳定，在消化之前和消化之后显示出几乎相同的信号。另一种含D-氨基酸的PCC(Cy(rwfnv))在蛋白酶处理后保留80％的信号。由赖氨酸和精氨酸L-氨基酸组成的Cy(AKYRG)是对胰蛋白酶最敏感的环状PCC，并且在处理后仅显示出30％的信号。图3-11示出关键化合物的结果(小图D)。

实施例9：经修饰CD8表位的结合位置分析

确定大环化合物与CD8表位1-2结合的方向的测定。步骤：在室温下用2μM大环肽配体的TBS溶液(pH 7.6)将黑色中性抗生物素蛋白包被的高结合容量96孔板(15510，Pierce)包被2小时。抽吸平板，然后用TBS(5×)和洗涤缓冲液(0.05％(v/v)吐温-20的PBS溶液，1×)洗涤。以洗涤缓冲液制备2μM的以化学方式合成的带有His标签的CD8表位，并在室温下在指定的微孔中孵育90分钟。加入不含表位的洗涤缓冲液，作为对照。抽吸微孔，随后用洗涤缓冲液(10×)洗涤。为了检测结合的CD8表位，以1:10,000稀释度制备碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-6X His

抗体[HIS-1](ab49746，Abcam)，并在室温下加入至微孔中，保持1小时。抽吸平板，并用洗涤缓冲液洗涤(5×)。使用

AP荧光底物***(S1000，Promega)对微孔显影。使用430nm的激发波长，通过Beckman Coulter DTX880光度计记录535nm处的荧光发射。在减去无表位的背景后显示数据。

对于该项实验，用His₆测定手柄以及N-末端至点击手柄(R10)的位置含有聚甘氨酸取代的序列和C-末端至点击手柄(R10)的位置含有聚甘氨酸取代的序列重新合成CD8表位1(图12A)。类似地，用His₆测定手柄和聚甘氨酸取代(N-末端或C-末端至K58)重新合成CD8表位2(图12B)。进行针对固定化大环肽配体的带有His标签的CD8表位的点ELISA。对于PEG₃-生物素-修饰的Cy(wplrf)、Cy(AKYRG)、Cy(rwfnv)和Cy(ffrly)，获得与CD8表位1N端结合的最大ELISA信号(蓝色条，图12C)，表明优先与CD8表位1的N-末端部分结合。对于PEG₃-生物素-修饰的Cy(PWTHG)、Cy(yGGvr)和Cy(slrfG)，获得与CD8表位2N端结合的最大ELISA信号(黑色条，图12D)，表明优先与CD8表位2的N-末端部分结合。对于PEG₃-生物素-修饰的Cy(HGRGH)和Cy(wsvnv)，获得与CD8表位2的C端结合的最大ELISA信号(红色条，图12D)，表明优先与CD8表位2的C-末端部分结合。这些结果证实了表位靶向策略的选择属性。

示于图3-12中的结果表明对于识别CD8表位的特定部分以及人重组蛋白的稳定大环肽配体，表位靶向策略产生低于100nM的亲和力。图13示出与CD8α晶体结构重叠的大环化合物结合取向的概览。

实施例10：设计与两个大环配体共价连接的接头

随后利用CD8α蛋白的三级结构，作为开发显示出真正协同结合(K_D范围<1nM)的双配位PCC试剂的支架。两个大环化合物的组合共价连接在一起，以建立对两个表位具有高亲合性的双配位PCC试剂。

在该过程中重要的是设计桥接蛋白质两个表位之间距离的合适接头。以PyMOL(DeLano Scientific)分析人类CD8α(PDB ID:1AKJ)的3-D晶体结构，以确定CD8表位1和CD8表位2之间的距离(图14)。在CD8表位1中，以序列RVSPLD为重点，因为大环化合物Cy(AKYRG)、Cy(wplrf)、Cy(ffrly)和Cy(rwfnv)被确定为优先与N-末端区域发生相互作用(图12)。在CD8表位2中，以序列AAEGLD为重点，因为大环化合物Cy(HGRGH)和Cy(wsvnv)被确定为优先与C-末端区域发生相互作用(图12)。随后对CD8αα二聚体的一个单体中的两个表位位置之间的距离进行测量。在单体CD8α蛋白中，序列AAEGLD(在CD8表位2的C端中)与序列RVSPLD(在CD8表位1的N端中)分开

因此，

的化学接头将可用于一个靶向CD8表位1的大环化合物和一个靶向CD8表位2的大环化合物的共价连接。由此产生的协同双配体将可用于同时检测CD8αα和CD8αβ。

实施例11：采用PEG接头合成协同双配体候选物

用长度可变的PEG接头来合成协同双配体候选物，所述PEG接头将一个来自CD8表位1的大环化合物与一个来自CD8表位2的大环化合物共价连接。连接两个大环化合物的接头是单个PEG化氨基酸(Fmoc-NH-PEG_x-丙酸；x＝1至8)。选择PEG接头是因为它可以具有桥接蛋白质两个表位之间的

距离的各种长度。还预计PEG会显示有利的亲水性和抗生物污损性。

首先，由大环化合物Cy(Epi2C PCC)(靶向CD8表位2的C端)和Cy(Epi1N PCC)(靶向CD8表位1的N端)产生协同双配体候选物，其中Epi2C PCC＝选自HGRGH或wsvnv的大环化合物，并且Epi1N PCC＝选自AKYRG、wplrf、ffrly或rwfnv的大环化合物。协同双配体候选物生物素-PEG₃-Cy(Epi2C PCC)-PEG_x-Cy(Epi1N PCC)的结构如图15所示。此外，可以从大环化合物Cy(Epi2N PCC)(靶向CD8表位2的N端)和Cy(Epi1N PCC)(靶向CD8表位1的N端)产生协同双配体候选物，其中Epi2N PCC＝选自PWTHG、yGGvr或slrfG的大环化合物。

实施例12：采用氨基酸接头合成协同双配体候选物

使用原位点击化学来开发其它双配体候选物，以确定在与CD8α蛋白结合时将两个大环化合物共价连接在一起的线性肽(图16)。为了将Cy(Epi2C PCC)与Cy(Epi1N PCC)组合，将动力学控制的原位点击化学与组合的接头文库一起用于确定分子桥接。首先，在固相树脂上合成Cy(Epi1N PCC)，并且其连有用D-炔丙基甘氨酸(D-Pra)终止的N-末端接头文库。该接头文库具有全面的7个D-氨基酸中的0到5个残基，其被选择用于亲水性和结构刚性。用C-末端Az4(L-叠氮基赖氨酸)和N-末端生物素-PEG₃标记物重新合成Cy(Epi2C PCC)。加入CD8α蛋白，以通过使反应性叠氮化物基团(来自Epi2C PCC)和炔烃基团(来自Epi1NPCC)紧密接近来实现双配体PCC试剂的靶标引导合成。

步骤：采用形式为H₂N-(D-Pra)-xxxxx-Cy(R₆R₇R₈R₉R₁₀-点击)-Met-TG的OBOC文库来进行确定氨基酸接头的筛选，其中

S NH₂树脂(S 30 902，Rapp Polymere)，x＝七种D-氨基酸Gly、D-Ala、D-Leu、D-Pro、D-Ser、D-Thr、Aib)之一或无氨基酸，并且Cy(R₆R₇R₈R₉R₁₀-click)＝Epi1N PCC＝选自AKYRG、wplrf、ffrly或rwfnv大环化合物。对于每个Epi1N PCC，文库多样性为8⁵＝32,768个接头。分别地，合成生物素-PEG₃-Cy(R₁R₂R₃R₄R₅-点击)-Az4，并制备储液，其中Cy(R₁R₂R₃R₄R₅-点击)＝Epi2C PCC＝选自HGRGH和wsvnv的大环化合物。通过以下两个步骤筛选针对CD8α人重组蛋白和Epi2C PCC的文库来确定氨基酸接头：1)预清洗以消除非特异性的背景结合物，2)由CD8α蛋白促进的原位点击筛选，确定连接两个大环化合物Epi2C PCC和Epi1N PCC的线性肽(长度为0至5个D-氨基酸)。

预清洗。在4℃下用封闭缓冲液(25mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％(w/v)BSA和0.05％(v/v)吐温-20,pH 7.6)将溶胀的接头文库珠粒(40mg，过量取样～3.5×)封闭过夜，随后用封闭缓冲液洗涤三次。随后，将珠粒与4mL的100μM生物素-PEG₃-Cy(R₁R₂R₃R₄R₅-点击)-Az4(Epi2C PCC)和1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶(V559C，Promega)的封闭缓冲液在室温下孵育3小时。之后用3×3mL TBS(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.6)(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH 2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，然后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-HCl,150mM NaCl,1mM MgCl₂,pH 9)洗涤珠粒(每次5分钟)。通过在5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)底物(S3771，Promega)存在下将珠粒孵育25分钟来使得结合可视化。紫色珠粒表示背景结合物，并通过移液管移除并丢弃。收集剩余的澄清珠粒，用7.5M盐酸胍(pH 2.0)剥离30分钟，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

利用CD8α蛋白进行原位点击筛选。用水将从预清洗剩余的珠粒洗涤十次，并用TBS洗涤三次。然后，将珠粒与4mL的100μM生物素-PEG₃-Cy(R₁R₂R₃R₄R₅-点击)-Az4(Epi2C PCC)和150nM带有His标签的CD8α人重组蛋白(TP760215，Origene)的封闭缓冲液在室温下孵育3小时，允许以蛋白质为模板的原位点击反应发生。用TBS将珠粒洗涤十次，然后用7.5M盐酸胍(pH 2.0)孵育1小时，以去除未与珠粒共价连接的所有Epi2C PCC和CD8α蛋白质。用TBS将这些珠粒洗涤十次，并用封闭缓冲液再次封闭2小时。加入1:10,000稀释的链霉亲和素-碱性磷酸酶的封闭缓冲液(4mL)，保持1小时，以检测点击至珠粒的Epi2C PCC的存在。随后，用3×3mL TBS(每次1分钟)、3×3mL 0.1M甘氨酸洗涤缓冲液(pH 2.8)、3×3mL TBS洗涤珠粒，然后用3×3mL碱性磷酸酶缓冲液(pH 9)洗涤珠粒(每次5分钟)。此后，如预清洗中所述的，用BCIP/NBT将珠粒显影25分钟。通过移液管选择含有两个缀合的大环化合物的紫色击中珠粒。用7.5M盐酸胍(pH 2.0)处理击中物30分钟，以去除附着的链霉亲和素，用水洗涤10次，并在NMP中孵育过夜以脱色。

在CNBr切割以及MALDI-MS和MS/MS分析后，测定击中珠粒上的线性D-氨基酸接头(xxxxx)的序列。在可切割的树脂上重新合成这些双配体候选物，使用C₁₈柱(PhenomenexLuna，5μm，250×10mm)通过反相HPLC纯化，并通过ELISA测试与人类CD8α蛋白的协同结合。

实施例13：协同双配体的合成

为了合成第一组协同双配体，我们将来自CD8表位2C端的大环化合物Cy(HGRGH)和来自CD8表位1N端的大环化合物Cy(wplrf)连接起来。采用常规的基于Fmoc的固相肽合成(SPPS)在Rink酰胺树脂上制备Cy(wplrf)来起始合成。采用碘化亚铜(I)(1.5当量)和抗坏血酸(5当量)的NMP:哌啶(4:1)溶液使得肽在N-末端的Pra和C-末端的Az4之间环化。第二天，通过用含5％(w/v)二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物和5％(v/v)N,N-二异丙基乙胺的NMP振荡树脂5分钟，以去除与树脂结合的残留铜。然后，将各种长度的PEG接头(PEG₃、PEG₄、PEG₅、PEG₆和PEG₇)偶联到树脂上。由获得自ChemPep的Fmoc-NH-PEG₃-CH₂COOH(280103)、Fmoc-NH-PEG₄-CH₂COOH(280117)和Fmoc-NH-PEG₅-CH₂COOH(280104)制备PEG₃、PEG₄和PEG₅。Fmoc-NH-PEG₃-CH₂COOH的两次连续偶联产生PEG₆。Fmoc-NH-PEG₄-CH₂COOH和Fmoc-NH-PEG₃-CH₂COOH的偶联产生PEG₇。在偶联PEG接头后，将树脂重新返回AAPPTEC Titan 357仪器中，以合成双配体的剩余部分。第二次环化产生每个双配体的Cy(HGRGH)部分。通过螯合作用再次去除残留的铜。然后用92.5％TFA、2.5％H₂O、2.5％TIS(三异丙基硅烷)和2.5％DODT(3,6-二氧杂-1,8-辛二硫醇)处理4小时，使双配体从树脂上断裂下来，然后采用C₁₈柱通过反相HPLC进行纯化。

采用相同的策略来构建另一组包含来自CD8表位2C端的Cy(HGRGH)和来自CD8表位1N端的Cy(AKYRG)的双配体。

实施例14：确定协同性的测定

CD8 ELISA(亲和力测定)。步骤：在室温下用150至250nM生物素-PEG₃-修饰的双配体的TBS溶液(25mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.6)将黑色中性抗生物素蛋白包被的高结合容量96孔板(15510，Pierce)包被2小时。抽吸平板，然后用TBS洗涤。然后，用2μM生物素将平板封闭15分钟。然后，用TBS和/或洗涤缓冲液(0.05％(v/v)吐温-20的PBS溶液)洗涤板。将带有His标签的CD8α人重组蛋白(MBS968456，MyBioSource)连续稀释于洗涤缓冲液中(从200至0nM)，并在指定的微孔中在室温下孵育90分钟。抽吸微孔，随后用洗涤缓冲液洗涤(10×)。为了检测结合的CD8α蛋白，以1:10,000稀释度制备碱性磷酸酶(AP)缀合的抗-6X His

抗体[HIS-1](ab49746，Abcam)，并加入微孔中，在室温下保持1小时。抽吸平板，并用洗涤缓冲液洗涤(5×)。将

AP荧光基质***(S1000，Promega)用于显影。使用430nm的激发波长，记录535nm处的荧光发射。采用四参数回归曲线拟合程序(Origin 8.5)拟合滴定曲线以确定EC₅₀值。

通过分析CD8α晶体结构，图14示出估计CD8表位2C端和CD8表位1N端之间距离为

这预示将两个PCC大环化合物共价连接的优化接头将具有接近

的长度。在图17中，通过测试不同长度的聚乙二醇(PEG)接头来验证这种预测。在采用长度非常接近

的PEG接头将大环化合物Cy(HGRGH)和Cy(wplrf)彼此共价连接时，所得双配体(PEG₅)针对CD8的EC₅₀值为200pM。这表示相对于各自的PCC大环配体，亲和力提高了>30倍。更短或更长的接头所产生的双配体亲和力相对于任一种PCC大环化合物均得以改善，是最佳接头的亲和力的约～1/10。

双配体候选物生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG_x-Cy(wplrf)(x＝3至7)的结构示于表7。

实施例15：CD8双配体的结构和表征

表7：CD8双配体

在图18中，通过测试其中大环化合物Cy(HGRGH)和Cy(AKYRG)彼此共价连接的其它双配体来进一步验证这种想法。用PEG₅和PEG₆制备双配体，因为其长度与CD8表位2C端和CD8表位1N端之间的距离

最相似。这些双配体对CD8的EC₅₀值为25pM，表示相对于各自的PCC大环配体，亲和力改善>200倍。

双配体候选物生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG_x-Cy(AKYRG)(x＝5至6)的结构示于表7。

图17中的生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(wplrf)以及图18中的生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(AKYRG)和生物素-PEG₃-Cy(HGRGH)-PEG₆-Cy(AKYRG)显示的结合效应增强被称为结合协同性。由于CD8α具有明确定义的已知3D蛋白质结构，因而能够针对蛋白质的两个不同区域单独地开发PCC大环配体。利用设计适当的PEG接头，将两个配体以化学方式连接在一起，以形成对于靶标具有皮摩尔亲和力(pM＝10^-12M)的双配体。换言之，这些双配体显示出远优于任一各自配体的结合亲和力。

实施例16：其它双配体的合成

采用上述策略以合成包含以下的其它双配体：

·来自CD8表位2N端的Cy(PWTHG)和来自CD8表位1N端的Cy(AKYRG)

·来自CD8表位2N端的Cy(Ghtwp)和来自CD8表位2C端的Cy(hGrGh)(靶向人类CD8的单环表位的N-末端侧和C-末端侧)

采用每个大环化合物的逆-反式类似物来建立针对单环表位的双配体，以便含有对蛋白酶消化更稳定的D-氨基酸。发现逆-反式途径保留了大多数亲和力和选择属性，同时改善稳定性。

测试双配体对于带有His标签的CD8α人重组蛋白的亲和力。从每一类双配体获得皮摩尔结合物(图19)。将这些双配体显示出的结合效应增强称为结合协同性。

实施例17：CD8双配体的细胞结合测定

按照供应商的方案，采用淋巴细胞培养基(#LYMPH-1，Zen-Bio)将来自Zen-Bio的冷冻保存的人外周血单核细胞(PBMC)(1名供体；#SER-PBMC-F)进行解冻。然后将细胞重新悬浮于FACS缓冲液(1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液+2％胎牛血清+2mM EDTA)中。

步骤：用0.5μL Alexa Fluor 488标记的双配体Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(AKYRG)(终浓度：5μM)、2μL人类CD3-APC mAb(克隆：BW264/56)(#130-098-156，MACS Miltenyi Biotec)和2.5μL 7-AAD活力染色溶液(#00-6993，eBioscience)在室温下孵育人类PBMC(总共1×10⁶)的FAC缓冲液(50μL)，持续30分钟。作为对照，用20μL人类CD8-FITC mAb(克隆：RPA-T8)(#561947，BD Biosciences)、2μL人类CD3-APC(克隆：BW264/56)和2.5μL 7-AAD活力染色溶液在室温下孵育另一份人类PBMC(1×10⁶)的FAC缓冲液(50μL)样品，持续30分钟。在用FACS缓冲液洗涤一次后，使用BD LSR Fortessa X-20细胞计数器进行流式细胞术分析。获得数据，并分别用FACSCalibur和FACSDiva v8.0.1(BD Biosciences)进行分析。

将流式细胞术用于评估细胞CD8的双配体检测。用Alexa Fluor 488标记物重新合成针对重组人类CD8α蛋白的EC₅₀值为25pM的双配体Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(AKYRG)(图20A)。用CD3-APC mAb(pan T细胞标志物)和Alexa Fluor 488标记的双配体Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(AKYRG)对人类PBMC进行染色(图20B)。随后，洗涤样品，并分析绿色荧光(CD8；FITC-A)和红色荧光(CD3；APC-A)。采用7-AAD以从流式细胞术分析中排除非活力的细胞。通过为CD8⁺的双配体检测到Q2(10.9％)和Q4(11.6％)中的细胞群，并且其与供应商报道的CD8⁺细胞％一致。作为对照，用CD3-APC mAb和商业上的FITC标记的CD8mAb对另一份人类PBMC样品进行染色(图20C)。通过CD8-FITC mAb检测到的细胞群在Q2中为11.2％，并且在Q4中为2.1％。

实施例18：其它CD8双配体的结构和表征

表8：CD8双配体

实施例19：物种交叉反应性分析

为了测试与鼠CD8α的潜在交叉反应性，通过ELISA测定针对鼠CD8α蛋白的靶向人类CD8α的大环锚。图21示出针对固定化大环化合物的人类CD8α蛋白和鼠CD8α蛋白的ELISA滴定曲线。抗人类CD8α大环锚对人类蛋白具有较高的选择性，而与鼠蛋白的结合较弱。较高的物种选择性似乎是由化学表位靶向所产生的，化学表位靶向是用于开发针对人类CD8蛋白特定区域(表位)的大环化合物的方法。

使用氟-18正电子发射断层扫描(PET)以研究大环锚和双配体的体内药代动力学(PK)和在器官中的生物分布。

实施例20：氟-18放射化学

使用Fmoc固相肽合成，在Rink酰胺树脂上合成每种氨氧基-PCC。通过偶联Boc-氨氧基乙酸(AK Scientific，货号#66435)将氨氧基基团掺入至肽-树脂的N-末端。通过用TFA:H₂O:TIS:DODT(92.5:2.5:2.5:2.5)处理来实现树脂切割和侧链去保护。然后通过C₁₈HPLC纯化氨氧基-PCC，并在进行标记反应之前通过MALDI-MS确认其质量。

将氨氧基-PCC与4-氟苯甲醛缀合。通过使氨氧基-PCC(1当量)与4-氟苯甲醛(1当量；AK Scientific，货号#268112)在80℃下在100mM甲酸铵缓冲液(pH 4.0)/甲醇(2:1)中(反应体积＝1.5mL)反应20分钟来制备¹⁹F-氟苯甲醛肟。将反应混合物进行C₁₈HPLC以分离纯的¹⁹F-氟苯甲醛肟，并且通过MALDI-MS确认其质量。观察到两种肟异构体(E/Z)，并且通常收集作为非放射性(“冷”)标准品。

将氨氧基-PCC与4-[¹⁸F]氟苯甲醛([¹⁸F]FB)缀合。通过使用ELIXYS自动化放射合成仪，将[¹⁸F]FB与氨氧基-PCC缩合而得到¹⁸F-标记的大环锚和双配体。对于该反应(图22)，[¹⁸F]FB是限制性试剂，并且加入过量的氨氧基-PCC(5-10mg)。另外，反应条件与以上相同。通过C₁₈HPLC从反应混合物中纯化放射性标记的PCC，然后与“冷”¹⁹F-氟苯甲醛肟共同注射以证实其同一性。

对于[¹⁸F]FB的生产和随后的PCC标记，总体衰变校正的放射化学产率在1-10％的范围内。合成时间在100-130分钟的范围内，包括HPLC纯化和制剂注射。

实施例21：PET体内成像数据

在正常(健康)小鼠中，通过PET成像将放射性标记的大环锚和双配体的体内PK可视化并且定量测定。将放射性标记的肽配制在含有<10％EtOH的PBS(pH 7.4)中。经由每只小鼠的尾静脉以静脉内方式施用50-100μCi的放射性标记的肽。进行动态(0-1小时)和静态PET成像，以量化初始肽生物分布、清除初始浓度位点的时间和最终的***途径。随后获取CT扫描用于解剖学参考。以GENISYS⁸和Inveon microPET-CT小动物扫描仪进行成像。

通过PET测定三个大环锚在小鼠中的生物分布概况。在正常(健康)小鼠中，[¹⁸F]FB-标记的Cy(AKYRG)示出肾脏清除至膀胱(约1小时)(图23)，肝活性很小。在注射后2小时，肽主要在膀胱中。由于人类CD8和鼠CD8在其细胞外结构域的氨基酸序列仅仅具有40％的同源性，因而与鼠CD8没有显著的结合；因此，这些图像提供了用于评估在小鼠中清除而非靶向性的手段。

[¹⁸F]FB-标记的Cy(HGRGH)在正常(健康)小鼠中的生物分布是相似的(图24)，肾脏清除至膀胱(约1小时)，肝活性很小。在1-2小时内大环锚在肠道中存在少量活性。

[¹⁸F]FB-标记的Cy(wplrf)在正常(健康)小鼠中的生物分布具有以下特征：主要在肝脏和肠道内吸收，在注射后2小时一些清除物质到达至膀胱。该大环锚的肝胆清除似乎受其相对疏水性的影响。

作为对照，从施用[¹⁸F]FB的正常(健康)小鼠获得microPET-CT图像。图像(图26)示出快速的肾脏吸收和清除，然后完全到达膀胱花费接近30分钟。如果放射性标记的大环锚中的肟键在体内水解，则[¹⁸F]FB将会被释放并产生这种生物分布概况。由于大环锚示出不同的生物分布概况，因而这表明肟键在扫描过程中仍保持完整，并且主要由肽产生所观察到的生物分布。

由PET测定一种双配体在小鼠中的生物分布概况。在正常(健康)小鼠中，[¹⁸F]FB-标记的Cy(HGRGH)-PEG₅-Cy(wplrf)(图27)示出反映由两个组成性大环锚所产生的生物分布，其中经由肾(主要)和肝脏清除。

Claims (27)

1.一种特异性结合CD8的稳定的合成捕获剂，其中所述捕获剂包含对CD8上的第一表位具有亲和力的第一配体、对CD8上的第二表位具有亲和力的第二配体、和将所述第一配体共价连接至所述第二配体的接头，其中所述第一配体和所述第二配体各自由5个氨基酸组成，

其中：

a.所述第一表位包含序列SQFRVSPLD并且所述第二表位包含序列FLLYLSQNKP，

其中所述第一配体包含选自由AKYRG、wplrf、rwfnv和ffrly组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由PWTHG、slrfG、yGGvr和Ghtwp组成的组的氨基酸序列；

b.所述第一表位包含序列SQFRVSPLD并且所述第二表位包含序列AAEGLDTQR，

其中所述第一配体包含选自由AKYRG、wplrf、rwfnv和ffrly组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由HGRGH、wsvnv和hGrGh组成的组的氨基酸序列；

c.所述第一表位包含序列FLLYLSQNKP并且所述第二表位包含序列SQFRVSPLD，

其中所述第一配体包含选自由PWTHG、slrfG、yGGvr和Ghtwp组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由AKYRG、wplrf、rwfnv和ffrly组成的组的氨基酸序列；

d.所述第一表位包含序列FLLYLSQNKP并且所述第二表位包含序列AAEGLDTQR，

其中所述第一配体包含选自由PWTHG、slrfG、yGGvr和Ghtwp组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由HGRGH、wsvnv和hGrGh组成的组的氨基酸序列；

e.所述第一表位包含序列AAEGLDTQR并且所述第二表位包含序列SQFRVSPLD，

其中所述第一配体包含选自由HGRGH、wsvnv和hGrGh组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由AKYRG、wplrf、rwfnv和ffrly组成的组的氨基酸序列；

f.所述第一表位包含序列SQFRVSPLDRTWNLGETVELKSQ并且所述第二表位包含序列FLLYLSQNKP，

其中所述第一配体包含选自由HGSYG、KRLGA、AKYRG、hallw、lrGyw、vashf、nGnvh、wplrf、rwfnv、havwh、wvplw、ffrly和wyyGf组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由PWTHG、slrfG、yGGvr和Ghtwp组成的组的氨基酸序列；

g.所述第一表位包含序列SQFRVSPLDRTWNLGETVELKSQ并且所述第二表位包含序列AAEGLDTQR，

其中所述第一配体包含选自由HGSYG、KRLGA、AKYRG、hallw、lrGyw、vashf、nGnvh、wplrf、rwfnv、havwh、wvplw、ffrly和wyyGf组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由HGRGH、wsvnv和hGrGh组成的组的氨基酸序列；

h.所述第一表位包含序列SQFRVSPLDRTWNLGETVELKSQ并且所述第二表位包含序列FLLYLSQNKPKAAEGLDTQR，

其中所述第一配体包含选自由HGSYG、KRLGA、AKYRG、hallw、lrGyw、vashf、nGnvh、wplrf、rwfnv、havwh、wvplw、ffrly和wyyGf组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由AGDSW、HVRHG、HGRGH、THPTT、FAGYH、WTEHG、PWTHG、TNDFD、LFPFD、slrfG、yfrGs、wnwvG、vawlG、fhvhG、wvsnv、wsvnv、lnshG、yGGvr、nsvhG、ttvhG、fdvGh、rhGwk、Ghtwp和hGrGh组成的组的氨基酸序列；或者

i.所述第一表位包含序列FLLYLSQNKPKAAEGLDTQR并且所述第二表位包含序列SQFRVSPLD，

其中所述第一配体包含选自由AGDSW、HVRHG、HGRGH、THPTT、FAGYH、WTEHG、PWTHG、TNDFD、LFPFD、slrfG、yfrGs、wnwvG、vawlG、fhvhG、wvsnv、wsvnv、lnshG、yGGvr、nsvhG、ttvhG、fdvGh、rhGwk、Ghtwp和hGrGh组成的组的氨基酸序列，并且

其中所述第二配体包含选自由AKYRG、wplrf、rwfnv和ffrly组成的组的氨基酸序列，

其中氨基酸序列中小写字母表示D型氨基酸，大写字母表示L型氨基酸。

2.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第一配体是线性肽。

3.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第一配体是环肽。

4.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体是线性肽。

5.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体是环肽。

6.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第一配体包含1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代的-1,2,3-***残基(Tz5)。

7.根据权利要求6所述的捕获剂，其中所述***残基是1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)。

8.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第二配体包含1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)或1,5-取代的-1,2,3-***残基(Tz5)。

9.根据权利要求8所述的捕获剂，其中所述***残基是1,4-取代的-1,2,3-***残基(Tz4)。

10.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述接头为二价。

11.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述接头的长度对应于所述第一表位和所述第二表位之间的距离。

12.根据权利要求11所述的捕获剂，其中所述接头的长度为

至

13.根据权利要求12所述的捕获剂，其中所述接头的长度为

14.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述接头包含一个或多个乙二醇重复单元。

15.根据权利要求14所述的捕获剂，其中所述接头包括PEG₁、PEG₂、PEG₃、PEG₄、PEG₅、PEG₆、PEG₇或PEG₈。

16.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述接头包含氨基酸或肽。

17.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述捕获剂标记有可检测部分。

18.根据权利要求17所述的捕获剂，其中所述可检测部分选自由生物素、铜-DOTA、生物素-PEG₃、氨氧基乙酸酯、¹⁹FB、¹⁸FB和FITC-PEG₃所组成的组。

19.根据权利要求17所述的捕获剂，其中所述可检测部分选自由⁶⁴Cu DOTA、⁶⁸Ga DOTA、⁶⁸Ga NOTA、¹⁸F、Al¹⁸F NOTA、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、⁸⁹Zr、¹²⁴I、⁸⁶Y、^94mTc、^110mIn、¹¹C和⁷⁶Br所组成的组。

20.根据权利要求1所述的捕获剂，其中所述第一配体和所述第二配体选自以下捕获剂中的配体

21.根据权利要求1所述的捕获剂，其中

所述第一配体包含HGRGH，并且所述第二配体包含wplrf；或

所述第一配体包含HGRGH，并且所述第二配体包含AKYRG；或

所述第一配体包含Ghtwp，并且所述第二配体包含hGrGh；或

所述第一配体包含PWTHG，并且所述第二配体包含AKYRG。

22.根据权利要求1所述的捕获剂，选自以下捕获剂

23.根据权利要求1至22中任一项所述的捕获剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于确定、检测、定量和/或分离生物样品中的CD8，包括使所述生物样品与一种或多种所述捕获剂接触。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述捕获剂标记有可检测部分。

25.根据权利要求24所述的用途，还包括将CD8与所述一种或多种捕获剂结合，并且检测与所述一种或多种捕获剂连接的所述可检测部分。

26.权利要求1至22中任一项所述的捕获剂在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于对与存在CD8相关的病症进行诊断和/或分期。

27.一种生产如权利要求1至22中任一项所述的合成捕获剂的方法，其中所述合成捕获剂与CD8靶蛋白特异性结合，包括：

a.选择与所述第一表位结合的所述第一配体，

b.选择与所述第二表位结合的所述第二配体，

c.选择接头，其中所述接头的长度允许当所述第一配体和所述第二配体分别特异性结合所述第一表位和所述第二表位时所述接头同时与所述第一配体和所述第二配体结合，和

d.将所述接头与所述第一配体和所述第二配体结合，由此产生与所述靶蛋白特异性结合的所述合成捕获剂。

Images