CN108178742B

CN108178742B - 一种他卡西醇的异构体杂质py3及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN108178742B
Application number: CN201711491453.9A
Authority: CN
Inventors: 丁伯祥; 闵涛; 王林; 王雪萌; 胡永康; 葛元丽; 郭彦飞
Original assignee: Nanjing Hairong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing Hairong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-30
Filing date: 2017-12-30
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2037-12-30
Also published as: CN108178742A

Abstract

本发明公开了一种他卡西醇的异构体杂质PY3，即(1β,3β,5Z,7E,22E)‑9,10‑开环麦角甾‑5,7,10(19),22‑四烯‑1,3‑二醇，以及其制备方法，属于化学制药技术领域。本发明所述高纯度的阿法骨化醇的有关杂质PY3，可作阿法骨化醇成品检测分析中的杂质标准品，从而提升阿法骨化醇成品检测分析对杂质的准确定位和定性，有利于加强对该杂质的控制，进而提高阿法骨化醇成品质量。本发明提供的方法原料便宜易得，操作简单，重现性好，HPLC纯度≥99.5%。

Description

一种他卡西醇的异构体杂质PY3及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于化学制药技术领域，具体涉及一种他卡西醇的异构体杂质PY3及其制备方法，以及利用该杂质作为杂质对照品，在他卡西醇的原料药和制剂中的检测与分析等质量控制方面的用途。

背景技术

银屑病，又称牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，患病时间长，易于复发，有的病例几乎终生不愈；其发病以青壮年为主，对患者的身体健康和精神状态均有所影响；临床上常为红斑和鳞屑等症状，全身均可发病，以头皮，四肢伸侧较多，在冬季易加重；目前治疗银屑病外用药物主要有维生素D类衍生物、皮质类固醇类、维A酸类、蒽林、角质脱剥剂等；皮质类固醇是由肾上腺皮质产生的类固醇类物质，多是激素类，如糖皮质类固醇和盐皮质类固醇等；在牛皮癣的治疗中，已知使用联合治疗，其中牵涉一种类固醇化合物，如皮质类固醇化合物，和一种维生素D类似物。

维生素D(vitamin D)为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。目前认为维生素D也是一种类固醇激素，维生素D家族成员中最重要的成员是VD2(麦角钙化醇)和VD3(胆钙化醇)。维生素D均为不同的维生素D原经紫外照射后的衍生物。缺乏维生素D可能对身体极其有害。维生素D衍生物活性较高，故其制剂含量都非常低，通常在0.0001~0.0005%之间。

他卡西醇(Tacalcitol)，是维生素D3活性代谢产物的类似物，化学名为(+)－(5Z，7E，24R)－9，10－开链胆甾－5，7，10(19)－三烯－1a，3b，24－三醇，化学式C27H44O3，CAS登录号 57333-96-7；是一种治疗银屑病(牛皮癣)的药物。于1993年由日本的帝人制药株式会社 (Teijin)生物医药研究院推出上市，商品名为萌尔夫。由于他卡西醇药效好且可以用于面部感染的银屑病的治疗，因此成为治疗银屑病(牛皮癣)的主要外敷药物。

他卡西醇性质不稳定，对光、热、空气均很敏感，尤其是在反应过程中容易产生一些异构体杂质及其它有关物质，难于分离纯化，因而合成条件较难把握，合成工艺技术门槛高、难度大。同时，对原料药和制剂产品的质量控制也提出了更好的要求。

目前为止，由于他卡西醇在制剂中的含量极低，主药本身的理化性质有极不稳定。因此，公开文献中，对于他卡西醇的杂质研究和质量控制鲜有报道。

他卡西醇的异构体杂质PY3，即(1β,3β-5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,24-三醇，是成品他卡西醇的1β异构体，其存在会影响产品质量，其结构式如下式1化合物所示，

。

经检索，尚未有关于该杂质合成的文献报道，因此，提供一种他卡西醇的异构体杂质PY3的合成方法，用于杂质对照品的制备具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种他卡西醇的异构体杂质PY3，即(1β,3β-5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,24-三醇的合成方法，该合成方法具有操作简单，原料便宜易得，收率高，纯度高等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明提供了一种他卡西醇的异构体杂质PY3，即(1β,3β-5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,24-三醇，其结构如式1化合物所示，

。

优选地，该杂质的高效液相纯度为大于等于98.5%，优选为大于等于99.0%，更加优选为大于等于99.5%；纯化方法是可通过柱层析，重结晶或者制备液相色谱进行纯化；该杂质的用途是用于他卡西醇的有关物质对照品，或者用于他卡西醇的杂质鉴定。

本发明提供的上述杂质PY3作为杂质对照品，在他卡西醇原料药和制剂的质量控制中的用途。

本发明提供的杂质PY3，其质量控制时采用的杂质分析方法为高效液相色谱法，其计算方法选自外标法，加校正因子的自身对照法，不加校正因子的自身对照法，峰面积归一化法中的一种。

本发明还提供了一种制备上述杂质PY3的方法，包含如下步骤：

（1）将对硝基苯甲酸、三苯基膦、四氢呋喃和式6化合物加入反应瓶，搅拌溶解，冰盐浴降温，并在低温下滴加偶氮二甲酸二乙酯溶液，滴完0℃反应，TLC监控反应完全，浓缩，残余物用乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤两次，分液，有机相减压浓缩；向浓缩后的残余物中加入甲醇和碳酸钾固体，30℃搅拌反应，TLC监控反应完全，减压浓缩，残余物加入乙酸乙酯和水溶解，分液，有机相水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩干得黑色油状物；柱层析硅胶纯化，洗脱剂为正己烷：乙酸乙酯=30:1，减压浓缩干，所得油状物中加入二氯甲烷、咪唑，搅拌溶解后，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物；

（2）将式7化合物溶于二氯甲烷中，降温，-20~-10℃向反应液中通入二氧化硫气体，通毕，升温至-15~-10℃下控温搅拌反应1 h，TLC监测反应完全，脱除溶剂得黄色油状物，即式8化合物；

（3）将式8化合物溶于等体积的二氯甲烷和四氢呋喃混合溶剂中，降温至-65~-80℃后通入臭氧，搅拌反应6~8 h，TLC监测反应完全后加入三苯基膦，室温搅拌0.5h，将反应液依次用5%碳酸氢钠溶液、水、饱和盐水各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干得到黄色固体，即式9化合物；

（4）将式9化合物溶于95%乙醇，加入碳酸氢钠，搅拌升温至75～85℃下反应1~2 h，TLC监测反应完全，加入乙酸乙酯和纯化水溶解分液，有机相依次用水、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠，滤液浓缩至干得到棕红色固体，即式10化合物；

（5）将式10化合物与3-甲基-1-(三苯基亚甲基膦)- 2-丁酮，加入到甲苯中，110~115℃下回流反应30 ~35 h，TLC监测反应完全，冷至室温，浓缩至干后柱层析纯化，得到浅黄色油状物，即式11化合物；

（6）将式11化合物、碳酸氢钠、连二硫酸钠、十六烷基三甲基氯化铵加入到甲苯和纯化水中，加热至60~65℃下，反应1~1.5 h，TLC监测反应完全，冷至室温，后加入乙酸乙酯和纯化水分液，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干得到浅黄色油状物，式12化合物；

（7）将式12化合物溶于四氢呋喃中，加入(1S,2R)-(-)-1-氨基-2-茚醇，氮气保护下，降温至0℃以下，滴加三仲丁基硼氢化钾的四氢呋喃溶液，滴毕，在-5~0℃搅拌1 h， TLC监测反应完全后加入冰水淬灭，后加入乙酸乙酯和纯化水分液，有机相用饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干柱层析纯化，得到浅黄色油状物，即式13化合物；

（8）将式13化合物、9-乙酰基蒽、吡啶和甲苯，加入到光化学反应器中，在氮气保护下进行光照反应，TLC监测反应完全，脱除溶剂，得到浅黄色油状物，即式14化合物；

（9）将式14化合物溶于四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中，50-55℃反应2h，TLC监测反应完全，脱除溶剂，剩余物中加入乙酸乙酯和水分液，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩至干，剩余物中加入马来酸酐和乙酸乙酯，30-35℃下搅拌反应24h，浓缩至干后柱层析得到高纯度的白色固体，即式1化合物。

进一步优选地，具体的实验操作如下：

（1）将对硝基苯甲酸10g、三苯基膦20g、四氢呋喃400mL和式6化合物15g加入反应瓶，搅拌溶解，冰盐浴降温，并在低温下滴加偶氮二甲酸二乙酯12g溶于50mL四氢呋喃的溶液，滴完0℃反应，TLC监控反应完全，浓缩，残余物用乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤两次，分液，有机相减压浓缩；向浓缩后的残余物中加入甲醇400mL和碳酸钾固体10g，30℃搅拌反应，TLC监控反应完全，减压浓缩，残余物加入乙酸乙酯500mL和水500mL溶解，分液，有机相水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩干得黑色油状物；柱层析硅胶纯化，洗脱剂为正己烷：乙酸乙酯=30:1，减压浓缩干，所得油状物中加入二氯甲烷、咪唑，搅拌溶解后，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物8.4g；

（2）将式7化合物8.4g溶于二氯甲烷150mL中，降温，-20~-10℃向反应液中通入二氧化硫气体，通毕，升温至-15~-10℃下控温搅拌反应1 h，TLC监测反应完全，脱除溶剂得黄色油状物9.0g，即式8化合物；

（3）将式8化合物9.0g溶于等体积的二氯甲烷和四氢呋喃混合溶剂120mL中，降温至-65~-80℃后通入臭氧，搅拌反应6~8 h，TLC监测反应完全后加入三苯基膦10g，室温搅拌0.5h，将反应液依次用5%碳酸氢钠溶液、水、饱和盐水各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干得到黄色固体，即式9化合物；

（4）将式9化合物溶于70mL95%乙醇，加入碳酸氢钠8.6g，搅拌升温至75～85℃下反应1~2 h，TLC监测反应完全，加入乙酸乙酯和纯化水溶解分液，有机相依次用水、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠，滤液浓缩至干得到棕红色固体11g，即式10化合物；

（5）将式10化合物11g与3-甲基-1-(三苯基亚甲基膦)- 2-丁酮14g，加入到甲苯100mL中，110~115℃下回流反应30 ~35 h，TLC监测反应完全，冷至室温，浓缩至干后柱层析纯化，得到浅黄色油状物2.1g，即式11化合物；

（6）将式11化合物2.1g、碳酸氢钠5g、连二硫酸钠6g、十六烷基三甲基氯化铵0.7g，加入到80mL甲苯和80mL纯化水中，加热至60~65℃下，反应1~1.5 h，TLC监测反应完全，冷至室温，后加入乙酸乙酯和纯化水分液，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干得到浅黄色油状物，式12化合物；

（7）将式12化合物溶于四氢呋喃20mL中，加入(1S,2R)-(-)-1-氨基-2-茚醇1g，氮气保护下，降温至0℃以下，滴加三仲丁基硼氢化钾的四氢呋喃溶液10mL，滴毕，在-5~0℃搅拌1 h， TLC监测反应完全后加入冰水淬灭，后加入乙酸乙酯300mL和纯化水300mL分液，有机相用饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干柱层析纯化，得到浅黄色油状物1g，即式13化合物；

（8）将式13化合物、9-乙酰基蒽0.05g、吡啶0.1mL和甲苯70mL，加入到光化学反应器中，在氮气保护下进行光照反应，TLC监测反应完全，脱除溶剂，得到浅黄色油状物1g，即式14化合物；

（9）将式14化合物溶于四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液100mL中，50-55℃反应2h，TLC监测反应完全，脱除溶剂，剩余物中加入乙酸乙酯300mL和水300mL分液，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩至干，剩余物中加入马来酸酐0.1g和乙酸乙酯50mL，30-35℃下搅拌反应24h，浓缩至干后柱层析得到高纯度的白色固体300mg，即式1化合物，HPLC纯度：99.5%；

本发明制备杂质PY3的起始物式6化合物可以参考文献Org. Process Res. Dev.2012,16,967-975中实验部分的化合物14的制备方法得到，具体步骤如下：

（a）将式2化合物即维生素D2 18.97g，在大约-10℃的低温下，缓慢通入二氧化硫气体，使之溶解于液态的二氧化硫中，TLC监控反应完全，减压抽去二氧化硫气体，得到油状物式3化合物，约24.30g；

（b）将上述式3化合物在氮气保护下，加入7.81g咪唑，132mL二氯甲烷，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷8.65g，80min后再补加叔丁基二甲基氯硅烷1.44g，TLC监控反应完全，脱除溶剂，剩余物用乙酸乙酯200mL溶解，依次用水100mL，饱和食盐水100mL洗涤，无水硫酸镁干燥，滤液浓缩至干，得到式4化合物，约27.91g；

（c）将上述式4化合物中加入250mL 95%乙醇，碳酸氢钠2.5g，加热回流140min后补加碳酸氢钠5g，加毕继续反应2h，脱除溶剂，加入乙酸乙酯，依次用水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，滤液浓缩至干，得到式5化合物，约21.01g；

（d）将上述式5化合物溶于210mL二氯甲烷中，加入N—甲基氧化吗啉19.3g，加热至42℃左右使之澄清，再加入二氧化硒3.19g溶于甲醇210mL中的溶液，继续反应2h，脱除溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯300mL，依次用水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，滤液浓缩得到式6化合物的粗品，然后经过柱层析或者制备液相的分离纯化，得到式6化合物精品15g。

因上述式6化合物再维生素D合成领域属于较为常见的中间体，可通过本领域内熟知的方法制备所得。如果针对本发明报道的上述方法进行优化改进，比如替换反应试剂，变更反应顺序，也都在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的在于利用他卡西醇的杂质PY3，作为杂质对照品，检测与分析他卡西醇原料药中有关物质的方法，其特征在于，具体包含如下步骤：

避光操作，取本品约2mg，置20ml棕色容量瓶中，加流动相适量使样品溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得对照溶液。取他卡西醇及杂质PY3各适量，配制成每ml含0.1mg他卡西醇及1μg杂质PY3的溶液，作为***适用性溶液，照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，用直链淀粉衍生物手性色谱柱为填充剂（CHIRALCEL AD-H 250*4.6mm 5 μm）；以正庚烷-无水乙醇（86：14）为流动相；柱温30℃；检测波长为265nm；取***适用性溶液50μl注入液相色谱仪，调整流速，使他卡西醇的出峰时间约为12min，PY3与他卡西醇的分离度应符合规定；再分别量取供试品溶液、对照溶液各50μl注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有PY3峰，PY3面积不得大于对照溶液主峰面积的2倍（1.0%）。

本发明取得的有益的技术效果是：

（1）本发明条件易控，路线简单，溶剂易得；

（2）本发明制备的他卡西醇的异构体杂质PY3可达99%以上的纯度，可作为对照品使用；

（3）合成他卡西醇的异构体杂质PY3，不仅为阿法骨化醇的杂质鉴定和杂质检测提供对照品，从而提升他卡西醇成品检测分析中对杂质PY3的准确定位和定性，有利于加强对该杂质的控制，进而对他卡西醇原料药及其制剂的质量标准的提高及产品的质量控制提供有益参考，也为同类化合物合成提供借鉴；

（4）手性还原条件的优化：在制备式13化合物的过程中，为了进一步提高手性还原的选择性，我们尝试多种反应条件，最后选定三仲丁基硼氢化钾在手性助剂(1S,2R)-(-)-1-氨基-2-茚醇的存在性，进行手性还原，再经过简单的柱层析初步纯化，手性纯度即可满足要求，若想进一步提高手性纯度，可采用正己烷-乙酸乙酯体系缓慢析晶即可。这样的后处理省去了制备液相分离手性异构体的繁琐步骤，同时降低了企业成本，亦符合绿色环保要求。

具体实施方式

下面结合优选实施例，对本发明进行进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

本发明所用试剂和物料均市售可得。

合成路线如下所示。

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其中在合成式11化合物的过程中使用的片段化合物，即3-甲基-1-(三苯基亚甲基膦)- 2-丁酮，可购买市售中间体，也可通过常规方法制备所得，包含但不限于以下的方法，即以甲基异丙基酮为起始，先经甲醇溶剂中的溴代反应，再在甲苯溶液中加入三苯基膦缩合而成。

实施例1 式7化合物的制备

将对硝基苯甲酸10g、三苯基膦20g、四氢呋喃400mL和式6化合物15g加入反应瓶，搅拌溶解，冰盐浴降温，并在低温下滴加偶氮二甲酸二乙酯12g溶于50mL四氢呋喃的溶液，滴完0℃反应，TLC监控反应完全，浓缩，残余物用乙酸乙酯溶解，饱和食盐水洗涤两次，分液，有机相减压浓缩；向浓缩后的残余物中加入甲醇400mL和碳酸钾固体10g，30℃搅拌反应，TLC监控反应完全，减压浓缩，残余物加入乙酸乙酯500mL和水500mL溶解，分液，有机相水洗两次，无水硫酸钠干燥，浓缩干得黑色油状物；柱层析硅胶纯化，洗脱剂为正己烷：乙酸乙酯=30:1，减压浓缩干，所得油状物中加入二氯甲烷、咪唑，搅拌溶解后，控温0-5℃, 滴加叔丁基二甲基氯硅烷；滴加完毕后升至室温反应2h，TLC监控至原料反应完全，水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得深棕色油状物，即式7化合物8.4g。

实施例2 式8化合物的制备

将式7化合物8.4g溶于二氯甲烷150mL中，降温，-20~-10℃向反应液中通入二氧化硫气体，通毕，升温至-15~-10℃下控温搅拌反应1 h，TLC监测反应完全，脱除溶剂得黄色油状物9.0g，即式8化合物。

实施例3 式10化合物的制备

将式8化合物9.0g溶于等体积的二氯甲烷和四氢呋喃混合溶剂120mL中，降温至-65~-80℃后通入臭氧，搅拌反应6~8 h，TLC监测反应完全后加入三苯基膦10g，室温搅拌0.5h，将反应液依次用5%碳酸氢钠溶液、水、饱和盐水各洗涤一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干得到黄色固体，即式9化合物；

将式9化合物溶于70mL95%乙醇，加入碳酸氢钠8.6g，搅拌升温至75～85℃下反应1~2 h，TLC监测反应完全，加入乙酸乙酯和纯化水溶解分液，有机相依次用水、饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠，滤液浓缩至干得到棕红色固体11g，即式10化合物。

实施例4 式11化合物的制备

将式10化合物11g与3-甲基-1-(三苯基亚甲基膦)- 2-丁酮14g，加入到甲苯100mL中，110~115℃下回流反应30 ~35 h，TLC监测反应完全，冷至室温，浓缩至干后柱层析纯化，得到浅黄色油状物2.1g，即式11化合物。

实施例5 式13化合物的制备

将式11化合物2.1g、碳酸氢钠5g、连二硫酸钠6g、十六烷基三甲基氯化铵0.7g，加入到80mL甲苯和80mL纯化水中，加热至60~65℃下，反应1~1.5 h，TLC监测反应完全，冷至室温，后加入乙酸乙酯和纯化水分液，有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干得到浅黄色油状物，式12化合物；

将式12化合物溶于四氢呋喃20mL中，加入(1S,2R)-(-)-1-氨基-2-茚醇1g，氮气保护下，降温至0℃以下，滴加三仲丁基硼氢化钾的四氢呋喃溶液10mL，滴毕，在-5~0℃搅拌1h， TLC监测反应完全后加入冰水淬灭，后加入乙酸乙酯300mL和纯化水300mL分液，有机相用饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干柱层析纯化得到浅黄色油状物1g，即式13化合物。

实施例6 式14化合物的制备

将式13化合物、9-乙酰基蒽0.05g、吡啶0.1mL和甲苯70mL，加入到光化学反应器中，在氮气保护下进行光照反应，TLC监测反应完全，脱除溶剂，得到浅黄色油状物1g，即式14化合物。

实施例7 式1化合物的制备

将式14化合物溶于四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液100mL中，50-55℃反应2h，TLC监测反应完全，脱除溶剂，剩余物中加入乙酸乙酯300mL和水300mL分液，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩至干，剩余物中加入马来酸酐0.1g和乙酸乙酯50mL，30-35℃下搅拌反应24h，浓缩至干后柱层析得到高纯度的白色固体300mg，即式1化合物，HPLC纯度：99.5%。

实施例8 式1化合物的制备

（7）将式12化合物溶于四氢呋喃20mL中，加入(1S,2R)-(-)-1-氨基-2-茚醇1g，氮气保护下，降温至0℃以下，滴加三仲丁基硼氢化钾的四氢呋喃溶液10mL，滴毕，在-5~0℃搅拌1 h， TLC监测反应完全后加入冰水淬灭，后加入乙酸乙酯300mL和纯化水300mL分液，有机相用饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干柱层析纯化得到浅黄色油状物1g，即式13化合物；

（9）将式14化合物溶于四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液100mL中，50-55℃反应2h，TLC监测反应完全，脱除溶剂，剩余物中加入乙酸乙酯300mL和水300mL分液，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩至干，剩余物中加入马来酸酐0.1g和乙酸乙酯50mL，30-35℃下搅拌反应24h，浓缩至干后柱层析得到高纯度的白色固体300mg，即式1化合物，HPLC纯度：99.5%。

实施例9 式1化合物的结构解析

从上述数据可知，样品氢谱除去溶剂CDCl₃峰外共有19组峰，对应比例为：1:1:2:1:1:1:1:2:1:4:2:3:2:4:3:3:3:6:3，对应44个氢。各氢归属如下：δ6.6099-6.6328 (d，1H，J=11.45Hz），归属为6-H；δ5.9130-5.9360 (d，1H，J=11.5Hz），归属为7-H；δ5.2381-5.2697（t，2H），归属为22-H，23-H；δ5.1660-5.1680（s，1H），归属为19（E）-H；δ5.0019-5.0058（s，1H），归属为19（Z）-H；δ4.5251-4.5443（t，1H），归属为1-H；δ4.2555-4.2893（m，1H），归属为3-H；δ2.8912-2.9179（d，2H），归属为4-H；δ2.2989-2.3434（m，1H），归属为9-H；δ2.0267-2.1232（m，4H），归属为2-H，12-H，17-H，24-H；δ1.8888-1.9463 (m，2H)，归属为2-H，20-H；δ1.7286-1.8004（m，3H），归属为9-H，11-H，16-H；δ1.5749-1.6781（s，2H），归属为1-OH，3-OH；δ1.5077-1.6185（m，4H），归属为11-H，15-H，25-H；δ1.3312-1.4063（m，3H），归属为12-H，14-H，16-H；δ1.0660-1.0793（d，3H），归属为21-H；δ0.9671-0.9808（d，3H），归属为28-H；δ0.8712-0.9001（t，6H），归属为26-H，27-H；δ0.6219（s，3H），归属为18-H。

核磁共振碳谱中除去溶剂DMSO外共有26组峰，对应27个碳，与样品结构分子式C₂₇H₄₄O₃有27个碳相符。δ12.3563；δ17.5892；δ19.6157；δ19.9154；δ21.0765；δ22.2282；δ23.5221；δ27.7028；δ29.0640；δ33.0739；δ36.7354；δ40.2887-40.3282；δ41.9843；δ42.8363；δ45.8567；δ56.5037-56.5771；δ65.8980；δ71.0874；δ109.5498；δ115.8708；δ123.3513；δ132.0557；δ132.6545；δ135.5253；δ145.2946；δ151.7430。

由此可见，从质谱结果[M+Na]⁺、[M-H]^-的m/z分别为439.3、415.3，可以推测样品分子量为416.3，与C₂₇H₄₄O₃理论分子量416.6相符。符合偶氮原子偶分子量的氮规则。

根据样品的质谱分析结果知样品分子量为416.6，与结构理论分子量相符；核磁共振氢谱，碳谱谱图所示氢，碳个数，归属与结构相符。在他卡西醇杂质的制备方法中，烯丙基氧化反应，可能引入1β-羟基杂质，其最终该生成的化合物即为化合物为成品的1β-异构体，所以样品结构与预想的相符。

实施例10 以杂质PY3作为杂质对照品，检查他卡西醇原料药中的有关物质

本发明提供了一种杂质PY3作为杂质对照品，检查阿法骨化醇原料药中的有关物质的方法，具体包含如下步骤：

避光操作，取本品约2mg，置20ml棕色容量瓶中，加流动相适量使样品溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml置200ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得对照溶液。取他卡西醇及杂质PY3各适量，配制成每ml含0.1mg他卡西醇及1μg杂质PY3的溶液，作为***适用性溶液，照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定，用直链淀粉衍生物手性色谱柱为填充剂（CHIRALCEL AD-H 250*4.6mm 5 μm）；以正庚烷-无水乙醇（86：14）为流动相；柱温30℃；检测波长为265nm。取***适用性溶液50μl注入液相色谱仪，调整流速，使他卡西醇的出峰时间约为12min，PY3与他卡西醇的分离度应符合规定；再分别量取供试品溶液、对照溶液各50μl注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有PY3峰，PY3面积不得大于对照溶液主峰面积的2倍（1.0%）。

以上所揭示的仅为本发明的较佳实施例，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此，本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种制备他卡西醇的异构体杂质PY3，即(1β,3β-5Z,7E)-9,10-开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-1,3,24-三醇的方法，其结构如式1化合物所示，

，

其特征在于：首先，由式2化合物制备得到式6化合物，包含如下步骤：

（a）将式2化合物即维生素D2 18.97g，在-10℃的低温下，缓慢通入二氧化硫气体，使之溶解于液态的二氧化硫中，TLC监控反应完全，减压抽去二氧化硫气体，得到油状物式3化合物，24.30g；

（b）将上述式3化合物在氮气保护下，加入7.81g咪唑，132mL二氯甲烷，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷8.65g，80min后再补加叔丁基二甲基氯硅烷1.44g，TLC监控反应完全，脱除溶剂，剩余物用乙酸乙酯200mL溶解，依次用水100mL，饱和食盐水100mL洗涤，无水硫酸镁干燥，滤液浓缩至干，得到式4化合物，27.91g；

（c）将上述式4化合物中加入250mL 95%乙醇，碳酸氢钠2.5g，加热回流140min后补加碳酸氢钠5g，加毕继续反应2h，脱除溶剂，加入乙酸乙酯，依次用水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，滤液浓缩至干，得到式5化合物，21.01g；

（d）将上述式5化合物溶于210mL二氯甲烷中，加入N—甲基氧化吗啉19.3g，加热至42℃左右使之澄清，再加入二氧化硒3.19g溶于甲醇210mL中的溶液，继续反应2h，脱除溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯300mL，依次用水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，滤液浓缩得到式6化合物的粗品，然后经过柱层析或者制备液相的分离纯化，得到式6化合物精品15g；

然后，再由式6化合物制备得到式1化合物，包含如下步骤：

（7）将式12化合物溶于四氢呋喃20mL中，加入(1S,2R)-(-)-1-氨基-2-茚醇1g，氮气保护下，降温至0℃以下，滴加三仲丁基硼氢化钾的四氢呋喃溶液10mL，滴毕，在-5~0℃搅拌1h， TLC监测反应完全后加入冰水淬灭，后加入乙酸乙酯300mL和纯化水300mL分液，有机相用饱和盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，滤液浓缩至干柱层析纯化，得到浅黄色油状物1g，即式13化合物；

（9）将式14化合物溶于四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液100mL中，50-55℃反应2h，TLC监测反应完全，脱除溶剂，剩余物中加入乙酸乙酯300mL和水300mL分液，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥后浓缩至干，剩余物中加入马来酸酐0.1g和乙酸乙酯50mL，30-35℃下搅拌反应24h，浓缩至干后柱层析得到白色固体300mg，即式1化合物，HPLC纯度：99.5%。