CN108137684A - 抗ox40抗体及其应用 - Google Patents

抗ox40抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108137684A
CN108137684A CN201580083716.5A CN201580083716A CN108137684A CN 108137684 A CN108137684 A CN 108137684A CN 201580083716 A CN201580083716 A CN 201580083716A CN 108137684 A CN108137684 A CN 108137684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
variable region
chain variable
seq
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580083716.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108137684B (zh
Inventor
徐霆
栾彦
汪皛皛
彭建建
马树立
马慧
潘晓龙
傅士龙
宁珊珊
费烨琼
赵猛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dingfu Biotarget Co ltd
Original Assignee
Dingfu Biotarget Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dingfu Biotarget Co ltd filed Critical Dingfu Biotarget Co ltd
Priority to CN202110853915.7A priority Critical patent/CN114380908B/zh
Publication of CN108137684A publication Critical patent/CN108137684A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108137684B publication Critical patent/CN108137684B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供了抗OX40全人抗体。具体地，通过酵母展示技术筛选得到特异性结合OX40的全人抗体，并通过亲和力成熟改善了抗体的亲和力。本发明还提供了所述抗体用于预防或***的用途。

Description

抗OX40抗体及其应用 技术领域
本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种抗OX40抗体及其应用。
背景技术
T细胞活化需要两种信号协同作用：第一信号由T细胞抗原受体(TCR)识别抗原产生，经CD3分子将信号转导至细胞内，第一信号决定T细胞在适应性免疫应答中的特异性；第二信号是由抗原提呈细胞(APC)或者靶细胞表面的共刺激分子与T细胞表面的相应的协同刺激分子受体相互作用而产生。共刺激信号刺激抗原特异性T细胞增殖，并分化为效应T细胞。如果缺乏共刺激信号，T细胞则会进入无反应或自身免疫耐受状态，甚至进入程序性死亡。
OX40(又称TNFRSF4、ACT35、CD134、IMD16或TXGP1L)是TNFR受体超家族成员，是I型跨膜糖蛋白，OX40主要表达于活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞上(Paterson等(1987)MolImmunol24:1281–1290)。其胞外段由3个半胱氨酸富集域和一个C端不完全CRD组成(DeanneM等(2006)Structure14:1321-1330)。OX40是次级共刺激分子。与CD28不同，OX40不表达于静止的T细胞表面，而在T细胞活化24-72小时有较高的表达。其配体OX40L(TNFSF4，TXGP1，OX-40L，gp34或CD252)是II型跨膜糖蛋白，表达于活化的抗原提呈细胞，如树突状细胞、B细胞等(Godfrey,W.R等(1994)JExpMed180:757–762)。OX40/OX40L信号在T细胞的活化、增值以及抑制凋亡过程中发挥着非常重要的作用。研究表明激活型的OX40抗体能够有效地促进T细胞增殖和活化，并产生较好的抗肿瘤作用(BrendanD.Curti等(2013)CancerRes73:7189-7198)。
StefanieN.Linch等人对OX40激活性抗体和其他***的方法的联和使用做了详细的整理与描述(StefanieN.Linch等(2015)frontiers in oncology 5:1-14)。已有的报道也显示当放疗和OX40激活性抗体联用时可以明显延长小鼠的生存期(Gough M J等(2010)J Immunother 33(8):798-809；Kjaergaard J等(2005)103(1)：156-164)。
本领域仍需要能够与OX40高亲和性结合、并且具有OX40激动剂活性的抗 OX40抗体。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种良好特异性、较高的亲和性和稳定性的抗OX40抗体及其应用。
本发明第一方面涉及抗OX40抗体或其抗原结合部分，其包括选自如下一组的CDR区：
1)其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：5-7所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：14-16所示，或者其重链可变区和轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％；
2)其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：23-25所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：32-34所示，或者其重链可变区和轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％；
3)其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：41-43所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：50-52所示，或者其重链可变区和轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其还包括选自于如下一组的重链可变区框架区：
1)其重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：8-11所示；
2)其重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：26-29所示；
3)其重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：44-47所示。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其还包括选自于如下一组的轻链可变区框架区：
1)其轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：17-20所示；
2)其轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：35-38所示；
3)其轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO：53-56所示。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22和40所示，或者其重链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22和40所示，或者其重链可变区CDR区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
进一步的，包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22、40、62、66、69、72和79所示。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31和49所示，或者其轻链可变区CDR区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31和49所示，或者其轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
进一步的，包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31、49和74所示。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2或Fv。
在本发明的一个实施方案中，当其为scFv时，其重链和轻链可变区之间可含有连接肽，所述连接肽的序列如SEQ ID NO 1所示。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其重链恒 定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
在本发明的实施方案中，其重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本发明的具体实施方案中，其重链恒定区为IgG1或IgG4。
根据本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其轻链恒定区为κ或λ。
本发明第二方面涉及核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，所述重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：5-7；
(2)SEQ ID NO：23-25；
(3)SEQ ID NO：41-43；
(4)与前述(1)～(3)序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，所述重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：4、22和40，或与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位、b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22和40所示，或者其重链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
进一步的，包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22、40、62、66、69、72和79所示。
在本发明的实施方案中，所述核酸分子还包含能够编码抗体重链恒定区的核酸序列；所述重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
在本发明的实施方案中，其重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
在本发明的具体实施方案中，其重链恒定区为IgG1或IgG4。
本发明第二方面涉及核酸分子，其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，所述轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
(1)SEQ ID NO：14-16；
(2)SEQ ID NO：32-34；
(3)SEQ ID NO：50-52；
(4)与前述(1)～(3)序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，所述重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
SEQ ID NO：13、31和49，或与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
进一步的，包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31和49所示，或者其轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
进一步的，包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31、49和74所示。
在本发明的实施方案中，所述核酸分子还包含能够编码抗体轻链恒定区的核酸序列；所述轻链恒定区为κ型或λ型。
本发明第四方面涉及载体，其含有本发明第二或第三方面任一项的核酸分子。
根据本发明第四方面任一项的载体，其含有本发明第二方面任一项的核酸分子和第三方面任一项的核酸分子。
本发明第五方面涉及宿主细胞，其含有本发明第二或第三方面任一项的核酸分子或本发明第四方面任一项的载体。
本发明第六方面涉及偶联物，其含有本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，以及其它生物活性物质，所述抗OX40抗体或其抗原结合部分直接或通过连接片段与其它生物活性物质偶联。
在本发明的实施方案中，所述其它生物活性物质选自可间接抑制肿瘤细胞生长、或通过激活机体免疫反应从而抑制或杀灭细胞，从而达到***的化学物质、多肽、酶、细胞因子或其他具有生物活性的单一物质或混合物质，例 如白介素类、肿瘤坏死因子、趋化因子、纳米颗粒等。
本发明第七方面涉及组合物(例如药物组合物)，其含有本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面任一项的核酸分子、第四方面任一项的载体、第五方面任一项的宿主细胞、或者本发明第六方面任一项的偶联物，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。根据本发明第七方面任一项的组合物(例如药物组合物)，所述其它生物活性物质包括但不限于其它抗体、融合蛋白或药物(例如抗肿瘤药物，如放、化疗药物)。
本发明还涉及本发明第一方面任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分、第二方面或第三方面任一项的核酸分子、第四方面任一项的载体、第五方面任一项的宿主细胞、第六方面任一项的偶联物或第七方面任一项组合物用于制备预防或***的用途。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明利用酵母展示技术，通过筛选和进一步亲和力成熟得到了具有良好特异性、较高的亲和性和稳定性的抗OX40抗体，该抗体能够特异性地与人OX40结合，其可以通过和活化的T细胞结合进而增强T细胞的活化作用，对肿瘤生长具有显著的抑制作用。另外，本发明的抗OX40抗体为全人源抗体，与传统的鼠源、嵌合抗体和人源化抗体相比，具有更低的免疫原性，减少病人的排异反应，具有更好的成药能力。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是纯化的anti-hOX40scFv对hOX40的结合的结果图，
其中，x轴表示EGFP的荧光强度，Y轴表示anti-hlg-PE的荧光强度；
图2是anti-OX40抗体的特异性检测，
其中，x轴表示EGFP的荧光强度，Y轴表示anti-hlg-PE的荧光强度；
图3是亲和力提高的酵母单克隆染色结果图；
图4是ELISA法检测三种抗体与hOX40的结合能力图；
图5是ELISA法检测亲和力成熟后的不同重链突变体与hOX40的结合能力图；
图6是ELISA法检测亲和力成熟后的H96位重链突变体和不同轻链突变体与hOX40的结合能力图；
图7是anti-hOX40抗体体外激动剂活性的检测结果图；
图8是H96-L80的3种IgG亚型的体外agonist活性对比图；
图9是anti-OX40抗体与人和恒河猴的CD4+T和CD8+T细胞结合能力检测图；
图10是O21scFv抗体激动剂活性检测结果图；
图11是O21scFv和lgG两种形式的激动剂活性检测结果；
图12是H96-L80的IgG1和IgG4两种亚型的体外对T细胞亚型的影响；
图13是O21mAb在体内对肿瘤(PC-3)生长抑制作用的结果图；
图14是O21mAb在体内对肿瘤(A375)生长抑制作用的结果图；
图15是45℃加速稳定实验评价anti-OX40抗体稳定性的结果图，
其中A为浓度检测，B为单体含量检测，C为NF-κb***对体外活性的检测；
图16是H96-L80抗体的药物代谢动力学检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下对本发明做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。本发明中所述的氨基酸的位置根据abysis在线工具比对得到(http://www.bioinf.org.uk/abysis/index.html)，并不代表氨基酸的序列中的实际排位。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，OX40)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，ed.，第2版，Raven Press，N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody) 和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
在本发明中，术语“载体”指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸***其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。
在本发明中，“特异性结合”指的是，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)结合该抗原，其中KD指解离率与结合率的比值(koff/kon)，其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。
实施例1：重组人OX40的表达和相关EGFP细胞制备
S1.1、根据蛋白数据库Uniprot上人OX40的氨基酸序列(P43489)，得到人OX40胞外结构域的氨基酸序列(hOX40)(即P43489中第1位残基至216位残基)；
S1.2、根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01857)，得到人IgG1-Fc(hFc)的结构域氨基酸序列(即P01857 中第104位残基至330位残基)；
S1.3、根据蛋白数据库Uniprot上小鼠免疫球蛋白gamma1(IgG1)的恒定区氨基酸序列(P01868)，得到小鼠IgG1-Fc(muFc)的结构域氨基酸序列(即P01868中第98位残基至324位残基)；
S1.4、通过人工合成的方式得到步骤S1.1～S1.3中的DNA片段，合成好的基因序列分别经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即：pcDNA4-hOX40-hFc、pcDNA4-hOX40-muFc；
S1.5、根据蛋白数据库Uniprot上信息得到增强型绿色荧光蛋白EGFP氨基酸序列(C5MKY7)、人OX40的氨基酸序列(P43489)、鼠OX40的氨基酸序列(P47741)、人CD137的氨基酸序列(Q07011)、人CD27氨基酸序列(P26842)；
S1.6、通过人工合成的方式得到步骤S1.5中的DNA片段，合成好的基因序列分别经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即：pcDNA4-hOX40-EGFP、pcDNA4-hCD137-EGFP、pcDNA4-mOX40-EGFP和pcDNA4-hCD27-EGFP。
S1.7、将步骤S1.6中的EGFP重组质粒转染到HEK293(ATCC，CRL-1573TM)细胞中，转染48h后通过荧光激活信号分选(FACS)确认hOX40、hCD137、mOX40、hCD27的表达。
S1.8、将pcDNA4-hOX40-Fc、pcDNA4-hOX40-muFc瞬时转染至HEK293细胞用于蛋白生产。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将每组质粒/PEI混合物分别加入细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，90rpm中培养；培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，初步纯化得到hOX40-Fc、hOX40-muFc蛋白样品，用于以下各实施例。得到的蛋白样品利用SDS-PAGE进行初步的检测，可以清晰的看到目的条带。
实施例2：从酵母展示文库中筛选anti-hOX40抗体，克隆表达和鉴定
2.1方法
采用酵母展示技术筛选针对人OX40的全人抗体。通过克隆来自150个健康人的PBMC的IgM和IgG cDNA中的VH和VL基因到特定载体，构建scFV酵母展示文库(VH和VL中间的连接序列是 连接肽)，库容为5×108。将10倍库容的酵母库复苏，诱导酵母表面表达抗体，用100nM生物素化的hOX40抗原利用磁珠分选的方式富集二次，然后用生物素化的hOX40做流式分选再富集两次。得到的酵母涂板，挑取单克隆。单克隆酵母经扩增和诱导表达后用anti-myc抗体和生物素化的hOX40或对照抗原hCD137染色分析，抗原阳性/对照酵母阴性的酵母为阳性酵母。
将经过FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序，PCR引物为：sequence-F：sequence-R：测序的引物为sequence-R。得到测序结果后用BioEdit软件对序列进行比对分析。
将上述得到的单链抗体scFv基因及前述的人IgG1-Fc基因融合后经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA中，按照分子克隆的标准操作进行克隆和质粒小提。提取后的质粒在HEK293细胞中瞬时表达，并通过protein A柱纯化。
取hOX40-EGFP细胞，重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入上述纯化后2μg的anti-hOX40scFv抗体，同时设置相关对照，阴性对照为2μg的hIgG1蛋白。二抗为eBioscience的anti-hIg-PE。染色完毕后流式细胞仪进行检测。以此方法鉴定能结合细胞表面hOX40抗原的抗体。
经过筛选和鉴定后得到3株特性较好的抗体分别是O3scFv、O19scFv、O21scFv。如图1所示，3株抗hOX40的抗体均能够与细胞表面hOX40相结合，而阴性对照不能够与细胞表面hOX40相结合。上述抗体重链和轻链可变区之间含有连接肽序列
2.2序列
2.2.1O3scFv重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：5-7； 未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：8-11；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：14-16；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：17-20；
其对应的DNA序列为：
2.2.2O19scFv重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：23-25；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：26-29；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：32-34；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：35-38；
其对应的DNA序列为：
2.2.3O21scFv重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：41-43；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：44-47；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：50-52；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：53-56；
其对应的DNA序列为：
实施例3：3株抗体的scFv型抗体格式化为IgG型抗体
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma4(IgG4)的恒定区氨基酸序列(P01861)，得到人IgG4恒定区氨基酸序列。将筛选得到的O3、O19、O21的重链可变区VH序列与人IgG4恒定区基因序列拼接在一起，将拼接好的基因合成，经Fermentas公司HindIII和EcoRI双酶切亚克隆至载体pcDNA4/myc-HisA中得到pcDNA4-O21HC、pcDNA4-O3HC、pcDNA4-O19HC。
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白Kappa的恒定区氨基酸序列(P01834)，得到人Kappa轻链恒定区氨基酸序列。将筛选得到的O21的轻链可变区VL序列与人Kappa轻链恒定区基因序列拼接在一起；根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白lambda的恒定区氨基酸序列(A0M8Q6)，得到人lambda轻链恒定区氨基酸序列，将筛选得到的O3、O19的轻链可变区VL序列与人lambda轻链恒定区基因序列拼接在一起，将拼接好的基因合成，经Fermentas 公司HindIII和EcoRI双酶切亚克隆至载体pcDNA4/myc-HisA中得到pcDNA4-O21LC；pcDNA4-O3LC；pcDNA4-O19LC。
利用AidLab公司提供的质粒大提试剂盒(PL14)对上述得到的重链和轻链质粒进行质粒大提。将重组构建的轻链和重链质粒共转染HEK293细胞进行抗体表达。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将每组质粒/PEI混合物分别加入细胞悬液中，放置在37℃，10％CO2，120rpm中培养，培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，纯化得到anti-hOX40抗体：O3mAb、O19mAb和O21mAb。
实施例4：anti-hOX40Abs特性鉴定
抗体是否特异性识别hOX40的鉴定：
纯化的anti-hOX40抗体与hOX40、hCD137和hCD27蛋白的结合
取实施例1构建的表达hOX40-EGFP、hCD137-EGFP和hCD27-EGFP的HEK293细胞，重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入anti-hOX40mAb蛋白，冰上孵育20min。洗涤后加入eBioscience二抗anti-hIg-PE，冰上20min。洗涤后将细胞重悬于500μl0.5％PBS-BSA Buffer中，流式细胞仪进行检测。结果如图2所示，三株抗体(O3mAb、O19mAb和O21mAb)均能与hOX40-EGFP细胞结合，而不能与其他几种EGFP细胞(hCD137-RGFP-293F、hCD27-RGFP-293F)结合，展示出很好的特异性。
实施例5：anti-OX40抗体的体外亲和力提高
由于三株抗体(O3mAb、O19mAb和O21mAb)均能特异性与hOX40-EGFP细胞结合，且试验发现O21scFv与hOX40有更高的亲和力，同时瞬时转染有稳定的较高表达量，因而选择O21scFv抗体做进一步的体外亲和力提高试验；然而应当说明的是，体外亲和力提高试验的目的在于研究突变率对于抗体亲和力的影响，试验结果应当不局限于O21scFv的判定，而应理解为包括O3scFv、O19scFv和O21scFv在内的抗体，其突变率对于抗体亲和力的影响。
5.1 anti-OX4021#ScFv亲和力改善的酵母文库构建
以实施例1构建的pcDNA4-OX40-21-Fc质粒为模板，pcDNA4-F:和cMyc-BBXhoI: 为引物进行标准PCR反应。得到的PCR产物经Fermentas公司的NheI和BglII酶切后构建重组质粒。接下来参考文献Ginger等(2006)NatProtoc1(2):755-68的方法，利用error prone PCR的方法获得scFv随机突变的PCR产物。所用的引物为ep-F：和ep-R:得到的PCR产物经Fermentas公司GeneJET DNA purification Kit纯化后再乙醇沉淀浓缩至浓度大于1μg/μl。剩下的操作方法参考文献Ginger等(2006)Nat Protoc 1(2):755-68的方法，利用酵母电转化和体内重组的方法获得亲和力成熟的酵母库。
5.2产生亲和力改善的酵母anti-OX40 21#scFv筛选
将上述得到的亲和力成熟后的酵母库用10nM和1nM的hOX40-Fc蛋白经过两轮流式分选，分选得到的酵母产物涂板，挑取单克隆鉴定。利用低浓度抗原染色的方法，以之前得到的野生型酵母作为对照，流式染色确定亲和力提高的酵母单克隆，将经过FACS确认的酵母克隆进行酵母菌落PCR和测序，方法同上。将测序得到的序列利用BioEdit软件进行突变位点的分析。
整理对抗体亲和力没有影响甚至是提高亲和力的O21scFv突变位点，结果如表1所示，该表结果应当理解为，O21scFv上发生如表中所示的其中之一个或多个突变，对于亲和力没有影响甚至会有所提高；与之相对应的筛选出的酵母单克隆序列分析结果，如表2所示，该表应当理解为，表1中列出的突变位点，当具有如表2所示的几种突变组合时，可以提高抗体的亲和力；表2中所示的酵母染色结果如图3所示，可见与O21scFv相比，抗体的亲和力均得到不同程度的提高。
表1对抗体亲和力没有影响的O21scFv突变位点
重链 轻链
H7位：S突变成L L30位：S突变成G
H13位：K突变成M L90位：L突变成Q
H28位：S突变成N  
H33位：S突变成G  
H43位：R突变成G  
H65位：S突变成N  
H67位：I突变成M  
H96位：N突变成D  
表2亲和力提高的酵母单克隆序列分析结果
由表2可知，对于O21scFv重链CDR区和轻链CDR区而言，已有实验指出可分别突变3个和2个氨基酸(实施例6中的anti-OX40 21#H96-L80mAb，其轻链突变可至3个氨基酸)，仍可以维持甚至提高抗体的亲和力，而现在已知O21scFv重链可变区和轻链可变区分别包括119个氨基酸(其中CDR区32个 氨基酸，FR区87个氨基酸)和109个氨基酸(其中CDR区29个氨基酸，FR区80个氨基酸)，那么可以认为与重链CDR区或轻链CDR区的同源性在90％以上的，仍具有维持甚至提高抗体亲和力的能力。实际情况下，抗体的亲和力与序列同源性的百分比例之间并没有决定性的联系，而是更多地受到可决定抗体表位(或称抗原决定部位)的关键氨基酸残基的影响，在这些关键氨基酸残基未发生突变或突变不具决定性改变作用的前提下，序列同源性可低至70％。
实施例6：scFv型抗体格式化为IgG型抗体
按照实施例3中的方法对亲和力成熟后的scFv型抗体格式化为IgG型抗体型抗体，得到一系列的anti-OX40 21#mAb的变体，具体序列信息如下：
6.1 anti-OX40 21#H28H33mAb
其重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：63、42和43；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：64、45、46和47；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：50-52；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：53-56；
其对应的DNA序列为：
6.2、anti-OX40 21#H65mAb
其重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：41、67和43；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：44-47；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：50-52；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：53-56；
其对应的DNA序列为：
6.3、anti-OX40 21#H96mAb
其重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：41、42和70；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：44-47；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，其序列编号分别为SEQ ID NO：50-52；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：53-56；
其对应的DNA序列为：
6.4、anti-OX40 21#VHnew-L80
其重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：63、67和70；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：44-47；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：75-77；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：53-56；
其对应的DNA序列为：
6.5、anti-OX40 21#H96-L80mAb
其重链可变区氨基酸序列：
横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3，框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：41、42和70；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：44-47；
其对应的DNA序列为：
其轻链可变区氨基酸序列：
其中横线部分分别为CDR1、CDR2、CDR3,框内所示为突变部分，其序列编号分别为SEQ ID NO：75-77；未划横线部分分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其序列编号分别为SEQ ID NO：53-56；
其对应的DNA序列为：
实施例7：anti-hOX40Abs特性鉴定
7.1纯化的anti-hOX40抗体与hOX40结合能力检测(ELISA法)
以包被缓冲液(50mM Na2CO3，NaHCO3pH9.6)稀释hOX40-muFc至2μg/ml，100μL/well，4℃过夜。洗板后，3％BSA-PBS37℃封闭1h。将anti-hOX40抗体分别从2000ng/ml开始，进行2倍梯度稀释，共11个浓度，稀释液(1％BSA-PBS)作对照，37℃孵育2h。加入羊抗人IgG-HRP(Goat anti-human IgG-HRP conjugated)，37℃孵育1h。加可溶性单组分TMB底物显色液，室温避光显色5-10min。2N H2SO4 50μL/well，终止显色反应。置MD SpectraMax Plus384酶标仪上读OD 450nm-650nm值，应用软件SoftMax Pro v5.4进行数据处理和作图分析，结果如图4-6所示。由图4可知，由ScFv转变为IgG型抗体后，O19mAb亲和力依然比较低；O21mAb亲和力变化不大，亲和力比较好；O3mAb亲和力显著提高。由图5和图6可知，上述的anti-OX40 21#mAb的变体均能和OX40结合，且经过体外亲和力成熟后的anti-OX40 21#VHnew-L80mAb，anti-OX40  21#H96-L80mAb与anti-OX40 21#mAb相比，亲和力大约提高两倍。
7.2通过表面等离子共振(SPR)分析a-hOX40mAbs与hOX40的动力学亲和力常数
anti-hOX40抗体针对重组的人OX40的结合动力学通过表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)方法，使用BIAcore X100仪器测量。CM5芯片偶联anti-humanFc抗体(不交叉识别mouse Fc)，将待测抗体用running buffer稀释至5nM并被芯片上抗体捕获作为配体。OX40-muFc用running buffer稀释至1000-1.37nM二倍稀释。进样时间为180S，解离时间为1800s，再生时间为60S。running buffer为HBS-EP+，再生buffer为10mM glycine-HCl(pH2.0)。使用简单一对一Languir结合模型(BIAcore评价软件3.2版(BIAcore Evaluation Software version3.2))计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(kD)以比率koff/kon计算。由表3可知，亲和力成熟后的anti-OX40 21#H96-L80mAb的亲和力约提高两倍。
表3 anti-hOX40抗体与hOX40结合动力学检测
名称 Kon(1/Ms) Koff(1/s) KD(M)
O3mAb 2.84E+05 3.91E-04 1.378E-09
O21mAb 4.181E+4 6.077E-04 1.454E-08
VHnew-L80 3.329E+04 3.415E-04 1.026E-08
H96-L80 2.999E+04 2.368E-04 7.898E-09
7.3NF-κb***检测anti-hOX40抗体体外agonist活性
构建OX40-CD40质粒：根据蛋白数据库Uniprot上人OX40的氨基酸序列(P43489)，得到人OX40胞外结构域的和跨膜区氨基酸序列(即P43489中第1位残基至235位残基)；根据蛋白数据库Uniprot上人CD40氨基酸序列(P25942)，得到人CD40的胞内段氨基酸序列(即P25942中第216位残基至277位残基)；通过基因合成的方法将两者拼接到一起，再经Fermentas公司的HindIII与EcoRI双酶切亚克隆到商业化载体pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen，V863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒DNA即：pcDNA4-OX40-CD40(即下文中提到的OX40-CD40)。
293T-NF-κB稳定细胞系：293T细胞接种24孔板，1x105/well，每孔200μlDMEM完全培养基，同时加入20μlNF-κB-luciferase-lentivirus(Qiagen，cat： CLS-013L)，MOI＝2。感染24h之后，弃去上清，加入1ml DMEM完全培养基继续培养，24h后，换用含0.3μg/ml promycin的DMEM完全培养基继续培养，培养扩大细胞并冻存。用promycin筛选的293T-NF-κB细胞接种24孔板，1x105/well，10ng/ml TNF-α刺激6h后，裂解细胞检测luciferase，结果显示，TNF-α刺激过的细胞luciferase值明显高于未刺激的细胞，证明NF-κB-luciferase已经稳转进293T细胞。
用不含双抗的培养基重悬5x105 293T-NF-κB细胞，接种于6孔板中。24h后，弃上清，并用PBS清洗一遍，加入1.8ml的无双抗无血清的培养液。以质粒：脂质体＝1:3的比例，转染0.2μg OX40-CD40质粒。转染4h后，弃上清，换成新鲜完全培养液，继续培养。转染次日，将细胞以5x104/孔的密度接种于96孔板，加入一系列浓度梯度的抗体(初浓度10μg/ml，10倍稀释7个梯度)，同时加入同浓度的cross-link(Jackson ImmunoResearch Laboratories:109-006-008)继续培养6h，裂解细胞检测luciferase。如图7所示，图中A、C、E、G分别代表O3mAb、O21mAb、anti-OX40 21#VHnew-L80mAb和anti-OX40 21#H96-L80mAb在不同浓度下，体外激动剂活性检测结果，图中B、D、F、H分别为取log之后的体外激动剂活性检测结果图，结果显示O3mAb和O21mAb在体外均有较好的agonist活性，并且呈现较好的剂量依赖性。亲和力提高后的anti-OX40 21#VHnew-L80mAb，anti-OX40 21#H96-L80mAb在Agonist活性上大约提高两倍。
实施例8不同亚型对抗体agonist活性的影响
由于anti-OX40 21#mAb的各种变体，均对hOX40具有特异的高亲和力，与hOX40结合动力学结果均较好，而其中之一的anti-OX40 21#H96-L80mAb在Agonist活性上大约提高两倍，因此本申请以anti-OX40 21#H96-L80mAb(以下简称H96-L80)为例做进一步的说明，其余各变体不再赘述。然而应当说明的是，后续各实施例中虽然仅对H96-L80做出说明，但不应当理解为anti-OX40 21#mAb的各种变体不具有相应的特性，或是其它两种抗体(O3mAb、O19mAb)不具有相应的特性。后续各实施例中对于H96-L80的进一步实验数据，仅用于证明根据本发明方法获得的各种anti-OX40抗体，具有较高的活性、亲和力、功 能性或稳定性。
根据蛋白数据库Uniprot上人免疫球蛋白gamma1(IgG1)和人免疫球蛋白gamma2(IgG2)的恒定区氨基酸序列(分别是P01857和P01859)，得到人IgG1和IgG2恒定区氨基酸序列。剩余按照上述的方法操作，得到anti-OX40 21#H96-L80 IgG1mAb和anti-OX40 21#H96-L80 IgG2mAb。按照实施例7的方法进行实验，结果如图8所示，其中图8A和图8B分别为IgG1和IgG2两种亚型，在不同浓度下，体外激动剂活性检测结果，图8C为IgG1和IgG2两种亚型取log之后的对比结果图，图8D为0.1ug/ml浓度下，可见H96-L80的三种亚型的抗体agonist活性相当。
实施例9：纯化的H96-L80抗体与人和恒河猴活化后CD4+T和CD8+T细胞结合能力检测
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC，接种到RPMI完全培养基中。用终浓度为5ug/ml的PHA活化PBMC 48小时。将细胞重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入H96-L80蛋白，冰上孵育20min。洗涤后加入biolegend二抗FITC anti-hIgG(Cat#409310)或Biolegend抗体PE anti-hOX40(Cat#350003)，以及biolegend抗体APC anti-human CD4(Cat#317416)，冰上孵育20min。洗涤后将细胞重悬于500μl 0.5％PBS-BSA Buffer中，流式细胞仪进行检测。结果如图9A所示，H96-L80可以很好的结合活化的CD4+T细胞。
为检测H96-L80与CD4+细胞中Treg与Teff的结合能力，用上述活化后的人PBMC染色。将细胞重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入H96-L80蛋白，冰上孵育20min。洗涤后加入biolegend二抗FITC anti-hIgG，以及biolegend抗体APC anti-human CD4，冰上孵育20min，洗涤后穿膜固定液(BD，51-2090KZ)作用1h，穿膜液(eBioscience，00-8333-56)洗涤后再用穿膜液从悬，加入PE anti-human Foxp3(Cat#320208)，4℃染色过夜，洗涤后将细胞重悬于500μl 0.5％PBS-BSA Buffer中，流式细胞仪进行检测。结果如图9B所示，H96-L80可以很好的结合活化的CD4+Foxp3+Treg和CD4+Foxp3-Teff细胞。
为检测H96-L80与恒河猴OX40的结合能力，利用上述步骤获得活化的恒 河猴外周血单核细胞PBMC。将细胞重悬于0.5％PBS-BSA Buffer中，加入H96-L80蛋白，冰上孵育20min。洗涤后加入biolegend二抗FITC anti-hIgG，以及biolegend抗体APC anti-human CD4和PE anti-human CD8a(Cat#301008)，冰上孵育20min。洗涤后将细胞重悬于500μl 0.5％PBS-BSA Buffer中，流式细胞仪进行检测。结果如图9C所示，H96-L80可以很好的结合活化的恒河猴CD4+T和CD8+T细胞，提示H96-L80可以结合恒河猴OX40。
实施例10：anti-OX40抗体促进T细胞的活化和增殖
10.1用T细胞活化和增殖来研究anti-OX40scFv抗体的体外活性和评价其激动剂(agonist)功能。
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC，接种到RPMI完全培养基中。预先用50μl 1μg/ml的anti-CD3包被96孔板，4℃过夜。实验组用50μl 2μg/ml的O21scFv，37℃包被2h，和同时加上soluble形式终浓度2μg/ml O21scFv+终浓度4μg/ml cross-link(Jackson ImmunoResearch Laboratories:109-006-008)，阴性对照为RPMI完全培养基。PBMC量为2×105/孔，培养五天后取上清。如图10所示，利用IFN-γELISA检测试剂盒(ebioscience)检测上清中IFN-γ的水平(图10A)，以及用BrdU染色试剂盒(罗氏：11647229001)检测T细胞增殖(图10B)，可见O21scFv在coating和cross-link两种用药方式下均有较好的活化PBMC和促进T细胞增殖的活性。
10.2用体外PBMC和CD4+T细胞活化评价O21scFv和IgG两种形式的agonist活性
利用人淋巴细胞分离液(天津灏洋)密度梯度离心从健康捐献者外周血浓缩白细胞中分离外周血单个核细胞PBMC，接种到RPMI完全培养基中。用CD4+T细胞分离试剂盒(美天旎，cat#no.130-096-533)从PBMC中分离CD4+T细胞。预先用50μl 1μg/ml的anti-CD3包被96孔板，4℃过夜。实验组用50μl2μg/ml的O21scFv或O21mAb，37℃包被2h，阴性对照为同等剂量的hIgG-Fc。PBMC和CD4+T细胞量为2×105/孔，培养五天后取上清，利用IFN-γELISA检测试剂盒(ebioscience)检测上清中IFN-γ的水平。
如图11所示，对于PBMC(图11A)和CD4+T细胞(图11B)，可以看出在体外O21抗体的全抗体mab型比scFv型有更好的agonist活性。
实施例11：IgG1和IgG4亚型的anti-OX40抗体H96-L80对T细胞亚群的影响
按照实施例10操作，获得人外周血单核细胞(PBMC)，将PBMC用溶解的抗CD28(0.5μg/ml)和结合板的抗CD3(3μg/ml)和抗人OX40mAb H96-L80 IgG1或IgG4(10μg/ml)刺激。48小时后，收获细胞。用biolegend抗体APC anti-human CD4和PE anti-human CD8a(Cat#301008)染色，或用biolegend抗体APC anti-human CD4和PE anti-human Foxp3(Cat#320208)染色，流式细胞仪进行检测。结果如下图所示，O21mAb H96-L80 IgG1和IgG4两种亚型可以降低CD4+Foxp3+Treg在CD4+T细胞中的比例(图12A)，但对CD4+T与CD8+T细胞的比例没有影响(图12B)。
实施例12：anti-OX40抗体在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用
12.1使用植入肿瘤细胞PC-3和人PBMC的NOD-SCID小鼠肿瘤肿瘤模型，来评价anti-OX40抗体在体内的药效
在第0天用PC-3(ATCC CRL-1435TM)和人的外周血单个核细胞(PBMC)一起进行皮下(SC)注射小鼠，并在第0、7天用10mg/kg的O21mAb或PBS腹腔注射给药，PBS作为阴性对照，每组5只小鼠。每周两次观察肿瘤的形成，并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线图，结果如图13所示，可以看出抗体O21mAb可以显著抑制肿瘤生长。
12.2使用植入肿瘤细胞A375和人PBMC的NOD-SCID小鼠肿瘤肿瘤模型，来评价anti-OX40抗体在体内的药效
在第0天用7×106的A375(ATCC CRL-1619TM)和1×106人的外周血单个核细胞(PBMC)一起进行皮下(SC)注射小鼠，并在第0、7天用1mg/kg的O21mAb或PBS腹腔注射给药，PBS作为阴性对照，每组5只小鼠。每周两次观察肿瘤的形成，并用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线图，如图14所示，可以看出抗体O21mAb可以显著抑制肿瘤生长。
实施例13：anti-OX40Abs稳定性检测
对anti-hOX40抗体O21mAb的稳定性用45℃加速稳定性实验进行检测。具体实验方法为：将抗O21mAb抗体浓缩至约10mg/ml，置于45℃水浴，在第0天、第10天、第20天、第30天收样进行浓度、SEC-HPLC、NF-κb分析实验。SEC-HPLC采用岛津LC20AT HPLC液相色谱仪进行分析实验，将样品浓缩至1mg/ml，流速为0.5ml/min上样，总上样量为50ug，上样后进行等度洗脱30min；NF-κb按实施例7进行操作，结果如图15所示，可以看到anti-hOX40抗体O21mAb在体外有较好的稳定性。
实施例14 anti-hOX40抗体O21mAb的药物代谢动力学评价
用10mg/kg和1mg/kg的剂量来评价H96-L80 IgG1抗体的药物代谢动力学。使用Balb/C、雌性、8周龄小鼠，取16只小鼠，每个剂量分为A/B两组，每组四只。向所有的小鼠静脉注射H96-L80 IgG1抗体200μg(10mg/kg)或20ug(1mg/kg)，给药后分14个时间点分别取血100μl，每个时间点取一组小鼠，两组轮换。分离血清。用ELISA方法检测血清中受试蛋白的浓度：hOX40-muFc包板，加入适当稀释度的血清样品，然后加入Goat anti-Human IgG HRP(Sigma CatNO:A0170),用TMB显色。使用H96-L80 IgG1抗体作为标准蛋白做标准曲线。利用WinNolin软件计算药代动力学参数。平均C-T曲线如图16所示，经检测，本发明的H96-L80 IgG1抗体比较稳定，1mg/kg的剂量其体内半衰期平均为205小时；10mg/kg的剂量其体内半衰期平均为371小时。经检测，没有anti-H96-L80的抗抗体产生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (24)

  1. 一种抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：其包括选自如下一组的CDR区：
    1)其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：5-7所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：14-16所示，或者其重链可变区和轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％；
    2)其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：23-25所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：32-34所示，或者其重链可变区和轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％；
    3)其重链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：41-43所示，轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO：50-52所示，或者其重链可变区和轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  2. 根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22和40所示，或者其重链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  3. 根据权利要求2所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22和40所示，或者其重链可变区CDR区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
  4. 根据权利要求3所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22、40、62、66、69、72和79所示。
  5. 根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31和49所示，或者其轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  6. 根据权利要求5所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31和49所示，或者其轻链可变区CDR区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
  7. 根据权利要求6所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31、49和74所示。
  8. 根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：其为全抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
  9. 根据权利要求8所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：当其为scFv时，其重链和轻链可变区之间可含有连接肽。
  10. 根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：其重链恒定区选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
  11. 根据权利要求1所述的抗OX40抗体或其抗原结合部分，其特征在于：其轻链恒定区为κ或λ。
  12. 一种核酸分子，其特征在于：其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，所述重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
    (1)SEQ ID NO：5-7；
    (2)SEQ ID NO：23-25；
    (3)SEQ ID NO：41-43；
    (4)与前述(1)～(3)序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  13. 根据权利要求13所述的核酸分子，其特征在于：所述重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
    SEQ ID NO：4、22和40，或与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  14. 根据权利要求14所述的核酸分子，其特征在于：包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22和40所示，或者其重链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突 变氨基酸的个数不超过3个。
  15. 根据权利要求15所述的核酸分子，其特征在于：包括选自于如下一组的重链可变区，其序列如SEQ ID NO：4、22、40、62、66、69、72和79所示。
  16. 一种核酸分子，其特征在于：其包含能够编码抗体轻链可变区的核酸序列，所述轻链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
    (1)SEQ ID NO：14-16；
    (2)SEQ ID NO：32-34；
    (3)SEQ ID NO：50-52；
    (4)与前述(1)～(3)序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  17. 根据权利要求17所述的核酸分子，其特征在于：所述重链可变区包含选自如下一组的氨基酸序列：
    SEQ ID NO：13、31和49，或与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)同一性大于70％、80％、85％、90％或97％。
  18. 根据权利要求18所述的核酸分子，其特征在于：包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31和49所示，或者其轻链可变区与前述序列相比满足以下二者中至少一个的序列：a)结合相同抗原表位；b)突变氨基酸的个数不超过3个。
  19. 根据权利要求19所述的核酸分子，其特征在于：包括选自于如下一组的轻链可变区，其序列如SEQ ID NO：13、31、49和74所示。
  20. 一种载体，其特征在于：其含有权利要求13-20任一项的核酸分子。
  21. 一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求13-20任一项的核酸分子或权利要求21的载体。
  22. 一种偶联物，其特征在于：其含有权利要求1-12任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分，以及其它生物活性物质，所述抗OX40抗体或其抗原结合部分直接或通过连接片段与其它生物活性物质偶联。
  23. 一种组合物，其特征在于：其含有权利要求1-12任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分、权利要求13-20的核酸分子、权利要求21的载体、权利要求22的宿主细胞、或者权利要求23的偶联物，以及任选的药学上可接受的 载体或赋形剂，以及任选的其它生物活性物质。
  24. 权利要求1-12任一项的抗OX40抗体或其抗原结合部分、权利要求13-20的核酸分子、权利要求21的载体、权利要求22的宿主细胞、权利要求23的偶联物、或者权利要求24的组合物用于制备预防或***的用途。
CN201580083716.5A 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用 Active CN108137684B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110853915.7A CN114380908B (zh) 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2015/091958 WO2017063162A1 (zh) 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110853915.7A Division CN114380908B (zh) 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108137684A true CN108137684A (zh) 2018-06-08
CN108137684B CN108137684B (zh) 2022-03-08

Family

ID=58516967

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580083716.5A Active CN108137684B (zh) 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用
CN202110853915.7A Active CN114380908B (zh) 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110853915.7A Active CN114380908B (zh) 2015-10-15 2015-10-15 抗ox40抗体及其应用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10624974B2 (zh)
EP (1) EP3363816A4 (zh)
JP (1) JP6771551B2 (zh)
CN (2) CN108137684B (zh)
WO (1) WO2017063162A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110172090A (zh) * 2019-06-03 2019-08-27 北京岳昊科技发展有限公司 Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用
CN112279915A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂
CN112279914A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂
CN112279916A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Il13ra1抗体、基因、载体、宿主细胞和il13ra1拮抗剂
CN112300277A (zh) * 2019-07-25 2021-02-02 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Csf1r抗体、基因、载体、宿主细胞和csf1r拮抗剂
CN112867737A (zh) * 2018-10-19 2021-05-28 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd137抗体及其应用

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
CN109475603B (zh) 2016-06-20 2023-06-13 科马布有限公司 抗pd-l1抗体
EP3704159A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 Bristol-Myers Squibb Company Immunostimulatory agonistic antibodies for use in treating cancer
SG11202003443TA (en) * 2017-11-24 2020-05-28 Eucure Beijing Biopharma Co Ltd Anti-ox40 antibodies and uses thereof
CN110092832B (zh) * 2018-01-29 2020-03-31 康源博创生物科技(北京)有限公司 抗ox40抗体及其用途
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
JP7411575B2 (ja) 2018-05-11 2024-01-11 ウーシー・バイオロジクス・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド Ｏｘ４０に対する完全ヒト抗体、それを調製する方法、およびその使用
SG11202011024WA (en) * 2018-05-23 2020-12-30 Beigene Ltd Anti-ox40 antibodies and methods of use
US20220017629A1 (en) * 2018-11-20 2022-01-20 Shanghai Pharmaexplorer Co., Ltd. Ox40 antibody, preparation method thereof and use thereof
US10442866B1 (en) * 2019-01-23 2019-10-15 Beijing Mabworks Biotech Co. Ltd Antibodies binding OX40 and uses thereof
US20220363760A1 (en) 2019-05-30 2022-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signature for suitability to immuno-oncology therapy
CN114174537A (zh) 2019-05-30 2022-03-11 百时美施贵宝公司 细胞定位特征和组合疗法
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
CN113045655A (zh) * 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
AU2021334361A1 (en) 2020-08-31 2023-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and immunotherapy
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
EP4267172A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
MX2023007734A (es) 2020-12-28 2023-08-21 Bristol Myers Squibb Co Composiciones de anticuerpos y metodos de uso de las mismas.
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684157A (zh) * 2004-09-17 2010-03-31 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-ox40l抗体
CN102741287A (zh) * 2009-02-17 2012-10-17 Ucb制药公司 对人ox40具有特异性的抗体分子
CN103221427A (zh) * 2010-08-23 2013-07-24 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
CN103717263A (zh) * 2011-07-11 2014-04-09 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN103946240A (zh) * 2011-11-11 2014-07-23 Ucb医药有限公司 对人ox40具有特异性的抗体分子
CN103946238A (zh) * 2011-08-23 2014-07-23 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体及使用其的方法
WO2014148895A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Biocerox Products B.V. Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
CN104080809A (zh) * 2011-09-16 2014-10-01 比奥塞罗克斯产品公司 抗cd134(ox40)抗体及其应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2295639T3 (es) * 2002-06-13 2008-04-16 Crucell Holland B.V. Agonistas del receptor ox40=(=cd134) y uso terapeutico descripcion.
US7291331B1 (en) * 2002-09-11 2007-11-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods of treating OX40 medicated recall immune responses
CN101023102B (zh) * 2004-09-17 2013-05-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-ox40l抗体
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
US20100136030A1 (en) * 2007-02-27 2010-06-03 Lamhamedi-Cherradi Salah-Eddine Antagonist ox40 antibodies and their use in the treatment of inflammatory and autoimmune diseases
PT2851374T (pt) * 2007-12-14 2017-06-20 Pfizer Moléculas de ligação ao recetor humano ox40
MX2016012779A (es) * 2014-03-31 2017-04-27 Genentech Inc Terapia de combinacion con agentes antiangiogénesis y agonistas de unión a ox40.
HUE046767T2 (hu) 2014-03-31 2020-03-30 Hoffmann La Roche Anti-OX40 antitestek és alkalmazási eljárások
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
AU2016256911B2 (en) 2015-05-07 2022-03-31 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of use thereof
SG10202008304TA (en) 2015-05-29 2020-10-29 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684157A (zh) * 2004-09-17 2010-03-31 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-ox40l抗体
CN102741287A (zh) * 2009-02-17 2012-10-17 Ucb制药公司 对人ox40具有特异性的抗体分子
CN103221427A (zh) * 2010-08-23 2013-07-24 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
CN103717263A (zh) * 2011-07-11 2014-04-09 格兰马克药品股份有限公司 结合ox40的抗体及其用途
CN103946238A (zh) * 2011-08-23 2014-07-23 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体及使用其的方法
CN104080809A (zh) * 2011-09-16 2014-10-01 比奥塞罗克斯产品公司 抗cd134(ox40)抗体及其应用
CN103946240A (zh) * 2011-11-11 2014-07-23 Ucb医药有限公司 对人ox40具有特异性的抗体分子
WO2014148895A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Biocerox Products B.V. Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI等: "Effect of antibody to CD134 on perforin-mediated cytolysis in human peripheral blood mononuclear cells", 《HYBRIDOMA》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112867737A (zh) * 2018-10-19 2021-05-28 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd137抗体及其应用
CN112867737B (zh) * 2018-10-19 2023-01-06 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗cd137抗体及其应用
CN110172090A (zh) * 2019-06-03 2019-08-27 北京岳昊科技发展有限公司 Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用
CN112279915A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂
CN112279914A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂
CN112279916A (zh) * 2019-07-25 2021-01-29 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Il13ra1抗体、基因、载体、宿主细胞和il13ra1拮抗剂
CN112300277A (zh) * 2019-07-25 2021-02-02 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 Csf1r抗体、基因、载体、宿主细胞和csf1r拮抗剂

Also Published As

Publication number Publication date
US20180339059A1 (en) 2018-11-29
JP2018534924A (ja) 2018-11-29
CN114380908B (zh) 2023-03-17
WO2017063162A1 (zh) 2017-04-20
CN108137684B (zh) 2022-03-08
US10624974B2 (en) 2020-04-21
EP3363816A1 (en) 2018-08-22
CN114380908A (zh) 2022-04-22
JP6771551B2 (ja) 2020-10-21
EP3363816A4 (en) 2019-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108137684A (zh) 抗ox40抗体及其应用
CN105777906B (zh) 抗pd-l1全人抗体及其应用
TWI823895B (zh) 抗b7-h4抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
WO2021063330A1 (zh) 靶向cd3的抗体、双特异性抗体及其用途
CN108026169A (zh) 抗人cd137的完全人抗体及其应用
US20210115143A1 (en) Anti-pd-l1 antibody and use thereof
KR20220104783A (ko) Cd3 및 bcma에 대한 항체, 및 이로부터 제조된 이중특이적 결합 단백질
EP3988573A1 (en) Anti-cd3e/bcma bispecific antibody and use thereof
TWI713464B (zh) 針對Fcγ受體IIB及Fcε受體的新穎抗體
US20230071422A1 (en) ANTI-CD3 and ANTI-CD123 Bispecific Antibody and Use Thereof
JP2022532173A (ja) ヒト化抗ｃｄ１３７抗体およびその使用
JP2021505206A (ja) 抗ｃｄ１３７抗体およびその使用
TW202112826A (zh) 抗tigit抗體及使用方法
EP3856790A2 (en) Anti-cd40 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
AU2019349874A1 (en) Anti-CD40 binding molecules having engineered Fc domains and therapeutic uses thereof
WO2022188721A1 (zh) 抗pvrig蛋白抗体或抗体片段及其用途
WO2020058762A1 (en) Antibodies specific to ctla-4 and uses thereof
KR20210005082A (ko) 항-cd40 항체 및 이의 용도
TWI839395B (zh) 靶向cd137的抗體及其使用方法
WO2023236844A1 (zh) 靶向her2和pd-l1的双特异性抗体及其制备方法和应用
TWI802923B (zh) 標靶ｏｘ４０的抗體及其製備方法和應用
WO2024067759A1 (zh) 一种能够结合cldn18.2的抗体或其抗原结合片段及其应用
WO2023138639A1 (zh) 靶向tigit的抗原结合蛋白及其用途
CN116133684A (zh) 抗人nr1抗体衍生物
CN116003625A (zh) 包含抗TIGIT抗体和TGF-βR的融合蛋白、其药物组合物及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Xu Ting

Inventor after: Fei Yeqiong

Inventor after: Zhao Meng

Inventor after: Luan Yan

Inventor after: Wang Popo

Inventor after: Peng Jianjian

Inventor after: Ma Shuli

Inventor after: Ma Hui

Inventor after: Pan Xiaolong

Inventor after: Fu Shilong

Inventor after: Ning Panpan

Inventor before: Xu Ting

Inventor before: Fei Yeqiong

Inventor before: Zhao Meng

Inventor before: Luan Yan

Inventor before: Wang Popo

Inventor before: Peng Jianjian

Inventor before: Ma Shuli

Inventor before: Ma Hui

Inventor before: Pan Xiaolong

Inventor before: Fu Shilong

Inventor before: Ning Shanshan

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant