CN108220264A - 一种糖基转移酶在生物合成红景天苷中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶在生物合成红景天苷中的应用，通过催化底物酪醇生成红景天苷，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明提供的糖基转移酶UGT73C5能高效转化酪醇合成红景天苷，为红景天苷的工业化生产奠定了基础。

Description

一种糖基转移酶在生物合成红景天苷中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种糖基转移酶UGT73C5在生物合成红景天苷中的应用。

背景技术

糖基化反应是指在糖基转移酶(Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y)的催化作用下，将活化的糖分子连接到受体分子上，改变受体分子的活性、增加受体分子的水溶性及分泌性等。糖基化是植物次生代谢中的关键反应之一，是决定植物天然产物的生物活性的重要因素。植物源中药中有很多重要活性成分都是糖基化的产物，比如红景天的活性成分红景天苷，天麻活性成分天麻素等。由于糖基转移酶在植物天然产物糖基化和生理功能中发挥的关键作用及其在生物技术中潜在的应用价值，近几年广受关注。

糖基转移酶(GTs)根据序列相似性、特征结构域、糖苷键立体构型以及底物特异性等可以分成92个家族。尿苷二磷酸(UDP)-糖基转移酶(UGTs)属于家族1，其广泛存在于植物、动物、真菌、细菌以及病毒中，催化供体糖基基团转移至小分子受体上，这些小分子受体如次级代谢物、生物或非生物毒素、植物激素等。UGT73C5来源于植物拟南芥，是UGT73C亚家族的一员。研究表明UGT73C5可以催化油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)类化合物发生糖基化，如油菜素甾酮(castasterone,CS)和油菜素内酯(brassinolide,BL)等(Poppenberger,B.,Fujioka,S.,Soeno,K.,George,G.L.,Vaistij,F.E.,Hiranuma,S.,Seto,H.,Takatsuto,S.,Adam,G.,Yoshida,S.,Bowles,D.(2005)The UGT73C5ofArabidopsis thaliana glucosylates brassinosteroids.Proc Natl Acad Sci U SA.102,15253-8)，尚未有其催化对羟基苯乙醇(酪醇,Tyrosol)的醇羟基发生糖基化生成红景天苷(Salidroside)的报道。

红景天原是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，主治气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘，具有扶正固本、补气养血、滋阴益肺的神奇功效，历代藏医将其视为“吉祥三宝”。红景天苷是红景天的主要药效成分，近年来更是作为环境适应药物如抗高原症和抗氧化美白护肤品备受关注，极具有开发前景。红景天苷化学名称为2-(4-hydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C14H20O7，分子量为300.304，CAS号为10338-51-9。迄今为止，序列清楚、生化功能确切的红景天苷葡萄糖基转移酶很少。Han-Song Yu等研究人员从红景天植物中克隆得到UGT73B6等3个红景天苷合成相关的葡萄糖基转移酶(Yu,H.S.,Ma,L.Q.,Zhang,J.X.,Shi,G.L.,Hu,Y.H.,Wang,Y.N.(2011)Characterization of glycosyltransferases responsible for salidrosidebiosynthesis in Rhodiola sachalinensis.Phytochemistry.72,862-70)。本实验室白艳芬等研究人员在大肠杆菌中过表达这三个酶，发现只有UGT73B6能催化合成红景天苷，而且催化效率较低，添加2mM酪醇时UGT73B6底物转化率只有6％(Bai,Y.,Bi,H.,Zhuang,Y.,Liu,C.,Cai,T.,Liu,X.,Zhang,X.,Liu,T.,Ma,Y.(2014).Production of salidroside inmetabolically engineered Escherichia coli.Scientific reports.4,6640)。葡萄糖基转移酶是生物合成红景天苷的瓶颈酶，因此获得催化活性高的糖基转移酶，是创建高效合成红景天苷生物合成通路的关键之一。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种糖基转移酶UGT73C5在生物合成红景天苷中的应用，克服现有技术中红景天苷催化效率较低的问题。

本发明的技术方案为：

根据糖基转移酶UGT73C5的氨基酸序列，优化合成其表达基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；

所述的糖基转移酶在生物合成红景天苷中的应用。

通过高效催化底物酪醇生成红景天苷。

能表达含有所述糖基转移酶基因的大肠杆菌。

所述的应用是指构建表达质粒，在大肠杆菌中诱导表达糖基转移酶UGT73C5，然后在发酵液中添加底物酪醇，糖基转移酶UGT73C5可直接通过生物催化酪醇的醇羟基加葡萄糖基，生成红景天苷。通过底物酪醇的饲喂实验，鉴定了红景天苷的合成，及UGT73C5体内转化酪醇为红景天苷的效率；

纯化糖基转移酶UGT73C5，通过体外实验进一步验证糖基转移酶UGT73C5催化酪醇合成红景天苷的功能，并进行了酶动力学参数测定；

本发明的有益效果是：本发明提供的糖基转移酶UGT73C5能高效转化酪醇合成红景天苷，为红景天苷的工业化生产奠定了基础。

附图说明

图1为pET28-ugt73C5表达质粒图谱。

图2为HPLC及LC-MS图谱；a.菌株BL0发酵液HPLC图谱，b.菌株BL73C5发酵液HPLC图谱，c.红景天苷标品HPLC图谱，d.化合物峰2的MS图谱；峰1，酪醇；峰2，红景天苷。

图3为UGT73C5蛋白表达及纯化SDS-PAGE；Lane1,蛋白Marker；Lane2纯化后的UGT73C5蛋白；Lane3,超声破碎后上清中总蛋白；Lane4，总蛋白；

图4为酪醇经UGT73C5催化合成红景天苷结构图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明中，对表达载体的种类没有特殊要求，可以为能够在大肠杆菌或其他表达载体中表达UGT73C5的本领域常用的各种表达载体，例如质粒等。本领域技术人员应该理解的是，表达载体的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，在此不再赘述。

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

以下实施例中，大肠菌株BL21(DE3)和大肠杆菌DH5α均可市售获得。大肠菌株BL21(DE3)用于本发明中糖基转移酶UGT73C5基因的表达，大肠杆菌DH5α用于基因UGT73C5克隆。大肠杆菌表达载体pET28a(+)购自Novagen，所述质粒携带来自于拟南芥(Arabidopsisthaliana)并根据大肠杆菌进行密码子优化的糖基转移酶UGT73C5蛋白的编码基因。

实施例1 pET28a-UGT73C5表达质粒构建

根据Genbank提供UGT73C5(GI:66774038)蛋白的氨基酸序列，进行大肠杆菌中密码子优化，优化后的核苷酸序列如如SEQ ID No：1所示，优化后的基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成后的基因经限制性内切酶NdeI和BamH酶切回收后，与同样酶切回收的pET28a(+)片段连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，酶切、测序验证获得正确质粒pET28a-UGT73C5，确认UGT73C5基因置于T7启动子下游，由T7启动子控制表达。质粒图谱如图1所示。

实施例2 UGT73C5生物转化底物酪醇及产物红景天苷LC-MS鉴定

分别转化不含基因的空质粒pET28a及表达质粒pET28a-UGT73C5至大肠杆菌BL21(DE3)，得菌株BL0、BL73C5。BL0和BL73C5克隆分别接种含50mg/L卡那霉素的液体LB培养基中37℃培养过夜，0.5mL过夜培养物接种50mL含50mg/L卡那霉素的液体的LB培养基，37℃培养至OD600达0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的IPTG后置16℃摇床诱导培养24小时后，离心收集菌体，重悬于50mL的M9Y培养基，并添加终浓度为2mM的底物酪醇，然后置30℃培养48小时。发酵液上清进行HPLC分析及LC-MS鉴定产物红景天苷。实验设三个重复。

HPLC及LC-MS图谱如图2所示，BL73C5菌株发酵液检测到红景天苷保留时间Rt为10min，其中[M+H]⁺＝301，[M+NH₄]⁺＝318，与红景天苷标品分子量及MS结果一致，确定BL73C5催化酪醇的醇羟基发生糖基化生成红景天苷。发酵中添加2mM底物酪醇，红景天苷的转化率大于70％，远高于目前文献及专利所报道的转化效率。

实施例3 UGT73C5蛋白表达纯化

挑取表达菌株BL73C5克隆至加入50mg/L卡那霉素的液体LB培养基中37℃培养过夜，然后以1:100的比例接入1000mL加入50mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD为0.6-0.8，加入0.1mM的IPTG进行16℃诱导培养20小时。4℃，3000rpm离心10min收集菌体，重悬于50mL的裂解缓冲液(50mM Tris/HCl，pH＝8.0，10mM咪唑，10％的甘油)。重悬菌体，经French高压细胞破碎仪破碎3遍，10,000g，4℃离心30min，上清立即与用裂解缓冲液平衡后的2mL镍柱琼脂糖树脂(Ni-NTA resin，QIAGEN Valencia,CA)混合，4℃结合50min后，用100mL的裂解缓冲液洗镍柱。然后用3mL洗脱缓冲液(50mM Tris/HCl，pH＝8.0，0.5M咪唑，10％的甘油)洗脱镍柱，收集洗脱液至透析袋，用50mM Tris/HCl(pH＝8.0)含10％glycerol缓冲液平衡去除咪唑。纯化的蛋白于Milipore超滤管(3KD)浓缩。Bradford蛋白测定试剂盒测定浓缩后的蛋白浓度并分装，-80℃保存。

纯化后的蛋白进行SDS-PAGE，如图3所示，带His标签的UGT73C5蛋白分子量大小为约50KD。总蛋白和菌体超声破碎后上清中的UGT73C5条带亮度接近，表明UGT73C5蛋白有较高的可溶性。

实施例4 UGT73C5酶促动力学测定

酶促反应温度为30℃，反应体系为100uL，含50mM Tris/HCl(pH＝8.0),5mMMgCl₂，100μg纯酶，反应时间为10min。受体酪醇和UDP-glucose作为可变底物测定UGT73C5酶对二者的k_cat和K_m值。测定对酪醇的动力学参数时，UDP-glucose浓度设定为5mM，酪醇浓度变化为0.5mM到20mM。测定对酪醇的动力学参数时，酪醇浓度设定为5mM，UDP-glucose浓度变化为0.5mM到5mM。反应用4μL 10％TFA终止，然后10,000g离心10min，50uL上清进行HPLC分析。根据标准曲线，计算各反应产物浓度，动力学参数用Origin 8.0，非线性曲线进行模拟分析。

所测得UGT73C5酶促动力学参数如表1。

表1 UGT73C5不同底物的动力学参数

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 糖基转移酶UGT73C5在生物合成红景天苷中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgagcg aaaccaccaa atctagtccg ttacattttg tgctgtttcc gtttatggca 60

cagggtcaca tgattccgat ggtggatatt gcacgcttac tggcccagcg cggcgttatt 120

attaccattg tgaccacccc gcataatgca gcacgcttta aaaatgtgct gaatcgcgcc 180

attgaaagtg gcctgccgat taacctagtt caggttaaat ttccgtatct ggaagccggc 240

ttacaggaag gccaggaaaa tattgatagc ttagatacca tggaacgcat gattccgttt 300

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cgcccgtctt gtctgattag cgatttttgt ctgccgtata cctctaaaat tgccaaaaaa 420

ttcaatattc cgaaaattct gtttcatggc atgggctgtt tttgtctgtt atgtatgcat 480

gtgctgcgca aaaatcgcga aattctggat aatctgaaat cagataaaga actgtttacc 540

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tgggtaattc gcggttggga aaaatacaag gaattagttg aatggtttag cgaatcaggc 1020

tttgaagatc gtattcagga tcgcggctta ctgattaaag gttggtcacc gcagatgctg 1080

attctgagtc atccgagcgt gggcggcttt ctgacccatt gtggttggaa tagtacctta 1140

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aacgagaaac tggttgttga agtgctgaaa gcaggcgttc gtagcggcgt ggaacagccg 1260

atgaaatggg gcgaagaaga aaaaattggc gtgttagtgg ataaagaagg tgttaaaaaa 1320

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gaattaggcg atagcgcaca taaagcagtt gaagaaggtg gctcaagtca tagcaatatt 1440

agctttctgc tgcaggatat tatggaactg gccgaaccga ataattaa 1488

Claims (6)

1.一种糖基转移酶UGT73C5，其编码基因的核苷酸序列特征，如SEQ ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的糖基转移酶在生物合成红景天苷中的应用。

3.根据权利要求2所述的糖基转移酶在生物合成红景天苷中的应用，其特征在于，通过高效催化底物酪醇生成红景天苷。

4.能表达含有权利要求1所述基因的大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述大肠杆菌或其他来源的蛋白表达菌株在生物合成红景天苷中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，构建表达质粒，在大肠杆菌中诱导表达糖基转移酶UGT73C5，然后在发酵液中添加底物酪醇，糖基转移酶UGT73C5可直接通过生物催化酪醇的醇羟基加葡萄糖基，生成红景天苷。