CN110082466A - 一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，具体涉及一种用于监测地黄加工炮制工艺和评价熟地黄熟质量的方法，属于中药技术领域，该方法以熟地黄炮制过程中变化明显的糖和低聚类成分的HPLC‑ELSD指纹图谱以及标志化合物的峰面积比值进行熟地黄炮制过程的质量控制，包含以下步骤：(1)供试品粉碎；(2)成分提取；(3)色谱条件、特征图谱、指纹图谱相似度限定值；(4)色谱峰比值限定值。本方法简便，可以明确的判定熟地黄炮制是否实质上的完成，同时可方便地识别熟地黄产品是否得到有效的炮制，对于生、制饮片制定具有个性特色的质量标准提供示范。

Description

一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法
技术领域
本发明涉及一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，尤其是能指示蒸制程度。
背景技术
熟地黄为生地黄的炮制加工品，是中药生熟异用的典型代表之一，由于生熟地黄药性和功能主治均不一样，因此，炮制的成功与否对熟地黄质量及应用有着重要的影响，熟地黄传统加工方法为九蒸九晒，当下熟地黄的加工方法为机械化大生产，熟地黄炮制工艺有两种，即蒸法或酒炖法，一般是在密闭容器中蒸或炖数小时后再焖数小时，大生产中对生地黄是否成功炮制成熟地黄是以“蒸至黑润”或“炖至酒吸尽”来判定。这种判定标准有着较大的人为因素，同时原料生地黄表面棕黑色及断面乌黑色干扰结果的判定，不同生产企业、不同操作人员判定标准存在差异，由此差异带来产品质量的差异，影响临床疗效的发挥。此外目前大生产中自动化程度较高，多以固定蒸制时间和焖制时间来控制产品的加工过程，当蒸锅或炖锅密闭效能降低(漏气)时，因判定标准的可塑性，不能及时发现因炮制温度不足造成熟地黄炮制欠缺，容易将不合格品流入市场。因此需要用现代药物分析技术建立客观化、准确的熟地黄质量控制方法，以更好的控制熟地黄饮片质量，确保临床用药的效果。
发明内容
本发明目的是提供一种以高效液相色谱法判定内在成分比例是否达标来判定熟地黄是否炮制合格的方法，方法准确，判定方便，不仅能指导企业工艺参数的合理设定，也能监测设备密闭***的完好程度，能够克服现有的判定标准因靠人为感官判断、缺乏刚性指标带来的产品质量不确定性和临床疗效的不确定性的不足。
一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，包含以下步骤：(1)供试品粉碎；(2)成分提取；(3)色谱条件、特征图谱、指纹图谱相似度限定值；(4)色谱峰比值限定值；
所述的步骤(1)供试品粉碎包括：取本品适量，剪碎，精密称定，精密加入等量硅藻土，粉碎成细粉；
所述步骤(2)成分提取包括：取粉末，精密称定，置锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液，超声处理1小时，高速离心或用微孔滤膜滤过；
所述步骤(3)色谱条件包括：色谱柱：糖柱(参考色谱柱PrevailCarbohydrateES)；流动相：以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱；蒸发光散射检测器检测；
所述指纹图谱包括：指纹图谱共有峰8个，其中6个峰标定为果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖；
所述特征图谱限定值包括：熟地黄的HPLC色谱图与对照指纹图谱比较，单糖寡糖指纹图谱相似度≥0.95时为炮制合格；
所述步骤(4)色谱峰比值限定值包括：指纹图谱中峰1～峰8分别为果糖(峰1)、葡萄糖(峰3)、蔗糖(峰4)、蜜二糖(峰5)、棉子糖(峰6)、甘露三糖(峰7)、水苏糖(峰8)，熟地黄的HPLC色谱图中，果糖峰面积为水苏糖2倍以上时为炮制合格；或果糖峰面积为棉籽糖20倍以上时为炮制合格。
由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：该检测方法简便，可以明确的判定熟地黄炮制是否实质上的完成，同时可方便地识别熟地黄是否得到有效的炮制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中的熟地黄对照指纹图谱；
图2是本发明实施例中的熟地黄样品相似度测定图；
图3是本发明实施例中的生地黄样品相似度测定图；
图4是本发明实施例中的地黄不同蒸制时段相似度测定图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1:本发明检测方法
①色谱柱：Prevail Carbohydrate ES(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，水为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度100℃，N2流速2.0ml/min；理论板数按水苏糖峰计算应不低于2000。地黄糖类成分在此色谱条件下可以得到良好的分离。
流动相梯度表
②参照峰的选择及配制
在熟地黄糖类图谱中，以甘露三糖成分在药材中有较高的分离度和相对含量，故选择甘露三糖作为熟地黄指纹图谱的参照峰。取甘露三糖对照品适量，精密称定，加25％甲醇制成每1ml含甘露三糖1.5mg的溶液，即得。
③供试品溶液的制备
取本品适量，剪碎，精密称定，精密加入等量硅藻土，研匀，取粉末约2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入25％甲醇溶液25ml，超声处理1小时，高速离心10min后用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
④在上述检测方法下
可将熟地黄中一系列单糖、寡糖相分离。采用上述方法，对不同生产设备、不同参数下生产出的熟地黄进行检测，通过相似度、峰面积比值等计算，可判定炮制质量是否符合要求，也可作为饮片加工企业工艺验证量化指标。
实施例2:本发明检测方法验证
①熟地黄精密度考察
按照上述制备方法及色谱条件，制备供试品溶液1份，连续进样6次，记录色谱图，并按国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对其相似度进行评价，以选取的7个特征峰作为Mark峰，以Mark峰模式进行相似度计算，结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对保留峰面积基本一致，相似度大于0.990，RSD％＜3.0％，符合指纹图谱技术要求，该方法精密度良好。
②重复性试验
精密称取熟地黄6份，按照上述制备方法及色谱条件分别进行测定，记录色谱图，并按国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***分别对其相似度进行评价，以Mark峰模式进行相似度计算，对各色谱峰的相对保留时间和相对保留峰面积进行统计。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对保留峰面积统计符合指纹图谱技术要求,该方法具有较好的重复性。
③稳定性试验
按照上述制备方法及色谱条件制备熟地黄供试品溶液各1份并进行测定，分别在0、4、8、12、16、20、24h时注入液相色谱仪，记录色谱图，并按国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对其相似度进行评价，以Mark峰模式进行相似度计算，对各色谱峰的相对保留时间和相对保留峰面积进行统计，结果显示熟地黄供试品溶液在24小时内稳定。
④熟地黄对照指纹图谱的建立
应用国家国家药典委员会发布的中药指纹图谱相似度评价***对生地黄和熟地黄样品指纹图谱进行分析，提取熟地黄共有峰生成对照图谱，见图1，根据数据分析最终确定8个共有峰，其中峰1为果糖、峰3为葡萄糖、峰4为蔗糖、峰5为蜜二糖、峰6为棉子糖、峰7为甘露三糖(S峰)、峰8为水苏糖。
以甘露三糖7号峰为参照峰，8个共有峰的保留时间和相对峰面积如表1所示：
表1标准指纹图谱共有峰保留时间和相对峰面积
实施例3:本发明检测方法应用
①不同生产企业熟地黄样品与熟地黄对照指纹图谱相似度评价分析
取8家企业生产的15批熟地黄样品，进行指纹图谱相似度的测定，运用上述生成的地黄对照指纹图谱作对照，采用国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对其相似度进行评价，结果见图2、表2。
表2熟地黄样品相似度测定结果
由上表可知，15批熟地黄指纹图谱与熟地黄对照指纹图谱的相似度均大于0.95，果糖峰面积与水苏糖及棉籽糖峰面积之比均达到2倍及20倍，表明这些企业的熟地黄炮制质量均符合要求。
②炮制欠缺样品与熟地黄对照指纹图谱相似度评价分析
对经验鉴别认为已经经过炮制但未炮制完全的样品，进行指纹图谱相似度的测定，运用上述生成的地黄对照指纹图谱作对照，采用国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对其相似度进行评价，结果见表3。
表3炮制欠缺样品与熟地黄对照指纹图谱相似度评价
由上表可知，10批炮制欠缺熟地黄样品指纹图谱与熟地黄对照指纹图谱的相似度均小于0.95，果糖峰面积与水苏糖及棉籽糖峰面积之比均未达到2倍及20倍，表明这些批次熟地黄炮制质量不符合要求，这一结果与经验鉴别一致。
③生地黄样品与熟地黄对照指纹图谱相似度评价分析
取4家企业生产的7批生地黄样品，进行指纹图谱相似度的测定，运用上述生成的地黄对照指纹图谱作对照，采用国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对其相似度进行评价，结果见图3、表4。
表4生地黄样品与熟地黄对照指纹图谱相似度评价
由上表可知，7批生地黄样品指纹图谱与熟地黄对照指纹图谱的相似度均小于0.40，果糖峰面积与水苏糖及棉籽糖峰面积之比均远小于2倍及20倍，表明生地黄指纹图谱与熟地黄指纹图谱有显著性差异。
④地黄加工不同时间段与熟地黄对照指纹图谱相似度评价分析
取同一批生地黄样品，入锅蒸制，分别于3、6、9、12、15、18、21、24、27小时取样，并进行指纹图谱相似度的测定，运用上述生成的地黄对照指纹图谱作对照，采用国家药典会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价***对其相似度进行评价，结果见图4、表5。
表5地黄加工不同时段与熟地黄对照指纹图谱相似度评价
由上表可知，地黄加工过程中相似度在发生变化，至少蒸制12小时以上，方能满足指纹图谱与熟地黄对照指纹图谱的相似度大于0.95，且果糖峰面积与水苏糖及棉籽糖峰面积之比大于2倍及20倍，表明熟地黄指纹图谱和峰面积比值与蒸制时间相关性明显。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，其特征在于包含以下步骤：采用液相色谱为分离手段，以蒸发光散射检测器或示差检测器等检测器为检测手段，同时获得熟地黄和地黄的高效液相(HPLC)对照指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价***计算各熟地黄样品的相似度，根据相似度以及果糖与水苏糖峰面积比值，或果糖与棉籽糖峰面积比值来评价炮制质量。
2.根据权利要求1所述的一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)供试品粉碎；(2)成分提取；(3)色谱条件、特征图谱、指纹图谱相似度限定值；(4)色谱峰比值限定值；
所述的步骤(1)供试品粉碎包括：取本品适量，剪碎，精密称定，精密加入等量稀释剂，优选硅藻土，粉碎成粉末；
所述步骤(2)成分提取包括：取粉末，精密称定，置锥形瓶中，精密加入水或甲醇水溶液提取，高速离心或用微孔滤膜滤过；
所述步骤(3)色谱条件包括：色谱柱：糖柱；流动相：以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱；蒸发光散射检测器检测。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，其特征在于，所述指纹图谱共有峰8个，其中6个峰标定为果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水苏糖；
所述特征图谱限定值包括：熟地黄的HPLC色谱图与对照指纹图谱比较，单糖寡糖指纹图谱相似度≥0.95时即为炮制合格。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于熟地黄加工炮制质量的检测方法，其特征在于，所述色谱峰比值限定值包括：指纹图谱中峰1～峰8分别为果糖(峰1)、葡萄糖(峰3)、蔗糖(峰4)、蜜二糖(峰5)、棉子糖(峰6)、甘露三糖(峰7)、水苏糖(峰8)，熟地黄的HPLC色谱图中，果糖峰面积为水苏糖2倍以上时为炮制合格；或果糖峰面积为棉籽糖20倍以上时即为炮制合格。
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