CN108165497A - 一种高产莫纳克林k的红曲菌株培育方法 - Google Patents

一种高产莫纳克林k的红曲菌株培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，首先通过对红曲米进行分离纯化得到红曲霉菌落，并将制得的红曲霉菌落添加到由琼脂、土豆汁、麦芽汁、乳酸、无水乙醇、硝酸钠和磷酸二氢钾制得的培养基中，制得红曲霉孢子，然后通过氯化钠无菌水对培养基进行冲洗，得到红曲霉孢子菌悬液，将红曲霉孢子菌悬液通过紫外线照射进行物理诱变后，再添加硫酸二乙酯溶液进一步诱变，最后将得到的红曲霉孢子菌悬液与大米粉混合，使得红曲菌株快速繁殖；本申请通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，有效提高了培养基中红曲菌株的繁殖速率，红曲菌株增多，代谢的莫纳克林K也递增，进而提高莫纳克林K的产量。

Description

一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法
技术领域
本发明涉及一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法。
背景技术
生物制药是十二五规划期间国家重点鼓励发展的产业。当前癌症已成为威胁全球人类健康的一大杀手，主要治疗手段以西医方法为主，包括手术、放疗化疗等等，均具有较强的副作用。然而到现在为止，癌症依然只能靠药物控制，而新研发的抗癌功能性红曲产品与以往的抗癌类药物相比较，能在体内维持较高的血药浓度，从而提高抗癌活性。并且没有任何药物毒性，给药方便，只需口服给药，患者无需住院，提高了生活质量。抗癌功能性红曲具有显著的疗效，是一种安全、有效、天然、绿色、零毒的口服抗癌药物。
但是，目前红曲霉的发酵工艺主要有两种，即固态发酵和液态发酵。目前红曲霉生产在固态发酵和液态发酵两种方式上常用物理诱变和化学诱变，进而达到红曲菌株生产，现有的诱变方式虽然能够提高菌株产量，但是在原有的产量上增产量小，无法达到现有市场需求的数量，另外由于红曲菌株的产量不高，因此莫纳克林K的产量较低。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，可有效提高培养基中红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K产量的红曲菌株培育方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，包括以下步骤：
1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养5-7天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养5-7天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养5-7天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。
2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌20-25min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养8-10天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；
3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于60Co-Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的60Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；
4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌2-3遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；
5)将步骤4)制得含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉在高温房打堆，当室温低于20℃时，在高温房打堆；当室温高于20℃时，在曲池打堆，并在打堆过程中，其堆厚35-40cm，表面覆以灭菌的毛毡保温，保持室温20-30℃，持续15-20小时，备用；
6)将步骤5)打堆完成的含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉进行摊堆，并在表面上喷施蒸馏水，使得大米粉保持约35％-55％的水分，并在室温20-25℃的温度培养4天，收集后送入烘干机内进行烘干，备用；
7)莫纳克林K的提取：取步骤6)制得的大米粉碾碎，并采用75％乙醇回流提取3次，每次3小时，然后合并提取液并除去红曲色素，最后将提取液进行浓缩，并通过测定吸光度计算莫纳克林的含量，即得。
进一步的，所述步骤2)中乙醇的浓度为95％。
进一步的，所述步骤6)中的大米粉为红曲米面团。
本发明的有益效果：
本申请对红曲米进行多次分离纯化得到纯化的红曲霉菌落，添加到结合琼脂、土豆汁、麦芽汁、乳酸、无水乙醇、硝酸钠和磷酸二氢钾制得的培养基中，然后通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，有效提高培养基中红曲菌株繁殖速率，红曲菌株增多，代谢的莫纳克林K也递增，进而提高莫纳克林K的产量。
具体实施方式
实施例1
一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，包括以下步骤：
1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养5天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养5天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养5天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。
2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌20min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养8天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；
3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于60Co-Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的60Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；
4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌2遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；
5)将步骤4)制得含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉在高温房打堆，当室温低于20℃时，在高温房打堆；当室温高于20℃时，在曲池打堆，并在打堆过程中，其堆厚35cm，表面覆以灭菌的毛毡保温，保持室温20℃，持续15小时，备用；
6)将步骤5)打堆完成的含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉进行摊堆，并在表面上喷施蒸馏水，使得大米粉保持约35％的水分，并在室温20℃的温度培养4天，收集后送入烘干机内进行烘干，备用；
7)莫纳克林K的提取：取步骤6)制得的大米粉碾碎，并采用75％乙醇回流提取3次，每次3小时，然后合并提取液并除去红曲色素，最后将提取液进行浓缩，并通过测定吸光度计算莫纳克林的含量，即得。
在本实施例中，所述步骤2)中乙醇的浓度为95％。所述步骤6)中的大米粉为红曲米面团。
实施例2
一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，包括以下步骤：
1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养7天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养7天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养7天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。
2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌25min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养10天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；
3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于60Co-Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的60Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；
4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌3遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；
5)将步骤4)制得含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉在高温房打堆，当室温低于20℃时，在高温房打堆；当室温高于20℃时，在曲池打堆，并在打堆过程中，其堆厚40cm，表面覆以灭菌的毛毡保温，保持室温30℃，持续20小时，备用；
6)将步骤5)打堆完成的含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉进行摊堆，并在表面上喷施蒸馏水，使得大米粉保持约55％的水分，并在室温25℃的温度培养4天，收集后送入烘干机内进行烘干，备用；
7)莫纳克林K的提取：取步骤6)制得的大米粉碾碎，并采用75％乙醇回流提取3次，每次3小时，然后合并提取液并除去红曲色素，最后将提取液进行浓缩，并通过测定吸光度计算莫纳克林的含量，即得。
在本实施例中，所述步骤2)中乙醇的浓度为95％。所述步骤6)中的大米粉为红曲米面团。
实施例3
一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，包括以下步骤：
1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养6天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养6天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养6天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。
2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌23min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养9天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；
3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于60Co-Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的60Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；
4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌3遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；
5)将步骤4)制得含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉在高温房打堆，当室温低于20℃时，在高温房打堆；当室温高于20℃时，在曲池打堆，并在打堆过程中，其堆厚37cm，表面覆以灭菌的毛毡保温，保持室温25℃，持续17小时，备用；
6)将步骤5)打堆完成的含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉进行摊堆，并在表面上喷施蒸馏水，使得大米粉保持约45％的水分，并在室温23℃的温度培养4天，收集后送入烘干机内进行烘干，备用；
7)莫纳克林K的提取：取步骤6)制得的大米粉碾碎，并采用75％乙醇回流提取3次，每次3小时，然后合并提取液并除去红曲色素，最后将提取液进行浓缩，并通过测定吸光度计算莫纳克林的含量，即得。
在本实施例中，所述步骤2)中乙醇的浓度为95％。所述步骤6)中的大米粉为红曲米面团。
实验例
实验方法：对照组一、照组二和实验组皆采用固态发酵方式培育红曲菌株。
实验要求：三组实验皆采用等量的红曲米。对照组一和对照组二通过紫外诱变后检测菌株致死率，实验组通过原子能诱变变后检测菌株致死率。在本实施例中，致死率的计算公式为：致死率＝(照射前活菌数/ml-照射后活菌数/ml)÷照射前活菌数/ml。
表1为三组红曲菌株生产方式在诱变后检测菌株致死率的对照数据
表1
根据上表1，对比三组实验诱变试验后测得的数据，结果表明，在表1的数据对比中，本申请的红曲菌株以8.3％致死率的数据，低于对比两组对照组高达10％的致死率，因此本申请的红曲菌株生产方法对于红曲菌株增产有明显的效果。
表2为三组红曲菌株培育方式在紫外诱变后检测莫纳克林K含量的对照数据
表2
根据上表2，对比三组实验诱变试验后测得的数据，结果表明，在表2的数据对比中，本申请的红曲菌株以≥30mg/g的莫纳克林K含量，高于对比两组对照组，因此本申请的红曲菌株培育方法对于提高莫纳克林K含量有明显的效果
本申请对红曲米进行多次分离纯化得到纯化的红曲霉菌落，添加到结合琼脂、土豆汁、麦芽汁、乳酸、无水乙醇、硝酸钠和磷酸二氢钾制得的培养基中，然后通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，有效提高培养基中红曲菌株繁殖速率，红曲菌株增多，代谢的莫纳克林K也递增，进而提高莫纳克林K的产量。
当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (3)

1.一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养5-7天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养5-7天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养5-7天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。
2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌20-25min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养8-10天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；
3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于60Co-Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的60Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；
4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌2-3遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；
5)将步骤4)制得含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉在高温房打堆，当室温低于20℃时，在高温房打堆；当室温高于20℃时，在曲池打堆，并在打堆过程中，其堆厚35-40cm，表面覆以灭菌的毛毡保温，保持室温20-30℃，持续15-20小时，备用；
6)将步骤5)打堆完成的含有红曲霉孢子菌悬液的大米粉进行摊堆，并在表面上喷施蒸馏水，使得大米粉保持约35％-55％的水分，并在室温20-25℃的温度培养4天，收集后送入烘干机内进行烘干，备用；
7)莫纳克林K的提取：取步骤6)制得的大米粉碾碎，并采用75％乙醇回流提取3次，每次3小时，然后合并提取液并除去红曲色素，最后将提取液进行浓缩，并通过测定吸光度计算莫纳克林的含量，即得。
2.如权利要求1所述的一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，其特征在于：所述步骤2)中乙醇的浓度为95％。
3.如权利要求2所述的一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，其特征在于：所述步骤6)中的大米粉为红曲米面团。
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