CN108164601A - 一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：合成重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的核酸序列；利用所得重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的核酸序列构建载体，转染宿主细胞，筛选高表达的细胞克隆，建立细胞库；利用所得细胞株进行培养，分离纯化，获得重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体。本发明根据中国仓鼠偏爱密码子设计合成重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体的轻链、重链，构建真核表达载体，转染宿主细胞CHO‑GS‑，并采用无血清培养技术培养，分离纯化，获得高纯度的重组抗TNF‑α全人源单克隆抗体。本发明制备方法操作简单，生产周期短，适于工业化生产。

Description

一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid Rrthritis，RA)，是以关节滑膜的炎症为主要特征的一种慢性、侵蚀性、对称性、小关节、多关节为主的全身性自身免疫病，严重影响患者的生活质量。
TNF-α是促使滑膜炎症发生的常见细胞因子，在发病机制的网络中居于重要位置。TNF-α是一种多效性前炎症因子，在炎症反应过程中出现最早、最重要的炎症介质之一：以自分泌和旁分泌方式激活单核巨噬细胞，使其产生大量IL-1、IL-6、IL-8等促炎症因子，引起级联反应，放大信号传导；还可以进一步激发体内细胞间黏附因子(ICAM)的高度表达，导致组织内抗原不能被及时遏制或清除；可联合其他类分湿因子与抗原形成较大的抗原-抗体复合物，并在关节腔内沉积，进一步难以清除。最终造成正常组织损伤，关节肿大，弯曲变形。
阿达木单抗(Adalimumab)，商品名为修美乐(Humira)，是一种抗TNF-α的人源化抗体产品，于2002年被FDA批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)和强直性脊柱炎(AS)，可特异性地与TNF-α结合并阻断其与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用，从而阻断炎症反应的产生，对于慢性炎症疾病具有显著效果。
目前，单克隆抗体以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术为制备手段已是一种常规方法，而治疗性单抗药物也已成为生物技术药物的热点，现行的四代抗体技术-全人源化也日渐成为一种趋势。但面对国外针对阿达木单抗的技术垄断，国内仿制药行业技术手段水平参差不一，造成抗体的表达量、稳定性、效价等结果差异明显，国内抗体药水平始终落后于国外公司，国内患者的生活质量不能得到有效保障。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法。本发明发现，通过对表达载体进行改造和优化，将有可能获得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的高效表达和结构稳定。本发明中采用无血清分批补料式培养方式，防止了交叉污染、病毒污染，保证了产品质量。
本发明提出的一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
a)合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列；重组抗TNF-α全人源单克隆抗体具有轻链和重链，其中轻链的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；重链的可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
b)利用步骤a)所得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列构建载体pHL101-GS/Neo，转染宿主细胞，筛选高表达的细胞克隆，建立细胞库；
c)利用步骤b)所得细胞株进行培养，分离纯化，获得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体。
优选地，步骤a)中，采用中国仓鼠卵巢细胞的偏爱密码子合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列。
优选地，步骤b)中，所述构建载体过程中，包括构建表达重链的载体、构建表达轻链的载体、构建双真核启动子驱动表达重链和轻链的载体。
优选地，步骤b)中，构建表达重链的载体的过程中，采用双BbsⅠ结构的酶切位点进行酶切连接。
优选地，步骤b)中，构建表达轻链的载体的过程中，采用GS-Neo双筛选***质粒进行构建。
优选地，步骤b)中，宿主细胞为本方冻存的经CHO-K1细胞自主改造并已鉴定的GS缺陷型细胞CHO-GS-。
优选地，步骤c)中，采用无血清、分批补料培养的方式培养宿主细胞。
优选地，步骤c)中，分离纯化的具体操作如下：将培养后的细胞悬液经深层过滤，取上清液经亲和层析、低pH孵育除病毒、阳离子层析和疏水层析后，纳滤和超滤浓缩得到重组抗TNF-α全人源单克隆抗体原液。
本发明根据中国仓鼠偏爱的密码子，设计合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的轻链和重链，连接到CHO细胞高效表达载体中，获得了双启动子驱动轻链和重链共表达的真核表达载体pHL101-GS/Neo。
本发明将pHL101-GS/Neo稳转至CHO-GS-细胞，利用GS基因和Neo抗性进行MSX-G418联合筛选剂筛选，加快高表达细胞克隆的筛选。
最终本发明使用商用化的基础培养基，化学成分限定(Chemical Defined，CD)培养基和对应的补料培养基，经过对50L体积发酵罐的条件优化，确定了中间的一些关键参数，蛋白表达量稳定在2.3g/L左右，收率稳定在65％，后期可经过定制培养基和条件优化进一步提高产量。
附图说明
图1为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻、重链双启动子表达质粒示意图。
图2为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻链全长L扩增质粒双酶切凝胶电泳结果图(HindⅢ和NheⅠ)。
图3为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链可变区VH扩增质粒双酶切凝胶电泳结果图(BbsⅠ)。
图4为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻链全长L表达质粒双酶切凝胶电泳结果图(SalⅠ和NotⅠ)。
图5为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链全长H表达质粒双酶切凝胶电泳结果图(SalⅠ和NotⅠ)。
具体实施方式
如图1、2、3、4、5所示，图1重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻、重链双启动子表达质粒示意图；图2为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻链全长L扩增质粒双酶切凝胶电泳结果图(HindⅢ和NheⅠ)；图3为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链可变区VH扩增质粒双酶切凝胶电泳结果图(BbsⅠ)；图4为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻链全长L表达质粒双酶切凝胶电泳结果图(SalⅠ和NotⅠ)；图5为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链全长H表达质粒双酶切凝胶电泳结果图(SalⅠ和NotⅠ)。
实施例1轻链、重链序列的获得与合成
本发明根据人IgG1相关文献和GeneBank数据确定了IgG1的轻链恒定区kappa序列(IGK，Gene ID:50802)和重链链恒定区gamma序列(IGHG1，Gene ID:3500)，并根据原研药物Humira的公开数据确定了阿达木单抗的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列和DNA序列。经过序列比对和确认，选用中国仓鼠偏爱的密码子人工合成轻链全长链L、重链可变区VH和重链恒定区CH序列，并加入所需酶切位点和保护位点。
其中轻链的核酸序列具有SEQ ID NO.1的序列，轻链的氨基酸序列具有SEQ IDNO.3的序列；重链的可变区的核酸序列具有SEQ ID NO.2的序列，重链的可变区的氨基酸序列具有SEQ ID NO.4的序列。
实施例2pHL101-GS/Neo载体构建
(1)人工合成的轻链全长序列L、重链可变区VH和重链恒定区CH序列置于扩增质粒pEASY，大量扩增以获得足够的目的片段。
(2)首先选用重链恒定区CH双酶切(HindⅢ和NheⅠ)并连接入哺乳动物表达载体如pcDNA3.1(+)中，获得重链恒定区CH的连接载体，方便于与其它重链V区相连。在CH序列N端即与重链V区相连接位置加入了双BbsⅠ结构的酶切位点(gtcttcgagaagac)，BbsⅠ的酶切特点与传统限制性内切酶不同，其识别后切除末位后6位的碱基，形成一个相差4碱基的缺口。在保证或改造接入的重链可变区VH序列无BbsⅠ位点的情况下，只需在其两端设计加入BbsⅠ位点后，利用序列本身碱基组合特异性连接入质粒，无需另行在序列两端加入或设计酶切位点，保证序列的可靠性、完整性与原始性，极大简便了设计和构建的步骤，加快了构建及设计时间，最终获得单启动子表达重链全长H的表达质粒pH101。
(3)轻链全长序列L双酶切(HindⅢ和NheⅠ)后连接入带GS-Neo双筛选***质粒中，如pcDNA3.l/GS，获得单启动子表达轻链全长L的表达质粒pL101-GS/Neo。
(4)将单启动子表达重链全长H的表达质粒pH101和单启动子表达轻链全长L的表达质粒pL101-GS/Neo分别双酶切(SalⅠ和NotⅠ)后，分别获得4kb和9kb的序列，连接后获得双启动子驱动重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链和轻链共表达的真核表达载体pHL101-GS/Neo。
实施例3转染宿主细胞CHO-GS-筛选高表达克隆
CHO细胞可以在生物反应器中高密度生长，易于进行基因操作，N-糖基化类型与人类相似，较低的病毒传播风险，因此广泛用于生物制药领域。本发明使用我方经商业化CHO-Kl细胞株自主改造并鉴定的GS缺陷型细胞CHO-GS-，进一步减少内源性GS的表达，使用GS-Neo双筛选***。
电转法转染线性化pHL101-GS/Neo质粒，GS-Neo双筛选***梯度加压筛选获得高效表达重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的稳定细胞克隆。经过多轮的转染及筛选，经过鉴定和检测后，获得了表达量大于35pg/cell·day的细胞克隆，建立细胞库。
实施例4Fed-Batch无血清培养
本发明使用商用化的基础培养基、化学成分限定(Chemical Defined，CD)培养基和对应的补料培养基，经过对50L体积发酵罐的条件优化，确定了中间的一些关键参数，蛋白表达量稳定在2.3g/L左右，收率稳定在65％。后期可经过定制培养基按细胞生长需要监测并按一定比例调整氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和微量元素等含量，添加激素、基因工程重组生长因子，并且实施监控培养条件，进一步优化从而提高目的蛋白产量。
实施例5重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的分离纯化
将扩大培养后的细胞悬液经过深层过滤获得上清液，经过滤后采用ProteinA亲和层析，低pH孵育灭活病毒，再经阳离子交换层析，疏水层析，制得高于高纯度99％的重组抗TNF-α全人源单克隆抗体，再经除病毒过滤、超滤浓缩、缓冲液置换、降低生物负荷过滤，使其达到制造检定规程要求，即为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体原液。
参照图1为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻、重链双启动子表达质粒示意图；参照图2为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻链全长L扩增质粒双酶切凝胶电泳结果图(HindⅢ和NheⅠ)；参照图3为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链可变区VH扩增质粒双酶切凝胶电泳结果图(BbsⅠ)；参照图4为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体轻链全长L表达质粒双酶切凝胶电泳结果图(SalⅠ和NotⅠ)；参照图5为重组抗TNF-α全人源单克隆抗体重链全长H表达质粒双酶切凝胶电泳结果图(SalⅠ和NotⅠ)。
经过3个批次的生产试验，其重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的细胞表达量、总蛋白表达量、原液蛋白量和最终得率如下表所示：
以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (6)

1.一种重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列；重组抗TNF-α全人源单克隆抗体具有轻链和重链，其中轻链的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；重链的可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
b)利用步骤a)所得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列构建载体pHL101-GS/Neo，转染宿主细胞，筛选高表达的细胞克隆，建立细胞库；
c)利用步骤b)所得细胞株进行培养，分离纯化，获得重组抗TNF-α全人源单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤a)中，采用中国仓鼠卵巢细胞的偏爱密码子合成重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的核酸序列。
3.根据权利要求1所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述构建载体过程中，包括构建表达重链的载体、构建表达轻链的载体、构建双真核启动子驱动表达重链和轻链的载体。
4.根据权利要求3所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤b)中，构建表达重链的载体的过程中，采用双BbsⅠ结构的酶切位点进行酶切连接。
5.根据权利要求1所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤b)中，宿主细胞为GS缺陷型细胞CHO-GS-。
6.根据权利要求1所述重组抗TNF-α全人源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤c)中，采用无血清、分批补料培养的方式培养宿主细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951691A (zh) * 2019-11-06 2020-04-03 浙江正熙生物医药有限公司 抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用
WO2021164717A1 (zh) * 2020-02-20 2021-08-26 百奥泰生物制药股份有限公司 抗TNF-α的抗体制剂及其制备方法和用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2799450A1 (en) * 2007-12-31 2014-11-05 Bayer Intellectual Property GmbH Antibodies to TNFalpha
RU2556816C1 (ru) * 2014-03-12 2015-07-20 Открытое акционерное общество "Фармацевтический импорт, экспорт" (ОАО "Фармимэкс") Штамм клеток яичников китайского хомячка - продуцент рекомбинантного антитела против фактора некроза опухоли альфа человека
CN105820246A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 上海张江生物技术有限公司 一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2799450A1 (en) * 2007-12-31 2014-11-05 Bayer Intellectual Property GmbH Antibodies to TNFalpha
RU2556816C1 (ru) * 2014-03-12 2015-07-20 Открытое акционерное общество "Фармацевтический импорт, экспорт" (ОАО "Фармимэкс") Штамм клеток яичников китайского хомячка - продуцент рекомбинантного антитела против фактора некроза опухоли альфа человека
CN105820246A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 上海张江生物技术有限公司 一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张惠展: "《基因工程》", 31 August 2005 *
王志云: "中华仓鼠卵巢细胞密码子的研究", 《中国优秀博士学位论文全文数据库》 *
董志伟等: "《抗体工程 第2版》", 30 June 2002 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110951691A (zh) * 2019-11-06 2020-04-03 浙江正熙生物医药有限公司 抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用
CN110951691B (zh) * 2019-11-06 2021-12-14 浙江正熙生物技术股份有限公司 抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用
WO2021164717A1 (zh) * 2020-02-20 2021-08-26 百奥泰生物制药股份有限公司 抗TNF-α的抗体制剂及其制备方法和用途

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