CN105820246A - 一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途 - Google Patents

一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途属于生物技术领域。本发明根据仓鼠偏爱密码子设计合成CMAB008抗体的轻链、重链，构建真核表达载体，转染GS基因敲除的CHO-CR-GS-/-宿主细胞，并采用无血清培养技术培养，分离纯化，获得低免疫原性CMAB008抗体，有利于临床应用。

Description

一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法及用途。
背景技术
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以慢性、对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，病情迁延反复。其临床表现为四肢关节红、肿、疼痛，严重影响患者的生活质量，如不及时治疗，一般2年内就可以造成关节强直畸形，最后导致残疾。关节滑膜炎症是其主要病理改变，四肢关节则是最易受侵犯的部位。其慢性炎症不仅限于关节及关节周围组织，还可发生于心、肺、血管等器官和组织。
类风湿关节炎是一种世界性疾病，在美国该病的发病率将近1%，随年龄增长发病率增高，35岁以下成年人发病率约0.3%，而65岁以上者发病率超过10%。国内发病率略低，约0.3%左右，但考虑到我国的人口基数，总发病人数仍很高（约4百万人患病）。
类风湿关节炎是一种普遍的、破坏性极高的慢性关节炎症，无法治愈，长期预后效果差，使个人、社会的经济生活成本大大增加。如未治疗，80%的患者将逐渐丧失行动能力，寿命平均减少3-18年，在美国，每例患者每年的治疗费用为5919美元，在英国为2600英镑。目前临床应用的抗风湿药物起效缓慢、疗效有限，副作用较多，且长期预后效果较差。
类风湿关节炎的治疗，一般可以分为：
药物治疗：
类风湿关节炎的传统常见治疗药物为：非甾体类抗炎药（NSAIDs），缓解病情的抗风湿药（DMARDs），糖皮质激素（GCS）等。
非甾体抗炎药是类风湿关节炎治疗中最常见的一类药物，其特点是起效快，且可明显缓解类风湿关节炎的关节肿痛及全身症状，包括传统的NSAIDs如双氯芬酸及COX-2抑制剂如美洛昔康、萘丁美酮，该类药物缺点是只能缓解症状，无明显抑制组织滑膜病变进展的作用。使用时还需注意不应将两种口服剂型的NSAIDs同时服用，避免增加不良反应。该类药物较易产生较强的胃肠道副反应。而新一代COX-2抑制剂的长期使用发生心血管事件的几率增加。
缓解病情的抗风湿药是一类可使类风湿关节炎完全缓解的药物，其特点是起效缓慢，作用持久，可阻止或减缓类风湿关节炎的滑膜破坏。一般在轻症状时可选用一种DMARD，在较重的患者则应考虑DMARDs的联合应用以控制病情，至完全缓解后可减量或改为一种DMARD维持治疗。这类药主要有：甲氨蝶呤、柳氮磺砒啶、青霉胺、金诺芬、硫唑嘌呤、羟氯喹、来氟米特等。
糖皮质激素类药物在类风湿关节炎的治疗中，适应征为经正规治疗仍不能缓解的难治性类风湿关节炎、作为临时缓解症状的过渡性治疗及关节腔内用药。长期使用激素类药物带来的副作用（高血压，骨质疏松，感染等）更加棘手。此类药物主要有***、强的松等。长期服用小剂量激素治疗类风湿关节炎的利弊尚无定论，除非有确切的循证医学依据，否则不宜提倡。
使用药物的内科治疗遵循早期用药，缓解病变的抗风湿药（DMARDs）的合理使用以及个体化治疗方案的原则。各种治疗方案及治疗指南，强调早期诊断、早期治疗，同时加强治疗强度，建议诊断后立即给予DMARDs联合治疗，以尽快控制病情发展。但实际的治疗中部分患者的关节破坏仍可能进一步发展，因而传统药物的治疗效果并不是很理想。
生物制剂：
TNFα和白细胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）是类风湿关节炎致病机制中最关键的细胞因子，近年来以TNFα和IL-1等为靶点的生物制剂为RA患者提供了更多的选择。该类药品直接针对免疫***内的特定炎症介质，从而有助于迅速控制炎症进展，不仅显著缓解疼痛和僵硬等症状，还可进一步防止关节损害。国外已上市的此类药物有：由美国Centocor公司研制生产的Infliximab（商品名“RemicadeTM”），肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（Etanercept，商品名“EnbrelTM”，美国Amgen公司）和重组抗TNFα全人单克隆抗体（Adalimumab，商品名“HumiraTM”，美国Abbott公司）。国内上市品种也有注射用重组II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（商品名“益赛普®”，中信国健；商品名“强克”，上海赛金），西安杨森的进口品种注射用英利昔单抗（商品名：类克®）。上述三类TNFα抑制剂可显著降低类风湿因子和抗环瓜氨酸多肽抗体（CCP）的滴度，据统计此三类药物治疗RA的总有效率为50-70%。
除上述药物，尚有多种生物药处于不同的研究阶段，包括HLA-DR4多肽、IDEC-131、CII胶原多肽、HLA-DRb1疫苗等，均有望成为治疗RA的有效药物。
免疫净化疗法：
对于经正规内科治疗无明显效果，血清中有高滴度自身抗体的难治性类风湿关节炎患者，可采用免疫吸附及淋巴细胞清除等免疫净化治疗，该方法只有与DMARDs联合应用才可能使病情长期缓解。该方法包括血浆置换，免疫吸附及淋巴细胞清除等。
外科手术治疗：
手术治疗有滑膜切除术、关节融合术、截骨术和人工关节置换术，通常以人工关节置换和滑膜切除术较常见。不过关节置换术适用于较晚期的畸形并失去正常功能的关节。一般只适用于年龄超过50岁的患者，因为人工关节的寿命为15~20年，常见的部位是膝、髋和肩部关节。手术治疗不能治愈疾病，只能改善关节功能和提高病人的生活自理能力。
其他治疗方法：
其他治疗方法还有一般治疗方法、植物药治疗、外周血干细胞移植、基因治疗等方法。
一般治疗是指病因治疗以外的一些疗法，如心理疗法、运动疗法（恢复期）、关节制动、卧床休息、理疗和食疗等。对类风湿关节炎的预后有重要影响。
植物药中白芍总苷和雷公藤等植物制剂已用于类风湿关节炎的治疗中。
干细胞移植法用于重症、难治性的RA。基因治疗虽然起步较晚，但随着人类基因组工程的完成，该方法也将会成为治疗RA的一大利器。
以往研究发现，TNFα在类风湿关节炎的发病过程中起关键作用。TNFα是一种重要的炎症细胞因子，在正常的免疫功能和引起炎症过程的级联反应中起重要的作用。在类风湿关节炎病人关节滑液中，TNFα和其他炎症因子大量表达。TNFα作为关键炎症因子，在炎症过程级联反应中的作用及在类风湿关节炎中可能的机制包括：（1）诱导IL-1，IL-6，IL-8，TGF，GM-CSF等其它炎症因子的合成；（2）刺激***素E2和白三烯B4等炎症介质的产生；（3）通过上调E-选择素、血管细胞黏附分子及细胞内黏附分子活化白细胞并协助其向炎症部位渗出；（4）刺激中性粒细胞和纤维原细胞产生胶原酶和基质金属蛋白酶。另外，TNFα还可诱导细胞凋亡及产生急性相反应。因此阻断TNFα的生成和作用，与阻断其他细胞因子（如IL-1）相比，更能全面、有效地抑制类风湿关节炎的发展。
TNFα抑制剂开创了类风湿关节炎治疗的崭新时代。TNFα抑制剂是目前治疗类风湿关节炎最有效的治疗手段，起效快，疗效确切，尤其是抗TNFα单抗。但最初制备获得的是鼠源抗TNFα单克隆抗体，用于类风湿关节炎中和TNFα的治疗。但研究发现鼠源单抗作为治疗药物存在许多缺陷，鼠源单抗用于人体具有强烈的免疫原性，体内消除快，半衰期短，导致临床疗效有限，副作用大。人源化单抗技术部分克服了抗TNFα鼠源单抗的缺陷。其中人鼠嵌合抗TNFα单抗（Infliximab，Remicade®）利用基因工程上游构建技术制备获得，其可变区仍取自鼠源TNFα单抗，保留了与肿瘤坏死因子可溶性片段和跨膜区结合的特异性和亲和力（Ka = 1010 M-1），恒定区为人IgG1的恒定区所取代，体内半衰期大大延长。
Infliximab通过与可溶和跨膜形式TNFα高亲和力的结合，中和TNFα的生物学活性，阻断TNFα与其受体的结合。同时Infliximab通过抗体依赖的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用进一步杀死表达TNFα的细胞。但Infliximab不中和与TNFα共用相同受体的细胞因子TNFβ（又称为淋巴毒素）的作用。
Remicade®是靶向人TNFα的人鼠嵌合单克隆抗体，包含鼠源可变区和人源恒定区（IgG1），与人TNFα特异结合（亲和常数为1010M-1），分子量为149KDa，为静脉输注用无菌、白色、冻干粉针，每瓶含Infliximab 100毫克、蔗糖500毫克、聚山梨酯80 0.5毫克、磷酸二氢钠2.2毫克和磷酸氢二钠6.1毫克，不含防腐剂。使用前用10毫升USP无菌注射用水溶解，pH7.2，再用生理盐水稀释后静脉滴注。Remicade于1998年8月24日由美国FDA首次批准上市，用于治疗中重度活动性克罗恩病和瘘管克罗恩病。随后又在欧盟批准上市，并陆续批准新的适应证，包括类风湿关节炎（RA）、强直性脊柱炎（AS）、银屑病性关节炎、斑块性银屑病、溃疡性结肠炎和6岁以上儿童的溃疡性结肠炎。该抗体是通过基因重组技术和哺乳动物细胞连续灌注培养技术生产的重组蛋白。
与目前上市的大多数重组抗体类药物不同，Remicade所使用的宿主细胞是SP2/0细胞，该细胞为小鼠骨髓瘤细胞系，已知有逆转录病毒颗粒分泌。而由于该产品上市较早，研发者Centocor公司没有掌握无血清培养技术，因而该药在生产过程中使用的是需加入牛血清的培养基。虽然Remicade十余年的使用过程中表现出良好的疗效和耐受性，全球应用该抗体的患者累计超过100万人，其中未发现比传统DMARDs更严重的不良反应。但由于SP2/0细胞中明确的逆转录病毒存在以及生产过程中牛血清的应用，该产品始终存在病毒污染的风险。另外SP2/0宿主细胞在抗体的翻译后修饰过程中，会产生多种非人的糖基化修饰，主要包括（NGNA，Gal-α1,3-Gal）和比例较高的高甘露糖修饰等，在使用过程中可带来免疫原性。
Remicade自1998年在美国上市以后，一直是生物抗体类药物的翘楚，属销售额超过40亿美元的“超级重磅炸弹”级药物。2013年全球最畅销药物中，Remicade位列第三，销售额超过80亿美金。
发明内容
为解决上述问题，降低病毒污染风险和减低免疫原性，本发明提供了一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，获得一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体CMAB008。该抗体具有与已上市同类药物的相似生物活性，并且本发明产品CMAB008高甘露糖形的比例很低，未见Gal-α1,3-Gal末端半乳糖的连接方式，未见NGNA末端唾液酸修饰，在使用过程中可降低免疫原性；本发明中采用无血清培养，降低病毒污染风险。
本发明公开了：
1. 一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体具有SEQ ID NO ：1所述核苷酸序列的轻链及具有SEQ ID NO ：2所述核苷酸序列的重链；
b）利用步骤a）所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆；
c）优化培养条件，大规模培养，获得新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体，分离纯化。
2. 上述的一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，根据仓鼠最偏爱密码子设计合成新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的轻链、重链。
3. 一种载体，含有权利要求1所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。
4. 上述的载体，为pcDNA3.1（+）或pcDNA3.1/ZEO（+）。
5. 上述的一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，所述宿主细胞为真核哺乳动物细胞CHO-CR-GS-/-。
6. 上述的一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，采用无血清培养的方式培养宿主细胞。
7. 一种组合物，含有上述的新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体，和药学上可接受的载体。
8. 上述的新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体在制备类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。
9. 上述的组合物在制备类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。
10. 上述任一用途，还包括和其他的治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物联合使用。
本发明根据仓鼠的最偏爱密码子，设计合成CMAB008抗体的轻链和重链，连接入真核细胞高效表达载体中，获得轻链和重链的真核表达载体。本发明利用CRISPR/Cas技术敲除CHO-K1的GS基因，获得的细胞系命名为CHO-CR-GS-/-消除了内源性GS表达，更有利于高表达细胞克隆的筛选。将含有CMAB008的表达载体转染CHO-CR-GS-/-，筛选高表达克隆。
本发明开发了针对CHO-CR-GS-/-的通用型基础培养基，培养基类型为化学成分限定性（Chemical Defined，CD）培养基，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和微量元素等组合成的基础培养基。基础培养基能够初步满足筛选获得的工程细胞的生长需要，为进一步提高工程细胞目的抗体的产量，对基础培养基进行了针对性的优化调整，包括添加激素、基因工程重组生长因子，调整氨基酸的量。经过反复比较优化，其中一优选实施例，确定了适于抗TNFα嵌合抗体工程细胞大规模无血清培养的培养基（CHOM-B08）和补充培养基（CHOM-S08），工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/cell.day，利用Fed-batch培养模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可在3g/L以上。
附图说明
图1、CMAB008抗体的分离纯化结果
图2、CHO-CR-GS-/-工程细胞图
图3、SP2/0细胞图
图4、CMAB008寡聚糖2-AB标记后荧光色谱图
图5、Remicade寡聚糖2-AB标记后荧光色谱图
图6、CMAB008与Remicade生物活性对比结果图
图7、CMAB008与Remicade ELISA检测结果图。
具体实施方式
实施例 1 、 CMAB008 载体构建
选用仓鼠最偏爱的密码子构建真核高效表达载体，以期在拟用的中国仓鼠卵巢表达体系中获得更加高效的表达。仓鼠偏爱密码子如表1。
表1、仓鼠偏爱密码子
信号肽：选择来自中国仓鼠B细胞抗原受体复合物相关蛋白β链的信号肽。MATMVPSSVPCHWLLFLLLLFSGSS，ATG GCC ACC ATG GTG CCC TCT TCT GTG CCC TGC CAC TGG CTG CTG TTC CTG CTG CTG CTG TTC TCT GGC TCT TCT。
根据仓鼠的最偏爱密码子设计合成CMAB008轻链序列具有SEQ ID NO ：1的核苷酸序列和SEQ ID NO ：2的氨基酸序列，CMAB008重链序列具有SEQ ID NO ：3的核苷酸序列和SEQ ID NO ：4的氨基酸序列。将上述轻链和重链连接入真核细胞高效表达载体中，获得轻链和重链的真核表达载体。
实施例 2 、宿主细胞的选择与改造
生物制药领域中宿主细胞的选择需要关注以下几个重要的方面：糖基化及其他翻译后修饰类型避免带来免疫原性；宿主细胞适于生物反应器的大规模培养，并能在无动物源性成分的化学成分限定性（chemically defined and animal component free，ACDF）培养基中生长至高密度；病毒安全性；适于在ACDF中进行克隆及压力筛选。
已经获得FDA、EMA批准的多数治疗性单克隆抗体选用CHO细胞作为宿主细胞，另外还有少量选用小鼠骨髓瘤细胞系，如NS0和SP2/0-Ag14。另外还有BHK21、HEK293、HKB11等细胞用于蛋白稳定表达的报道。另外还有人视网膜母细胞瘤Per.C6用于抗体稳定表达。其他用于蛋白稳定表达的细胞还有鸟类胚胎干细胞EB66、人神经元细胞以及转化的人的原代细胞等。
CHO细胞可以在生物反应器中高密度生长，易于进行基因操作，N-糖基化类型与人类相似，较低的病毒传播风险，因此广泛用于生物制药领域。工业生产中最常使用的克隆为CHO-K1，CHO-DXB11和CHO-DG44。CHO-K1与原代CHO近似，而DXB11和DG44为经过随机突变缺失DHFR基因，从而可以通过代谢缺陷标记进行基因扩增。CHO-K1使用GS筛选***，但GS在CHO-K1中有内源性表达，因而降低了筛选的效率。
与Remicade及Celltrion公司的Inflectra/Remsima不同，本发明选用治疗性抗体工业化生产应用更加广泛的CHO细胞作为宿主细胞，并对CHO-K1进行了适宜的改造。我们利用CRISPR/Cas技术敲除了CHO-K1的GS基因，获得的细胞系命名为CHO-CR-GS-/-消除了内源性GS表达，因此更加有利于高表达细胞克隆的筛选。
实施例 3 、转染宿主细胞筛选高表达克隆
脂质体法共转染CHO-CR-GS-/-，GS筛选***加压筛选获得高效表达抗TNFα嵌合抗体的稳定细胞克隆。经过多轮的转染及筛选，获得了表达量大于20pg/cell.day的细胞克隆。
实施例 4 、无血清培养适应及培养基的优化
我们开发了针对CHO-CR-GS-/-的通用型基础培养基，培养基类型为化学成分限定性（Chemical Defined，CD）培养基，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和微量元素等组合成的基础培养基。基础培养基能够初步满足筛选获得的工程细胞的生长需要，为进一步提高工程细胞目的抗体的产量，对基础培养基进行了针对性的优化调整，包括添加激素、基因工程重组生长因子，调整氨基酸的量。经过反复比较优化，最终确定了适于抗TNFα嵌合抗体工程细胞大规模无血清培养的培养基（CHOM-B08）和补充培养基（CHOM-S08），工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/cell.day，利用Fed-batch培养模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可在3g/L以上。
实施例 5 、 CMAB008 抗体的分离纯化
将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，收集上清，9000rpm*20min,4℃离心弃去沉淀的细胞及碎片，利用Millipore公司50KD超滤膜包进行超滤浓缩，然后再9000rpm*30min，4℃离心去除细胞碎片，0.45μm滤膜进行过滤，利用rProtein A（重组蛋白A）亲和层析进行初步纯化，原位清洗缓冲液为6M GuCl，柱子用结合缓冲液是20mM PB+150mM NaCl pH7.0，平衡三到五个柱体积后，用洗脱缓冲液20mM Citric Acid（柠檬酸缓冲液） pH3.0三到五个柱体积进行洗脱，柱平衡清洗后保存于20% EtOH，。rProteinA洗脱目的Infliximab用 Hitrap G25（GE Healthcare）进行脱盐置换缓冲液，柱子洗脱缓冲液为PBS（20mMPB+150mMNaCl pH7.0），原位清洗液为0.5M NaOH。以上所有纯化步骤均为冰上操作，纯化所得嵌合抗体Infliximab经50KD超滤离心管（Merck Millipore）进行浓缩，最后以紫外吸收法测280nm OD值定量，Infliximab的紫外OD280吸收系数是1.35，所测得OD值除以1.35即得到其浓度（mg/ml）。结果见图1。
实验例 1 、工程细胞透射电镜
结果显示，该产品采用的CHO-CR-GS-/-工程细胞未见逆转录病毒颗粒（如图2 ），而对照的SP2/0细胞中则可见明显的逆转录病毒颗粒（如图3 ）。
实验例 2 、 CMAB008 抗体糖基化分析
用pH：8.0，浓度50mM NH4HCO3溶解抗体样品，并与已分装好的重组糖苷酶混合，设定100ul反应体系，37℃孵育24小时。制备2-AB荧光标记寡聚糖：
检测柱采用ACQUITY UPLC BEH 300 Amide 1.7m 2.1*100mm，荧光检测器进行检测，LC-MS质谱进行糖型确认，结果图4，图5。
根据检测结果显示：高甘露形，本发明产品高甘露糖形的比例很低；本发明产品中未见Gal-α1,3-Gal末端半乳糖的连接方式；本发明产品中未见NGNA末端唾液酸修饰。
实验例 2 、亲和力分析
本产品与Remicade亲和力相似
样品名称 批号 亲和常数
本发明产品 1301 2.03E-10
Remicade AAM05014 2.33E-10
实验例 3 、 L929 细胞生物活性分析
（1）取对数生长期的L929细胞，胰蛋白酶消化，计数，每次检测 (1块96孔板)取约2*106个细胞，离心弃上清，加入培养液B调整细胞密度至1.5*105/ml，加入96孔培养板中，0.1ml/孔，培养过夜（18-24h）。注意不使用96孔板边缘的孔，但在这些孔中加入无菌水（防止多孔板的边缘效应）。
（2）次日用12mL培养液C稀释放线菌素D母液0.48ml至终浓度为20μg/ml，取2ml作为对照用（培养液D），其余10ml加入2.45μlrh TNFα母液至浓度为4.9ng/ml（培养液E）。
（3）取Remicade®，用培养液E逐步稀释至1000ng/ml。
（4）将CMAB008用培养液E逐步稀释至1000ng/ml。
（5）分别在10个1.5ml无菌离心管中用培养液E连续倍比稀释标准品或样品的稀释液（即稀释后所有管中含相同浓度的TNF和放线菌素D，但TNF单抗的浓度不同）。(计算时请注意：因为下一步加入含等体积培养液的孔中，所以实际的稀释度是这时的稀释度的2倍)。
（6）将上步所有离心管内的稀释液彻底混匀，10,000rpm离心30秒将液体集中于管底。
（7）设定培养液E和培养液D分别为阴性对照和阳性对照（加入培养液D的孔，细胞不受TNF的杀伤；加入培养液E的孔，细胞则受到最大杀伤）。
（8）接种了L929细胞的96孔板中，加入稀释好的样品或进口对照品0.1ml/孔，或者阴性、阳性对照用培养液。每个点设立2个复孔。置入5% CO2，37℃孵箱培养。
（9）96孔培养板在孵箱持续孵育14~16h，将新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS溶液加入孔内（20μl/孔），再在孵箱中持续孵育1-4小时，用酶标仪测量其A490-A630值。
（10）Logistic回归：横坐标为标准品浓度，纵坐标为光吸收值的平均数(A490-A630)。
回归方程： Y = (A-B)/[1+(X/C) D ] + B
根据该方程，C的数值即为半数有效浓度（ED50）。
相对中和活性 (%)=标准品ED50(ng/mL)/ 待测品 ED50(ng/mL)*100%
结果见图6。
实验例 4 、竞争 ELISA 检测生物活性分析
（1） PBS将TNF-α稀释至0.1μg/ml，加入酶标板，100μl/孔。
（2） 37℃，包被2小时。
（3） 弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
（4） PBS将牛血清白蛋白稀释至3%，加入酶标板，加满孔。
（5） 37℃，封闭2小时。
（6） 弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
（7） PBS将HRP标记的rc TNF mAb稀释至0.34μg/ml，用PBS将Remicade稀释至10μg/ml，再将二者等体积混匀。
（8） PBS将HRP标记的rc TNF mAb稀释至0.34μg/ml，用PBS将rc TNF mAb稀释至10μg/ml，再将二者等体积混匀。
（9） PBS将HRP标记的rc TNF mAb稀释至0.17μg/ml，并用该溶液分别2倍比序列稀释上两步中的Remicade及rc TNF mAb液体。
（10） 将序列稀释的Remicade及rc TNF mAb加入酶标板，100μl/孔。另外以0.17μg/ml的HRP标记的rc TNF mAb作为最强显色反应对照，PBS作为最弱显色反应对照。
（11） 37℃，温育1小时。
（12） 弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
（13） 将TMB显色底物A及B等体积混合，加入酶标板，100μl/孔。
（14） 室温避光反应10分钟。
（15） 每孔加入50μl浓度为0.5M的硫酸终止反应。
（16） 酶标仪检测OD450nm，630nm为参比波长。
结果见图7。根据文献报道（Ravinder N Maini and Marc Feldmann. How does infliximab work in rheumatoid arthritis Arthritis Res 2002, 4(Suppl 2):S22-S28.），Remicade® 的亲和常数（K a ）为1010M-1。
本产品与Remicade体外生物活性相似。
样品名称 批号 亲和常数
本发明产品 1301 118%
Remicade AAM05014 110%
实验例 4 、安全性：
I期单次给药，1、3、10mg/kg,27例入选者，实验室各指标基本正常，不良反应率从高到低为头晕、肌肉酸痛、发热、腹痛等，均反应轻微，注射相关反应不明显。
共27例入组病例中7例出现不良事件，不良事件发生率为25.9%。
组别 编号 症状 入组日期 发生日期 结束日期 程度 关系 处理 结果
10mg/kg 19 头晕 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.19 轻 可能有关 休息 好转
10mg/kg 20 头晕 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.19 轻 可能有关 休息 好转
10mg/kg 21 头晕 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.22 轻 可能有关 休息 好转
10mg/kg 21 发热 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.18 轻 可能有关 物理降温 好转
10mg/kg 22 肌肉酸痛 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.23 轻 可能有关 休息 好转
10mg/kg 23 腹痛 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.18 轻 可能有关 留观 好转
10mg/kg 23 腹泻 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.17 轻 可能有关 留观 好转
10mg/kg 23 感冒 2007.11.13 2007.12.14 2007.12.19 中 可能有关 药物治疗 好转
10mg/kg 23 转氨酶升高 2007.11.13 2007.12.15 2008.1.12 中 可能有关 药物治疗 好转
10mg/kg 25 头晕 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.18 轻 可能有关 休息 好转
10mg/kg 25 肌肉酸痛 2007.11.13 2007.11.18 2007.11.23 轻 可能有关 休息 好转
10mg/kg 27 右手酸软 2007.11.13 2007.11.17 2007.11.17 轻 可能有关 休息 好转
I期多次给药，0、2、6、10、14周静脉滴注，期间均未出现任何严重不良事件，未发生注射部位反应（红肿、瘀斑或皮疹），只有一例出现恶心呕吐，20分钟后缓解。
连续多次静脉滴注 CMAB008 后发生的不良事件
编号 症状 程度 关系 影响药物评价 结果
B 被狗咬伤 轻度 无关 无 因给予狂犬疫苗退出试验，伤口愈合良好
恶心、呕吐 轻度 可能有关 无 20分钟后自行缓解
C 红细胞减少 轻度 可能有关 无 血常规正常
血红蛋白减少 轻度 可能有关 无 血常规正常
D 白细胞减少 轻度 可能有关 无 血常规正常
实验例 5 、免疫原性：
（1）单次给药：
检测受试者接受重组抗 TNFα人鼠嵌合单克隆抗体后血清抗 Chimeric anti-TNFαMAb 抗体(ADA)产生情况，于给药前、给药后 14、28、56 天采集血清样本；
1mg/kg 剂量组 9 例受试者中有 2 例（7#、8#）血清中抗 CMAB008抗体检测结果为阳性，经进一步检测均为非中和性抗体；
单次给药1mg/kg组血清抗抗体检测结果
采样时间 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9
给药前 - - - - - - - - -
给药后2周 - - - - - - - - -
给药后4周 - - - - - - + + -
给药后8周 - - - - - - - - -
单次给药1mg/kg组血清中和抗体检测
采样时间 #7 #8
给药前 - -
给药后4周 - -
3mg/kg 剂量组和 10mg/kg 剂量组受试者血清中抗CMAB008抗体检测结果均为阴性。
分析 7#、 8#受试者血清中重组抗 TNFα人鼠嵌合单克隆抗体浓度情况，未发现与其他受试者血清药物浓度有显著性差异。
单次给药3mg/kg组血清抗抗体检测结果
采样时间 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9
给药前 - - - - - - - - -
给药后2周 - - - - - - - - -
给药后4周 - - - - - - - - -
给药后8周 - - - - - - - - -
单次给药10mg/kg组血清抗抗体检测结果
采样时间 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9
给药前 - - - - - - - - -
给药后2周 - - - - - - - - -
给药后4周 - - - - - - - - -
给药后8周 - - - - - - - - -
（2）多次给药：
为检测受试者多次给予重组抗 TNFα 人鼠嵌合单克隆抗体后血清抗CMAB008抗体(ADA)产生情况，于每次滴注前及最后 1 次滴注结束后第 1、2、4、6、8、12周采血进行血清抗 rc-TNF MAb 抗体(ADA)的检测。
仅一名受试者J在第三、四、五次滴注前及第五次滴注后1周、2 周、4周血清中抗CMAB008抗体检测结果为阳性，经进一步检测均未非中和性抗体；
多次给药组血清抗抗体检测结果
采样时间 A C D E F G H I J K
第一次给药前 - - - - - - - - - -
第二次给药前 - - - - - - - - - -
第三次给药前 - - - - - - - - + -
第四次给药前 - - - - - - - - + -
第五次给药前 - - - - - - - - + -
第五次给药后1周 - - - - - - - ND + -
第五次给药后2周 - - - - - - - - + -
第五次给药后4周 - - - - - - - - + -
第五次给药后6周 - - - - - - - - - -
第五次给药后8周 - - - - - - - - - -
第五次给药后12周 - - - - - - - - - -
多次给药组血清中和抗体检测
采样时间 J
第一次给药前 -
第三次给药前 -
第四次给药前 -
第五次给药前 -
第五次给药后1周 -
第五次给药后2周 -
第五次给药后4周 -
分析该名受试者J血清中CMAB008的血药浓度情况，未发现与其他受试者血清药物浓度有显著性差异。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海张江生物技术有限公司
<120> 一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体、制备方法及其应用
<130> 2014
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacatcctgc tgacccagtc tcccgccatc ctgtctgtgt ctcccggcga gagagtgtct 60
ttctcttgca gagcctctca gttcgtgggc tcttctatcc actggtacca gcagagaacc 120
aacggctctc ccagactgct gatcaagtac gcctctgagt ctatgtctgg catcccctct 180
agattctctg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctgt ctatcaacac cgtggagtct 240
gaggacatcg ccgactacta ctgccagcag tctcactctt ggcccttcac cttcggctct 300
ggcaccaacc tggaggtgaa gagaaccgtg gccgccccct ctgtgttcat cttccccccc 360
tctgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc tctgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtctgg caactctcag 480
gagtctgtga ccgagcagga ctctaaggac tctacctact ctctgtcttc taccctgacc 540
ctgtctaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtcttctc ccgtgaccaa gtctttcaac agaggcgagt gc 642
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggtgaagc tggaggagtc tggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc tatgaagctg 60
tcttgcgtgg cctctggctt catcttctct aaccactgga tgaactgggt gagacagtct 120
cccgagaagg gcctggagtg ggtggccgag atcagatcta agtctatcaa ctctgccacc 180
cactacgccg agtctgtgaa gggcagattc accatctcta gagacgactc taagtctgcc 240
gtgtacctgc agatgaccga cctgagaacc gaggacaccg gcgtgtacta ctgctctaga 300
aactactacg gctctaccta cgactactgg ggccagggca ccaccctgac cgtgtcttct 360
gcctctacca agggcccctc tgtgttcccc ctggccccct cttctaagtc tacctctggc 420
ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtct 480
tggaactctg gcgccctgac ctctggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagtcttct 540
ggcctgtact ctctgtcttc tgtggtgacc gtgccctctt cttctctggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagccctct aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660
aagtcttgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 720
ccctctgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatctc tagaaccccc 780
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtct cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 900
tctacctaca gagtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtgtc taacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatctct 1020
aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgcccccctc tagagacgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc tctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc ctctgacatc 1140
gccgtggagt gggagtctaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 1200
ctggactctg acggctcttt cttcctgtac tctaagctga ccgtggacaa gtctagatgg 1260
cagcagggca acgtgttctc ttgctctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtctc tgtctctgtc tcccggcaag 1350
<210> 4
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450

Claims (10)

1.一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体具有SEQ ID NO ：1所述核苷酸序列的轻链及具有SEQ ID NO ：3所述核苷酸序列的重链；
b）利用步骤a）所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆；
c）优化培养条件，大规模培养，获得新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体，分离纯化。
2.根据权利要求1所述的一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，根据仓鼠最偏爱密码子设计合成新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的轻链、重链。
3.一种载体，含有权利要求1所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。
4.权利要求3所述的载体，为pcDNA3.1（+）或pcDNA3.1/ZEO（+）。
5.根据权利要求1所述的一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，所述宿主细胞为真核哺乳动物细胞CHO-CR-GS-/-。
6.根据权利要求1所述的一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，采用无血清培养的方式培养宿主细胞。
7.一种组合物，含有权利要求1所述的新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体，和药学上可接受的载体。
8.权利要求1所述的新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体在制备治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。
9.权利要求8所述的组合物在制备治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。
10.权利要求8、9任一所述的用途，还包括和其他的治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物联合使用。
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