CN108191657A - 一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法 - Google Patents

一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，具体为一种双水相体系萃取苎麻叶提取液中绿原酸的方法。所述双水相体系为六氟异丙醇(HFIP)‑无机盐双水相体系，由HFIP、无机盐和水构成。苎麻叶提取液用无机盐水溶液稀释，加入HFIP，涡旋，离心，使体系形成界面清晰的液‑液两相，上层为盐相、下层为醇相，绿原酸主要分布于盐相，而杂质主要分布于醇相；取盐相，过滤后进行半制备液相色谱分析，收集含绿原酸的流出物蒸发至干，残渣经丙酮溶解后过滤除盐，滤液在氮气流下挥干，密封，于4℃下结晶，即得绿原酸纯品。本发明双水相体系萃取绿原酸的方法操作简单，除杂效果好，萃取效率高(萃取率接近100％)，具有较好的应用前景。

Description

一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法
技术领域
本发明属于化学分离提纯领域，涉及一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法。
背景技术
苎麻是荨麻科苎麻属多年生草本植物，国际上又称为“中国草”。我国的苎麻植物资源极为丰富，在苎麻的茎皮作为纺织原料被开发的同时，大量的苎麻叶被当作工业废料丢弃，既浪费资源，又污染环境。我国民间以苎麻叶入药由来已久，早在《本草纲目》中便对苎麻叶的性味归经做了记载，《中药大辞典》中也有收录。中医认为：苎麻叶甘寒、无毒，具有活血、化瘀、散癖等功效，对跌打损伤所致伤折出血、尿血、血淋、***肿痛以及部分妇科疾病有治疗效果。绿原酸作为苎麻中的主要活性成分，与多种药理活性的表达有着重要联系。目前已报道证实了绿原酸具有降血压、调节糖类和脂质代谢、抗病毒以及抗肿瘤、抗炎、保护神经***等功能，而且部分活性已在人体试验中得到证实。从苎麻叶中提取绿原酸是对废物的再利用，既能创造经济和社会效益，又能减少环境污染。
绿原酸属于酚酸类化合物，极性很强(logP＝0.370±0.461，pKa＝3.91±0.50，分子量354.31)，而天然酚酸类化合物的传统提取分离和纯化方法多存在提取选择性差、有机溶剂消耗量大、操作繁琐、耗时长、成本高等问题，这在一定程度上限制了苎麻叶中绿原酸的提取分离研究。因此，研究开发从苎麻叶中提取分离绿原酸的新方法非常必要。
双水相体系是一种或几种物质的水溶液在一定条件下自发形成的两个互不相溶、界面清晰的水相体系。基于双水相体系所发展起来的双水相萃取技术，由于分相条件温和、分相迅速、操作步骤简单且易于放大等特点，而在提取分离纯化领域有着诸多应用。小分子醇-无机盐双水相体系是一种新型双水相体系，主要依靠无机盐的盐析作用(盐离子争夺体系中的水分子、释放出醇分子)而分相；与基于高聚物的双水相体系相比，具有原料成本低、体系粘度低、传质速度快、原料易于回收利用(蒸馏回收醇、结晶回收盐)、不易乳化、可简化操作和降低成本等特点。但是传统小分子醇-无机盐双水相体系为小分子碳氢醇-盐体系，它们应用于萃取绿原酸时存在一些问题：(1)绿原酸主要分布在醇相，由于醇相中同时会引入很多其他干扰物质，不利于绿原酸的进一步纯化；(2)小分子碳氢醇-无机盐体系主要依靠盐析作用分相，分相能力较弱，不利于对绿原酸的高效萃取；(3)消耗的碳氢醇较多，不利于绿色环保。
发明内容
为了解决上述小分子碳氢醇-无机盐双水相体系在萃取绿原酸时存在的问题，本发明主要提供一种六氟异丙醇(HFIP)-无机盐双水相体系应用于萃取苎麻叶中绿原酸的方法。本发明旨在克服现有小分子碳氢醇-无机盐双水相体系萃取绿原酸时的不足，提高绿原酸的萃取效率，减少苎麻叶中其他物质对萃取分离绿原酸的干扰，利于提高绿原酸的纯度，并减少有机溶剂的用量。
本发明提供的技术方案如下。
一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，包括以下步骤：
(1)制备苎麻叶的提取物
A、将新鲜苎麻叶于阴凉通风处自然晾干，干燥叶片由粉碎机粉碎，过筛得苎麻叶粉末；
B、取苎麻叶粉末置于提取瓶中，使用乙醇进行加热回流提取，抽滤收集提取液，重复此过程两次，合并三次提取液；
C、提取液减压旋转蒸发至干，残渣用甲醇超声溶解，合并甲醇溶解液，过滤并保留滤液；
(2)双水相体系萃取绿原酸
D、取C步骤过滤所得的滤液，加入无机盐水溶液稀释，混匀得到稀释液；
E、向D步骤稀释液中加入六氟异丙醇(HFIP)，涡旋混匀然后离心得到液-液两相体系，其中上层为盐相，下层为醇相；
(3)绿原酸纯品制备
F、收集E步骤所得的上层盐相，过滤后进行半制备液相色谱分析，收集含绿原酸的流出物；
G、流出物减压旋转蒸发至干，残渣用丙酮多次超声溶解，合并丙酮溶解液，过滤得到滤液；
H、将步骤G所得滤液在氮气氛围下加热除去丙酮，然后密封、自然结晶，即得绿原酸纯品。
上述萃取绿原酸的双水相体系为HFIP-无机盐双水相体系，由HFIP、无机盐和水构成。
上述的无机盐包括柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钾和磷酸氢二钾中的一种，其浓度为1.5～4mol/L、pH为1～6。
所述步骤D中无机盐水溶液的体积为步骤C中所得甲醇溶液体积的10倍。
所述步骤E中六氟异丙醇与步骤D中无机盐水溶液的体积比范围为1:1.5～10。
所述步骤E中涡旋功率为60W，涡旋时间为3～60s。
所述步骤E中离心转速为3000rpm，离心时间为3～15min。
所述步骤B中每1g苎麻叶粉末需要乙醇10mL；乙醇浓度为70％(v/v)，pH值为4.0；加热回流温度为70℃，提取时间为2h。
发明人意想不到地将HFIP作为小分子醇-无机盐双水相体系中的醇相，并且打破了传统小分子醇-无机盐体系以醇相为萃取相的传统思路。六氟异丙醇(HFIP)相比于碳氢醇具有强疏水性(logP＝1.57,异丙醇0.173)、强氢键给体能力(1.96，异丙醇0.767)、强溶解能力等独特性能。这些特性使得HFIP-无机盐双水相体系较传统的小分子碳氢醇-无机盐双水相体系具有以下优势：
(1)分相能力更强
除了盐析作用外，HFIP的强疏水性、HFIP分子间的强氢键作用在HFIP-盐双水相体系分相中也发挥了非常重要的作用。因此，HFIP的分相能力显著强于传统的正丙醇、异丙醇、乙醇等小分子碳氢醇，导致HFIP-盐体系分相条件更温和简单，且分相能力不受盐溶液pH、温度和少量水溶性有机溶剂(如甲醇)的影响，体系的相行为更稳定、更易于控制；
(2)萃取效率更高、除杂效果更好
HFIP的强疏水性使得苎麻叶提取液中强极性的绿原酸在萃取过程中更倾向于分布在上层盐相中；而HFIP的强疏水性和强溶解能力使得苎麻叶提取液中非极性、弱极性的干扰物质进入下层醇相，HFIP的强氢键供体能力也会使极性干扰物质更多地进入下层醇相，从而很大程度上排除了这些物质对萃取绿原酸的干扰。与传统小分子碳氢醇-盐双水相体系通过醇相萃取绿原酸(但除杂效果差)不同，本发明的HFIP-盐双水相体系可以通过盐相萃取、醇相除杂的方式实现对绿原酸的提取分离和纯化，盐相对绿原酸的萃取效率高，而醇相对干扰物质的除杂效果好。
基于上述分析，本发明的有益效果为：
1.采用HFIP-盐双水相体系，盐相对绿原酸的萃取率高，最高可接近100％；
2.采用HFIP-盐双水相体系，醇相对干扰物质的清除效果好，所得到的盐相后续只需再通过半制备色谱分析就能获得高纯度的绿原酸(按含水物计算，纯度接近100％)；
3.萃取得到的绿原酸来源于苎麻叶，原料丰富、工业废弃物再利用、成本低、绿色环保；
4.提取分离绿原酸的方法工艺简单，具有应用价值，适合工业化生产。
附图说明
图1为实施例1的绿原酸萃取率图；
图2为实施例2的绿原酸绝对含量图；
图3为实施例3的绿原酸绝对含量图；
图4为实施例4的绿原酸绝对含量图；
图5为实施例5的绿原酸绝对含量图；
图6为实施例6的绿原酸绝对含量图；
图7为HFIP-NaCl双水相体系的色谱图，其中：A-萃取苎麻叶提取液所得的醇相，B-1.5μg/mL绿原酸加标的空白盐相，C-萃取苎麻叶提取液所得的盐相，峰1-绿原酸；
图8为所制备绿原酸产物的IR图谱，其中：A-制备产物，B-文献提供的绿原酸IR图谱；
图9为所制备绿原酸产物的MS/MS图谱，其中：A-制备产物，B-绿原酸标准品；
图10为绿原酸的化学结构式。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明，本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1无机盐种类的选择
1.配制0.5mg/mL绿原酸标准溶液：
精密称取绿原酸标准品，用甲醇溶解并稀释，得到0.5mg/mL绿原酸标准溶液。
2.双水相萃取：
取上述0.5mg/mL绿原酸标准溶液0.15mL，分别加入1.5mL 1.5mol/L的不同种类无机盐(柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾)溶液(使用1mol/L HCl调pH值至3.0)，再加入1mL HFIP，配制得到10份溶液。每份溶液60W涡旋20s，3000rpm离心10min，得到互不相溶的液-液两相，其中上层为盐溶液富集相，简称盐相，下层为HFIP富集相，简称醇相。用注射器吸取下层醇相并丢弃，精密量取盐相体积，经0.22μm有机滤膜过滤后，进行HPLC-UV分析，采取外标一点法对绿原酸的含量进行定量分析，并计算萃取率。
图1为实施例1的分析结果，从图中可以看出，柠檬酸钠和氯化钠与HFIP组成的双水相体系对绿原酸的萃取率相似并显著高于其他6种无机盐。考虑到柠檬酸钠在水中的溶解性不如氯化钠，选择氯化钠为最优无机盐、与HFIP组成双水相体系。
实施例2 HFIP加入量的优化
1.制备苎麻叶提取液：
将新鲜苎麻叶置于阴凉通风处自然晾干，干燥叶片由高速万能粉碎机粉碎。取粉碎物过16目筛，得苎麻叶粉末。取2g苎麻叶粉末置于50mL的圆底烧瓶中，加入20mL 70％(v/v)的乙醇(1mol/L盐酸调节pH至4.0)，于70℃下加热回流提取2h，抽滤收集提取液，药渣转移回烧瓶中再次在相同条件下提取，重复2次。合并3次提取液，滤除不溶物后于55℃旋转蒸发至干，分别加入15mL、10mL和5mL甲醇将提取物超声溶解并转移，30mL提取物的甲醇溶液经0.45μm有机滤膜过滤。
2.双水相萃取：
取上述苎麻叶提取液0.15mL，加入1.5mL 2.5mol/L NaCl水溶液(使用1mol/L HCl调节pH值至3.0)，再分别加入0.15mL、0.25mL、0.5mL、0.75mL、1mL HFIP配制成梯度溶液。然后60W涡旋20s，3000rpm离心10min，得到互不相溶的液-液两相，其中上层为盐相，下层为醇相。用注射器吸取下层醇相并丢弃，精密量取盐相体积，经0.22μm有机滤膜过滤后，进行HPLC-UV分析，并采取外标一点法对绿原酸的含量进行定量分析。
图2为实施例2的分析结果，从图中可以看出，盐相中绿原酸绝对含量随着HFIP加入量的增加逐渐下降。这是因为当体系中HFIP加入量增加时，醇相的体积增加，会争夺更多的水进入醇相，则盐相体积随之减少，萃取到的绿原酸的量也逐渐降低。综合盐相的萃取能力和醇相的除杂能力，选择0.25mL为HFIP的最优加入量。
实施例3无机盐NaCl浓度的优化
1.制备苎麻叶提取液：重复实施例2的步骤进行制备。
2.双水相萃取：
取上述苎麻叶提取液0.15mL，分别加入1.5mL浓度为1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、4mol/L的NaCl水溶液(使用1mol/L HCl调节pH值至3.0)，再加入0.25mLHFIP配制成梯度溶液。接着60W涡旋20s，3000rpm离心10min，后续采用实施例1的处理方式取盐相进行HPLC-UV分析。
从图3可以看出，NaCl浓度为2mol/L时能达到最佳的萃取能力。
实施例4 NaCl水溶液pH值的优化
1.制备苎麻叶提取液：重复实施例2的步骤进行制备。
2.双水相萃取：
取上述苎麻叶液0.15mL，分别加入1.5ml pH值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0(使用1mol/L HCl调节pH值)的2mol/L NaCl水溶液，再加入0.25mL HFIP配制成梯度溶液。60W涡旋20s，3000rpm离心10min，后续采用实施例1的处理方式取盐相进行HPLC-UV分析。
从图4可以看出，pH值为3.0时双水相体系达到最佳的萃取能力。pH太小或太大都不利于绿原酸的萃取，这可能是因为绿原酸中酯键的水解而导致萃取效率降低。
实施例5涡旋时间的优化
1.制备苎麻叶提取液：重复实施例2的步骤进行制备。
2.双水相萃取：
取上述苎麻叶提取液0.15mL，加入1.35mL 2mol/L NaCl水溶液(使用1mol/L HCl调节pH值至3.0)，再加入0.25mL HFIP配制成溶液。采用上述方法配制7份溶液，分别采用手动上下振摇20次、60W涡旋3s、5s、15s、30s、45s、60s进行处理，然后3000rpm离心10min，后续采用实施例1的处理方式取盐相进行HPLC-UV分析。
从图5可以看出，随涡旋时间的增加，萃取进入盐相的绿原酸含量先增加后趋于稳定，因而涡旋混匀的方式更有利于绿原酸的萃取，选择5s为相对最优的涡旋时间。
实施例6离心时间的优化
1.制备苎麻叶提取液：重复实施例2的步骤进行制备。
2.双水相萃取：
取上述苎麻叶提取液0.15mL，加入1.5mL NaCl水溶液(NaCl浓度为2mol/L，使用1mol/L HCl调节pH值至3.0)，再加入0.25mL HFIP，60W涡旋5s得到溶液。采用该方法制备得到5份溶液，在转速3000rpm下分别离心3min、5min、7min、10min、15min，后续采用实施例1的处理方式取盐相进行HPLC-UV分析。
从图6可以看出，盐相中绿原酸的含量在离心时间超过7min时已基本不再增加，因而选择离心时间为7min。
实施例7 HFIP-盐双水相体系在最佳萃取条件下对绿原酸的萃取率
最佳萃取条件为：无机盐为NaCl，NaCl水溶液的浓度为2mol/L、pH值3.0，HFIP加入量为NaCl水溶液体积的1/6，涡旋时间5s，离心时间7min。
双水相萃取：取苎麻叶提取液0.15mL，加入1.5mL的2mol/L NaCl水溶液(使用1mol/L HCl调节pH值至3.0)，再加入0.25mL HFIP，60W涡旋5s，3000rpm离心7min使体系分相。分别取盐相和醇相，进行HPLC-UV分析。
从图7中可以看出，盐相中检测出绿原酸的色谱峰，醇相中未出现绿原酸的色谱峰，说明HFIP-NaCl双水相体系对绿原酸的萃取率几乎达到100.00％。
实施例8制备绿原酸纯品
取实施例1所制备的苎麻叶提取液0.15mL，加入1.5mL 2mol/L NaCl水溶液(使用1mol/L HCl调节pH值至3.0)，再加入0.25mL HFIP，60W涡旋5s，3000rpm离心7min使体系分相；收集所得的上层盐相，经0.22μm有机滤膜过滤后进行半制备液相色谱分析；收集含绿原酸的流出物，于55℃减压旋转蒸发至干，残渣用丙酮分三次(每次5mL)超声溶解，合并丙酮溶液，以0.22μm有机滤膜过滤除去盐，所得滤液于40℃、氮气流下除去丙酮，密封，于4℃下自然结晶，即得绿原酸纯品。
从4g苎麻叶粉末中制得10.6035mg淡黄色晶体，产物结构经UV、IR、1H NMR和MS/MS鉴定为绿原酸(含1分子结晶水，C16H18O9·H2O)。按含水物计算，产物纯度接近100％。
图8所示为产物的红外光谱图，主要特征吸收峰包括：3350.36cm-1(-O-H)，1722.43cm-1(＝C-COOR中的C＝O)，1687.71cm-1(R-COOH)，1637.56cm-1(＝C-COOR中的C＝C)，1602.85cm-1(苯环中的C＝C)，1288.45cm-1(-O-H)，1188.15cm-1(-COOR)，974.05cm-1(-C＝CH-)，817.82cm-1(-C＝CH-)，与文献(SciFinder Scholar from Chemical AbstractService)报道的绿原酸红外光谱结果一致。图9是产物的二级质谱图，在负离子模式下，产物与绿原酸标准品的分子离子峰和碎片离子峰一致。分子离子峰均为m/z 353，m/z 190.9特征离子峰表明存在奎尼酸基团[奎尼酸-H]-，m/z 179.0和m/z 161特征离子峰表明存在咖啡酸基团[咖啡酸-H]-和[咖啡酸-H2O-H]-。(绿原酸是由一分子奎尼酸与一分子咖啡酸形成的酯，又名3-O-咖啡酰奎尼酸，结构式见图10)。结果表明，所制备的产物实为绿原酸。
综上所述，通过实施例1～6确定了使用本发明提供的HFIP-无机盐双水相体系从苎麻叶提取液中萃取绿原酸的最优萃取条件。实施例7是在最优条件下进行萃取，产物的萃取率高，几乎达到100％。实施例8制备了绿原酸纯品并通过红外光谱图和质谱图验证了其化学组成和结构。总而言之，本发明提供的制备方法除杂效果好，产品纯度高，工艺简单，是一种高效的双水相萃取方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备苎麻叶的提取物
A、将新鲜苎麻叶于阴凉通风处自然晾干，干燥叶片由粉碎机粉碎，过筛得苎麻叶粉末；
B、取苎麻叶粉末置于提取瓶中，使用乙醇进行加热回流提取，抽滤收集提取液，重复此过程，合并提取液；
C、提取液减压旋转蒸发至干，残渣用甲醇超声溶解，合并甲醇溶解液，过滤并保留滤液；
(2)双水相体系萃取绿原酸
D、取步骤C过滤所得的滤液，加入无机盐水溶液稀释，混匀得到稀释液；
E、向步骤D稀释液中加入六氟异丙醇(HFIP)，涡旋混匀，然后离心得到液-液两相体系，其中上层为盐相，下层为醇相；
(3)绿原酸纯品制备
F、收集步骤E所得的上层盐相，过滤后进行半制备液相色谱分析，收集含绿原酸的流出物；
G、流出物减压旋转蒸发至干，残渣用丙酮多次超声溶解，合并丙酮溶解液，过滤得到滤液；
H、将步骤G所得滤液在氮气氛围下加热除去丙酮，然后密封、自然结晶，即得绿原酸纯品。
2.根据权利要求1所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述的萃取绿原酸的双水相体系为HFIP-无机盐双水相体系，由HFIP、无机盐和水构成。
3.根据权利要求1或2所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述的无机盐包括柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、氯化钾和磷酸氢二钾中的一种，其浓度为1.5～4mol/L、pH为1～6。
4.根据权利要求1所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述步骤D中无机盐水溶液的体积为步骤C所得滤液体积的10倍。
5.根据权利要求1所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述步骤E中所加六氟异丙醇与步骤D中所加无机盐水溶液的体积比范围为1:1.5～10。
6.根据权利要求1所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述步骤E中涡旋功率为60W，涡旋时间为3～60s。
7.根据权利要求1所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述步骤E中离心转速为3000rpm，离心时间为3～15min。
8.根据权利要求1所述的从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法，其特征在于：所述步骤B中每1g苎麻叶粉末需要乙醇10mL；乙醇浓度为70％(v/v)，pH值为4.0；加热回流温度为70℃，提取时间为2h。
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