CN110951691B - 抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用 Download PDF

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

本发明公开了一种抗人TNF‑α稳转细胞株及其构建方法和应用，该稳转细胞株被命名为抗人TNF‑α稳转细胞株CHO K1，已于2019年9月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学；保藏编号为CCTCC No：C2019183。本发明的抗人TNF‑α稳转细胞株CHO K1的抗人TNF‑α抗体产量可达到3g/L，是现有的抗人TNF‑α抗体表达细胞株的6倍；不同生产批次之间抗体产量稳定、抗体质量高。

Description

抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
TNF(Tumor necrosis factor，肿瘤坏死因子)是一种在炎症和免疫应答中自然出现的细胞因子，研究发现在类风湿性关节炎患者的滑膜液中，TNF水平升高，并在病理性炎症和关节破坏方面起重要作用。
阿达木单抗能够特异性地与TNF-α结合，而不结合TNF-β等细胞因子，并阻断TNF-α与p55和p75细胞表面TNF受体的相互作用，降低因TNF-α过量产生和释放引发的炎症反应，对于治疗由TNFα过量产生引发的疾病具有重要的临床意义。阿达木单抗是一种可自我注射的生物治疗药物，它先后在国家食品药品监督管理总局(CFDA)获批了2个适应症，分别是类风湿关节炎、强直性脊柱炎。
分泌单克隆抗体细胞株的传统制备方法为免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合法，包括抗原免疫、细胞融合、细胞株筛选、细胞库构建等过程。由于小鼠抗体相对于人体为异种抗原，因此当小鼠单克隆抗体注入人体后会引发机体严重的排斥反应。同时，传统方法制备的融合细胞株容易产生染色体丢失、基因缺失等现象，严重影响单克隆抗体生产过程中不同批次之间的稳定性，影响产品质量。此外，融合细胞株还存在抗体产量低、细胞培养困难等问题。
发明内容
本申请的发明目的是提供一种具有较高的抗人TNF-α抗体产量的抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用。
为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
一种抗人TNF-α稳转细胞株，该稳转细胞株被命名为抗人TNF-α稳转细胞株CHOK1，已于2019年9月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学；保藏编号为CCTCC No：C2019183。
所述的抗人TNF-α稳转细胞株的构建方法包括以下步骤：
(1)制备含有抗人TNF-α抗体重链基因的质粒和含有抗人TNF-α抗体轻链基因的质粒，并将上述两种质粒共转染亲代CHO K1细胞；
(2)对转染完成的CHO K1细胞进行MSX(即蛋氨酸亚氨基代砜)筛选，获得稳转细胞；
具体地，所述的MSX筛选包括：将转染完成的细胞培养于完全培养液中，48h后将完全培养液更换为含有50-200μM蛋氨酸亚氨基代砜的筛选培养液，并每隔3-4天更换一次筛选培养液，直至细胞稳定生长；
筛选培养液即是在完全培养液中添加MSX，至MSX的终浓度达到50-200μM而获得的。
作为优选，所述的筛选培养液中蛋氨酸亚氨基代砜的终浓度为100μM。
作为优选，所述的MSX筛选还包括：将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中继续培养，获得已成功转染的稳转细胞。
作为优选，将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中继续培养2-3天，接种后，完全培养液中的细胞密度为5×105cells/mL。
(3)对稳转细胞进行单克隆细胞株分选，获得所述的抗人TNF-α稳转细胞株CHOK1。
具体地，所述的单克隆细胞株分选包括：将稳转细胞中的单克隆细胞株一一接种至完全培养液中，继续培养19-21天后检测各单克隆细胞株的抗人TNF-α抗体产量，获得所述的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1。
本发明还提供了所述的抗人TNF-α稳转细胞株在制备抗人TNF-α抗体中的应用，该应用包括以下步骤：
(a)将所述的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1接种到含有完全培养液的摇瓶中，置于37℃，5％CO2的环境中，于120rpm下进行传代培养；
(b)传代培养完成后，将细胞转移至较大体积培养摇瓶内，细胞接种后初始密度要大于3×105cells/mL；为了使培养液中有更高的溶氧量，培养摇瓶内培养液的体积不要超过培养瓶总体积的1/5；
(c)待细胞密度达到1×106cell/mL后，切断二氧化碳供应，将摇床转速调节至130-135rpm；
(d)继续培养6-8天，收集培养液，离心并经0.45μm滤膜过滤，获得细胞培养上清液，依次对细胞培养上清液进行纯化和洗脱，获得抗人TNF-α抗体。
作为优选，步骤(a)中，至少传代2次，传代培养过程中，培养液中的细胞密度不超过2×106cells/mL。
本发明的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1的抗人TNF-α抗体产量可达到3g/L，是现有的抗人TNF-α抗体表达细胞株的6倍。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1的抗人TNF-α抗体产量可达到3g/L，是现有的抗人TNF-α抗体表达细胞株的6倍；不同生产批次之间抗体产量稳定、抗体质量高。
(2)本发明的抗人TNF-α稳转细胞株构建方法步骤简便，易于实施。
附图说明
图1为抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1的细胞培养上清液与标准抗体蛋白IgG的PAGE凝胶电泳结果；
其中，“cell supernatant”表示细胞培养上清液，“standard IgG”表示标准抗体蛋白IgG，标准抗体蛋白IgG的浓度依次为80/120 160μg/mL；
图2为GE AKTA Pure蛋白质分离纯化***对纯化后细胞培养上清液进行洗脱的洗脱曲线；
其中，横坐标表示洗脱液体积，纵坐标mAU表示响应值；
图3为对抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1表达获得的抗体溶液进行蛋白浓度检测的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
本实施例一种抗人TNF-α稳转细胞株的构建方法，该构建方法包括以下步骤：
(1)制备含有抗人TNF-α抗体重链基因的质粒和含有抗人TNF-α抗体轻链基因的质粒，并将上述两种质粒共转染亲代CHO K1细胞；
其中，抗人TNF-α抗体重链基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，抗人TNF-α抗体轻链基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，质粒的制备方法则根据QIAGEN试剂盒的说明进行；质粒的转染步骤则根据Invitrogen试剂盒的说明进行。
(2)对转染完成的CHO K1细胞进行MSX筛选，获得稳转细胞；
具体包括：
(2.1)将转染完成的细胞培养于完全培养液中，48h后将完全培养液更换为含有100μM蛋氨酸亚氨基代砜的筛选培养液，并每隔3-4天更换一次筛选培养液，直至细胞稳定生长；
(2.2)将在筛选培养液中稳定生长的细胞接种至完全培养液中，接种后，完全培养液中的细胞密度为5×105cells/mL；继续培养3天后检测细胞的抗人TNF-α抗体产量，以确定质粒是否成功转染、MSX筛选是否成功，最终获得稳转细胞(多克隆)；
(3)对稳转细胞进行单克隆细胞株分选，获得抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1。
具体包括：
(3.1)将稳转细胞经多次稀释后接种至96孔板中，每孔中含有200μL完全培养液，并确保每孔中只含有一个稳转单克隆细胞株；
(3.2)将96孔板中的细胞培养7天左右，时常用显微镜观察细胞生长状态，并对各单克隆细胞株培养孔作标记；
(3.3)继续培养12-14天后检测各单克隆细胞株的抗人TNF-α抗体产量，选取高产量的单克隆细胞株转入24孔板中，继续培养12-14天，并检测各孔内单克隆细胞株的抗人TNF-α抗体产量；继续从24孔板中选取高产量的单克隆细胞株转入6孔板中，继续培养12-14天，并检测各孔内单克隆细胞株的抗人TNF-α抗体产量，从中选取抗人TNF-α抗体产量最高的单克隆细胞株，即为本实施例的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1；
(3.4)将上述的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1冻存保种。
从抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1的细胞培养上清液与标准抗体蛋白IgG的PAGE凝胶电泳结果(如图1所示)可以看出，抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1的细胞培养上清液中抗人TNF-α抗体的含量比160μg/mL的IgG含量还要高。
采用QC ELISA法对上述细胞培养上清液进行抗体结合检测，ELISA反应孔中包被人TNF-α，分别加入1000倍和2000倍稀释度的细胞培养上清液，而后加入酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的IgG)，而后检测OD值。检测结果如表1。
表1
Figure BDA0002262674800000061
由表1可见，两个稀释度下，细胞培养上清液都检测到有抗人TNF-α抗体存在；且与稀释1000倍相比，稀释2000倍的OD450较低，表明细胞培养上清液中的抗体确实为抗人TNF-α抗体。
实施例2
本实施例采用实施例1获得的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1生产抗人TNF-α抗体，该生产方法包括以下步骤：
(1)(a)将抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1(以下简称细胞株CHO K1)转移至含有30mL完全CD培养液的125mL摇瓶内，将摇瓶放置于37℃，5％CO2摇床内，于120rpm下震荡培养；
冻存的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1需要预先复苏，复苏方法为：将细胞株CHO K1从液氮罐中取出，并在37℃水浴锅内迅速解冻，随后将细胞液离心、去除上清，而后用PBS进行清洗；
初始培养时，每隔2-3天对细胞株CHO K1进行传代培养，至少需传代2次以上，传代培养过程中注意避免细胞密度过高(不得大于2×106cell/mL)；
(b)传代培养完成后，将细胞转移至较大体积培养摇瓶内，细胞接种后初始密度要大于3×105cells/mL；为了使培养液中有更高的溶氧量，培养摇瓶内培养液的体积不要超过培养瓶总体积的1/5；
(c)培养48h后，用显微镜检测培养液中的细胞密度是否达到1×106cell/mL(应当达到或高于)，待细胞密度达到1×106cell/mL后，切断二氧化碳供应，将摇床转速调节至130-135rpm；
(d)继续培养6-8天(培养液中的细胞密度最高可达7-8×106cell/mL)，收集培养液，离心并经0.45μm滤膜过滤，获得细胞培养上清液10mL，采用GE AKTA Pure蛋白质分离纯化***依次对细胞培养上清液进行纯化和洗脱，洗脱曲线如图2所示。
由图2所示，洗脱液中抗人TNF-α抗体的响应值最高接近2600，表明洗脱液中抗人TNF-α抗体具有较高的浓度。
洗脱后获得6mL抗体溶液，将抗体溶液稀释四个浓度梯度，进行蛋白浓度检测，检测结果如表2和图3所示。
表2
Figure BDA0002262674800000081
由表2可见，测得的抗体终浓度为：4.86mg/mL；则10mL细胞培养上清液中抗体终产量为29.16mg，则预估细胞株CHO K1的抗体产量为3g/L。
委托上海生物科学研究所对获得的抗人TNF-α抗体进行测序，测序结果显示，抗人TNF-α抗体重链的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，抗人TNF-α抗体轻链的氨基酸序列如SEQID No.4所示。由生物化学和细胞生物学研究所(Institute of Biochemistry and CellBiology)、上海生物科学研究所(Shanghai Institutes For Biological Sciences)和中国科学院(Chinese Academy of Sciences)出具的肽段覆盖率分析结果表明，本发明的抗人TNF-α抗体与阿达木单抗的序列具有100％的一致性。
序列表
<110> 浙江正熙生物医药有限公司
<120> 抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 1
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggtggc ctggtgcagc ccggccggtc cctgcggctg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttcgac gactacgcca tgcactgggt gcggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgtccgcc atcacctgga actccggcca catcgactac 180
gccgactccg tggagggccg gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac 240
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggtgtcc 300
tacctgtcca ccgcctcctc cctggactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 360
tccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgcctcc atctcgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 2
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60
atcacctgcc gggcctccca gggcatccgg aactacctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gcctccaccc tgcagtccgg cgtgccctcc 180
cggttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaaccggg ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa gcggaccgtg gcggcgccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggtaccgct agcgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 3
<211> 451
<212> PRT
<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> 中国仓鼠(Cricetulus griseus)
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (4)

1.一种抗人TNF-α稳转细胞株，其特征在于，命名为抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1，于2019年9月25日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No：C2019183。
2.如权利要求1所述的抗人TNF-α稳转细胞株在制备抗人TNF-α抗体中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(a)将所述的抗人TNF-α稳转细胞株CHO K1接种到含有完全培养液的摇瓶中，置于37℃，5％CO2的环境中，于120rpm下进行传代培养；
(b)传代培养完成后，将细胞转移至较大体积培养摇瓶内，细胞接种后初始密度要大于3×105cells/mL；为了使培养液中有更高的溶氧量，培养摇瓶内培养液的体积不要超过培养瓶总体积的1/5；
(c)待细胞密度达到1×106cells/mL后，切断二氧化碳供应，将摇床转速调节至130-135rpm；
(d)继续培养6-8天，收集培养液，离心并经0.45μm滤膜过滤，获得细胞培养上清液，依次对细胞培养上清液进行纯化和洗脱，获得抗人TNF-α抗体。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(a)中，至少传代2次，传代培养过程中，培养液中的细胞密度不超过2×106cells/mL。
CN201911076644.8A 2019-11-06 2019-11-06 抗人TNF-α稳转细胞株及其构建方法和应用 Active CN110951691B (zh)

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