CN104672090A - 一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法 - Google Patents

一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法 Download PDF

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曹诣
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Abstract

一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法，该方法是以乙醇超声波法从苎麻叶片中提取绿原酸粗提物，于该绿原酸粗提物中加入水，搅拌后静置过夜，过滤，取上清液，得绿原酸粗提液，再以D-101大孔树脂分离纯化所述绿原酸粗提液。本方法通过比较LSA40、D-101和D14大孔吸附树脂分离纯化绿原酸的效果。根据吸附量和吸附率筛选出D-101树脂为富集纯化苎麻叶片绿原酸的最适宜树脂。并比较研究了不同上样液流速、洗脱溶液pH值和洗脱溶液浓度对吸附率和绿原酸纯度的影响，确定了上样液流速、洗脱液pH值和洗脱液浓度等参数，建立了大孔树脂分离纯化苎麻叶中绿原酸的工艺流程。绿原酸最终纯度达23.7％，达到了富集纯化的目的。

Description

一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法
技术领域
本发明涉及植物绿原酸的分离纯化方法，具体涉及一种从苎麻叶片中分离纯化绿原酸的方法。
背景技术
绿原酸(chlorogenic acid)，又名3-咖啡酰奎尼酸(3-caffeoylquinicacid)，是植物在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径(HMS)的中间产物合成的一种苯丙素类物质。绿原酸共有10种异构体，植物中存在的多为其混合物。绿原酸对很多种致病菌均有较强烈的抑制和杀伤作用，具有降低血脂、降低血糖、增强免疫力等生物活性作用。绿原酸还是一种自由基清除剂及抗氧化剂，具有保护心血管的功能，具有较高的药用价值。
绿原酸在植物中分布广泛，从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道。已有研究发现含有绿原酸的各植物科属中，以忍冬科分布最广，其品种的相对含量也最高。前人研究表明苎麻叶片的绿原酸含量较高，其中又以悬铃叶苎麻中绿原酸的含量最高，而绿原酸纯度越高，药用价值越大。因此，如何有效分离纯化苎麻叶片绿原酸具有十分重要的经济价值。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法，以建立D-101树脂富集纯化绿原酸的工艺参数。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法，该方法包括以乙醇超声波法从苎麻叶片中提取绿原酸粗提物，于该绿原酸粗提物中加入水，搅拌后静置过夜，过滤，取上清液，得绿原酸粗提液，其特点是，该方法还包括以D-101大孔树脂分离纯化所述绿原酸粗提液，其中分离纯化时的工艺参数为：以D-101大孔树脂吸附绿原酸，绿原酸粗提液的上样流速为2-3mL/min，用2BV体积浓度为50-70％且pH值为3-5的乙醇溶液以2-3mL/min的流速进行洗脱。
所述分离纯化时的工艺参数为：以D-101大孔树脂吸附绿原酸，绿原酸粗提液的上样流速为3mL/min，用2BV体积浓度为50％且pH值为4的乙醇溶液以3mL/min的流速进行洗脱。
上述提及的以乙醇超声波法从苎麻叶片中提取绿原酸粗提物为现有常规技术优化，参见《苎麻叶总绿原酸提取工艺研究》第13551-13552页，《安徽农业科学》2011年22期出版。
所述绿原酸粗提液是于该绿原酸粗提物中加入0.5倍绿原酸粗提物体积的水，磁力搅拌25-35min，然后置于4℃静置过夜，过滤除去水不溶性杂质，取上清液得到。
下面对本方法中以D-101大孔树脂分离纯化绿原酸时的工艺参数的确定详述如下：
1.材料
采自湖南农业大学国家长期定位点实验基地湘苎3号叶片。苎麻样品干燥方式是：先置于通风阴凉处放置24h，再置于60℃恒温鼓风干燥箱中烘48h至恒重，粉碎后过40目筛。
2.HPLC法检测苎麻叶片绿原酸含量
色谱柱：(3.9×150mm Column，5μm)；检测波长:326nm，流动相:水:甲醇:乙酸＝81:18:l，流速0.8mL/min，柱温25℃。
将苎麻叶绿原酸提取滤液真空浓缩至25mL，离心(15℃，6500转，6分钟)，将提取液经0.5μm滤膜过滤，从所得液中取6μL，进行HPLC分析。
制作标准曲线：精密称取烘干至恒重的绿原酸对照品4.5mg，50％甲醇超声溶解并定容50mL棕色容量瓶中，摇匀，作为标准品。先后精密吸取标准品原液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，50％甲醇分别定容于10mL棕色容量瓶中，摇匀，过0.45μm微滤膜，高效液相检测，记录色谱图及峰面积，以峰面积为纵坐标，绿原酸浓度为横坐标作图，见图1。回归方程为y＝14685x-86868，r2＝0.9999。
3.绿原酸粗提液的制备
精确称取苎麻叶粉末100.00g，加入1000mL体积浓度为70％且pH值为4的乙醇超声提取2次，每次超声提取30min，过滤浓缩。于绿原酸粗提液中加入0.5倍绿原酸粗提物体积的水，磁力搅拌30min，然后置于冰箱中静置过夜，过滤除去水不溶性杂质，得上清液，待上柱。绿原酸溶液浓度为1.3mg/ml。
4.树脂筛选
选择LSA40、D-101和D14大孔吸附树脂进行分离纯化。将树脂以蒸馏水溶涨后浮选，用0.5mol/L的HCl浸泡1d，并不时搅拌，倾去酸液，水洗至中性；再用70％体积浓度的乙醇浸泡1d，并不断搅拌，水洗至无须状物为止；抽干，室温干燥至不黏。以蒸馏水湿法装柱。
分别取处理好的树脂各1g至于100mL的锥形瓶，加入绿原酸粗提液20mL，放入摇床(120r/min)震荡24h，然后测定吸附后溶液中绿原酸的含量。计算各树脂的吸附量和吸附率，见下表1。通过比较各树脂吸附绿原酸的综合效果，确定D101是分离绿原酸效果最好的树脂。
表1 不同树脂吸附量和吸附率
树脂型号 吸附量(mg/g) 吸附率(％)
LSA40 1.61 61.53
D-101 2.16 83.07
D14 1.80 69.23
5.上样液流速确定
2cm×30cm玻璃柱中装入10cm已处理好的树脂，上澄清液，以流速2-6mL/min上样。结果如图2所示，在一定范围内，流速增加时D-101树脂吸附绿原酸的能力降低，流速为2-3mL/min时获得最佳吸附性能。很可能是由于在低流速时，样品溶液在树脂上得到了相对较好的内扩散。鉴于流速为2mL/min和3mL/min时树脂吸附能力差异微小，而低流速会延长工作时间，因此后续试验中最佳上样流速为3mL/min。
6.洗脱条件确定
洗脱溶液pH值的确定：2cm×30cm玻璃柱中装入10cm已处理好的树脂，上澄清液，以流速3mL/min，使柱内液面高度保持在1-2cm，用pH1-6的2BV体积浓度为30％的乙醇洗脱液洗脱，收集洗脱液分别计算吸附率。结果由图3可知，pH值为4时，吸附效果最好。
洗脱溶液浓度的确定：2cm×30cm玻璃柱中装入10cm已处理好的D-101树脂，上澄清液，然后分别用2BV 30、40、50、60、70和80％体积浓度的乙醇溶液(pH＝4)以3mL/min流速洗脱。收集洗脱液分别计算吸附率。测定绿原酸纯度。由下表2可知，50％乙醇洗脱时，绿原酸的纯度明显高于其它洗脱液。不同洗脱液的吸附率差异较小。因此，筛选50％体积浓度的乙醇溶液为D-101树脂吸附绿原酸的洗脱溶液。
表2 不同体积浓度乙醇的吸附率及绿原酸纯度
乙醇浓度(％) 吸附率(％) 纯度(％)
30 66.2 16.6
40 70.3 19.5
50 84.6 23.7
60 88.8 20.3
70 80.7 19.7
80 77.5 18.2
7.工艺参数
本方法确定了上样液流速、洗脱溶液pH值和洗脱溶液浓度等参数，建立了大孔树脂分离纯化苎麻叶中绿原酸的较好工艺流程：D-101树脂装柱，上样流速3mL/min，用2BV 50％体积浓度的乙醇溶液(pH＝4)以3mL/min流速对树脂柱进行洗脱，浓缩洗脱液。此时，绿原酸最终纯度达23.7％，达到了富集纯化的目的。而D-101大孔树脂对绿原酸吸附量大、吸附时间短且易解吸，且该工艺易于操作、溶剂消耗低，能应用于绿原酸的富集纯化。
本方法通过比较LSA40、D-101和D14大孔吸附树脂分离纯化绿原酸的效果。根据吸附量和吸附率筛选出D-101树脂为富集纯化苎麻叶片绿原酸的最适宜树脂。并比较研究了不同上样液流速(2-6mL/min)、洗脱溶液pH值(pH 1-6)和洗脱溶液浓度(30-80％体积浓度的乙醇溶液)对吸附率和绿原酸纯度的影响。确定了上样液流速、洗脱液pH值和洗脱液浓度等参数，建立了大孔树脂分离纯化苎麻叶中绿原酸的工艺流程。绿原酸最终纯度达23.7％，达到了富集纯化的目的。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：首次对苎麻叶片绿原酸进行了分离纯化；从LSA40、D-101和D14三种大孔吸附树脂中筛选出D-101，以适合于苎麻叶片绿原酸的分离纯化，并确定了D-101分离化苎麻叶片绿原酸的工艺参数。
附图说明
图1是绿原酸的标准曲线图。
图2是不同流速对绿原酸吸附率的影响。
图3是洗脱溶液pH值对绿原酸吸附率的影响。
具体实施方式
制备绿原酸粗提液：取苎麻叶片置于通风阴凉处放置24h，再置于60℃恒温鼓风干燥箱中烘48h至恒重，粉碎后过40目筛。称取苎麻叶粉末100.00g，加入1000mL 70％体积浓度的乙醇溶液(pH值为4)超声提取2次，每次提取30min，过滤浓缩，得绿原酸粗提物。于绿原酸粗提物中加入1/2体积的水，磁力搅拌30min，然后置于4℃静置过夜，过滤除去水不溶性杂质，得上清液，待上柱。绿原酸粗提液浓度为1.3mg/ml。
实施例1
将上述配制的绿原酸粗提液以2mL/min的流速通过装有D-101大孔树脂的分离柱进行吸附分离，至吸附饱和，然后用2BV体积浓度为70％且pH值为3的乙醇溶液以2mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，回收乙醇，得绿原酸提取物，经检测，绿原酸得率为65％，纯度为20.2％。
实施例2
将上述配制的绿原酸粗提液以3mL/min的流速通过装有D-101大孔树脂的分离柱进行吸附分离，至吸附饱和，然后用2BV体积浓度为50％且pH值为4的乙醇溶液以3mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，回收乙醇，得绿原酸提取物，经检测，绿原酸得率为84％，纯度为23.7％。
实施例3
将上述配制的绿原酸粗提液以2.5mL/min的流速通过装有D-101大孔树脂的分离柱进行吸附分离，至吸附饱和，然后用2BV体积浓度为60％且pH值为5的乙醇溶液以2.5mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，回收乙醇，得绿原酸提取物，经检测，绿原酸得率为80％，纯度为16.5％。

Claims (3)

1.一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法，该方法包括以乙醇超声波法从苎麻叶片中提取绿原酸粗提物，于该绿原酸粗提物中加入水，搅拌后静置过夜，过滤，取上清液，得绿原酸粗提液，其特征在于，该方法还包括以D-101大孔树脂分离纯化所述绿原酸粗提液，其中分离纯化时的工艺参数为：以D-101大孔树脂吸附绿原酸，绿原酸粗提液的上样流速为2-3mL/min，用2BV体积浓度为50-70％且pH值为3-5的乙醇溶液以2-3mL/min的流速进行洗脱。
2.如权利要求1所述的一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法，其特征在于，所述分离纯化时的工艺参数为：以D-101大孔树脂吸附绿原酸，绿原酸粗提液的上样流速为3mL/min，用2BV体积浓度为50％且pH值为4的乙醇溶液以3mL/min的流速进行洗脱。
3.如权利要求1或2所述的一种分离纯化苎麻叶片绿原酸的方法，其特征在于，所述绿原酸粗提液是于该绿原酸粗提物中加入1/2体积的水，磁力搅拌25-35min，然后置于4℃静置过夜，过滤除去水不溶性杂质，取上清液得到。
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