CN108273051B - 猪a型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法。包括以下步骤：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；将培养基在高压锅内高压灭菌，待到温度降低后，把病料倒入高压锅内，厌氧培养，传代3次；取三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤培养，培养结束后离心，取上清液；向上清液加入灭活剂，充分振摇，灭活脱毒，得灭活菌液；将灭活菌液与佐剂混合，得灭活疫苗。本发明提供的方法工艺简单、成本低、污染小，制备出的灭活疫苗安全性高，注射后无不良反应，免疫效力高、免疫期长。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法。
背景技术
产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，可产生多种外毒素及酶类，能分解肌肉和***中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死。根据产气荚膜梭菌所合成分泌的主要毒素，分为A、B、C、D、E五种毒素型；其中A型产气荚膜梭菌主要引起胃肠道的病变，是人畜气性坏疽病，兔梭菌性下痢，马坏死性肠炎及人食物中毒的主要致病菌，也是引起鹿出血性肠炎的主要致病菌。该型菌产生的多种外毒素中，最主要的是α毒素。猪A型产气荚膜梭菌是造成仔猪、育肥猪、怀孕母猪以及种猪“猝死”的主要原因，以胃肠道弥漫性出血而引起的肠毒血症和坏死性肠炎为特征，发病急，病程短，无任何前期征兆而突然死亡。
目前，产气荚膜梭菌灭活疫苗的也有较多的研究，中国专利申请CN102698259A公开了一种鸡坏死性肠炎(A型)灭活疫苗制备方法，将A型产气荚膜梭菌CVCC37株种子液按培养基总量的1％-2％接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃厌氧发酵培养/或静置培养6小时，培养结束后经3000r/min离心30min去除菌体，分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩***进行超滤浓缩，经0.6％的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20％额氢氧化铝配制成疫苗。中国专利申请CN104623651A公开了一种家兔魏氏梭菌病的A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的制备方法，该方法以A型产气荚膜梭菌为原始菌种，经过一级和二级培养后最终获得菌液，将该菌液与白油佐剂混合即制得A型产气荚膜梭菌灭活疫苗；其中，所用灭活剂为最终质量分数为0.3％的甲醛，佐剂为白油佐剂。曲海波等([1]曲海波,刘洪斌,白同臣.A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与全菌灭活疫苗的安全性和免疫效力的比较研究[J].中国兽药杂志,2010,44(02):15-16.)研究了六批兔A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗和其全菌灭活疫苗，并且对其安全性和免疫效力进行了比较研究；结果表明，类毒素灭活疫苗无毒副作用，局部刺激小，安全性好于全灭活疫苗，免疫效力结果二者无明显差异，两种疫苗的攻毒保护率均不低于4/5，免疫期均在6个月以上；其中灭活剂采用0.4％的甲醛溶液，佐剂采用氢氧化铝胶。
目前，A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的研究针对的牲畜多为鹿、兔、牛，针对猪A型荚膜梭菌灭活疫苗的研究较少，而且简单的替换并不能得到安全性好、稳定性高、免疫效果好的猪疫苗，并且现有技术中产气荚膜梭菌的灭活试剂采用的是有致癌效果的甲醛，佐剂多采用含有重金属的氢氧化铝胶。这些疫苗在使用中尚存在一些需要进一步解决的问题：(1)家畜接种反应较重；(2)注射剂量大，使用多有不便(3)制备过程繁琐，时间较长。因此，需要改进制备过程和筛选培养基和佐剂，以快速制备出高效的疫苗，来提高疫苗免疫原性和集体免疫应答水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述缺陷，提供猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法。该方法简便可行、操作简单、成本低、污染小，制备出的灭活疫苗安全性高，注射后无不良反应，免疫效力高、免疫期长。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法，包括以下步骤：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；
(2)菌种培养：将培养基在高压锅内高压灭菌，待到温度降低后，把病料倒入高压锅内，厌氧培养，传代3次，其中培养基是纯牛奶和葡萄糖的合成培养基；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤培养，培养结束后离心，取上清液；
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入灭活剂，充分振摇，灭活脱毒，得灭活菌液，其中灭活剂是二乙烯亚胺和β-丙内酯；
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂混合，得灭活疫苗；其中，所述佐剂为免疫刺激复合物。
病原的选取关系到疫苗的生物学效力，本申请直接刮取肠道内容物为病原，可以避免保藏菌种可能出现的活力下降、毒性下降等问题，高温高压条件下抑制和杀死其他肠道病原菌；A型产气荚膜梭菌大量繁殖产酸产气，保证了A型产气荚膜梭菌的纯度和浓度。
培养基是细菌的人工养料，根据细菌的不同要求用人工方法将各种养料配制在一起成为维持和繁殖细菌的基础，制备适用的培养基，提供细菌所需的营养物质和生长条件，了解其生长和繁殖的规律，可以提高菌苗的质量和数量。本申请采用纯牛奶和葡萄糖合成培养基，传代3次，获得纯培养；再将纯化后的菌种在胰酶消化汤中扩增培养，采用肉肝胃膜消化汤来培养，该培养基培养出的A型梭菌的毒力相比普通培养基培养的毒力高，菌苗质量好。
灭活剂是用于灭活微生物的化学试剂或药品，是生物制品中的一项非常重要的技术，用来提高生物制品的安全性和防止病原体扩散。常用的灭活剂是甲醛，但是甲醛是一种强烈刺激性的致癌物质，其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A,G,U)，又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活；用甲醛灭活时间长，并且灭活的效果易受温度、pH、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，在研究中应引起注意；残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生制激性反应。本申请中采用二乙烯亚胺和β-丙内酯作为灭活剂，二乙烯亚胺主要作用于核酸，蛋白免疫抗原保持较好，且毒性小，但是灭活的病毒稳定性差，疫苗的有效期短；β-丙内酯直接与病毒核酸作用，而不作用于壳蛋白，能够保持免疫原性，具有强灭活效果，而且灭活时间短，极易水解，不必考虑成品在疫苗中的残留，虽然有诸多优势，但是β-丙内酯是一种潜在的致癌因子，而且保存时间过长引起自身聚合影响灭活效果。二乙烯亚胺和β-丙内酯共同作为灭活剂可以协同作用，优劣互补，不仅缩短了灭活时间，提高了灭活效力，还改善了疫苗的安全性，保持了病毒的免疫原性。
佐剂是可以增强抗原特异性免疫应答的物质。佐剂能够明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答，而且可以用最小的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。常用的佐剂是氢氧化铝胶，但是氢氧化铝胶制成的疫苗注射量大，免疫力持续时间短，家畜反应重，皮下注射常有肿胀或结块；本申请采用免疫刺激复合物作为佐剂，免疫刺激复合物(ISCOM)是由皂苷、油脂、胆固醇和抗原组成，通过前3个组分之间的疏水作用而结合在一起。疏水或亲水的抗原均可以结合到其复合物上，与其他佐剂相比，ISCOM更安全，能够形成长效生物活性反应，具有佐剂和抗原提呈的双重功能。
进一步，上述步骤(1)中，冷藏温度为2-5℃，冷冻温度为-20℃。
进一步，上述步骤(2)中，高压锅灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降到80℃后，把病料倒入高压锅内，42-45℃高温厌氧培养4-6h进行传代。本申请选择在80°加病料这一大胆的改进，既杀灭了无关病原菌又缩短了病菌分离纯化培养的时间，大大缩短了疫苗制作时间。
进一步，上述步骤(3)中，取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养6-10h，培养结束后在4000-6000r/min离心10-15min，取上清液。
更进一步，肉肝胃膜消化汤成分包括：猪胃粘膜、牛肉、牛肝、盐酸、氢氧化钠、去离子水和乙醇。
根据本申请的一个实施例，肉肝胃膜消化汤成分包括：猪胃粘膜150g、牛肉100g、牛肝100g、盐酸10mL、氢氧化钠6g、去离子水1000mL和乙醇100mL。
更进一步，肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉、牛肝、猪胃粘膜搅碎，加入蒸馏水、盐酸和乙醇，混合均匀后冷浸20-24h，缓慢加热至温度56±1℃保持22-24h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
进一步，上述步骤(4)中，向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.02-0.05％，将混合液在20-30℃震荡灭活20-24h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液。
进一步，上述步骤(5)中，免疫刺激复合物的制备包括以下步骤：
1)脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；
2)皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为10-15mg/mL。
3)免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:(3-5)充分混合室温下裂解5-7h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
更进一步，上述步骤(5)中，灭活菌液与佐剂的体积比为1：(2-4)。
根据本申请的一个实施例，一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法，包括以下步骤：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，2℃冷藏；
(2)菌种培养：将培养基在高压锅内高压灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降低至80℃，把病料倒入高压锅内，44℃高温厌氧培养4h进行传代，传代3次，其中培养基是纯牛奶和葡萄糖的合成培养基；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养8h，培养结束后在6000r/min离心10min，取上清液；其中，肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉100g、牛肝100g、猪胃粘膜150g搅碎，加入蒸馏水1000mL、盐酸10mL和乙醇100mL，混合均匀后冷浸20h，缓慢加热至温度56℃保持24h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液75mL调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.04％，将混合液在30℃震荡灭活20h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液。
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂按体积比1:3混合，得灭活疫苗；其中，所述佐剂为免疫刺激复合物；其中，免疫刺激复合物的制备包括以下步骤：
1)脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；
2)皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为12mg/mL。
3)免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:5充分混合室温下裂解7h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
本发明的另一个目的是提供一种根据上述任一制备方法制备得到的猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗。
本发明的有益效果：
(1)直接刮取肠道内容物为病原，高温高压条件下抑制和杀死其他肠道病原菌；A型产气荚膜梭菌大量繁殖产酸产气，保证了A型产气荚膜梭菌的纯度和浓度。80度加病料这一大胆的改进，既杀灭了无关病原菌又缩短了病菌分离纯化培养的时间，大大缩短了疫苗制作时间。
(2)以牛奶为培养基快速发酵分离提纯菌种，肉肝胃膜消化汤作为扩增培养基，培养出的A型梭菌的毒力相比普通培养基培养的毒力高，菌苗质量好。
(3)采用烷化剂与β-丙内酯协同作用极大程度上提高了灭活的效力，缩短灭活时间，提高了疫苗的安全性。
(4)疫苗包含灭活的菌体蛋白，内毒素和外毒素，免疫原性好，保护率高。
(5)疫苗的免疫效力高，免疫力持续时间长。
(6)过敏反应小，不影响精神，食欲，注射局部无肿胀，无坏死。
(7)工艺简单、时间短，成本低廉。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，2℃冷藏；
(2)菌种培养：将纯牛奶和葡萄糖的合成培养基在高压锅内高压灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降低至80℃，把病料倒入高压锅内，44℃高温厌氧培养4h进行传代，传代3次；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养8h，培养结束后在6000r/min离心10min，取上清液；其中，肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉100g、牛肝100g、猪胃粘膜150g搅碎，加入蒸馏水1000mL、盐酸10mL和乙醇100mL，混合均匀后冷浸20h，缓慢加热至温度56℃保持24h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液75mL调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.04％，将混合液在30℃震荡灭活20h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液。
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂按体积比1:3混合，得灭活疫苗；其中，所述佐剂为免疫刺激复合物，制备方法为：1)脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；2)皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为12mg/mL。3)免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:5充分混合室温下裂解7h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
实施例2
一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，5℃冷藏；
(2)菌种培养：将纯牛奶和葡萄糖的合成培养基在高压锅内高压灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降低至80℃，把病料倒入高压锅内，45℃高温厌氧培养4h进行传代，传代3次；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养10h，培养结束后在6000r/min离心15min，取上清液；其中，肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉100g、牛肝100g、猪胃粘膜150g搅碎，加入蒸馏水1000mL、盐酸10mL和乙醇100mL，混合均匀后冷浸24h，缓慢加热至温度57℃保持24h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液75mL调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.05％，将混合液在30℃震荡灭活20h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液。
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂按体积比1:4混合，得灭活疫苗；其中，所述佐剂为免疫刺激复合物，制备方法为：1)脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；2)皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为15mg/mL。3)免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:5充分混合室温下裂解7h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
实施例3
一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，4℃冷藏；
(2)菌种培养：将纯牛奶和葡萄糖的合成培养基在高压锅内高压灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降低至80℃，把病料倒入高压锅内，42℃高温厌氧培养6h进行传代，传代3次；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养6h，培养结束后在4000r/min离心10min，取上清液；其中，肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉100g、牛肝100g、猪胃粘膜150g搅碎，加入蒸馏水1000mL、盐酸10mL和乙醇100mL，混合均匀后冷浸20h，缓慢加热至温度55℃保持22h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液75mL调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.02％，将混合液在20℃震荡灭活24h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液。
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂按体积比1:2混合，得灭活疫苗；其中，所述佐剂为免疫刺激复合物，制备方法为：1)脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；2)皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为10mg/mL。3)免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:3充分混合室温下裂解5h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
实施例4
一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，4℃冷藏；
(2)菌种培养：将纯牛奶和葡萄糖的合成培养基在高压锅内高压灭菌，灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降低至80℃，把病料倒入高压锅内，43℃高温厌氧培养5h进行传代，传代3次；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养8h，培养结束后在5000r/min离心12min，取上清液；其中，肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉100g、牛肝100g、猪胃粘膜150g搅碎，加入蒸馏水1000mL、盐酸10mL和乙醇100mL，混合均匀后冷浸22h，缓慢加热至温度56℃保持22h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液75mL调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.04％，将混合液在25℃震荡灭活23h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液。
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂按体积比1:3混合，得灭活疫苗；其中，所述佐剂为免疫刺激复合物，制备方法为：1)脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；2)皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为12mg/mL。3)免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:3充分混合室温下裂解6h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
对比例1
将实施例1步骤(4)的菌液灭活过程改为：向步骤(3)的菌液加入甲醛溶液，使甲醛的最终质量分数为0.4％，37℃灭活脱毒3天，得灭活菌液；
实施例5
将实施例1步骤(4)得到的灭活菌液、对比例1得到的灭活菌液、未处理的猪A型产气荚膜梭菌病毒、不含病毒的培养基和实施例1灭活剂的混合液、不含病毒的培养基和对比例1灭活剂的混合液，接种到健康的ST细胞中，并做空白对照(不接种)，盲传到第三代观察细胞病变。观察细胞状态，结果发现，接种实施例1步骤(4)得到的灭活菌液、对比例1得到的灭活菌液、不含病毒的培养基和实施例1灭活剂的混合液、不含病毒的培养基和对比例1灭活剂的混合液的细胞数量与空白对照组一致，符合正常细胞生长状态，为发生病变；而接种未处理的猪A型产气荚膜梭菌病毒的细胞全部病变。
实施例6
猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的无菌检查
无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，均无菌生长。
实施例7
猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的安全性检查
(1)最小使用日龄猪一次单剂量接种疫苗的安全性试验
取30日龄健康易感猪20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别脖子肌肉注射实施例1提供的方法制备的3个批次的疫苗(第1批、第2批和第3批)，2ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察犬精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。
结果表明，经肌肉注射一次单剂量后，猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活。
(2)单剂量重复接种疫苗的安全性试验
取30日龄健康易感猪20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别肌肉接种按照实施例1方法制备的3个批次的疫苗，2ml/只，14日后加强免疫一次，2ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察猪精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。
结果表明，经肌肉途径重复接种疫苗后，猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活。
(3)一次超剂量接种疫苗的安全性试验
取30日龄健康易感猪20只，随机分成4组，5只/组。前3组分别肌肉接种按照实施例1制备的3个批次疫苗，6ml/只；第4组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察猪精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应。
结果表明，经肌肉途径超剂量接种疫苗后，猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活。
(4)疫苗对怀孕母猪的安全性试验
疫苗按照实施例1方法制备，取怀孕母猪10只，随机分成2组，5只/组。第1组于产前20日肌肉接种疫苗，8ml/只；第2组不接种作为对照。相同条件下饲养，观察10日，每日观察猪精神、饮食、粪便是否正常，注射部位及全身有无不良反应，并跟踪观察其产仔情况。
结果表明，怀孕母猪于产前20龄经肌肉超剂量接种后，母猪精神状态、饮食、粪便均正常，注射部位及全身未见不良反应，所有猪均健活，且产仔正常。
结论
用3批猪A型魏氏梭菌灭活苗进行了一次单剂量接种的安全试验、单剂量重复接种的安全性试验、一次超剂量接种的安全试验，结果均是安全的。表明该疫苗用于免疫接种猪是安全的。对实施例2、实施例3、实施例4也进行了上述试验(1)-(4)，结果表明，该疫苗用于免疫接种猪是安全的。
实施例8
猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的效力试验
取实施例制备的3批猪A型魏氏梭菌灭活疫苗，取健康易感猪80只，随机分为16组，5只/组。1、2、3组猪分别肌肉接种按照实施例1制备的3批疫苗2ml/只，4、5、6组猪分别肌肉接种按照实施例2制备的3批疫苗2ml/只，7、8、9组猪分别肌肉接种按照实施例3制备的3批疫苗2ml/只，10、11、12组猪分别肌肉接种按照实施例4制备的3批疫苗2ml/只，对照组1、2、3组猪分别肌肉接种按照中国专利CN101708332A提供的制备方法制得的3批疫苗2ml/只，空白组不进行免疫。分别于14日、30日、90日、120日、180日、270日口服梭菌活培养液15ml攻毒，观察10日，记录发病情况。结果如表1所示。
表1猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的效力试验
备注：保护率＝键活数/试验数
综上，本申请制备的疫苗安全性好，局部刺激性小，无肿块、肉芽肿等不良反应出现；且免疫效力高，免疫期长，可达9个月以上；在免疫期内进行效力检验，均符合《中国兽药典》质量标准。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗的快速高效制备方法，其特征在于，步骤为：
(1)病原菌的获取：挑取A型产气荚膜梭菌致死病猪的病料，刮取肠道内容物，冷藏或冷冻；
(2)菌种培养：将培养基在高压锅内高压灭菌，待到温度降低后，把病料倒入高压锅内，厌氧培养，传代3次，其中培养基是纯牛奶和葡萄糖的合成培养基；
(3)菌液制备：取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤培养，培养结束后离心，取上清液；
(4)菌液灭活：向步骤(3)的菌液加入质量分数为0.2％的二乙烯亚胺溶液使其最终质量分数为0.02-0.05％，将混合液在20-30℃震荡灭活20-24h，后加入β-丙内酯使其终浓度为1g/L，在37℃震荡灭活2h，加入1mol/L的无菌硫代硫酸钠溶液，使其终浓度与二乙烯亚胺一致，终止灭活1h，得灭活菌液；
(5)疫苗制备：将灭活菌液与佐剂混合，得灭活疫苗；
其中，灭活菌液与佐剂的体积比为1：(2-4)；
所述佐剂为免疫刺激复合物；所述免疫刺激复合物的制备包括以下步骤：
S1：脂类混合物溶液的配制：将卵磷脂和胆固醇加至20％Mega-10中，使两者终浓度都为10mg/mL；
S2：皂苷溶液的配制：将QS-21溶解于pH为7.2的PBS溶液中，调整浓度为10-15mg/mL；
S3：免疫刺激复合物制备：将脂类混合物溶液和皂苷溶液按体积比为1:(3-5)充分混合室温下裂解5-7h；冰浴超声处理，透析，过0.22μm滤膜除菌后于4℃保存备用。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，冷藏温度为2-5℃，冷冻温度为-20℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高压锅灭菌温度为110℃，灭菌时间为20min；待到温度降到80℃后，把病料倒入高压锅内，42-45℃高温厌氧培养4-6h进行传代。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，取步骤(2)中三次传代的菌液接入肉肝胃膜消化汤37℃培养6-10h，培养结束后在4000-6000r/min离心10-15min，取上清液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述肉肝胃膜消化汤成分包括：猪胃粘膜、牛肉、牛肝、盐酸、氢氧化钠、去离子水、乙醇。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述肉肝胃膜消化汤的制备包括以下步骤：将牛肉、牛肝、猪胃粘膜搅碎，加入蒸馏水、盐酸和乙醇，混合均匀后冷浸20-24h，缓慢加热至温度56±1℃保持22-24h，每1h搅拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氢氧化钠溶液调pH值，绒布过滤，取上清液116℃灭菌30min备用。
7.一种根据权利要求1-6任一制备方法制备得到的猪A型产气荚膜梭菌灭活疫苗。
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