CN111943996B

CN111943996B - 络塞维类似物及生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用

Info

Publication number: CN111943996B
Application number: CN201910403327.6A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 毕慧萍; 王帅; 庄以彬; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin National Synthetic Biotechnology Innovation Center Co ltd
Priority date: 2019-05-15
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2039-05-15
Also published as: CN111943996A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及络塞维类似物及生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用。络塞维类似物具有式I、式II、式III或式IV所示的结构，该基因工程菌含编码苯丙氨酸解氨酶或酪氨酸解氨酶、4‑香豆酸辅酶A连接酶4CL、肉桂酰辅酶A还原酶CCR和UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因。该基因工程菌，可发酵生产Triandrin和Triandrin B(式IV)；或Triandrin、Triandrin B、Triandrin C(式II)和Triandrin D(式III)，Triandrin和Triandrin B的产量最高可达1.7g/L和1.6g/L；或络塞维B(式I)，产量最高可达1.6g/L。

Description

络塞维类似物及生产该络塞维类似物的基因工程菌和其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种络塞维类似物、生产该络塞维类似物的基因工程菌、该基因工程菌在生产络塞维类似物中的应用、以及一种生产络塞维类似物的方法。

背景技术

肉桂醇糖苷类化合物(Cinnamyl alcohol glycosides，CAGs)是濒危植物玫瑰红景天中一类重要的活性成分，具有抗氧化，保护心脏，增强学习和记忆等功能。这类化合物包括络塞、络塞维、络塞琳、络塞木糖苷、Triandrin等。络塞、络塞维和络塞琳统称为络塞维复合物，其中络塞维是主要活性成分，也是常用来评价玫瑰红景天提取物质量的重要标志物。研究发现络塞维复合物具有多种有益的药理作用，如益智、抗癌、增强免疫、抗抑郁、抗紫外辐射等。

目前，络塞维的生产主要来源于植物提取。红景天生长于高寒地区，野生资源珍稀。近年来，因过度开采，玫瑰红景天已被包括中国在内多个国家列为濒危物种。受生长条件、病虫害等的制约，红景天至今未实现大规模人工种植；且植物红景天中活性成分积累周期很长，约需生长5-7年才能获得足够的活性成分。2006年，Patov等人报道了络塞维的化学合成(Kishida,M.,Akita,H.(2005)Simple synthesis of phenylpropenoidβ-D-glucopyranoside congeners based on Mizoroki-Heck type reaction of organoboronreagents.Tetrahedron Lett.46,4123-4125.)。但是化学合成步骤较多，产率低成本高，环境污染较严重。2014年，Grech-Baran等采用发根培养方法，在培养基中添加肉桂醇，通过生物转化获得络塞及其衍生物络塞维，培养14天后络塞维最高产量可达505mg/L(Grech-Baran,M.,Syklowska-Baranek,K.,Krajewska-Patan,A.,Wyrwal,A.,Pietrosiuk,A.(2014)Biotransformation of cinnamyl alcohol to rosavins by non-transformedwild type and hairy root cultures of Rhodiola kirilowii.Biotechnol.Lett.36,649-656.)。

目前的络塞维类化合物种类比较单一，且产量较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种新的络塞维类似物，以及能够生产该新的络塞维类似物的基因工程菌，该基因工程菌能够高产量的生产新的络塞维类似物。

本发明的发明人通过大量的研究，构建了含有能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，实现了香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin、香豆醇酚羟基单葡萄糖苷(新化合物，式IV所示，命名为Triandrin B)的微生物从头合成；同时再在基因工程菌中引入使糖链延伸的糖基转移酶的编码基因，在葡萄糖的存在下，实现了香豆醇醇羟基双葡萄糖苷(新化合物，式II所示，命名为Triandrin C)和香豆醇酚羟基双葡萄糖苷(新化合物，式III所示，命名为Trandrin D)的微生物从头合成。在引入使糖链延伸的糖基转移酶的编码基因的基因工程菌的基础上，将编码酪氨酸解氨酶TAL的基因替换为了能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，在葡萄糖的存在下，得到了另一种新的化合物，络塞葡糖苷(肉桂醇双葡萄糖苷，新化合物，式I所示，命名为络塞维B或Rosavin B)。并且通过本发明提供的基因工程菌获得的如上产物的产量较高，最高可达克级。

基于如上的发现，一方面，本发明提供了一种络塞维类似物，所述络塞维类似物具有如下式I、式II、式III或式IV所示的结构；

第二方面，本发明提供了一种生产如上所述的络塞维类似物的基因工程菌，该基因工程菌含有能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因或编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，和能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因。

优选的，所述基因工程菌还含有能够编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因。

第三方面，本发明提供了如上所述的基因工程菌在生产络塞维类似物中的应用。

第四方面，本发明提供了一种生产络塞维类似物的方法，在含葡萄糖的培养基中培养如上所述的基因工程菌，并诱导外源基因的表达以生产络塞维类似物。

本发明的生产香豆醇葡萄糖苷的基因工程菌，可以发酵生产香豆醇、香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin、新化合物香豆醇酚羟基单葡萄糖苷Triandrin B(式IV)，Triandrin和Triandrin B的产量最高可达1.7g/L和1.6g/L；在进一步引入编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因以及在葡萄糖的存在下，还可以生产新化合物香豆醇醇羟基双葡萄糖苷Triandrin C(式II)和香豆醇酚羟基双葡萄糖苷Triandrin D(式III)。此外，优选在引入编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因的基因工程菌的基础上，将编码酪氨酸解氨酶TAL的基因替换为能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，在葡萄糖的存在下，可以得到本发明的生产肉桂醇葡萄糖苷的重组大肠杆菌，可以发酵生产肉桂醇、肉桂醇单葡萄糖苷络塞和肉桂醇双葡萄糖苷络塞维B，其中络塞维B为新化合物(式I)，产量最高可达1.6g/L。因此，本发明提供了一种高产肉桂醇或香豆醇葡萄糖苷的新的生物合成途径，为肉桂醇和/或香豆醇葡萄糖苷的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的科研价值和社会效益。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成肉桂醇和/或香豆醇单葡萄糖苷(Triandrin B)和双葡萄苷(络塞维B、Triandrin C和Triandrin D)的途径示意图。

图2为大肠杆菌菌株BWT-PDG、BPHE-PDG、BWT-TDG和BTAL-TDG的发酵产物的HPLC结果，其中，a是菌株BWT-PDG的发酵产物HPLC检测图，b是菌株BPHE-PDG的发酵产物HPLC检测图，c是菌株BWT-TDG的发酵产物HPLC检测图，d是菌株BTAL-TDG的发酵产物HPLC检测图，峰1为肉桂醇，峰2为络塞，峰3为络塞维B；峰4为香豆醇，峰5为Triandrin，峰6为Triandrin B，峰7为Triandrin C，峰8为Triandrin D。

图3为峰1-8的MS图谱。a为肉桂醇，b为络塞，c为络塞维B；d为香豆醇，e为Triandrin，f为Triandrin B，g为Triandrin C，h为Triandrin D。

图4为络塞维B的NMR图，a为¹H NMR，b为¹³C NMR。

图5为Triandrin的¹H NMR图。

图6为Triandrin B的NMR图，a为¹H NMR，b为¹³C NMR。

图7为Triandrin C的¹H NMR图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明公开了一种络塞维类似物，所述络塞维类似物具有如下式I、式II、式III或式IV所示的结构；

根据本发明，式I所示结构的化合物，为肉桂醇双葡萄糖苷，本发明命名为络塞维B，英文命名为Rosavin B，化学名称trans-cinnamyl-(6'-O-β-D-glucopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₂₁H₃₀O₁₁，分子量458.18。

根据本发明，式II所示结构的化合物，为香豆醇醇羟基双葡萄糖苷，本发明英文命名为Triandrin C，化学名称4-hydroxyl-cinnamyl-(6'-O-β-D-glucopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₂₁H₃₀O₁₂，分子量474.17。

根据本发明，式III所示结构的化合物，为香豆醇酚羟基双葡萄糖苷，本发明英文命名为Triandrin D，化学名称4-hydroxyl-cinnamyl alcohol-(6'-O-β-D-glucopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid，分子式C₂₁H₃₀O₁₂，分子量474.17。

根据本发明，式IV所示结构的化合物，为香豆醇酚羟基单葡萄糖苷，本发明英文命名为Triandrin B，化学名称4-hydroxy-cinnamyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₁₅H₂₀O₇，分子量312.12。

根据本发明，当所述基因工程菌含有能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因时，其可以生物合成本发明提供的如上式IV所示的新化合物Triandrin B，还可以生物合成香豆醇和香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin。

其中，香豆醇具有以下特征：英文名称p-coumaryl alcohol，化学名称4-[(E)-3-hydroxyprop-1-enyl]phenol，分子式C₉H₁₀O₂，分子量150.18，CAS号3690-05-9，结构式

香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin，具有以下特征：英文名称Triandrin(Sachaliside)，化学名称4-hydroxyl-cinnamyl-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₁₅H₂₀O₇，分子量312.12，CAS号132294-76-9，结构式

根据本发明，当所述基因工程菌含有能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因时，该基因工程菌可以生物合成肉桂醇和络塞；

其中，肉桂醇，具有以下特征：英文名称Cinnamic alcohol，化学名称为3-phenyl-2-propene-1-ol，分子式为C₉H₁₀O，分子量为134.18，CAS号为104-54-1，结构式为

络塞，具有以下特征：英文名称Rosin，化学名称为

(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hydroxymethyl)-6-[(E)-3-phenylprop-2-enoxy]oxane-3,4,5-triol或trans-cinnamyl-O-β-D-glucopyranoside，分子式C₁₅H₂₀O₆，分子量为296.32，CAS号为85026-55-7，结构式为

本发明的发明人通过在如上的基因工程菌中进一步引入能够入编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因，并且在葡萄糖的存在下，含有能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因的基因工程菌，可以进一步生物合成本发明的新化合物Triandrin C和Triandrin D；含有能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因的基因工程菌，可以进一步生物合成本发明的新化合物Rosavin B。

根据本发明一种具体的实施方式，所述基因工程菌的外源基因为能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因和能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因，其可以生物合成如上式IV所示的新化合物Triandrin B，还可以生物合成香豆醇和香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin。

根据本发明一种具体的实施方式，所述基因工程菌的外源基因为能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因、能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因和能够编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因，其可以生物合成如上式IV所示的新化合物Triandrin B、式II所示的新化合物Triandrin C和式III所示的新化合物Triandrin D，还可以生物合成香豆醇和香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin。

根据本发明一种具体的实施方式，所述基因工程菌的外源基因为能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，和能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因和能够编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因，其可以生物合成如上式I所示的Rosavin B，还可以生物合成肉桂醇和络塞。

根据本发明，术语“苯丙氨酸解氨酶PAL”为苯丙氨酸解氨酶phenylalanineammonia-lyase，缩写PAL，是催化直接脱掉苯丙氨酸上的氨而生成反式肉桂酸的酶，其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库(如NCBI)中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“酪氨酸解氨酶TAL”为酪氨酸解氨酶tyrosine ammonia-lyase，缩写TAL，是催化直接脱掉酪氨酸上的氨的酶，其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库(如NCBI)中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“4-香豆酸:辅酶A连接酶4CL”为hydroxycinnamate:CoAligase，缩写4CL，是单木质醇类和黄酮类生物合成中苯丙素代谢途径中的一个关键酶。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库(如NCBI)中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“肉桂酰辅酶A还原酶CCR”为cinnamyl-CoA reductase，缩写CCR，负责催化木质素单体生物合成中最重要的代谢反应，它将类苯丙酸类代谢物转移到木质素的合成途径中。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库(如NCBI)中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“UDP葡萄糖基转移酶UGT”为UDP-glycosyltransferase，缩写为UGT，其在生物体内催化活化的葡萄糖基连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，从而赋予糖基化的产物具有很多生物学功能。其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库(如NCBI)中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，术语“使糖链延伸的糖基转移酶”为任意的可以使已有糖化合物的糖链延伸的酶，其可以为各种来源，例如，微生物来源、植物来源，其相应的氨基酸序列均为本领域技术人员所公知，可以利用本领域常规的技术手段获得，例如，可以通过在数据库(如NCBI)中搜索，或者在相关的公开文献中进行查询获得，本发明不再赘述。

根据本发明，优选的，所述UDP葡萄糖基转移酶UGT为UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5。

根据本发明，优选的，所述使糖链延伸的糖基转移酶为糖-糖基转移酶GGT，更优选为糖-糖基转移酶CaUGT3。

公知的，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，根据相应酶的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因为来自拟南芥的AtPAL基因，GenBank：AY133595.1。

根据本发明一种优选的实施方式，编码酪氨酸解氨酶TAL的基因如SEQ ID No.1所示，或者为来自粘红酵母的RgTAL基因，GeneBank：AAA33883.1，优选如SEQ ID No.1所示。

根据本发明一种优选的实施方式，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因如SEQ IDNo.2所示，或者为来自欧芹的Pc4CL基因，GenBank:X13325.1，优选如SEQ ID No.2所示。

根据本发明一种优选的实施方式，编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因为来自拟南芥的AtCCR基因，GenBank:AF332459.1。

根据本发明一种优选的实施方式，编码UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5的基因如SEQID No.3所示，或者为来自拟南芥的AtUGT73C5基因，GenBank:KJ138865.1，优选如SEQ IDNo.3所示。

根据本发明一种优选的实施方式，编码糖-糖基转移酶CaUGT3的基因如SEQ IDNo.4所示，或者为来自长春花的CaUGT3基因，GenBank:AB443870，优选如SEQ ID No.4所示。

根据本发明，用于构建所述基因工程菌的菌株可以为本领域常规使用的各种菌株，例如，可以真菌，如酵母，也可以为细菌，如杆菌。根据本发明一种优选的实施方式，所述菌株为大肠杆菌，对用于构建大肠杆菌表达菌株的大肠杆菌的种类没有特殊要求，可以为能够表达目的基因的本领域常用的各种大肠杆菌。为了使目的基因能够得到更好的表达，所述大肠杆菌优选为BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α，更优选为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明的发明人在研究中发现，与使用野生型的大肠杆菌相比，当将大肠杆菌中构建为高产苯丙氨酸的大肠杆菌或高产酪氨酸的大肠杆菌后，在引入本发明如上的各基因，获得各目标产物的效率能够进一步提高。

其中，所述高产苯丙氨酸的大肠杆菌可以为不表达tyrR(DNA-bindingtranscriptional dual regulator TyrR)、tyrA(fused chorismate mutase/prephenatedehydrogenase)和trpE(anthranilate synthase subunit TrpE)基因的大肠杆菌，其构建可以采用多种方法实现，例如，可以包括λRed重组***、CRISPR-Cas9重组***以及RNAi等。优选的，本发明高产苯丙氨酸大肠杆菌构建采用λRed重组***。本发明构建的高产苯丙氨酸的大肠杆菌更适用于合成Rosavin B，以及肉桂醇和络塞。

其中，所述高产酪氨酸的大肠杆菌可以为不表达tyrR(DNA-bindingtranscriptional dual regulator TyrR)、pheA(fused chorismate mutase/prephenatedehydrogenase)和trpE(anthranilate synthase subunit TrpE)基因的大肠杆菌，其构建可以采用多种方法实现，例如，可以包括λRed重组***、CRISPR-Cas9重组***以及RNAi等。优选的，本发明高产酪氨酸的大肠杆菌构建采用λRed重组***。本发明构建的高产酪氨酸的大肠杆菌更适用于生物合成Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D，以及香豆醇和Triandrin。

根据本发明，所述基因工程菌的构建方法可以通过本领域常规的技术手段完成，例如，通过在相应的菌株中导入***有相应基因的载体为获得，本发明对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至载体中，在此不再赘述。

其中，用于构建本发明基因工程菌的基因可以通过克隆在一个载体中导入大肠杆菌，也可以克隆在不同的载体中导入大肠杆菌中，出于载体的承受能力以及大肠杆菌外源载体个数的承受能力，优选的，将用于构建本发明基因工程菌的基因克隆至2-3个载体中导入大肠杆菌。

其中，用于构建本发明基因工程菌的基因在载体中的排列顺序没有特别的限制，只要能够进行有效地表达即可。

根据本发明，所述培养条件为常规的培养条件，如使用含有作为筛选标记用抗生素的培养基，在35-40℃下培养至OD₆₀₀为0.5-0.7，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在14-20℃进行诱导表达。在发酵培养时，上述基因能被翻译为相应的蛋白，并使相应蛋白发挥其作用。

其中，以所述基因工程菌为大肠杆菌为例，所述培养基可以为LB培养基(溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：Tryptone 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)，也可以为M9(Na₂HPO₄·12H₂O 15.12g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂0.011g/L，NH₄Cl 1.0g/L，葡萄糖20g/L)液体培养基，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。

根据本发明，在培养所得基因工程菌生产络塞维类似物时，还优选对构建的基因工程进行活化处理制备种子液，例如，在含有作为筛选标记用抗生素的培养基中，35-40℃培养12-20小时。

根据本发明一种优选的实施方式，如上LB培养基可以用于基因工程菌的活化，也即，制备种子液，如上M9培养基可以用于络塞维类似物的生产。其中，所述种子液的接种量也可以为本领域常规的选择，例如，接种量为1体积％，也即，每100mL的M9液体培养基中加入1mL所述种子液。

此外，本发明对IPTG的浓度也没有特别的限制，优选地，其加入量可以使其在M9液体培养基中的终浓度为0.08-0.12mM。

根据本发明，所述抗生素为表达载体上的作为筛选标记用的抗生素，以大肠杆菌常用转化载体为例，所述抗生素例如，可以为链霉素和卡那霉素；所述抗生素的浓度为本领域的常规选择，例如，所述链霉素的加入量使其终浓度为80-120mg/L；所述卡那霉素的加入量使其终浓度为40-60mg/L。

根据本发明，能够理解的是，本领域技术人员可以根据需要生产的化合物的种类选择相应的基因工程菌。

具体的，当仅需要生产Triandrin B时，可以选择外源基因为能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因和能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因的基因工程菌，可以在含有葡萄糖的条件下进行培养生产Triandrin B；

当需要生产Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D时，可以选择外源基因为能够编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因、能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因和能够编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因的基因工程菌，在含有葡萄糖的条件下培养生产Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D；

当需要生产Rosavin B时，可以选择外源基因为能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，和能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因和能够编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因的基因工程菌，在含有葡萄糖的条件下培养生产Rosavin B。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，大肠杆菌菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中所有基因的表达，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆。

大肠杆菌表达载体pCDFduet-1，pRSFDuet-1，pET28a购自Novagen公司。

Phusion高保真DNA聚合酶购自Thermo公司。

ClonExpress Multis One Step Cloning Kit购自Vazyme公司。

所用引物以及基因均由深圳华大基因科技有限公司合成。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

苯丙氨酸解氨酶基因PAL来自拟南芥(AtPAL，GenBank:AY133595.1)；

酪氨酸解氨酶基因TAL如SEQ ID No.1所示；

4-香豆酸辅酶A连接酶基因4CL如SEQ ID No.2所示；

肉桂酰辅酶A还原酶基因CCR来自拟南芥(AtCCR，GenBank:AF332459.1)；

UDP葡萄糖基转移酶UGT基因UGT73C5如SEQ ID No.3所示；

糖-糖基转移酶GGT基因CaUGT3如SEQ ID No.4所示。

质粒pKD46(温度敏感型，含有受***糖启动子调控的exo、bet和gam基因，Amp^r)、pKD4(含有两端带有FRT位点的卡那抗性基因，Kan^r)、pCP20(温度敏感型，编码能够识别FRT位点的FLP重组酶，Amp^r)均为市售。

实施例1

本实施例用于说明络塞维B合成途径在大肠杆菌中的重构

大肠杆菌表达载体V1为pCDFDuet-4CL-PAL-CCR，该载体的制备方法参考专利申请号201611179577.9(刘涛，周威，毕慧萍，庄以彬，殷华，马延和.生产肉桂醇和络塞的重组大肠杆菌、构建方法及应用)。

大肠杆菌表达载体V2为pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3，该载体的制备方法如下：

(1)以引物73C5-5FPBam(SEQ ID No.5)/73C5-3RPSal(SEQ ID No.6)为引导，以合成的AtUGT73C5基因(SEQ ID No.3)为模板进行PCR，扩增得到AtUGT73C5基因，经BamHI和SalI酶切后连入经BamHI和SalI酶切后的质粒pRSDet1中，构建得到pRSDDuet-AtUGT73C5。

(2)CaUGT3基因(SEQ ID No.4)两端合成时加入5’-KpnI和3’-XhoI酶切位点，经KpnI和XhoI酶切后连入经KpnI和XhoI酶切后的质粒pRSFDuet-AtUGT73C5中，构建得到pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3。

(3)将所述载体V1(pCDFDuet-4CL-PAL-CCR)和V2(pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3)共同转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到生产肉桂醇、络塞和络塞维B的大肠杆菌菌株BWT-PDG。从葡萄糖到络塞维B的合成通路如图1所示。

如上步骤(1)和(2)中，PCR扩增反应的反应体系为：5×phusion HF缓冲液10μL，2.5mM dNTP 2.5μL，50μM正向引物0.5μL，50μM反向引物0.5μL，模板0.5μL，Phusion DNA聚合酶0.5μL，水35.5μL。

PCR扩增反应的反应程序为：98℃预变性2分钟；98℃变性20秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。

如上步骤(3)中，将质粒V1(pCDFDuet-4CL-PAL-CCR)和V2(pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3)用化学转化的方法转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)，所述转化方法具体为：取100μL大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞于冰上，10分钟后加入2μL质粒pCDFDuet-4CL-PAL-CCR和2μL pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3，轻轻混匀，冰上放置30分钟后，42℃热激90秒，取出立即于冰上放置2分钟，加入600μL LB液体培养基，37℃，150rpm摇床复苏培养30分钟，然后将菌液涂布在含链霉素和卡那霉素的LB平板上。利用链霉素和卡那霉素抗性筛选同时携带两种表达载体的转化菌株BWT-PDG，并通过提取质粒进行酶切验证，得到能够合成肉桂醇、络塞和络塞维B的重组大肠杆菌菌株BWT-PDG。

实施例2

本实施例用于说明络塞维B合成途径在高产苯丙氨酸大肠杆菌中的重构

高产苯丙氨酸大肠杆菌不表达tyrR(DNA-binding transcriptional dualregulator TyrR)，tyrA(fused chorismate mutase/prephenate dehydrogenase)，trpE(anthranilate synthase subunit TrpE)基因，其构建具体方法如下：

(1)引物tyrR-5FPL(SEQ ID No：7)/tyrR-3RPL(SEQ ID No：8)用于扩增pKD4中Kan基因以替换tyrR基因编码区；引物tyrRGD-5FP(SEQ ID No：9)/tyrRGD-3RP(SEQ ID No：10)为tyrR基因敲除后重组菌鉴定引物，两条引物各位于打靶序列区的左右两侧。PCR反应体系为：5×PCR buffer，10μL；dNTP(2mM each)，5μL；引物tyrR-5FPL/tyrR-3RPL(10μM)，各2μL；Phusion high-fidelity DNA polymerase(5U/μL)，0.5μL；pKD4，50ng；ddH₂O补足体系到50μL。反应程序为：初始变性98℃30sec；98℃8sec，55℃30sec，72℃30sec，30个循环；终延伸72℃10min。得到打靶分子DNA片段。

(2)将过夜培养12h的含有pKD46的大肠杆菌BL21(DE3)按1:100的量接种，振荡培养至OD600值约为0.2，加入终浓度为10mmol/L的***糖继续培养至OD600为0.5-0.6，制备电转感受态。取50μL感受态菌液与约200ng的打靶分子DNA片段进行电转化。电击后立即加入1mL LB液体培养液，37℃，振荡培养2h，涂布于LB平板(Kan^r)筛选阳性克隆。随后第二轮体内重组过程中，将编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20转入TyrR敲除菌株中，将Kan抗性基因剔除。然后37℃培养，丢掉pCP20。利用引物tyrRGD-5FP/tyrRGD-3RP进行PCR验证，得到tyrR基因敲除的大肠杆菌。

(3)用同样的方法将tyrA、trpE基因敲除掉，得到敲除基因tyrR，tyrA和trpE的大肠杆菌菌株BPHE。用于敲除tyrA的引物如SEQ ID No：11和SEQ ID No：12所示，验证引物如SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示。用于敲除trpE的引物如SEQ ID No：15和SEQ ID No：16所示，验证引物如SEQ ID No：17和SEQ ID No：18所示。

将所述载体V1(pCDFDuet-4CL-PAL-CCR)和V2(pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3)共同转化大肠杆菌菌株BPHE，得到高产肉桂醇、络塞和络塞维B的大肠杆菌菌株BPHE-PDG。

实施例3

本实施例用于说明Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D生物合成途径在大肠杆菌中的重构

本实施例表达载体为大肠杆菌表达载体V2和大肠杆菌表达载体V3，大肠杆菌表达载体V2如实施例1所构建，大肠杆菌表达载体V3含有基因TAL，CCR和4CL。

大肠杆菌表达载体V3具体制备方法如下：

以引物CCR-4CL-5F(SEQ ID No：19)/CCR-4CL-3R(SEQ ID No：20)和TAL-5F(SEQID No：21)/TAL-3R(SEQ ID No：22)为引导，分别以EcoRI酶切后的线性化载体V1(pCDFDuet-4CL-PAL-CCR)和TAL基因(SEQ ID No.1)为模板进行PCR，扩增得到片段pCDFDuet-4CL-CCR和TAL，通过无缝克隆将两个片段拼接成一个完整载体，得到载体V3(pCDFDuet-4CL-TAL-CCR)。

无缝克隆的反应体系为：5×CE MultiS Buffer 4μL，Exnase MultiS 2μL，线性化载体片段pCDFDuet-4CL-CCR 4μL，基因片段TAL 10μL。37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。将20μL反应液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得到阳性克隆，经测序确证正确，得到构建好的载体V3(pCDFDuet-4CL-TAL-CCR)。

将所述载体V3(pCDFDuet-4CL-TAL-CCR)和V2(pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3)按照实施例1的方法共同转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到生产香豆醇、Triandrin、TriandrinB、Triandrin C和Triandrin D的大肠杆菌菌株BWT-TDG。

实施例4

本实施例用于说明Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D的生物合成途径在高产酪氨酸大肠杆菌中的重构

高产酪氨酸大肠杆菌不表达tyrR(DNA-binding transcriptional dualregulator TyrR)，pheA(fused chorismate mutase/prephenate dehydrogenase)，trpE(anthranilate synthase subunit TrpE)基因，其构建具体方法如下：

用实施例3中同样的方法将tyrR、pheA和trpE基因敲除掉，得到敲除基因tyrR，pheA和trpE的大肠杆菌菌株BTAL。用于敲除pheA的引物如SEQ ID No：23和SEQ ID No：24所示，验证引物如SEQ ID No：25和SEQ ID No：26所示。

将所述载体V3(pCDFDuet-4CL-TAL-CCR)和V2(pRSFDuet-AtUGT73C5-CaUGT3)按照实施例1的方法共同转化大肠杆菌菌株BTAL，得到高产香豆醇、Triandrin、Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D的大肠杆菌菌株BTAL-TDG。

测试例

本实施例用于说明大肠杆菌重组菌株BWT-PDG，BPHE-PDG，BWT-TDG和BTAL-TDG的发酵培养以及产物的鉴定

(1)发酵培养

1)将如上实施例1-4中构建的大肠杆菌表达菌株BWT-PDG、BPHE-PDG、BWT-TDG或BTAL-TDG分别接种至2ml含有作为筛选标记用抗生素(链霉素和卡那霉素，终浓度分别为100mg/L和50mg/L)的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L)中，并在37℃下培养12小时，得到大肠杆菌种子液。

2)将步骤(1)中得到的大肠杆菌种子液以1体积％的接种量分别接种至50mL含有所述作为筛选标记用抗生素(链霉素和卡那霉素，终浓度分别为100mg/L和50mg/L)的LB液体培养基，并在37℃下培养，当OD600达到0.6时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.1mM，16℃下诱导培养16小时。4000rpm离心收集菌体后转接入50mL含上述筛选标记用抗生素的M9Y(Na₂HPO₄·12H₂O 15.12g/L，KH₂PO₄ 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.011g/L，NH₄Cl 1.0g/L，酵母提取物0.25g/L，葡萄糖20g/L)液体培养基中，30℃培养24-72小时，得到含有肉桂醇、络塞和络塞维B的发酵液a(实施例1)和b(实施例2)，以及生产香豆醇、Triandrin、Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D的发酵液c(实施例3)和d(实施例4)。

(2)产物的检测

1)产物的HPLC检测：分别发酵液a，b，c和d各1mL，12000rpm离心5min后，取上清，进行HPLC分析检测。分析条件如下：仪器为：安捷伦液相色谱仪，测定条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长254nm；流动相A＝水(含0.1％体积甲酸)，B＝甲醇；流速＝1mL/min；梯度洗脱条件：0-5min 20％体积B；6-25min 20％体积B到100％体积B(6-25min内B的浓度均匀增加)；25-30min，100％B；31-40min，20％B。进样量50μL。

发酵液a，b，c和d的结果见图2。其中，发酵液a(菌株BWT-PDG)和发酵液b(菌株BPHE-PDG)中出现3个产物峰(峰1，2，3)，且发酵液b中峰1，2，3均高于发酵液a。发酵液c(菌株BWT-TDG)中有7个产物峰(峰1-7，其中，峰8较小，忽略不计)，发酵液d(菌株BTAL-TDG)中因为苯丙氨酸合成被阻断，峰1-3消失，有5个产物峰(峰4-8)。

2)产物的LC-MS以及NMR分析：对步骤(1)中各发酵液中监测的峰进行LC-MS分析，其中，进行LC-MS分析的条件包括：C18柱(4.6×250mm)；检测波长254nm；梯度洗脱条件：0-5min 20％体积B；6-25min 20％体积B到100％体积B(6-25min内B的浓度均匀增加)；25-30min，100％B；31-40min，20％B。进样量50μL。ESI正离子源，分子量扫描范围50-1000。

结果如图3所示，发酵液a中产物峰1-3的扫描结果见图3a-c。峰1的MS图谱(图3a)上有肉桂醇的MS特征峰117.0700；峰2的MS图谱(图3b)上有络塞的MS特征峰319.1151；峰3的MS图谱(图3c)上有络塞维B的MS特征峰476.2126和481.1686。通过进一步的一维和二维NMR可以确定峰3为Trans-Cinnamyl-(6'-O-β-D-glucopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，是玫瑰红景天重要活性成分络塞维的类似物，是新化合物，将其命名为络塞维B。NMR数据如下，具体如图4所示。

[¹H-NMR(600MHz,D₂O)数据:¹H NMR(600MHz,)δ7.42(d,J＝7.5Hz,H-5,9),7.32(d,J＝7.5Hz,H-6,8),7.26(d,J＝7.5Hz,H-7),6.65(d,J＝15.9Hz,H-3),6.31(dt,J＝15.9Hz,6.4Hz,H-2),4.45(d,J＝7.9Hz,H-1′),4.42(dd,J＝12.7,6.8Hz,H_α-1),4.39(d,J＝7.9Hz,H-1″),4.31(dd,J＝12.7,6.8Hz,H_β-1),4.08(dd,J＝11.8,2.0Hz,H_α-6′),3.80(dd,J＝12.4,2.1Hz,H_α-6″),3.76(dd,J＝11.8,5.7Hz,H_β-6′),3.61(dd,J＝12.4,5.6Hz,H_β-6′),3.51～3.22(m,H-2′,2″,3′,3″,4′,4″,5′,5″).¹³C NMR(150MHz,D₂O)数据：δ135.8(s,C-4),133.0(d,C-4),128.3(d,C-5,9),127.6(d,C-7),126.0(d,C-6,8),102.2(d,C-1″),100.7(d,C-1′),75.3/75.2/75.1/74.3/72.5/72.4/69.0/68.8(d,C-3′～5′/C-3″～5″),69.8(t,C-1),68.0(t,C-6″),60.1(t,C-6′).

峰4的MS图谱(图3d)上有香豆醇的特征峰133.0690；峰5的MS图谱(图3e)上有香豆醇醇羟基单葡萄糖苷Triandrin的特征峰313.1408，330.1536，335.1095；峰6的MS图谱(图3f)上有香豆醇酚羟基单葡萄糖苷Triandrin B的特征峰330.1528，335.1089；峰7的MS图谱(图3g)上有香豆醇醇羟基双葡萄糖苷Triandrin C的特征峰475.1794，492.2069,457.1615；峰8的MS图谱(图3h)上有香豆醇酚羟基双葡萄糖苷Triandrin D的特征峰492.2056，497.1608。

通过进一步的¹H和¹³C NMR可以确定峰5为4-hydroxyl-cinnamyl-O-β-D-glucopyranoside，香豆醇醇羟基单葡萄糖苷，是玫瑰红景天重要活性成分之一，英文名为Triandrin(Sachaliside)，NMR数据如下所示，具体参见图5；

¹H NMR(600MHz,CD₃OD)数据:δ7.29(d,J＝8.5Hz,H-5,9),6.78(d,J＝8.6Hz,H-6,8),6.61(d,J＝15.9Hz,H-3),6.21(dt,J＝15.9,6.4Hz,H-2),4.53(dd,J＝12.8,5.4Hz,H_α-1),4.41(d,J＝7.8Hz,H-1′),4.32(dd,J＝12.4,6.8Hz,H_β-1),3.93(dd,J＝11.9,1.7Hz,H_α-6′),3.73(dd,J＝11.9,5.1Hz,H_β-6′),3.44～3.23(m,H-2′,3′,4′,5′).

峰6为4-hydroxy-cinnamyl alcohol-4-O-β-D-glucopyranoside，香豆醇酚羟基单葡萄糖苷，是新化合物，将其命名为Triandrin B，NMR数据如下所示，具体参见图6；

¹H NMR(600MHz,CD₃OD)数据：δ7.33(d,J＝8.6Hz,H-5,9),7.04(d,J＝8.6Hz,H-6,8),6.54(d,J＝15.9Hz,H-3),6.24(dt,J＝5.8Hz,15.9Hz,H-2),4.89(d,J＝7.4Hz,H-1′),4.19(d,J＝5.8Hz,H-1),3.88(dd,J＝12.0,1.7Hz,H_α-6′),3.69(dd,J＝12.0,5.2Hz,H_β-6′),3.46～3.38(m,H-2′,H-3′,H-4′,H-5′).¹³C NMR(150MHz,CD₃OD)数据：δ159.1(s,C-7),133.3(s,C-4),131.7(d,C-3),129.0(d,C-5,9),128.9(d,C-2),118.3(d,C-6,8),102.7(d,C-1′),78.6(d,C-3′),78.5(d,C-5′),75.4(d,C-2′),71.8(d,C-4′),64.3(t,C-1),63.0(t,C-6′).

峰7为4-hydroxyl-cinnamyl-(6'-O-β-D-glucopyranosyl)-O-β-D-glucopyranoside，香豆醇醇羟基双葡萄糖苷，是新化合物，将其命名为Triandrin C，NMR数据如下所示，具体参见图7；

¹H NMR(600MHz,CD₃OD)数据：δ7.31(d,J＝8.5Hz,H-5,9),6.78(d,J＝8.5Hz,H-6,8),6.64(d,J＝15.9Hz,H-3),6.21(dt,J＝15.9,6.4Hz,H-2),4.53(dd,J＝12.3,5.9Hz,H_α-1),4.46(d,J＝7.7Hz,H-1′),4.42(d,J＝7.8Hz,H-1″),4.32(dd,J＝12.3,6.7Hz,H_β-1),4.21(dd,J＝11.4,1.5Hz,H_α-6′),3.92(brd,J＝11.6Hz,H_α-6″),3.85(dd,J＝11.5,5.7Hz,H_β-6′),3.72(dd,J＝11.8,4.9Hz,H_β-6″),3.51～3.27(m,H-2′,2″,3′,3″,4′,4″,5′,5″).

峰8化合物量较低，未进行NMR检测，结合MS特征峰以及与化合物5，6和7的关系，确定8为香豆醇酚羟基双葡萄糖苷，为新化合物，将其命名为Triandrin D。

且经测定，菌株BWT-PDG发酵液a中络塞维B的产量最高可达1107.9±109.2mg/L，剩余络塞和肉桂醇的量分别为256.8±26.9mg/L和161.1±20.1mg/L；

高产苯丙氨酸菌株BPHE-PDG发酵液b中络塞维B的产量可达1609.3±7.0mg/L，比野生型菌株BWT-PDG提高了45.3％，剩余络塞和肉桂醇的产量分别为180.7±9.0mg/L和346.7±20.1mg/L；

菌株BWT-TDG发酵液c中Triandrin最高产量达432.7±39.4mg/L，Triandrin B最高产量达302.5±49.1mg/L；香豆醇、Triandrin C和Triandrin D的产量没有测定。

高产酪氨酸菌株BTAL-TDG发酵液d中Triandrin最高产量达1686.4±135.6mg/L，比菌株BWT-TDG提高了2.9倍；Triandrin B最高产量达1565.6±53.2mg/L，比菌株BWT-TDG提高了4.2倍。香豆醇、Triandrin C和Triandrin D的产量没有测定。

本发明的高产肉桂醇葡萄糖苷的大肠杆菌可以发酵生产肉桂醇、络塞和RosavinB等3种化合物，其中新化合物Rosavin B产量最高可达1.6g/L。高产香豆醇葡萄糖苷大肠杆菌可以发酵生产香豆醇、Triandrin、Triandrin B、Triandrin C和Triandrin D等5种化合物，其中包括3种新化合物，且Triandrin最高产量达1.7g/L，Triandrin B最高产量达1.6g/L。因此，本发明提供了一种高产肉桂醇葡萄糖苷和香豆醇葡萄糖苷的新的生物合成途径，这些化合物作为红景天重要活性成分或其类似物，具有很好的应用前景，为大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 络塞维衍生物及生产该络塞维衍生物的基因工程菌和其应用

<130> I56961TIB

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2082

<212> DNA

<213> 编码酪氨酸解氨酶TAL的基因

<400> 1

atggctccgc gtccgacctc tcagtctcag gctcgtacct gcccgaccac ccaggttacc 60

caggttgaca tcgttgaaaa aatgctggct gctccgaccg actctaccct ggaactggac 120

ggttactctc tgaacctggg tgacgttgtt tctgctgctc gtaaaggtcg tccggttcgt 180

gttaaagact ctgacgaaat ccgttctaaa atcgacaaat ctgttgaatt tctgcgttct 240

cagctgtcta tgtctgttta cggtgttacc accggtttcg gtggttctgc tgacacccgt 300

accgaagacg ctatctctct gcaaaaagct ctgctggaac accagctgtg cggtgttctg 360

ccgtcttctt tcgactcttt ccgtctgggt cgtggtctgg aaaactctct gccgctggaa 420

gttgttcgtg gtgctatgac catccgtgtt aactctctga cccgtggtca ctctgctgtt 480

cgtctggttg ttctggaagc tctgaccaac ttcctgaacc acggtatcac cccgatcgtt 540

ccgctgcgtg gtactatctc tgcttctggt gacctgtctc cgctgtctta catcgctgct 600

gctatctctg gtcacccgga ctctaaagtt cacgttgttc acgaaggtaa agaaaaaatc 660

ctgtacgctc gtgaagctat ggctctgttc aacctggaac cggttgttct gggtccgaaa 720

gaaggtctgg gtctggttaa cggtactgct gtttctgctt ctatggctac cctggctctg 780

cacgacgctc acatgctgtc tctgctgtct cagtctctga ccgctatgac cgttgaagct 840

atggttggtc acgctggttc tttccacccg ttcctgcacg acgttacccg tccgcacccg 900

acccagatcg aagttgctgg taacatccgt aaactgctgg aaggttctcg tttcgctgtt 960

caccacgaag aagaagttaa agttaaagac gacgaaggta tcctgcgtca ggaccgttac 1020

ccgctgcgta cctctccgca gtggctgggt ccgctggttt ctgacctgat ccacgctcac 1080

gctgttctga ccatcgaagc tggtcagtct accaccgaca acccgctgat cgacgttgaa 1140

aacaaaacct ctcaccacgg tggtaacttc caggctgctg ctgttgctaa cactatggaa 1200

aaaacccgtc tgggtctggc tcagatcggt aaactgaact tcacccagct gaccgaaatg 1260

ctgaacgctg gtatgaaccg tggtctgccg tcttgcctgg ctgctgaaga cccgtctctg 1320

tcttaccact gcaaaggtct ggacatcgct gctgctgctt acacctctga actgggtcac 1380

ctggctaacc cggttaccac ccacgttcag ccggctgaaa tggctaacca ggctgttaac 1440

tctctggctc tgatctctgc tcgtcgtacc accgaatcta acgacgttct gtctctgctg 1500

ctggctaccc acctgtactg cgttctgcaa gctatcgacc tgcgtgctat cgaatttgaa 1560

tttaaaaaac agttcggtcc ggctatcgtt tctctgatcg accagcactt cggttctgct 1620

atgaccggtt ctaacctgcg tgacgaactg gttgaaaaag ttaacaaaac cctggctaaa 1680

cgtctggaac agaccaactc ttacgacctg gttccgcgtt ggcacgacgc tttctctttc 1740

gctgctggta ctgttgttga agttctgtct tctacctctc tgtctctggc tgctgttaac 1800

gcttggaaag ttgctgctgc tgaatctgct atctctctga cccgtcaggt tcgtgaaacc 1860

ttctggtctg ctgcttctac ctcttctccg gctctgtctt acctgtctcc gcgtacccag 1920

atcctgtacg ctttcgttcg tgaagaactg ggtgttaaag ctcgtcgtgg tgacgttttc 1980

ctgggtaaac aggaagttac catcggttct aacgtttcta aaatctacga agctatcaaa 2040

tctggtcgta tcaacaacgt tctgctgaaa atgctggctt aa 2082

<210> 2

<211> 1686

<212> DNA

<213> 编码对羟基肉桂酸辅酶A连接酶4CL的基因

<400> 2

atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60

agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca tcccgaacca cctatctctc 120

cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga 180

ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc 240

aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt 300

cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360

aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc 420

ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta 480

gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc 540

accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca 600

ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg 660

atgctgactc acaagggact agtcacgagc gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg 720

aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac 780

gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg cggcgattct gataatgccg 840

aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg 900

atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg 960

agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc 1020

gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt 1080

ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct 1140

tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg atccagacac cggagattct 1200

ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260

ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag acggttggct tcatactgga 1320

gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt 1380

atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag aggctttgct catcggtcat 1440

cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct 1500

gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc 1560

gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt 1620

cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga 1680

ttgtga 1686

<210> 3

<211> 1488

<212> DNA

<213> 编码UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5的基因

<400> 3

atggtgagcg aaaccaccaa atctagtccg ttacattttg tgctgtttcc gtttatggca 60

cagggtcaca tgattccgat ggtggatatt gcacgcttac tggcccagcg cggcgttatt 120

attaccattg tgaccacccc gcataatgca gcacgcttta aaaatgtgct gaatcgcgcc 180

attgaaagtg gcctgccgat taacctagtt caggttaaat ttccgtatct ggaagccggc 240

ttacaggaag gccaggaaaa tattgatagc ttagatacca tggaacgcat gattccgttt 300

tttaaagcag ttaattttct ggaagaaccg gttcagaaac tgattgaaga gatgaatccg 360

cgcccgtctt gtctgattag cgatttttgt ctgccgtata cctctaaaat tgccaaaaaa 420

ttcaatattc cgaaaattct gtttcatggc atgggctgtt tttgtctgtt atgtatgcat 480

gtgctgcgca aaaatcgcga aattctggat aatctgaaat cagataaaga actgtttacc 540

gtgccggatt ttccggatcg tgttgagttc acccgcaccc aggttccggt ggaaacctat 600

gttccggcag gcgattggaa agatattttt gatggtatgg ttgaagccaa cgagacctct 660

tatggcgtga ttgttaatag ctttcaggaa ctggaaccgg cctatgccaa agattataag 720

gaagttcgct caggcaaagc ctggaccatt ggcccggtga gcctgtgtaa taaggtgggt 780

gcagataaag ccgaacgcgg caacaaatca gatattgatc aggatgaatg tctgaaatgg 840

ttagatagca agaaacatgg tagtgtgctg tatgtgtgtc tgggtagcat ttgtaatctg 900

ccgctgtcac agctgaaaga actgggctta ggcttagaag aatcacagcg cccgtttatt 960

tgggtaattc gcggttggga aaaatacaag gaattagttg aatggtttag cgaatcaggc 1020

tttgaagatc gtattcagga tcgcggctta ctgattaaag gttggtcacc gcagatgctg 1080

attctgagtc atccgagcgt gggcggcttt ctgacccatt gtggttggaa tagtacctta 1140

gaaggcatta ccgccggcct gccgttactg acctggccgc tgtttgcaga tcagttttgt 1200

aacgagaaac tggttgttga agtgctgaaa gcaggcgttc gtagcggcgt ggaacagccg 1260

atgaaatggg gcgaagaaga aaaaattggc gtgttagtgg ataaagaagg tgttaaaaaa 1320

gcagtggaag aactgatggg cgaatcagat gatgccaaag aacgtcgtcg tcgcgccaaa 1380

gaattaggcg atagcgcaca taaagcagtt gaagaaggtg gctcaagtca tagcaatatt 1440

agctttctgc tgcaggatat tatggaactg gccgaaccga ataattaa 1488

<210> 4

<211> 1365

<212> DNA

<213> 编码糖-糖基转移酶CaUGT3的基因

<400> 4

atggccaccg aacagcagca ggcaagcatt agctgtaaaa ttctgatgtt tccgtggctg 60

gcatttggtc atattagtag ttttctgcaa ctggcaaaaa agctgagcga tcgcggcttt 120

tatttttata tttgcagcac cccgattaat ctggatagca ttaagaataa gatcaaccag 180

aattacagca gcagcattca gctggttgat ctgcatctgc cgaatagtcc gcagctgccg 240

ccgagcctgc ataccaccaa tggcctgccg ccgcatctga tgagtaccct gaaaaatgcc 300

ctgattgatg caaatccgga tctgtgtaaa attattgcca gcattaagcc ggatctgatt 360

atctatgatc tgcatcagcc gtggaccgaa gcactggcaa gtcgtcataa tattccggca 420

gttagtttta gtaccatgaa tgcagttagc tttgcctatg tgatgcacat gtttatgaat 480

ccgggcattg aatttccgtt taaagccatt catctgagtg attttgaaca ggcacgcttt 540

ctggaacagc tggaaagcgc caaaaatgat gccagtgcca aagatccgga actgcaaggc 600

agcaaaggtt tctttaatag tacctttatc gtgcgcagca gccgcgaaat tgaaggtaaa 660

tatgttgatt atctgagcga aattctgaaa agtaaagtga ttccggtgtg tccggttatt 720

agcctgaata ataatgatca gggccagggt aataaggatg aagatgaaat tattcagtgg 780

ctggataaaa aatctcatcg cagtagcgtg tttgttagtt ttggtagtga atatttcctg 840

aatatgcagg aaattgaaga aattgcaatc ggcctggaac tgagcaatgt gaattttatt 900

tgggtgctgc gctttccgaa aggtgaagat accaaaattg aagaagtgct gccggaaggc 960

tttctggatc gtgttaaaac caaaggccgt attgttcatg gctgggcacc gcaggcacgc 1020

attctgggcc atccgagtat tggtggtttt gtgagccatt gtggttggaa tagcgtgatg 1080

gaaagcattc agattggcgt gccgattatt gcaatgccga tgaatctgga tcagccgttt 1140

aatgcccgcc tggtggtgga aattggtgtg ggtattgaag ttggccgcga tgaaaatggc 1200

aaactgaaac gcgaacgtat tggtgaagtg attaaggaag tggcaattgg caaaaaaggc 1260

gaaaaactgc gcaaaaccgc caaagatctg ggtcagaaac tgcgtgatcg cgaaaaacag 1320

gattttgatg aactggcagc aaccctgaaa cagctgtgtg tgtaa 1365

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物73C5-5FPBam

<400> 5

actggatccg atggtgagcg aaaccaccaa atctagtccg 40

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物73C5-3RPSal

<400> 6

tgagtcgact tagtggtggt ggtggtggtg attattcgg 39

<210> 7

<211> 70

<212> DNA

<213> 引物tyrR-5FPL

<400> 7

gtgtcatatc atcatattaa ttgttctttt ttcaggtgaa ggttcccatg attccgggga 60

tccgtcgacc 70

<210> 8

<211> 71

<212> DNA

<213> 引物tyrR-3RPL

<400> 8

gcataattta atatgcctga tggtgttgca ccatcaggca tattcgcgct tatgtaggct 60

ggagctgctt c 71

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物tyrRGD-5FP

<400> 9

tggattgacg atgacaaacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物tyrRGD-3RP

<400> 10

ttctgcaagc ctacggtgtg 20

<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213> 用于敲除tyrA的引物F

<400> 11

tattatggtt gctgaattga ccgcattacg cgatcaaatt gatgaagtca ttccggggat 60

ccgtcgacc 69

<210> 12

<211> 67

<212> DNA

<213> 用于敲除tyrA的引物R

<400> 12

ttattactgg cggttgtcat tcgcctgacg caataacacg cggctttctg taggctggag 60

ctgcttc 67

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 敲除tyrA的验证引物F

<400> 13

tgtatccgta accgatgcct gc 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 敲除tyrA的验证引物R

<400> 14

aaccacaatc tgattatgac c 21

<210> 15

<211> 70

<212> DNA

<213> 用于敲除trpE的引物F

<400> 15

agagaataac aatgcaaaca caaaaaccga ctctcgaaca gctaacctgc attccgggga 60

tccgtcgacc 70

<210> 16

<211> 67

<212> DNA

<213> 用于敲除trpE的引物R

<400> 16

acgaccttcc gcctcggcaa ttaactgcat agcgcgtact ttcggcgctg taggctggag 60

ctgcttc 67

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 敲除trpE的验证引物F

<400> 17

aagggtatcg acaatgaaag c 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 敲除trpE的验证引物R

<400> 18

aaagtctcct gtgcatgatg c 21

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物CCR-4CL-5F

<400> 19

tgcgatttaa gcggccgcat aatgcttaag tcgaacaga 39

<210> 20

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物CCR-4CL-3R

<400> 20

cgcgggatcg ggatccttat ttcggcaggt caccagacg 39

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物RgTAL-5F

<400> 21

ataaggatcc cgatcccgcg aaattaatac gactcactat 40

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物RgTAL-3R

<400> 22

tcgattatgc ttatgccagc atcttcagca gaacgttgt 39

<210> 23

<211> 70

<212> DNA

<213> 用于敲除pheA的引物F

<400> 23

aacactatga catcggaacc atggaacccg ttactggcgc tgcgagagag cgattgtgta 60

ggctggagct 70

<210> 24

<211> 70

<212> DNA

<213> 用于敲除pheA的引物R

<400> 24

tcaggttgga tcaacaggca cccatggtac gttctcactt gggtaacata acggctgaca 60

tgggaattag 70

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 敲除pheA的验证引物F

<400> 25

tgaatgggag gcgtttcgtc gt 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 敲除pheA的验证引物R

<400> 26

gttattgcgt caggcgaatg ac 22

Claims

1.一种生产络塞维类似物的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌含有能够编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因或编码酪氨酸解氨酶TAL的基因，能够编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因，能够编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因，和能够编码UDP葡萄糖基转移酶UGT的基因；

其中，所述基因工程菌还含有能够编码使糖链延伸的糖基转移酶的基因；

所述UDP葡萄糖基转移酶UGT为UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5，其编码基因为来自拟南芥的AtUGT73C5基因，GenBank:KJ138865.1；

所述使糖链延伸的糖基转移酶为糖-糖基转移酶CaUGT3，其编码基因为来自长春花的CaUGT3基因，GenBank:AB443870；

编码苯丙氨酸解氨酶PAL的基因为来自拟南芥的AtPAL基因，GenBank：AY133595.1；

编码酪氨酸解氨酶TAL的基因为来自粘红酵母的RgTAL基因，GeneBank：AAA33883.1；

编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因为来自欧芹的Pc4CL基因，GenBank:X13325.1；

编码肉桂酰辅酶A还原酶CCR的基因为来自拟南芥的AtCCR基因，GenBank:AF332459.1；

使用大肠杆菌构建所述基因工程菌；

所述洛塞维类似物具有如下式I、式II、式III或式IV所示的结构；

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，所述编码UDP葡萄糖基转移酶UGT73C5的基因如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，所述编码糖-糖基转移酶CaUGT3的基因如SEQ ID No.4所示。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，编码4-香豆酸辅酶A连接酶4CL的基因如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α。

6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其中，所述大肠杆菌为高产苯丙氨酸的大肠杆菌或高产酪氨酸的大肠杆菌；

其中，所述高产苯丙氨酸的大肠杆菌不表达tyrR、tyrA和trpE基因；

所述高产酪氨酸的大肠杆菌不表达tyrR、pheA和trpE基因。

7.权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌在生产络塞维类似物中的应用。

8.一种生产络塞维类似物的方法，其特征在于，在含葡萄糖的培养基中培养权利要求1-6中任意一项所述的基因工程菌，并诱导外源基因的表达以生产络塞维类似物。