CN108203713A

CN108203713A - 生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用

Info

Publication number: CN108203713A
Application number: CN201611179577.9A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 周威; 毕慧萍; 庄以彬; 殷华; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2036-12-19
Also published as: CN108203713B

Abstract

本发明公开了一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用，生产肉桂醇的重组大肠杆菌构建方法包括如下步骤：向大肠杆菌中引入苯丙氨酸解氨酶PAL，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL，肉桂酰辅酶A还原酶CCR，得到一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌。大肠杆菌作为模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；且本发明通过构建肉桂醇合成通路，得到生产络塞苷元肉桂醇的大肠杆菌，肉桂醇产量达到300mg/L；进一步引入UDP葡萄糖基转移酶，将络塞与肉桂醇的生物合成途径有机地结合在一起，络塞的产量最高可达280mg/L。本发明为肉桂醇和/或络塞的大规模工业生产奠定了基础。

Description

生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用。

背景技术

红景天是一种传统草药，具有抗衰老，抗疲劳，增强免疫功能，保护心脑血管和抗肿瘤的生理活性。红景天作为一种环境适应性新兴植物药，自20世纪60年代以来，科学家对其化学活性成分及药理作用等进行了广泛研究。分析发现其主要活性成分包括红景天苷、络塞及其衍生物络塞维和络塞琳。络塞及其衍生物络塞维和络塞琳具有抗氧化，提高身体耐力，缓解心理压力和增强记忆等药理活性。其苷元肉桂醇是一种具有重要工业价值的酚类化合物，可用于香精香料原材料及药物合成中间体。

络塞具有以下特征：英文名称rosin，化学名称为(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-phenylprop-2-enoxy]oxane-3,4,5-triol或Trans-cinnamylO-β-D-glucopyranoside，分子式C15H20O6，分子量为296.32，CAS号为85026-55-7，结构式为

肉桂醇有以下特征：英文名称Cinnamic alcohol，化学名称为3-Phenyl-2-propene-1-ol，分子式为C9H10O，分子量为134.18，CAS号为104-54-1，结构式为

目前，络塞主要来源是植物提取。红景天野生资源过度开采，造成红景天日益匮乏，生态环境面临严重威胁，许多国家已将红景天列为濒危物种。络塞及其衍生物络塞维和络塞琳仅存在于少数红景天种类，如高山红景天(Rhdiola sachalinnsis)、喜马拉雅红景天(Rhodiola himalensis)、玫瑰红景天(Rhodiola rosea)和齿叶红景天(Rhodiolaserrata)等，其含量只有0.1％-3％。除植物提取外，也可通过生物转化获得络塞。

Furmanowa等采用玫瑰红景天愈伤组织培养，在悬浮细胞培养物中添加肉桂醇，获得了络塞及其衍生物络塞维(Furmanowa M,Oledzka H,Michalska M,Sokolnicka I,Radomska D(1995)Rhodiola rosea L.(Roseroot):in vitro regeneration and thebiological activity of roots.In:Bajaj YPS(ed)Biotechnology in agriculture andforestry,vol 33.Medicinal and Aromatic Plants VIII(pp 412–426).Springer,Berlin)。

Grech-Baran等采用发根培养方法，在培养基中添加肉桂醇，通过生物转化获得络塞及其衍生物络塞维(Grech-Baran M,-Baranek K,Krajewska-Patan A,A,Pietrosiuk A(2014)Biotransformation of cinnamyl alcohol to rosavinsby non-transformed wild type and hairy root cultures ofRhodiolakirilowii.Biotechnol Lett 36:649–656)。

络塞的异源生物合成还没有相关报道。因此构建络塞的异源合成通路，实现重组大肠杆菌利用葡萄糖发酵生产肉桂醇和/或络塞具有重要的科研价值和社会效益。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能高效率地生产肉桂醇的重组大肠杆菌构建方法。

本发明的第二个目的是提供一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌发酵生产肉桂醇的应用。

本发明的第四个目的是提供一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌构建方法。

本发明的第五个目的是提供一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌。

本发明的第六个目的是提供一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌发酵生产肉桂醇和络塞的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌构建方法，包括如下步骤：向大肠杆菌中引入苯丙氨酸解氨酶PAL，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL，肉桂酰辅酶A还原酶CCR，得到一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌。

上述方法构建的生产肉桂醇的重组大肠杆菌。

上述重组大肠杆菌发酵生产肉桂醇的应用。

一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌构建方法，包括如下步骤：向大肠杆菌中引入苯丙氨酸解氨酶PAL，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL，肉桂酰辅酶A还原酶CCR，UDP葡萄糖基转移酶UGTs,得到一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌。

优选地，UDP葡萄糖基转移酶UGTs为UDP葡萄糖基转移酶UGT73B6、UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5或UDP葡萄糖基转移酶oleD。

上述方法构建的生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌。

上述重组大肠杆菌发酵生产肉桂醇和络塞的应用。

大肠杆菌作为模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养，成本低廉；而且本发明通过构建肉桂醇合成通路，得到生产络塞苷元肉桂醇的大肠杆菌，肉桂醇产量达到300mg/L；进一步引入UDP葡萄糖基转移酶，将络塞与肉桂醇的生物合成途径有机地结合在一起，络塞的产量最高可达280mg/L。本发明提供了一种高效肉桂醇和/或络塞新的生产途径，也为肉桂醇和/或络塞的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成肉桂醇和络塞的途径示意图。

图2为大肠杆菌菌株BL21(DE3)的发酵产物的HPLC结果，其中，1是菌株BR的发酵产物，2是菌株BR1的发酵产物，3是菌株BR2的发酵产物，4是菌株BR3的发酵产物，峰Ⅰ为肉桂醇，峰Ⅱ为络塞。

图3为菌株BR1发酵产物的HPLC肉桂醇(峰Ⅰ)的MS图谱。

图4为菌株BR1发酵产物的HPLC络塞(峰Ⅱ)的MS图谱。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中，大肠杆菌菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α均可市售获得，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。

大肠杆菌表达载体pCDFduet，pET28a购自Novagen公司。

Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。

大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

所用引物均由深圳华大基因科技有限公司合成。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

一方面，本发明提供一种大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌能够表达PAL，4CL，CCR基因。

根据本发明，当本发明的大肠杆菌菌株还含有并能够表达UGT73B6或UGT73C5或oleD基因的情况下，能够有效地进行络塞的合成，因此，优选的，所述大肠杆菌还含有并能够表达UGT73B6或UGT73C5或oleD基因。

本发明中，基因PAL，CCR和4CL为肉桂醇合成相关基因。

基因PAL和CCR来自拟南芥植物中，4CL来自欧芹植物中，分别为苯丙氨酸解氨酶基因PAL(GenBank:AY133595.1)，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶基因4CL(GenBank:X13325.1)，肉桂酰辅酶A还原酶基因CCR(GenBank:AF332459.1)。

基因UGT73B6或UGT73C5或oleD为由肉桂醇合成络塞过程中的相关基因。

UGT73B6可以来自红景天植物，UGT73C5可以来自拟南芥植物，oleD可以来自抗生链霉菌。优选地，基因UGT73B6来自红景天(Rhodiola sachalinensis)的UDP-葡萄糖基转移酶基因RsUGT73B6(GenBank：AY547304)，基因UGT73C5(GenBank:KJ138865.1)来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的UDP-葡萄糖基转移酶，基因oleD(GenBank:ABA42119.2)来自抗生链霉菌竹桃霉素葡萄糖基转移酶。

优选的，为了提高4CL，UGT73B6，UGT73C5和oleD的表达量，还可以其进行大肠杆菌密码子偏好性优化，优化后的4CL，UGT73B6，UGT73C5和oleD基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明中，需要说明的是，在发酵培养时，上述基因PAL，CCR，4CL，CAD(大肠杆菌中固有的)，UGT73B6，UGT73C5和oleD等基因能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。

本发明中，用含有基因PAL，CCR，4CL，CAD，UGT73B6，UGT73C5和oleD，优选含有基因PAL，CCR，4CL，CAD，UGT73B6，UGT73C5和oleD的表达载体对大肠杆菌菌株BL21(DE3)进行转化得到所述大肠杆菌表达菌体。

本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。

实施例1

本实施例用于说明肉桂醇和/或络塞生物合成途径在大肠杆菌中的重构

本发明中，对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌，且所用菌株还有大肠杆菌本身的醇脱氢酶CAD，可将肉桂醛还原为肉桂醇。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)。

本发明中的表达载体优选为大肠杆菌表达载体V1和大肠杆菌表达载体V2，大肠杆菌表达载体V1优选含有基因PAL，CCR和4CL，大肠杆菌表达载体V2优选含有基因UGT73B6或UGT73C5或oleD。

本发明中，对上述导入大肠杆菌中的基因的排列顺序没有特别的限制，只要能够进行有效地表达即可。优选的，大肠杆菌表达载体V1为pCDFDuet-4CL-PAL-CCR，该载体的制备方法优选包括以下步骤：

(a)以引物CCR-F(SEQ ID No.5)/CCR-R(SEQ ID No.6)为引导，以拟南芥cDNA为模板进行PCR，扩增得到CCR基因，经NdeI和KpnI酶切后连入经NdeI和KpnI酶切后的质粒pCDFDuet1中，构建得到pCDFDuet-CCR。

(b)以引物4CL-F(SEQ ID No.7)/4CL-R(SEQ ID No.8)为引导，以优选以经密码子优选的4CL基因(SEQ ID No.1)为模板进行PCR扩增反应，扩增得到4CL基因，经NcoI和BamHI酶切后连入经NcoI和BamHI酶切后的质粒pCDFDuet-CCR中，构建得到pCDFDuet-4CL-CCR。

(c)以引物PAL-F(SEQ ID No.9)/PAL-R(SEQ ID No.10)为引导，以拟南芥cDNA为模板进行PCR扩增反应，扩增片段经NcoI和BamHI后连入经NcoI和BamHI酶切后的质粒pCDFDuet1中，构建得到质粒pCDFDuet-PAL，再以该质粒为模板，以引物T7PAL-F(SEQ IDNo.11)/T7PAL-R(SEQ ID No.12)为引导，扩增得到带有T7启动子的PAL基因片段T7-PAL，经EcoRI和NotI酶切后连入经EcoRI和NotI酶切后的质粒pCDFDuet-4CL-CCR中，构建得到pCDFDuet-4CL-PAL-CCR。

本发明中，大肠杆菌表达载体V2优选为pET28a-UGT73B6或pET28a-UGT73C3或pET28a-oleD。制备方法优选包括以下步骤：

(a)在优选的情况下，以引物UGT73B6-F(SEQ ID No.13)/UGT73B6-R(SEQ IDNo.14)为引导，优选以经密码子优选的UGT73B6基因(SEQ ID No.2)为模板进行PCR扩增反应，扩增片段经NcoI和BamHI酶切后连入经NcoI和BamHI酶切的质粒pET28中，构建得到质粒pET28a-UGT73B6。

(b)以引物UGT73C5-F(SEQ ID No.15)/UGT73C5-R(SEQ ID No.16)为引导，优选以经密码子优选的UGT73C5基因(SEQ ID No.3)为模板进行PCR扩增反应，扩增片段经NdeI和BamHI酶切后连入经NdeI和BamHI酶切的质粒pET28a中，构建得到质粒pET28a-UGT73C5。

(c)以引物oleD-F(SEQ ID No.17)/oleD-R(SEQ ID No.18)为引导，优选以经密码子优选的oleD基因(SEQ ID No.4)为模板进行PCR扩增反应，扩增片段经NcoI和BamHI酶切后连入经NcoI和BamHI酶切的质粒pET28中，构建得到质粒pET28a-oleD。

将所述载体pCDFDuet-4CL-PAL-CCR转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到生产肉桂醇的大肠杆菌表达菌株BC；

pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和pET28a-UGT73B6转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到生产络塞和肉桂醇的大肠杆菌表达菌株BR1。pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和pET28a-UGT73C5转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到生产络塞和肉桂醇的大肠杆菌表达菌株BR2。pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和pET28a-oleD转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到生产络塞和肉桂醇的大肠杆菌表达菌株BR3。从葡萄糖到肉桂醇的合成通路如图1所示，糖基转移酶UGT73B6或UGT73C5或oleD，将肉桂醇糖基化生成络塞(如图1所示)。

优选地，本发明中，所述大肠杆菌表达菌株优选为BC，BR1，BR2和BR3。

本领域技术人员应该理解的是，大肠杆菌与植物等在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将来自植物红景天的糖基转移酶基因进行密码子优化，可以使目标蛋白在大肠杆菌表达***中更有效地表达。所述密码子优化的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应体系可以为常规的PCR扩增反应体系，优选为：5×phusion HF缓冲液10μL，2.5mM dNTP 2.5μL，50μM正向引物0.5μL，50μM反向引物0.5μL，模板0.5μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL，水35.5μL。

本发明中，在上述步骤中，PCR扩增反应的反应程序可以为常规的PCR扩增反应程序，例如可以为：95-98℃预变性1-3分钟；95-98℃变性20-30秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-120秒，28-32个循环；72℃延伸8-10分钟。优选为：98℃预变性2分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

将质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，所述转化方法具体为：取100μL大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞于冰上，10分钟后加入2μL质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μL LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含链霉素的LB平板上。利用链霉素抗性筛选携带表达载体的转化菌株BC，并通过提取质粒进行酶切验证，得到肉桂醇生物合成途径的大肠杆菌表达菌株BC。

将质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和pET28a-UGT73B6用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，所述转化方法具体为：取100μL大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞于冰上，10分钟后加入2μL质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和2μL pET28a-UGT73B6或者pET28a-UGT73C5或者pET28a-oleD，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μL LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含链霉素和卡那霉素的LB平板上。利用链霉素和卡那霉素抗性筛选同时携带两种表达载体的转化菌株BR1，并通过提取质粒进行酶切验证，得到能够合成络塞的重组大肠杆菌菌株BR1。利用同样的方法，将质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和pET28a-UGT73C5用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到能够合成络塞的重组大肠杆菌菌株BR2。利用同样的方法，将质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和pET28a-OleD用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到能够合成络塞的重组大肠杆菌菌株BR3。

实施例2

本实施例用于说明大肠杆菌重组菌株BC，BR1，BR2和BR3的发酵培养

本发明中，所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：

(1)将如上所述的构建的大肠杆菌表达菌株接种至含有作为筛选标记用抗生素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L)中，并在37℃下培养16小时，得到大肠杆菌种子液；

(2)将步骤(1)中得到的大肠杆菌种子液接种至含有所述作为筛选标记用抗生素的M9(Na₂HPO₄·12H₂O 15.12g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂0.011g/L，NH₄Cl 1.0g/L，葡萄糖20g/L)液体培养基中，并在37℃下培养，当OD600达到0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，16℃下诱导培养16小时。

本领域技术人员应该理解的是，在发酵培养时，LB液体培养基和M9液体培养基中加入的抗生素为大肠杆菌表达菌株中含有的表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，例如，链霉素和卡那霉素；所述抗生素的浓度为本领域的常规选择，例如，所述链霉素的加入量使其终浓度为100mg/L；所述卡那霉素的加入量使其终浓度为50mg/L。

另外，所述大肠杆菌种子液的接种量也可以为本领域常规的选择，例如，接种量为1％体积，也即，每100mL的M9液体培养基中加入1mL所述大肠杆菌种子液。

此外，本发明对IPTG的浓度也没有特别的限制，优选地，其加入量可以使其在M9液体培养基中的终浓度为0.1mM。

根据本发明，能够理解的是，当需要生产肉桂醇时，可以对BC进行发酵培养；当需要肉桂醇和络塞时，可以对BR1，BR2和BR3进行发酵培养。

将菌株BC，在2mL加入有100mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到菌株BC种子液。

然后将种子液按1:100的转接量(0.5mL)转接入50mL加入有100mg/L链霉素的LB液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养16小时，4000rpm离心收集菌体，并转接50mL M9培养基，30℃继续培养24小时。得到表达有肉桂醇的发酵液1。

将菌株BR1，BR2和BR3分别在2mL加入有100mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12小时，得到菌株BR1，BR2和BR3种子液。

然后将种子液按1:100的转接量(0.5mL)分别转接入50mL加入有100mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养，当OD600约为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养15小时，4000rpm离心收集菌体，并转接50mL M9培养基，30℃继续培养24小时，得到生产肉桂醇和络塞的发酵液2，3和4。

测试例

肉桂醇和络塞的检测

(1)产物的HPLC检测：分别取实施例2中的发酵液1，2，3和4各1mL，12000rpm离心5min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长254nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0–5min 20％体积B；6–25min 20％体积B到100％体积B(6–25min内B的浓度均匀增加)；进样量10μL。

发酵液1，2，3和4的结果(分别为箭头1，2，3和4所指)见图2。发酵液1(菌株BR)，发酵液2(菌株BR1)，发酵液3(菌株BR2)和发酵液4(菌株BR3)。如图所示，菌株BC的发酵产物在24分钟时出现了一个新峰(峰Ⅰ)；菌株BR1，BR2和BR3的发酵产物除了前述24分钟处的峰，在21.5分钟时还出现了另一个新峰(峰Ⅱ)。

(2)产物的LC-MS分析：对步骤(1)中各发酵液中看到的新峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长254nm；梯度洗脱条件：0–5min20％体积B；6–25min 20％体积B到100％体积B(6–25min内B的浓度均匀增加)；进样量10μL。；ESI正离子源，分子量扫描范围50–1000。发酵液2的扫描结果见图3和图4。峰Ⅰ的MS图谱(图3)上有肉桂醇的MS特征峰117.0688，峰Ⅱ的MS图谱(图4)上有络塞的MS特征峰319.1143。

且经测定，肉桂醇生产菌株BC发酵液1中肉桂醇的产量为300mg/L，菌株BR1发酵液中的肉桂醇产量为200mg/L，络塞的产量为200mg/L，菌株BR2发酵液中的肉桂醇产量为180mg/L，络塞的产量为250mg/L，菌株BR3发酵液中的肉桂醇产量为180mg/L，络塞的产量为280mg/L。

本发明的高产肉桂醇大肠杆菌中肉桂醇产量可达300mg/L，在此基础上进一步实现了络塞的生物合成，络塞的产量最高可达280mg/L。因此，本发明提供了一种高产肉桂醇和络塞的新的生物合成途径，为肉桂醇和络塞的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用

<130>

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60

agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca tcccgaacca cctatctctc 120

cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga 180

ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc 240

aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt 300

cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360

aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc 420

ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta 480

gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc 540

accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca 600

ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg 660

atgctgactc acaagggact agtcacgagc gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg 720

aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac 780

gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg cggcgattct gataatgccg 840

aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg 900

atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg 960

agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc 1020

gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt 1080

ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct 1140

tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg atccagacac cggagattct 1200

ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260

ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag acggttggct tcatactgga 1320

gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt 1380

atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag aggctttgct catcggtcat 1440

cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct 1500

gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc 1560

gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt 1620

cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga 1680

ttgtga 1686

<210> 2

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgggctctg aaactcgccc gctgagcatc ttcttttttc cgtttatggc gcatggccac 60

atgattccga tggtggatat ggcacgtctg tttgcttctc agggtgtgcg ttgcaccatt 120

gttaccactc cgggtaacca gccgctgatt gctcgctcta tcggtaaggt tcagctgctg 180

ggttttgaaa ttggtgtgac tactatcccg ttccgcggta ctgagttcgg cctgccggat 240

ggctgtgaaa acctggatag cgtgccgagc ccgcagcatg tgtttcattt ctttgaggca 300

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gtgggcgata tgttctttcc gtggtctacc gactctgcgg ctaaattcgg tattccgcgc 420

ctggttttcc acggtacctc ctacttcgcg ctgtgcgctg gcgaagcagt gcgtattcat 480

aagccgtacc tgtctgtgtc ttctgatgat gaaccgttcg ttattccggg cctgccggac 540

gagatcaaac tgaccaagtc ccagctgccg atgcacctgc tggagggtaa gaaagactct 600

gttctggcac agctgctgga tgaggtgaaa gaaactgagg tttcctctta cggtgttatc 660

gttaactcta tctacgaact ggaaccggct tacgcagatt acttccgtaa cgttctgaag 720

cgccgtgcgt gggagatcgg tccgctgtct ctgtgtaacc gtgacgttga agagaaagcg 780

atgcgtggta tgcaggctgc tatcgatcag catgaatgcc tgaaatggct ggattccaaa 840

gaaccggatt ccgttgttta cgtttgtttt ggtagcactt gcaaattccc ggatgatcag 900

ctggcggaaa tcgcgtctgg tctggaggca agcggccagc agttcatctg ggttattcgc 960

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gaccgtgctc tgctgattcg cggttgggct ccgcaggttc tgatcctgga ccatcagtcc 1080

gttggcggtt ttgtttctca ctgtggttgg aactctaccc tggaaggcat cagcgcgggt 1140

ctgccgatgg ttacttggcc ggtgttcgct gaacagttct acaacgaaaa actgctgacc 1200

gaggtgctga aaatcggtgt tgcagtgggt gctcgtaagt ggcgtcagct ggtgggtgac 1260

ttcgttcaca aagacgctat tcagcgtgcg gtgcgtgaaa ttatggaggg cgaagaggcg 1320

gaggaacgtc gtatcatcgc gcgtcagatg ggtaaaatgg cgaaacgcgc ggtggagaag 1380

gacggtagct cttggaccaa cctgaacaac ctgctgcagg aactgaagct gaagaaggtt 1440

taa 1443

<210> 3

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atggtgagcg aaaccaccaa atctagtccg ttacattttg tgctgtttcc gtttatggca 60

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attaccattg tgaccacccc gcataatgca gcacgcttta aaaatgtgct gaatcgcgcc 180

attgaaagtg gcctgccgat taacctagtt caggttaaat ttccgtatct ggaagccggc 240

ttacaggaag gccaggaaaa tattgatagc ttagatacca tggaacgcat gattccgttt 300

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<212> DNA

<213> 人工合成

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cactctactc tgccgggtcc ggatgcagac ccggaggctt ggggtagcac tctgctggac 240

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gcagatcgcg tggatgagga cgtttatacc ttcgtgggtg catgccaggg tgatcgcgct 660

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gacctgttcg ttacccatgc gggtgcaggt ggttcccagg aaggtctggc tactgcgact 960

ccgatgattg ctgttccgca ggctgttgat cagttcggta acgcagacat gctgcaaggt 1020

ctgggtgttg cgcgtaaact ggcaactgag gaagcaaccg ctgatctgct gcgcgaaacc 1080

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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<212> DNA

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<400> 6

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<212> DNA

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<400> 7

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<212> DNA

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<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

aaatacatat ggatcaaatc gaagcaatgt tgtg 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 11

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 13

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

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<212> DNA

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<400> 15

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

aaatactcga gttaaccacc gttcgggcgg tcacc 35

Claims

1.一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌构建方法，其特征是包括如下步骤：向大肠杆菌中引入苯丙氨酸解氨酶PAL，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL，肉桂酰辅酶A还原酶CCR，得到一种生产肉桂醇的重组大肠杆菌。

2.权利要求1的方法构建的生产肉桂醇的重组大肠杆菌。

3.权利要求2的重组大肠杆菌发酵生产肉桂醇的应用。

4.一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌构建方法，其特征是包括如下步骤：向大肠杆菌中引入苯丙氨酸解氨酶PAL，对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL，肉桂酰辅酶A还原酶CCR，UDP葡萄糖基转移酶UGTs,得到一种生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是所述UDP葡萄糖基转移酶UGTs为UDP葡萄糖基转移酶UGT73B6、UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5或UDP葡萄糖基转移酶oleD。

6.权利要求4或5的方法构建的生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌。

7.权利要求6的重组大肠杆菌发酵生产肉桂醇和络塞的应用。